DE2327396A1

DE2327396A1 - Synthetisches polypeptid und verfahren zur herstellung desselben

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Publication number: DE2327396A1
Application number: DE2327396A
Authority: DE
Inventors: Stephen Francis Brady; Daniel Frank Veber
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1972-05-30
Filing date: 1973-05-29
Publication date: 1973-12-13
Also published as: FR2198931A1; NL7306837A; US3888836A; CH588447A5; FR2198931B1; JPS4941376A; GB1437477A; SE7603940L; CH588446A5

Description

Synthetisches Polypeptid und Verfahren zur Herstellung desselben

Die Erfindung betrifft neue Verfahren zur gesteuerten Stufensynthese von ISH/IH-RH, einem Decapeptid der Struktur Pyroglu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-ra_2J wobei die einzelnen Aminosäurebausteine der Peptidkette in,der angegebenen Reihenfolge durch Peptidbindungen aneinander gebunden werden, sowie Zwischenprodukte, die bei diesen neuen Verfahren entstehen. Insbesondere wird PSH/LH-RH hergestellt, indem man entweder nacheinander einen.jeden der einzelnen Aminosäurebausteine stufenweise in der angegebenen Reihenfolge einführt, oder indem man mehrere Segmente der Peptidkette synthetisiert und sie dann in der angegebenen Reihenfolge aneinander kuppelt. .

FSH/LH-RH ist dadurch wertvoll, dass es die Freigabe und/oder die Synthese von follikelstlmulierenden und luteihisierenden Hormonen im lebenden Organismus auslöst, und ist insofern besonders wertvoll, als es die Freigabe solcher Hormone durch die Zellen der Vorderhypophyse bewirkt. FSH/lH-RH wird ge-

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wohnlich injiziert, wodurch die Freigabe und/oder die Syn these von follikelstimulierenden und luteinisierenden Hormonen erzielt wird.

Die hier" für die verschiedenen Aminosäurebausteine, ihre Derivate und gewisse bevorzugte Schutzgruppen verwendeten Bezeichnungen sind die folgenden:

Aminosäure

L-Arginin Glycin

L-Histidin L—Leucin L-Prolin , · L-Pyroglutaminsäure L-Serin L-Tryptophan L-Tyrosin

Abgekürzte Bezeichnung

arg

his

leu

pro

pyroglu

ser

trp

tyr

Derivate; Schutzgruppen

K-Carboxyanhydrid Fitro

tert.Butyloxycarbonyl N-Hydroxysuccinimidester Methylester

Trifluoressigsäure bzw. Trifluoracetat

Dicyclohexylcarbodiimid Äthylester

Abgekürzte Bezeichnung

NCA

tBOG

MS

OMe

TI¹A DGC OBt

Gemäss der Erfindung wird PSH/LH-RH durch stufenweise Kupplung (über Pep'tidbindungen)· der einzelnen Aminosäurebausteine aneinander hergestellt, wobei die Peptidkupplung durchge-

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führt wird, indem man die "betreffende Aminosäure in der Reihe (als Derivat, bei dem die Carboxylgruppe aktiviert ist und alle Aminogruppen geschützt sind) zuerst mit Glycinamid (der Aminosäure des C-Endgliedes, d.h. des CarVoxyl-Endgliedes der Decapeptidreihe) und dann nacheinander mit jedem so als Zwischenprodukt entstehenden Polypeptid umsetzt; diese Methode wird hier als Stufensynthese bezeichnet. Wenn diese Stufensynthese in Lösung durchgeführt wird, verwendet man gewöhnlich vorzugsweise als carboxyl-aktivierte Aminosäure das Aminosäure-UCA, das Aminosäure-iDCA, das Amino säur eazid oder einen aktivierten Ester, wie den NHS-Ester der Aminosäure, oder gegebenenfalls eine eine freie Carboxylgruppe enthaltende Aminosäure zusammen mit einem Kupplungsmittel, wie Dicyclohexylcarbodiimid. Die NCA- und die TCA-Stufensynthese sind im einzelnen in der französischen Patentschrift 1 497 536 beschrieben.

Nach einem anderen Yerfahren wird ISH/IH-RH durch-Stufensynthese in fester Phase hergestellt, wobei man von dem C-Endglied ausgeht. Bei diesem Verfahren wird das Carboxylende der endständigen Aminosäure Glycin (und in den folgenden Stufen des Polypeptidprodukts) kovalent an ein unlösliches polymeres Trägerharz gebunden, z.B. als Carbonsäureester des chemisch in das Harz eingebundenen Benzylalkohol, der in dem hydroxymethylsubstituierten Polystyrol-Divinylbenzolharz enthalten ist. Bei dieser Synthese in fester Phase kann die Peptidkupplung durch unmittelbare Kondensation zwischen der freien Carboxylgruppe einer als Reaktionsteilnehmer dienenden Aminosäure und der Aminogruppe des an das Harz gebundenen G-lycins oder Polypeptids erzeugt werden. Eine solche Reaktion wird gewöhnlich in Gegenwart eines Kupplungsmittel, wie Dicyclohexylearbodiimid, durchgeführt; man kann die als Reaktionsteilnehmer dienende Aminosäure aber auch in Form einer carboxyl-aktivierten Aminosäure, wie des NHS-Esters, eines Aminosäureazids oder dergleichen, einsetzen.

