DE2311786C2 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number
DE2311786C2
DE2311786C2 DE2311786A DE2311786A DE2311786C2 DE 2311786 C2 DE2311786 C2 DE 2311786C2 DE 2311786 A DE2311786 A DE 2311786A DE 2311786 A DE2311786 A DE 2311786A DE 2311786 C2 DE2311786 C2 DE 2311786C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
added
dissolved
mixture
filtered
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2311786A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2311786A1 (de
Inventor
Masahiko Takarazuka Hyogo Fujino
Tsunehiko Suita Osaka Fukuda
Shigeru Hirakata Kobayashi
Mikihiko Obayashi
Susumu Shinagawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of DE2311786A1 publication Critical patent/DE2311786A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2311786C2 publication Critical patent/DE2311786C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06173—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Glp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/18—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D207/22—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/24—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/26—2-Pyrrolidones
    • C07D207/273—2-Pyrrolidones with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to other ring carbon atoms
    • C07D207/277—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D207/28—2-Pyrrolidone-5- carboxylic acids; Functional derivatives thereof, e.g. esters, nitriles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C07K1/084—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung verschiedener Peptide. Es ist bekannt. Peptide herzustelien, indem man Aminosäuren oder Peptide, deren N-endständige Amino- oder Iminogruppe geschützt worden ist, mit einer N-Hydroximidverbindung in Gegenwart einer Carbodiimidverbindung zu N-Hydroximidestern von Aminosäuren oder Peptiden, deren N-endständige Gruppe geschützt ist, umsetzt und die hierbei gebildeten N-Hydroximidester mit Aminosäuren, Peptiden oder deren Derivaten umsetzt, deren N-endständige Aminogruppe oder lminogruppe (die »Amino- oder lminogruppe« wird nachstehend der Einfachheit halber als »Aminogruppe« bezeichnet) frei ist. und wahlweise das Produkt, d. h. das geschützte Peptid, in die freie Form überführt.
Bei den Peptidchemikern gelten N-Hydroxyphthalimid und N-Hydroxysuccinimid als bevorzugte N-Hydroximidverbindurgen. die für die Peptidbildung verwendet werden.
Nefkens und Mitarbeiter berichteten über die Peptidsynthese unter Verwendung von N-Hydroxyphthalimid. N-Hydroxyphthalimid hat jedoch den großen Nachteil, daß es die Racemisierung in der Peptidbil dungsreaktion bewirkt. N-Hydroxysuccinimid hat den Nachteil, daß es in Lösungsmitteln schwer löslich und hierdurch seine Verwendung und sein Wert begrenzt ist.
Später berichteten F. Weygand und Mitarbeiter über ein Verfahren, bei dem N-Hydroxysuccinimid verwendet wird (Z. Naturf, 216. (1966). S. 426-428). Es ist bemerkenswert, daß bei diesem Verfahren die Neigung zur Racemisierung vermindert werden kann und die Bildung von N-Acylharnstoff als Nebenprodukt vermieden wird. Durch dieses Merkmal von N-Hydroxysuccmimid ist das unter seiner Verwendung durchgeführte Verfahren /um wichtigsten aller bekannten Verfahren zur Peptidsvnthese geworden.
Kürzlich wurde jedoch darauf hingewiesen, daß die Verwendung \on N-Hydroxysuccinimid zu der ungür. stigen Bildung von Succinimidoxycarbonyl-^-alanin N hydroxysuceinimidester als Nebenprodukt führt, der die gewünschte Peptidbildungsreaktion stört (Tetrahedron Letters 1968 (24), 6935-6939).
In dem Bemühen, die Nachteile der bekannten Verfahren auszuschalten, gelang der Anmelderin die Synthese der neuen N-Hydroxy-5^norborneni2,3-dicarboximidester von Aminosäuren Und Peptiden, deren N-endständige Aminogruppe geschützt Worden ist, wobei gefunden wurde, daß die hierbei gebildeten N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester sehr reaktionsfreudig mit Aminosäuren oder Peptiden sind, deren N-endständige Aminogruppe frei ist. Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß gleichzeitig ι alle genannten Nachteile der bisher bekannten Verfahren ausgeschaltet werden.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von Peptiden nach einem verbesserten Verfahren, bei dem im wesentlichen keine Racemisie-
lu rung stattfindet, und das die Herstellung von Peptiden ermöglicht, ohne daß die Bildung des unerwünschten Nebenprodukts vom /?-Alarüntyp ausgelöst und begünstigt wird.