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Statt durch Stufensynthese kann ESH/IH-RH auch durch Blocksynthese hergestellt werden, indem man verschiedene Peptidsegmente der PSH/LH-EH-Kette einzeln synthetisiert, und dann in der richtigen Reihenfolge unter Bildung des gewünschten Decapeptids aneinander kuppelt. Diese Peptidsegmente selbst lassen sich zweckmässig wiederum durch Stufensynthese in Lösung mit Hilfe des NCA-, TCA-, Azid- oder NHS-Esterverfahrens oder durch Stufensynthese in fester Phase unter Verwendung des carboxyl-aktivierten NHS-Esters oder des Aminosäureazids oder gegebenenfalls einer eine freie Carboxylgruppe aufweisenden Aminosäure zusammen mit einem Kupplungsmittel herstellen. Die Anzahl der Aminosäurebausteine in den Peptidsegmenten, die für die Blocksynthese des FSH/LH-RH verwendet werden, kann von 2 bis 8 variieren; vorzugsweise verwendet man jedoch Peptidsegmente, die 5 oder weniger Aminosäurebausteine enthalten, weil dadurch Kondensationen von grösseren Peptidsegmenten mit den entsprechenden Verlusten an diesen wertvolleren höheren Peptidbruchstücken vermieden werden.

Bei der Durchführung dieser Stufen- oder Blocksynthesen, bei denen eine Carboxylgruppe (oder aktivierte Carboxylgruppe) einer Aminosäure mit der Aminogruppe einer anderen umgesetzt wird, werden gewöhnlich vorzugsweise die Aminogruppen derjenigen Aminosäuren oder Peptide, die am Carboxylgruppenende des .Moleküls reagieren sollen, sowie .funktioneile Gruppen beider Reaktionsteilnehmer, die sonst unter den Bedingungen solcher Synthesen reagieren wurden, geschützt. Die Schutzgruppen müssen so ausgewählt werden, dass sie ihre schützenden Eigenschaften unter den Peptidkupplungsbedingungen beibehalten und sich selektiv abspalten lassen, ohne die Peptidbindungen zu beeinträchtigen. Schutzgruppen, die nach einer bestimmten Verfahrensstufe abgespalten werden sollen, müssen auch so beschaffen sein, dass sie sich selektiv abspalten lassen, ohne andere Schutzgruppen, die für spätere Kupplungsstufen erhalten bleiben müssen, anzugreifen.

— A. —

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Der Schutz der Aminogruppen wird gewöhnlich durch Salzbildung, die sich besonders zum Schutz stark basischer Aminogruppen eignet, durch eine Nitrogruppe, die sich besonders zum Schutz der basischen Aminogruppe des Arginine eignet, durch Acylsubstituenten, wie Formyl, Phthalyl, Trifluoracetyl, Toluolsulfonyl, Dibenzylphosphoryl, Mtrophenylsulfenyl,'Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl und dergleichen, durch Urethan-Schutzsubstituenten, wie Benzyloxycarbonyl (Carbobenzoxy), p-Methoxycarbobenzoxy, p-Uitroearbobenzoxy, tert.Butyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl und dergleichen, Alkylsubstituenten, wie Triphenylmethyl, Trialkylsilyl, Trimethylsilyl,und dergleichen, herbeigeführt. Zum Schutz der cc-Aminogruppe in den für die Reaktion am Garboxylende des Moleküls bestimmten Aminosäuren (oder Peptiden) verwendet man vorzugsweise tert.Butyloxycarbonyl (tBOC), da sich die tBOG-Schutzgruppe nach einer derartigen Reaktion und vor der nächsten Verfahrensstufe (bei der die a-Aminogruppe selbst an der Reaktion teilnimmt) durch eine verhältnismässig milde .Einwirkung von Säuren (z.B. Trifluoressigsäure oder Salzsäure in Äthylacetat) abspalten lässt, eine Behandlung, die andere Schutzgruppen, wie Nitro, Carbobenzoxy (Gbz) und Isonicotinyloxycarbonyl, die ihrerseits verwendet werden, um andere Aminogruppen, wie die basische Aminogruppe von Arginin, zu schützen, und die sich unter der energischen Wirkung einer starken Säure (z.B. von Bromwasserstoff in Eisessig "oder von wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol) abspalten lassen, nicht angreift.

Zu den gewöhnlich verwendeten Schutzgruppen für die Carboxyl-. gruppe gehören Amide.,, die Salzbildung, Estersubstituenten, wie Methyl- und Äthylester (die bevorzugt werden, wenn anschliessend eine Umwandlung über das Hydrazid in das Azid vorgenommen werden soll), der Benzylester und insbesondere der harzgebundene Benzylester, der bei der Synthese in fester

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Phase verwendet'wird (und der unmittelbar mit Hydrazin unter Abspaltung des Peptids von dem Harz und Bildung des Peptidhydrazids reagiert), p-Nitrobenzylester, tert.Butylester und dergleichen. Wenn die Kupplungsreaktionen in lösung durchgeführt werden, werden Hydroxylgruppen bei der Synthese von FSH/LH-RH gewöhnlich nicht geschützt; gegebenenfalls kann man aber zum Schutz solcher Hydroxylgruppen Tetrahydropyranyl, . Benzyl, Trifluoracetyl, tert.Butyl und dergleichen verwenden. Bei der Synthese in fester Phase zur Herstellung des serinhaltigen Segments der FSH/IH-RH-Kette arbeitet man jedoch gewöhnlich vorzugsweise mit diesen O-Schutzsubstituenten und insbesondere mit der 0-Benzylgruppe und der 0-tert.Butylgruppe..Der Imidazolstickstoff des Histidins kann gegebenenfalls ebenfalls geschützt werden, und zwar vorzugsweise durch einen N-Kohlenwasserstoffsubstituenten oder einen substituierten N-Kohlenwasserstoffsubstituenten, wie Η-Benzyl, N-(2,4-Dinitrophenyl) und dergleichen.

Die Auswahl der Schutzgruppen richtet sich zum Teil nach den jeweiligen Kupplungsbedingungen und zum Teil nach den an der Reaktion teilnehmenden Aminosäure- und Peptidbausteinen.

Eine Richtschnur für die Auswahl besonderer Schutzgruppen findet sich in der oben genannten französischen Patentschrift 1 496 536. .

Das bevorzugte Gesamtverfahren zur Herstellung von ESH/IH-KH ist schematisch in dem folgenden Pliessdiagramm dargestellt, in dem die neben den Pfeilen stehenden Zahlen sich auf die nachstehenden Beispiele beziehen, die die betreffenden Umwandlungsstufen erläutern.

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HIs-OME 2HCl

1 I Pyroglu Pyroglu-his-OMe

2 I H₂NNH₂ Pyroglu-hlS-NHNH₂

3 j Isoamylnitrit Pyroglirhis-N_

8 j Trp-ser-tyr-OMe-TFA ·*

'Py rogl li-hi s-trp-ser-tyr-OMe

Pyroglu-his-trp-ser-tyr-NHNH₂ 11] Isoamylnitrit ο Pyroglu-his-trp-ser-tyr-N-

CD OO 181 Gly-leu-arg-pro'-gIy-NH₀ *·—

■r-n 1 ··

UJ O CD 00 cn

Tyr-OMe

i» I tBOC-ser-NHS tBOC-ser-tyr-OMe

5 I TFA Ser-tyr-OMe-TFA

6 I tBOC-trp-NHS tBOC-trp-rser-tyr-OMe

TFA

Pyrogiu-his-trp-ser-tyr^gly-leu-arg-pro-giy-NH«

ro

QO GIy-NH₂
131 Pro-NCA ■

Pro-gVy-NH₂
Hi tB0C-arg-N0₂

tBOC-argiNOj-pro-giy-NH.,

15 I HCl,/fitOAc

Arg(NO )-pro-gIy-NH,

16 tBOC-gly-leu —

Leu

12

tBOC-gly-NHS

tBOC-gly-leu-arg(NO₂)-pro-gIy-NH₂

HF

Ni -J CO CO

cn

Diese "bevorzugten Gesamtverfahren sind Kombinationen von Stufen- und Blocksynthesen, "bei denen zunächst gewisse Peptidsegmente der Deeapeptidkette nach, der Stufenmethode, und zwar entweder durch Stufensynthese in Lösung oder durch Stufensynthese in fester Phase, hergestellt und dann in der richtigen Reihenfolge aneinander gekuppelt werden. Bei diesem Verfahren wird der tBOC-Subs tituent verwendet, um die α-Aminogruppen zu schützen, der NO₂-Substituent wird verwendet, um die- basische primäre Aminogruppe des Arginine„zu schützen, und der Methylester subs tituent wird, verwendet, um die Carboxylgruppen von Histidin, Tyrosin, Pyroglutamyl-histidin, Seryl-tyrosin, Tryptophanyl-seryl-tyrosin und Pyroglutamyl-histidyl-tryptophanyl-seryl-tyrosin zu schützen. Im Palle. von Pyroglu-his und Pyroglu-his-trp-ser-tyr erfüllt der Methylester die weitere Aufgabe, die Zwischenprodukte zu bilden, aus denen über das Hydrazid Pyroglu-his-azid und Pyroglu-his-trp-ser-tyr-azid hergestellt werden. Anstelle dieser bevorzugten Methode umfasst die Erfindung aber auch verschiedene abgeänderte Verfahren sowie die- Verwendung anderer Schutzgruppen, die den oben genannten Anforderungen genügen. Solche abgewandelten Verfahren bestehen ebenfalls aus der Stufensynthese in Lösung, der Stufensynthese in fester Phase und Kombinationen von Stufen- und Blocksyntheseverfahren.

¥ie das obige Reaktionsfliessdiagramin zeigt, ist ein bevorzugtes Gesamtverfahren zur Herstellung von FSH/LG-RH die in Lösung durchgeführte Stufensynthese von (a) dem Pentapeptidsegment Gly-leu-arg-pro-gly-Mg und (b) dem carboxyl-aktivierten Pentapeptidsegment Pyroglu-his-trp-ser-tyr-azid. Das erstgenannte Pentapeptid wird hergestellt, indem man GIy-HH₂ mit Pro-NCA umsetzt. Diese Umsetzung wird unter starkem Rühren der Reaktionsteilnehmer in wässriger Lösung bei einem pH-Wert von 10,7 durchgeführt und ist unter diesen Bedingungen gewöhnlich in etwa 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angesäuert, wodurch sich das als Zwischenprodukt

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entstandene Carbamat zersetzt und sich eine wässrige lösung von Pro-gly-NH₂ bildet, und der pH-Wert der lösung wird dann auf 9,5 eingestellt, die Lösung gefriergetrocknet und der Rückstand mit Chloroform extrahiert. Durch Eindampfen des Chloroformextrakts und Umkristallisieren des als Rückstand hinterbleibenden Öls aus einem organischen lösungsmittel, wie einem Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat, erhält man praktisch reines Pro-gly-NHp.