Das verbesserte Verfahren gemäß der Erfindung wird
ii durchgeführt, indem man Aminosäuren oder Peptide, deren N-endständige Gruppe geschützt worden ist, mit N-Hydroxy-5-norbornen-2J-dicarboximid ir Gegenwart eines Carbodiimidreagenz zu N-Hydroxy-5-norbornen-2r3-dicarboximidestern von Aminosäuren oder
3" Peptiden, deren N-endständige Gruppe geschützt ist. umsetzt und die so gebildeten N- Hydroxy 5-norbornen-2,3-dicarboximidester mit Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten umsetzt, deren N-endständige Gruppe frei ist, und wahlweise das geschützte Peptid in
.'-. die freie Form überführt.
Die vorstehend als Aminosäuren mit geschützter N-endständiger Aminogruppe bezeichneten Aminosäuren können beliebige Aminosäuren sein, die bei üblichen Verfahren verwendet werden. Mit anderen Worten.
in geeignet sind alle Verbindungen, die wenigstens eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe im Molekül enthalten. Wenn die Aminosäuren asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten, können auch alle optischen Isomeren verwendet werden. Ferner können
)"> diese Aminosäuren basisch, neutral oder sauer sein. Außerdem können nicht nur «-Aminosäuren, sondern auch ß- und γ- Aminosäuren verwendet werden. Geeignet sind ferner Aminosäuren, die nur auf synthetischem oder halbsynihetischem Wege herstell
4(1 bar sind. /. B. D-Phenylglycin. -x-Methylalanin. /f-Chlor alanin. Cyclohexylalanin und D-Cyclohexylglycin.
Als Peptide, die vorstehend als Peptide mit geschütz ter N endständiger Aminogruppe bezeichnet wurden, eignen sich . 'V Peptide, die bisher bei üblichen
4j Verfilzen verwendet wurden. Ks können somit zweckmäßig alle Verbindungen verwendet werden, die gebildet werden, wenn .ho vorstehenii genannten Aminosäuren eint- oder mehrere PeptiJbiniliingen zwischen den gleichen oJer verschiedenen Anunos.iu
>n ren bilden
Wenn diese Aminosäuren oder Peptide /um Schutz wenigstens ihrer N endständigen Aminogruppe n.ich einem der üblichen Verfahren behandelt werden, werden die vorstehend genannten Aminosäuren oder
v» Peptide mit geschützter N-cndständiger Aminogruppe erhalten. Diese Verfahren sind ausgereift und können erfolgreich im Rahmen der Erfindung angewandt werden. Als Beispiele von Schutzgmppen fur die N-emlständige Aminogruppe sind die C arbobenzoxy
h(i gruppe. tert.-Butyloxycarbonvlgruppe. tert -Amyloxvcarbonylgruppe, p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, ö'Nitrophenylsulfenylgruppe und die Isobornyloxycarbonylgruppezu nennen.
Die N-endständige Aminogruppe kann durch inlramolekulare Acylierung mit der Carboxylgruppe im Molekül geschützt werden, Es ist daher zu bemerken, daß die N-endständige Aminogruppe von Pyroglutaminsäure nicht durch Verwendung eines Schutzmittels,
sondern durch die intramolekulare Acylierung geschützt wird.