Dieses Pro-gly-NH₂ wird mit tBOC-ni.tr ο arginin umgesetzt. Diese Reaktion wird durchgeführt, indem man die Reaktionsteilnehmer in Acetonitril in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid bei etwa 20° C zusammenbringt, und ist unter diesen Bedingungen in etwa 5 bis 4 Stunden beendet. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft, das hinterbleibende Öl in Wasser gelöst und die wässrige Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert. Dann wird die wässrige Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand, durch Chromatographie gereinigt. So erhält man praktisch reines tBOC,-(NO₂) ar g-pro-gly-NH₂. Dieses Tripeptid wird in (NO^arg-pro-gly-OTL, übergeführt, indem man den tBOC-Substituenten durch Behandeln mit Chlorwasserstoff in Äthylacetat abspaltet.

Das Dipeptidsegment tBOC-gly-leu wird hergestellt, indem man Leucin mit dem NHS-Ester von tBOC-glycin in Lösung in Äthanol unter alkalischen Bedingungen (vorzugsweise bei einem pH-Wert, von 8,0) umsetzt. Dieses geschützte Dipeptid wird dann mit (N0₂)arg-pro-gly-NH₂ umgesetzt,· indem man die Reaktionsteilnehmer in Dimethylformamid zusammenbringt, den pH-Wert mit Triäthylamin auf 9_}5 einstellt, dann eine Lösung von Hydroxybenztriazol in Methylenchlorid und schliesslich eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid zusetzt. Unter diesen Bedingungen reagiert das tBOC-gly-leu zunächst mit dem Hydroxybenztriazol unter Bildung des entsprechenden Esters

— ⁹ "*

3 0 9 8 5 0/1218 ,

(d'er das Dipeptid bei der Umsetzung mit dem (N0₂)arg-pro-glygegen Racemisierung schützt). Das Reaktionsgemisch wird

3 Ms 4 Stunden bei 25° C gerührt, und na'ch diesem Zeitraum ist die Umsetzung des Hydroxybenztriazolesters des tBOC-glyleu mit dem (WO₂)arg-pro-gly-EH₂ unter Bildung des Pentapeptids praktisch vollständig verlaufen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, verrührt und durch Chromatographie gereinigt. Man erhält praktisch reines tBOC-gly-leu-arg(NO₂)-pro-gly-M^. Dieses geschützte Pentapeptid wird dann mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, vorzugsweise in Gegenwart von Anisol bei Temperaturen unter 0 G-, umgesetzt, wobei sowohl der tBOC-Substituent als auch der Nitrosubstituent in etwa 30 Minuten vollständig abgespalten werden. Überschüssiger Fluorwasserstoff wird zweckmässig durch Hindurchleiten eines Stickstoffstroms durch das Reaktionsgemisch abgetrieben. Das Gemisch wird dann mit Äther verrührt, in Essigsäure gelöst und die Essigsäurelösung in der Kälte eingedampft, und zwar vorzugsweise gefriergetrocknet. So erhält man das ungeschützte Pentapeptid-amidsalz Gly-leu-arg-progly-HH₂-hydrofluorid.

Die endständige Tripeptidfolge des zweiten Pentapeptids in Form des Trifluoracetats des Alkylesters, wie Trp-ser-tyr-OMe-TFA, Trp-ser-tyr-OEt-TFA und dergleichen, wird hergestellt, indem man zunächst den Tyrosinalkylester mit dem EHS-Ester des tBOC-serins in Lösung in Dimethylformamid unter alkalischen Bedingungen (vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,0) reagieren lässt, wobei sich tBOC-ser-tyr-OMe' bzw. tBOO-ser-tyr-OEt bildet. Dieses Dipeptid wird mit Trifluoressigsäure zu Ser-tyr-OMe-trifluoracetat bzw. Ser-tyr-OEt-trifluoracetat umgesetzt. Dieses Ser-tyr-alkylestertrifluoracetat wird mit dem NHS-Ester von tBOC-trp in Lösung in Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,0) zu dem Tripeptid tBOC-trp-ser-tyr-OMe bzw.

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3 Ü 9 8 5 0 / 1 2 1 G

tBOC-trp-ser-tyr-OEt umgesetzt, welches seinerseits mit Trifluoressigsäure zu Trp-ser-tyr-OMe-TPA "bzw. Trp-ser-tyr-OBtumgesetzt wird. "

Das noch verbleibende Dipeptidsegment dieses zweiten Pentapeptids wird in Form seines Azids, nämlich Pyroglu-his-N^, hergestellt, indem man zunächst den Methylester von Histidin mit Pyroglutaminsäure in Acetonitril, welches Triäthylamin enthält, in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt. Das Gemisch wird bei 25° C gerührt, und unter diesen'Bedingungen ist die Umsetzung in etwa 20 bis 25 Stunden beendet. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und dann filtriert, um den Dicyclohexylharnstoff abzutrennen. Die gefilterte Lösung wird mit mehreren Raumteilen Äther-verdünnt und der Niederschlag abfiltriert.und aus einem organischen Lösungsmittel, wie Isopropanol, umkristallisiert. So erhält man Pyroglu-his-OMe. Die letztgenannte Verbindung wird mit Hydrazin umgesetzt und das Hydrazid mit Isoamylnitrit reagieren gelassen, wobei man Pyrogluhis-azid erhält.

Dieses Pyroglu-his-azid wird dann mit dem Alkylester von Trp-ser-tyr in Lösung in Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,0) zu dem entsprechenden Pentapeptid Pyroglu-his-trp-ser-tyr-OMe bzw. Pyroglu-his-trp-ser-tyr-OEt umgesetzt, welches man seinerseits durch Reaktion mit Hydrazin in das Hydrazid überführt, worauf man durch Umsetzung des Hydrazide mit Isoamylnitrit Pyroglu-his-trp-ser-tyr-azid herstellte

Die beiden Pentapeptide Gly-leu-arg-pro-gly-I^ und Pyrogluhis-trp-ser-tyr-azid werden in Lösung in Dimethylformamid unter milden alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,,O) zu dem Decapeptid Pyroglu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-glyumgesetzt, das hier auch als PDH/LH-RH bezeichnet wird.

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Beispiel 1 ,

12,1 g His-OMe-hydrochlorid, 6,5 g Pyroglutaminsäure und 14 ml Triäthylamin werden in 200 ml Acetonitril gelöst, und die Lösung wird unter Rühren mit 12,8 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 22 Stunden bei 25° C gerührt und dann im Vakuum auf 50 ml eingeengt. Von diesem Gemisch wird der als Niederschlag ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und mit Acetonitril und sodann mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum auf 50 ml eingedampft und dann mit 200 ml Äther versetzt» Der Niederschlag wird abfiltriert und aus Isopropanol umkristallisiert. Man erhält 5>0 g kristallines Pyroglu-his-OMe.

Beispiel 2

0,2 g Pyroglu-his-OMe werden mit 10 ml eines Gemisches aus gleichen Teilen wasserfreiem Hydrazin und Methanol umgesetzt. Das Gemisch wird 6 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum bei 35 C eingedampft. Nach Zusatz von 10 ml Ithahol zu dem.Rückstand dampft man wieder im Vakuum ein, setzt 10 ml Dimethylformamid zu und dampft nochmals im Vakuum ein. Das hinterbleibende Öl wird mit Äthanol verrührt, im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält 0,19 g Pyroglu-his-hydrazid.

Beispiel 3

0,63 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Pyroglu-his-hydrazids werden in 80 ml frisch entgastem Dimethylformamid suspendiert, und die Suspension wird unter trockenem Stickstoff (zum Ausschluss von Feuchtigkeit) auf -40° C gekühlt. Die kalte Suspension wird unter Rühren mit einer Lösung von 4,0 ml 3-normaler Salzsäure in Tetrahydrofuran und dann mit 0,3 ml Isoamylnitrit versetzt. Das Gemisch wird 2,5-Stunden unter trokkenem Stickstoff auf -15 bis -20° C gehalten, worauf das Hydrazid vollständig zu Pyroglu-his-azid umgesetzt ist.

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Beispiel 4

2,54 g Tyr-OMe-hydrochlorid und 3,02 g NHS-Ester von tBOC-ser werden in 100 ml frisch entgastem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Diisopropyläthylamin auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und 4 Stunden "bei 25° C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von Diisopropyläthylamin auf 8,0 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird, im Vakuum eingedampft, das hinterhieltende Öl in Methylenchlorid gelöst und die Methylenchloridlösung zweimal mit mit Natriumsulfat gesättigter 0,2-normaler wässriger Schwefelsäure, einmal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung, zweimal mit gesättigter wässriger Natriumbiearbonatlösung und schliesslich zweimal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschene Methylenchloridlösung wird dann über wasserfreiem?Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingedampft und das hinterbleibende Öl aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Hexan umkristallisiert. Man erhält 3,2 g kristallines tBOC-ser-tyr-OMe. ·

Beispiel 5>

3,0 g tBOC-ser-tyr-OMe werden (bei 0° C) in der geringstmöglichen Menge Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wird 45 Minuten bei 25° C gerührt und dann unter starkem Rühren zu einer grossen Menge (etwa 100 ml) Äther zugetropft. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknete So erhält man 3,0 g Ser-tyr-OMe-trifluoracetat.

Beispiel 6

2,83 g Ser-tyr-OMe-trifluoracetat und 2,48 g NHS-Ester von tBOC-trp werden in 60 ml frisch entgastem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Triäthylamin auf einen pH-Wert von^ 8,0 eingestellt und 1,5 Stunden bei 25° 0. gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von Triäthylamin auf 8,0 gehalten wird.

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3 U 9 8 5 G / 1 ? 1 3 '

Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, im Vakuum eingedampft,' der hintertreibende Sirup in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit 0,2-normaler wässriger Schwefelsäure, dann mif gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. Die gewaschene Chloroformlösung wird ülirer wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, teilweise im Vakuum: eingedampft und das auskristallisierende Produkt abfiltriert und getrocknet. Man erhält 2,4 g kristallines tBOC-trp-ser-tyr-OMe.

B e i s pi el 7 ' . ■

1,2 g dieses tBOC-trp-ser-tyr-OMe werden in 4,3 ml Dimethylsulfid suspendiert, und das Gemisch wird (bei etwa 0 C) in 13 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei 25 G 12 Minuten gerührt und dann unter starkem Rühren zu einem grossen Volumen (etwa 250 ml) Äther zugetropft. Der Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,1g Trp-ser-tyr-OMe-trifluoraeetat. ' ·

Beispiel 8

Die nach Beispiel 3 hergestellte, Pyroglu-his-azid enthaltende Reaktionslösung wird auf -40° C gekühlt und mit einer Lösung von 1,1 g Trp-ser-tyr-OMe-trifluoracetat in 4 ml entgastem Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Diisopropyläthylamin auf 8,0 eingestellt und das Gemisch 18 Stunden auf -5° C gehalten (wobei man von Zeit zu Zeit den pH-Wert durch Zusatz von weiterem Diisopropyläthylamin auf 8,0 nachstellt). Nach diesem Zeitraum ist die Bildung des Pentapeptids praktisch vollständig verlaufen, was sich aus der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel G unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 10 T-eilen Äthylacetat, 5 Teilen Pyridin, 1 Teil Essigsäure und 3 Teilen Wasser nachweisen lässt. Die Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft, der