Die Reaktion zwischen Aminosäuren oder Peptiden, deren N-endständige Aminogruppe geschützt worden ist, und N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-carboximid in ~- Gegenwart eines Carbodiimidreagep.z kann nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid durchgeführt werden. Als Carbodiimidverbindungen kommen die Verbindungen in Frage, die routinemäßig vom Peptidchemiker verwendet werden, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid und wasserlösliche Carboiimide, z. B. N-Cyclohexyl-N-[^-(N-methylmorpholiniumJ-äthylJ-carbodiimid-p-toluolsulfonaL Hierbei beträgt das Molverhältnis von N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid zur Amino- is säure oder zum Peptid mit geschützter N-endständiger Aminogruppe gewöhnlich etwa 1 :1 bis 2 :1, vorzugsweise etwa 1 :1 bis 1,4 :1. Der Anteil der Carbodiimidverbindung beträgt gewöhnlich etwa 1 bis 2 MoI pro MoI Aminosäure oder Peptid mit geschützter N-end- zn ständiger Arninogruppe. Die zur Bildung solcher Ester führende Reaktion wird gewöhnlich bei etwa -20° bis 400C, vorzugsweise bei -10° bis 30° C durchgeführt. Als Reaktionslösungsmittel eignen sich für diese Reaktion beispielsweise Tetrahydiofuran, Äthylacetat, a Dioxan. Acetonitril, Chloroform, Dichlormethan, Dichloräthan und Dimethylformamid sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Die Reaktion ist im allgemeinen in 1 bis 6 Stunden vollendet. Nach beendeter Reaktion kann der N-Hydroxy-S-norbornen^-dicarboximide- m ster der Aminosäure oder des Peptids mit geschützter N-endständiger Aminogruppe in üblicher Weise, z. B. durch Konzentrierung. Phasenübergang. Kristallisation und Umkristallisation. isoliert werden. Das Reaktionsgemisch kann jedoch auch unter Umgebung der Stufe a der Isolierung des Esters unmittelbar in die nächste Peptidbildungsreaktion eingesetzt werden.
Die Reaktion zwischen N-Hydroxy-S-norbornen^J-dicarboximidester von Aminosäuren oder Peptiden. deren N-endständige Aminogruppe geschützt ist. und Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten, deren N-endständige Aminogruppe frei ist. kann nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid als N-Hydroximidverbindung durchgrführt werden. 4i
Als Aminosäuren oder Peptide, deren N-endständige Aminogruppe frei ist. und die mit den vorstehend genannten N-Hydroxy-S-norbornen^J-dicarboximidestern von Aminosäuren oder Peptiden mit geschützter N-endständiger Aminogruppe umzusetzen sind, kornmen die vorstehend beschriebenen Aminosäuren oder Peptide in Frage. Als Derivate von Aminosäuren oder Peptiden mit freier N-endständiger Aminogruppe eignen sich alle Verbindungen, die durch Einführung von Substituenten. die die Reaktion nicht hemmen, in Aminosäuren oder Peptide hergestellt werden können. Bevorzugt werden beispielsweise die entsprechenden Salze und Amide.
Die Erfindung hat unter anderem den Vorteil, daß die Salze, die in wäßrigen Lösungsmitteln allein selektiv löslich sind, z, B. die Salze der Aminosäuren oder Peptide mit anorganischen oder organischen Basen, beispielsweise die Salze von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Triäthylamin, Tributylamin, N-Methylinorpholin, N-Älhylinorpholin, Trimethylamin, N-Methylpiperazin und Dicyclohexylamin, verwendet werden können.
Als Amide können die durch Kondensation der Carboxylgruppe von Aminosäuren oder Peptiden mit Ammoniak herstellbaren Amide sowie die entsprechenden primären oder sekundären Amide verwendet werden.
Alle dem Reaktionssystem zugesetzten Aminosäuren und Peptidverbindungen, d. h. Aminosäuren oder Peptide mit geschützter N-endständiger Aminograppe sowie Aminosäuren, Peptide oder ihre Derivate, deren N-endständige Aminogruppe frei ist, können zusätzlich zur N-endständigen Aminogruppe und zur C-endständigen Carboxylgruppe funktioneile Gruppen in ihren Seitenketten enthalten, z. B. die ε-Aminogruppe in Lysin, die Guanidingruppe in Arginin, die y-Carboxylgruppe in Glutaminsäure, Carboxylgruppen, Thiolgruppen ..nd Hydroxylgruppen, und einige oder alle dieser funktioneilen Gruppen sind zweckmäßig geschützt. Die mit den vorstehend genannten N-geschützten Aminosäuren oder Peptiden umzusetzende C-endstänJige Carboxylgruppe der Aminosäuren oder Peptide mit freier N-endständiger Aminogruppe kann geschützt sein. Bezüglich dsr Schutzgruppen wurde bereits ■.veitgehend Klarheit für jede zu schützende funktioneile Gruppe geschaffen, und die bisher gemachten Feststellungen können im Rahmen der Erfindung ausgenutzt werden. Einige typische Schutzgruppen für die N-endständige Aminogruppe wurden bereits vorstehend erwähnt. Als geeignete Schutzgruppen für andere Aminogruppen werden gewöhnlich Substituentengrup· pen wie
Carbobenzoxygrupnen,
tert.-Amyloxycarbonylgruppen,
tert.- Buty loxycarbonylgruppen,
Isobornyloxycarbonylgruppen,
o-Nitrophenylsulfinylgruppen,
p-Nitrocarbobenzoxygruppen,
p-Chlorcarbobenzoxygruppen,
p-Methoxyr.arbobenzoxygruppen,
Formylgruppen und
Dipheny'methyloxycarbony !gruppe»
verwendet. Als Schutzgruppen für Carboxylgruppen können natürlich die gebräuchlichen esterbildenden Gruppen wie Methylreste. Äthylreste. Butyireste. tert.-Butylreste. Benzylreste. p-Methoxybenzylreste. iert.-Am>lreste. Phenylreste und p-Nitrobenzylreste verwendet werden. Außer den vorstehend genannten Gruppen können auch gewisse polymere Harze, z. B. Polyhydroxymethylstyrol, als Schutzgruppen verwendet werden.