-H-

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Rückstand in 50 ml Butanol gelöst, die Butanollösung dreimal mit je 25 ml Wasser gewaschen, .und die vereinigten Waschflüssigkeiten werden sechsmal mit je 10 ml Butanol extrahiert und die vereinigten Butane·!lösungen auf ein kleines Volumen eingeengt. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und weiter durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt. Man erhält 0,5 g praktisch reines Pyroglu-his-trpser-tyr-OMe. -

Beispiel 9

Wenn man bei den Verfahren der Beispiele 4 bis 8 Tyr-OEt-hydrochlorld anstelle des Tyr-OMe-hydrochlorids im Beispiel 4 verwendet, erhält man tBOC-ser-tyr-OEt, Ser-tyr-OEt-IlA, tBOC-trp-ser-tyr-OEt, Irp-ser-tyr-OEt-TFA bzw. Pyroglu-his- , trp-ser-tyr-OEt.

Beispiel 10

0,45 g Pyroglu-his-trp-ser-tyr-OMe oder Pyroglu-his-trp-sertyr-OEt werden mit 20 ml eines Gemisches aus gleichen TeiÜen wasserfreiem Hydrazin und Methanol versetzt. Das Reaktionsge- _misch wird 6 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann im Vakuum bei 35° C eingedampft. Nach Zusatz von 10 ml Äthanol zu dem Rückstand wird das Gemisch wieder im Vakuum eingedampft, worauf man 10 ml Dimethylformamid zusetzt und dann nochmals im Vakuum eindampft. Das hinterbleibende Öl wird mit Isopropanol verrührt und im Vakuum getrocknet. Man erhält 0,44 g Pyroglu-his-trp-ser-tyr-hydrazid.

Beispiel 11

0,32 g des nach Beispiel 10 hergestellten Pyroglu-his-trpser-tyr-hydrazids werden in 20 ml frisch entgastem Dimethylformamid suspendiert, und die Suspension wird unter trockenem Stickstoff (zum Ausschluss von Feuchtigkeit) auf -40° C gekühlt. Die kalte Suspension wird unter Rühren mit einer Lö-

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sung von 1,2 ml 3-normaler Salzsäure in Tetrahydrofuran und dann mit 0,035 ml Isoamylnitrit versetzt. Das G-emisch wird unter trockenem Stickstoff 1 Stunde auf -15 bis -20° C gehalten, worauf das Hydrazid praktisch vollständig zu Pyrogluhis-trp-ser-tyr-azid umgesetzt ist.

Beispiel 12

Eine wässrige lösung von 4,58 g Leu wird mit 200 ml Äthanol versetzt und mit 50-prozentiger wässriger Kalilauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Zu dieser leu-Lösung setzt man 9,54 g HHS-Ester von oc-tBOC-gly unter Rühren zu, wobei man die Temperatur auf 25 C und den pH-Wert durch Zutropfen von 50-prozentiger wässriger Natronlauge auf 8,0 hält. Wenn keine weitere Base verbraucht wird, wird die Lösung filtriert, das Äthanol im Takuum.abgedampft und die wässrige Reaktionslösung mit 300 ml Äthylacetat extrahiert, wodurch der nicht umgesetzte NHS-Ester aus der Lösung entfernt wird. Der pH-Wert der wässrigen Reaktionslösung wird dann mit konzentrierter Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt und die angesäuerte wässrige Lösung dreimal mit je 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natrium-" sulfat- getrocknet, und das Äthylacetat wird im Vakuum abgetrieben. Durch Dünnschichtchromatographie des Rückstandes an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus 80 Teilen Chloroform, 18 Teilen Methanol und 2 Teilen Wasser zum Eluieren wird nachgewiesen, dass das Produkt praktisch reines oc-tBOC-gly-leu ist.

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Beispiel 13

2,2. g GIy-IiHp werden in 200 ml 1-molarer wässriger Kaliumboratpufferlösung* (pH = 10,7) gelöst, die lösung wird auf 0° C gekühlt uiid in einem Schuss mit 3,52 g Pro-NCA versetzt,, wobei man das Gemisch (vorzugsweise im Waring-Mischer) stark rührt, die Temperatur auf 0° C und den pH-Wert durch Zutropfen von 50-prozentiger wässriger Kalilauge auf 10,7 hält. Man lässt die Reaktion unter weiterem Rühren und Innehalten einer Temperatur von 0° C und eines pH-Wertes von 10,7 fortschrei-.ten, "bis keine Base mehr verbraucht wird (etwa 1 Minute), stellt dann den pH-Wert mit konzentrierter Schwefelsäure auf 2,5 ein und leitet 30 Minuten Stickstoff durch das angesäuerte Reaktionsgemisch, um das Kohlendioxid aus der Pro-gly-RHg" Lösung zu verdrängen» Der pH-Wert dieser Lösung wird mit 50-prozentiger Kalilauge auf 9>5 eingestellt, die Lösung dann gefriergetrocknet und der Rückstand mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird filtriert, zur Trockne eingedampft und das hinterbleibende Öl aus einem Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat umkristallisiert. So erhält man 3»2 g praktisch reines Pro-gly-liHp. -

Beispiel 14 ·

170 mg Pro-gly-NHp und 320 mg tBOC-nitroarginin werden in 10 ml Acetonitril gelöst. Fach Zusatz von 227 mg Dicyclohexylcarbodiimid unter Rühren wird das Gemisch noch'3>5 Stunden "bei 20° C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im-Vakuum eingedampft, das hinterbleibende Öl in Wasser gelöst und die wässrige Lösung

* Diese Pufferlösung wird zweckmässig folgendermassen hergestellt: 1 Mol Borsäure wird in 500 ml Wasser aufgeschlämmt, worauf man gerade so viel festes Kaiiumhydroxid zusetzt, dass die Borsäure in Lösung geht. Dann setzt man weiteres Kaiiumhydroxid bis zu einem pH-Wert von 10,7 zu, · verdünnt die Lösung auf 990 ml, stellt den pH-Wert wieder auf 10,7 ein und verdünnt die Lösung schliesslich auf 1000 ml.

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zweiaal mit je 50 ml Chloroform extrahiert» Dann wird die wässrige Lösung im Vakuum eingedampft und^ das hinterbleibende Öl durcli Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus 50 Teilen Chloroform,.40 Teilen Methanol und 10 Teilen Wasser zum Eluieren gereinigt. Man erhält 80 mg reines tBOC-arg(N0₂)-pro-gly-NH₂.

Beispiel 15

1,1 g tBOC-arg(IiO₂)-pro-gly-NH₂ werden in 100 ml Äthylacetat suspendiert, lach Einstellung der Temperatur auf 5 C leitet man 7 Minuten in das (auf 5° C gehaltene) Gemisch wasserfreien Chlorwasserstoff ein. Dann leitet man Stickstoff durch das Reaktionsgemisch, bis' der Chlorwasserstoff abgetrieben ist. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und im Vakuum bei 25 C getrocknet. Man erhält 1,1 g praktisch reines (N0₂)arg-pro-gly-NH₂-hydrochlorid.

Beispiel 16

890 mg ArgClfOgJ-pro-gly-liHg-hydrochlorid¹ und 567 mg tBOC-glyleu werden in 10· ml frisch entgastem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Triäthylämin auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und mit einer Lösung von 440 mg Hydroxybenztriazol in 18 ml Methylenchlorid und sodann mit einer Lösung von 540 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 12 ml Methylenchlorid versetzt. Das.Gemisch wird 3,5 Stunden bei 25° C gerührt, dann im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äthylacetat verrührt. Der feste Stoff (1,2 g) wird durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus 80· Teilen Chloroform, 18 Teilen Methanol und 2 Teilen Wasser zum Eluieren gereinigt, wobei man 300 mg praktisch reines tBOC-gly-leu-arg(N0₂)^!-pro-gly-NH₂ erhält.

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Beispiel 17

200 mg tBOC-gly-leu-argCiäO^-pro-gly-HHg "werden 15 Stunden im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet, um die letzten Spuren iron Wasser zu entfernen, und das trockne Material wird in ein Polyäthylenrohr eingebracht, das 0,3 ml Anisol enthält» Das Gemisch wird auf -78° C gekühlt, worauf man 4 ml wasserfreien Fluorwasserstoff in das Rohr einkondensiert und das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei 0° C rührt. Sodann leitet man-(immer noch "bei 0 C) trocknen Stickstoff durch das Gemisch, um den Überschüssigen Fluorwasserstoff abzutreiben. Der Rückstand wird 20 Minuten bei 25° C unter Vakuum gehalten, dann mit Äther verrührt, mit Äther gewaschen, in wässriger Essigsäure gelöst und die-Essigsäurelösung gefriergetrocknet. Man erhält 190 mg praktisch reines Gly-leu-arg-pro-gly-lHg-hydrofluorid.

Beispiel 18

Die nach Beispiel 11 hergestellte, Pyroglu-his-trp-ser-tyrazid enthaltende Reaktionslösung wird auf -40° C gekühlt und mit einer Lösung von 251 .mg Gly-leu-arg-pro-gly-Mp-hydrofluorid in 4 ml entgastem Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt und das Gemisch 20 Stunden auf -5° C gehalten (wobei man von Zeit zu Zeit durch Zusatz .von Diisopropyläthylamin den pH-Wert auf 8,0 nachstellt) „ Hach diesem Zeitraum ist die Bildung des Decapeptids praktisch vollständig, was sich durch DünnschichtChromatographie an Kieselgel G unter Verwendung* eines Gemisches aus 5 Teilen Äthylacetat, 5 Teilen Pyridin, 1 Teil Essigsäure und 3 Teilen Wasser zum Eluieren nachweisen lässt. Die Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit Äthanol verrührt und der feste Stoff dreimal mit Äthanol gewaschen und weiter chromatographisch gereinigt. Man erhält 0,41 g praktisch reines Pyroglu-his-trp-ser-tyrgly-leu-arg-pro-gly-HH₂.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von FSH/IH-BH, dadurch gekennzeichnet, dass man unter Anwendung einer Kombination von Stufen- und Blocksynthesen die Aminosäurebausteine in der Reihenfolge Pyroglu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pra-gly-Peptidbindungen aneinander kuppelt«

2. Verfahren zur Herstellung von FSH/LH-RH, dadurch gekenn-. zeichnet, dass man unter Anwendung einer Kombination von Stufen- und Blocksynthesen die Aminosäurebausteine, in den folgenden Pentapeptidreihen über Peptidbindungen aneinander kuppelt: Pyroglu-his-trp-ser-tyr und Gly-leu-arg-progly-NHg, wobei man bei den Kupplungsverfahren funktioneile Gruppen (die in den Aminosäure- oder Peptidbausteinen enthalten sind und unter den Kupplungsbedingungen reagieren würden) durch Substituenten schützt, die bei der Kupplung nicht-reaktionsfähig sind und sich durch ein Abspaltungsmittel abspalten lassen, ohne dass dadurch Peptidbindungen oder andere Schutzsubstituenten, die für nachfolgende Kupplungsreaktionen erhalten bleiben müssen, angegriffen werden, so dass sich die die Schutzsubstituenten aufweisenden Pentapeptide bilden, worauf man· die geschützten Pentapeptide durch Einwirkung eines Abspaltungsmittels, welches die genannten Substituenten abspaltet, in die ungeschützten Pentapeptide überführt und die letzteren durch Peptidbindung unter Bildung des Decapeptids Pyroglu-his-trp-sertyr-gly-leu-arg-pro-gly-NH₂ aneinander kuppelt.