Als Schutzgruppen fürThiol eignen sich thioätherbildende Gruppen wie Benzylreste und p-Methoxybenz)lreste sowie thiocarbonylbildende Gruppen, z. B. Benzoylgruppen. tert.-Butyloxycarbonylgruppen und Carbobenzoxygruppen. Als Schutzgruppen für Hydroxylgruppen werden gewöhnlich die Benzyl- und tert.-Butyläther verwendet, jedoch sind in gewissesn Fällen auch O-Acylreste. z. B. Acetylreste und Benzoylreste. geeignet. Als Schutzgruppen für die oj-Guanidingruppe von Arginin eignen sich nicht nur die Carbobenzoxygruppe und Isobornyloxycarbonylgruppe. sondern auch die Nitrogruppe und Tosylgruppe.
Im allgemeinen genügt die Verwendung von etwa 1 Mol einer Aminosäure oder eines Peplids oder eines reaktionsfähigen Derivats mit freier N-endständiger Aminogruppe pro Mol des N'Hydroxy-5-norbornen-2,3'dicarboximidesters einer Aminosäure oder eines Peptids mit geschützter N-endständiger Aminogruppe, jedoch kann das Verhältnis nach Belieben erhöht oder erniedrigt werden.
23 Π 786
Die Reaktion kann im allgemeinen in einem geeigneten Lösungsmittel, das in der Peptidchemie gebräuchlich ist, durchgeführt werden. Geeignet sind beispielsweise Wasser, Äther, Äthylacetat, Acetone, Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform, Dichlormethan, Dichloräthan, Tetrachlorkohlenstoff, Dimethylacctamid. Dimethylformamid, Pyridin, Dimethylsulfoxyd, Phosphorsäure-Tris(diäthyl)amid, Acetonitril, N-Methylpyrrolidon sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von etwa -20° bis 500C und zur Erzielung besserer Ergebnisse zwischen etwa —5° und 3O0C. Die Reaktionszeit liegt im allgemeinen im Bereich von 30 Mir.uten bis zwei Tage.
Wenn das gebildete Peptid in Wasser schwer löslich ist, ist es nach beendeter Reaktion natürlich vorteilhaft, das Produkt durch Verdünnung des Reaktionsgemisches mit Wasser oder durch Zusatz von verdünntem wäßrigen Ammoniak, einer verünnten wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung oder einer wäßrigen KaIiumbicarbonatlösung auszufällen. Wenn das gebildete Peptid in organischen Lösungsmitteln schwer löslich ist, kann das geschützte Peptid durch Zusatz eines Lösungsmittels, z. B. Äthylacetat, Alkohol Aceton und Chloroform, ausgefällt werden. Das Produkt kann jedoch auch ohne Isolierung in die nächste Reaktion eingesetzt werden. Das N-Hydroxy-5-norbornen-2J-dicarboximid kann aus der Lösung wiedergewonnen werden.
Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung können in einen einzelnen Reaktor alle Materialien, d. h. eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter N-endständiger Aminogruppe, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-carboximid, ein Carbodiimidreagerz und eine Aminosäure oder ein Peptid oder deren Derivat mit freier N-endständiger Aminogruppe gegeben werden. In diesem Fall reagiert zunächst die Aminosäure oder das Peptid mit geschützter N-endständiger Aminogruppe mit dem N-Hydroxy-5-norbornc" 2J-dicarboximid mit Hilfe des Carbodiimidreagenz. worauf der hierbei gebildete N-Hydroxy-5-norbornen-23-dicarboximidester der Aminosäure oder des Peptids mit geschützter N-endständiger Aminogruppe mit einer Aminosäure, einem Peptid oder deren Derivat mit freier N-endständiger Aminogruppe reagiert. Auf diese Weise wird die Peptidbildungsreaktion in einem Einstufenverfahren durchgeführt. Die Mengenanteile der Reaktionsteilnehmer werden aus den vorstehend genannten Bereichen gewählt. Ebenso kann mit den vorstehend genannten Reaktionszeiten. Reaktionstemperaturen und Verfahren zur Isolierung der gebildeten Verbindung gearbeitet werden.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist. enthält das als Reaktionsprodukt erhaltene Peptid gewöhnlich im Molekül eine oder mehrere Schut/gruppen. die zum Schutz der funktionellen Gruppen, nämlich der Aminogruppen. Carboxylgruppen. Hydroxylgruppen und Thiolgruppen. verwendet worden sind. Falls gewünscht, kann das geschiit/te Peptid durch Entfernung einer oder mehrerer Schutzgruppen in die freie Form überführt werden. Die Verfahren ;ur Entfernung der Schutzgruppen sind auf dem Gebiet der Peptidsyn these allgemein bekannt. Beim Verfahren gemäß d?r trfindung können die Schutzgruppen ebenfalls nach diesen bekannten Methoden (z. B. Behandlung mil HF, CFjCOOH, HBr/CH3CÖOH oder dgl. oder durch katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladinrnschwarz) eiHfprnt werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht die Herstellung der verschiedensten Peptide, die eine beliebige Anzahl oder beliebige Arten von Aminosäureeinheiten enthalten. Als Beispiele dieser Peptide sind zu nennen: therapeutisch wertvolle Peptide, ζ. B. Oxytocin, Vassoprescin, Glucagon, ACTH (adrenocorticotropes Hormon) und ihre Analogen, Secretin, Calcitonin, Insulin, Gastrin, Bradykinin, Eledoisin, LH-RH (luteinizing hormone-releasing hormone = Iuteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon), cyclische Peptidantibiotika (z. B. Penicilline und Cephalosporine) und ihre Derivate, TRH (Thyrotropin freisetzendes Hormon), MIF (melanocyte stimulating hormone inhibiting factor) sowie Zwischenprodukte für die Herstellung dieser Peptide.
Das verbesserte Verfahren gemäß der Erfindung zeichnet sich durch die folgenden Merkmale aus:
(1) Es findet keine Racemisierung sowie keine Nebenreaktion als Begleiterscheinung der Verwendung von N-Hydroxysuccinimid statt.
(2) Das gewünschte Peptid w" .1 schnell in hoher Ausbeute gebildet
(3) Die Peptidbildungsreaktion kann in wäßriger Lösung durchgeführt werden, weil die N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester von Aminosäui en oder Peptiden mit geschützter N-endständiger Gruppe stabil und in einem Maße, wie es für die bekannten N-Hydroximidester fast undenkbar ist, hydrolysenbeständig sind.
(4) Das Peptid kann außerdem in hoher Reinheit gewonnen werden, weil das N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, das bei Bildung der Peptidbindung freigesetzt wird, aufgrund seiner guten Löslichkeit in Wasser und in gebräuchlichen Lösungsmitteln, die routinemäßig in der Peptidsynthese verwendet werden, leicht und vollständig aus dem Reaktionssystem entfernt werden kann. Es , · ι ■ π >r /U bemerken, daß das N-Hydroxy-5-norbornen-2._3-dicarxoximid in äußerst hoher Ausbeute zurückgewonnen werden kann.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Falls nicht anders angegeben, haben alle bei den dort beschriebenen Vei suchen verwendeten Aminosäuren oder Aminosäurereste die L-Konfiguration. Ferner werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
H-(Pyr)Glu-OH
H-GIu(OH)-OH
H-AIa-OH
HGIyOH
H-VaI-OH
H Pise C)H
H-ILe-OH
H-GIn-OH
H-Asn-OH
HHis-OH
H-Trp-OH
H-Arg-OH
H-Ser-OH
H'Tyr-OH
H^Phe-OH
,H-Met^OH
H-Lys-OH
H-Orn-OH
Pyroglutaminsäure
Glutaminsäure
Alanin
Glycin
Phenylalanin
Isoleucin
Glutamin
Asparagin
Histidin
Trypsin
Arginin
Serin
Tyrosin
Phenylalanin
Methionin
L.ysin
Ornithin
BOC-
-OMe
-OET
-OBzI
-OtBu
-ONBI
-OPCP
IBOC-
-ONP
HÖNBI
DCC
DMF
THF
Carböbenzoxy
tert-Butyloxycarbonyl
Methylester
Äthylester
Benzylester
terL-Butylester
N-Hydroxy-5-norbornen-
2,3-dicarboximidester
Pentachlofphehylestef
Isobornyloxycarbonyl
p-Nitrophenylester
N-Hydroxy-5-norbornen-
23-dicarboximid
N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid
Dimethylformamid
Tetrahydrofuran
Für die Dünnschichtchromatographie wurden die folgenden Entwicklerlösungsmittelgemische verwendet:
Rf 1 — Chloroform-Methanol-Eisessig(9 :1 :0,5)
Rf 2 — Äthylacelat-Pyridin-Essigsäure- Wasser
(60:20:6:11)
Rf 3 — n-Biitanol-Äthylacetat-Essigsäure-Wasscr
(1:1:1:1)
Rf 4 — n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 :1 :1)
Rf 5 — n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(30 :20 :6 :24)
Das N-Hydroxy-5-norbornen-2r3-dicarboximid kann nach den Angaben in J. Org. Chem. 24, 1959, 1293—6 hergestellt werden.
Beispiel 1
Z-(Pyr)Glu-ONBI
In 200 ml Tetrahydrofuran und 200 ml Dioxan werden 24 g (9OmM) Z-(Pyr)GIu-OH gelöst. Während mit Eis gekühlt wird werden 17,8 g HONBI und 21 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltrierL Das Filtrat wird unier vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei Kristalle zurückbleiben. Diese Kristalle werden aus Athylacetat-Erdölbenzin umkristallisiert, wobei 36 g (94%) Nadeln vom Schmelzpunkt 143,5° bis 144°C erhalten werden, [α] ? = -41S°C (c=02, Äthanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C22H20O7N?(424.40):
C 6Z26. H 4,75. N 6.60.
gefunden:
C 6Z47. H 4.73. N 6.55.
Beispiel 2
Z-GIu(OtBu)-ONBI
Zu einer Lösung von 16,82 g (50 mMol) Z-GIu(OtBu)-OH und 9.76 g (55 mMol) HONBI in 200 ml Dioxan werden 1135 g (55 mMol) DCC gegeben, während mit Eis gekühlt wird. Das Gemisch wird vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf der gebildete Diicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampfL Das erhaltene Öl wird mit Petroläther verrieben, wobei
Krislalte gebildet werden, die abfillriert und aus Äthylacetat-Petroläther umkrislallisiert werden, wobei feine Nadeln erhalten werden, Ausbeute 20,4 g (82%). Schmelzpunkt 120° bis 121°C[a] ?= -32,0° (c = 0,96 in Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C26H30O8N2:
C 62,64. H 6,07, N 5,62<
gefunden:
C 62,81, H 6,05, N 5,78.
Beispiel 3
Z-(Pyr)Glu-Glu(OBzl)-OH
In einem Gemisch von 50 ml Dioxan und 40 ml Wasser werden 2,6 g (1,1 mMol) H-GIu(OBzI)-OH suspendiert. Unter Zugabe von 1J5 ml Triethylamin wird die Suspension erhitzt, wobei eine Lösung gebildet wird. Die Lösung wird mit Eiswasser schnell gekühlt und mit 3,4 g (8 mMol) Kristallen von Z-(Pyr)Glu-ONBI gemäß Beispiel 1 versetzt. Das Gemisch wird fünf Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Dioxan wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Zum Rückstand werden 15 ml N-Salzsäure gegeben, worauf zweimal mit je 20 ml Äthylacetat extrahiert wird. Die Äthylacetatschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampfL Die als Rückstand verbleibenden Kristalle werden mit Petroläther behandelt, abfiltriert und getrocknet, wobei 3,6 g (92,8%) Nadeln vom Schmelzpunkt 127° bis 128°C
erhalten werden, [a] S = -17,9°<t = 1,02, Äthanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C25H26O8N2 (482.47):
C 62.23. H 5,43, N 5.81.
gefunden:
C 62.21, H 5.40, N 5,81.