3. Verfahren zur Synthese von FSH/LH-RH der Struktur Pyrogluhis-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-NH₂, dadurch gekenn-

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zeichnet, dass man die ungeschützten Pentapeptide Pyrogluhis-trp-ser-tyr und GIy-Ieu-arg-pro-gly-NH₂ durch Peptidbindung aneinander kuppelt.

4· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man

die Kuppluhgsceaktion durch Umsetzung von Pyroglu-his-trp- - ser-tyr-azid mit Gly-leu-arg-pro-gly-NH₂ durchführt.

5. Verfahren naah Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man His-OMe mit Pyroglu zu Pyroglu-his-OMe'umsetzt, das letztere mit Hydrazin reagieren lässt und das dabei gebildete Hydrazid mil Isoamylnitrit in Pyroglu-his-azid überführt, Tyr-OEt mit tBOC-ser-NHS zu de'm geschützten Dipeptidester tBO.Ö>-ser-tyr-OEt umsetzt, von diesem geschützten Dipeptidester durch. Jmsetzung mit Trifluoressigsäure den tBOC-Substituenten unter Bildung von Ser-tyr-OEt abspaltet, das genannte Ser-tyr-OEt mit tBOC-trp-NHS zu' dem geschützten Tripeptidester tBOC-trp-ser-tyr-OEt umsetzt, von diesem geschützten Tripeptidester durch Umsetzung mit Trifluor-" essigsäure den tBOC-Substituenten unter Bildung von Trpser-tyr-QEt abspaltet, dieses Trp-ser-tyr-OEt mit dem genannten Pyroglu-his-azid zu dem geschützten Pentapeptid Pyroglu-his-trp-ser-tyr-OEt umsetzt, aus diesem geschützten Pentapeptid durch Umsetzung mit Hydrazin und sodann mit

■ Isoamylnitrit das ungeschützte Pentapeptid-azid Pyrogluhis-trp-ser^tyr-azid herstellt, GIy-NHp mit Pro-NCA zu dem Dipeptidamid Pro-gly-NH₂ umsetzt, dieses Dipeptidamid mit tBOC-(NO₂)arg zu dem geschützten Tripeptidamid tBOC-arg(N0₂)-pro-gly-NH₂ umsetzt, die letztere Verbindung durch hydrolytische Abspaltung des tBOC-Substituenten mit Chlorwasserstoff in Essigsäure ohne Angriff der Nitro- und Amidgruppen in Arg(N0₂)-pro-gly-NH₂ überführt, Leu mit tBOC-gly-NHS zu dem geschützten Dipeptid tBOC-gly-leu umsetzt, dieses geschützte Dipeptid durch Umsetzung mit dem genannten Arg(N0₂)-pro-gly-NH₂ in das geschützte Pentapeptidamid

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tBOC-gly-leu-argCNOp^-pro-gly-NH^ überführt, das letztere geschützte Pentapeptidamid durch Abspaltung der tBOC- und Mtrosubstituenten durch Umsetzung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff ohne Angriff der Amid- oder Peptidbindungen in das ungeschützte Pentapeptidamid Gly-leu-arg-pro-gly-NH₂ überführt und dieses ungeschützte G-Iy-I eu-arg-pro-gly-NH₂ mit dem ungeschützten Pyroglu-his-trp-ser-tyr direkt zu dem ungeschützten Decapeptidamid Pyroglu-his-trp-ser-tyrgly-leu-arg-pro-gly-NHg umsetzt.

6. Synthetisches Pyroglu-his-tfp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-NH₂J dadurch gekennzeichnet, dass es durch Zusammenkuppeln des ungeschützten .Pentapeptids Pyroglu-his-trp-ser-tyr mit dem ungeschützten Pentapeptidamid Gly-leu-arg-pro-gly-NH^ erhalten worden ist.

7. Pentapeptidamid Gly-leu-arg-pro-gly-NH₂ und geschützte Derivate desselben, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Synthese erhalten worden sind.

8. Ungeschütztes Pentapeptidamid nach Anspruch 7₉ gekennzeichnet durch die Struktur Gly-leu-arg-pro-gly-NHp.

C.

9. Geschütztes Pentapeptidderivat nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Struktur tBOC-gly-leu-arg(NOp)-pro-gly-

10. Pentapeptid Pyroglu-his-trp-ser-tyr und Derivate-desselben.

11. Ungeschütztes Pentapeptid nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch die Struktur Pyroglu-his-trp-ser-tyr.

12. Pentapeptidderivat nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch die Struktur Pyroglu-his-trp-ser-tyr-OEt.

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13· Pentapeptidderivat"n.ach Anspruch TO, gekennzeichnet durch die Struktur Pyroglu-his-trp-ser-tyr-azid.

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ORIGINAL INSPECTED