Beispiel 4
Z-AIa-NH2
(Ausgangsprodukt für Beispiel 5)
In 30 ml Äthylacetat und 40 ml Tetrahydrofuran werden 43 g (20 mMol) Z-AIa-OH und 3.6 g HONBI gelösL Während mit Eis gekühlt wird, werden 43 g DCC zugesetzL Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 30 Minuten bei Raumtempertur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Zum Ritrat werden 20 ml konzentriertes wäßriges Ammoniak gegeben. Das Gemisch wird drei Stunden gerührt, während mit Eis gekühlt wird. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampfL und der Rückstand wird durch Zusatz von 150 ml Äthylacetat gelösL Die Losing wird zweimal mit je 100 ml Äthylacetat gelösL Die Lösung wird zweimal mit je 100 ml IN-Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampfL Der hierbei erhaltene kristalline Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristalfisiert, wobei 3,6 g (81%) Nadeln vom Schmelzpunkt 128° bis 129" C erhalten werden.
Elementaranalyse:
Berechnet für Ci ι ΗI4O3N2 (222,24):
C59,45, II 635, N 12,60,
gefunden:
C 59,69. H 6,25, N 12,50.
Beispiel 5
Z-AIa-GIy-OBzI
In 40 ml Äthylacetat und 30 ml Tetrahydrofuran werden 4,5 g (20 mMol) Z-AIa-OH und 3,6 g HONBI gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Der ölige Rückstand wird in einem 1 : 1-Gemisch von Äthylacelat und Petrolälher gelöst. Der unlösliche Harnstoff wird abfiltriert.
Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 40 ml Dioxan gelöst. Zur Lösung werden 6,8 g (20 mMol) H-Gly-OBzl-p-Toluolsulfonat und 3,0 ml Triäthyiamin gegeben. Das Gemisch wird vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und IN-Salzsäure gewaschen. Nach dem Waschen mit Wasser wird über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der kristalline Rückstand wird aus Äthylacetat-Erdölbenzin umkristallisiert, wobei 6,62 g (92.0%) Nadeln vom Schmelzpunkt 109° bis 110"C(Literalurwert 11 ΓC) erhalten werden.
Elemenlaranalyse:
Berechnet KJrC20H22O5Nr
C 64,85. H 5.99. N 7.56.
gefunden:
C 64.79. H 5.93. N 7.61.
Beispiel 6
Z-VaI-VaI-OBzI
In 30 ml Äthylacetat und 30 ml Tetrahydrofuran werden 5.0 g (20 MoI) Z-VaI-OH und 3.6 g HONBI gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 00C und dann eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abnitriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Der Rückstand wird in 40 ml Tetrahydrofuran gelöst Während mit Eis gekühlt wird, werden 7,6 g (20 mMol) H-Val-OBzi-p-ToluolsuIfonat und 25 ml Triäthyiamin zur Lösung gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Nach dieser Zeit wird es unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit einer 4°/oigen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und IN-Salzsäure gewaschen. Nach einer Wäsche mit Wasser wird die Lösung über Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Zum öligen Rückstand wird Petroläther gegeben, worauf das Gemisch gekühlt wird, wobei sich Kristalle abscheiden. Durch Umkristallisalion aus Äthylacetat-Petroläther werden 8,10 g (92%) Nadeln vom Schmelzpunkt 114° * bis 1!6CC (Literaturwert 116°G) erhallen, [a] 'O= -44,2° (c=2,06, Methanol) (Literaturwert: -443°)
Elementaranalyse:
ίο Berechnet für C25H32O5N2:
C 68,16, H 732,
gefunden:
C 67.76, H 7,08,
N 636,
N 6,47.
Beispiel 7
Z-Gly-Phe-Gly-OEt
(Anderson-Young-Test)
a) Herstellung der Ausgangsverbindung
Z-Gly-Phe-OH
In 100 ml Tetrahydrofuran werden 8,4 g (40 mMol) Z-GIy-OH und 7,2 g HONBI gelöst. Zur Lösung werden 9 g DCC gegeben, während mit Eis gekühlt wird. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0°C und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck zur Trockene
jo eingedampft. Inzwischen werden 7,4 g (45 mMol) H-Phe-OH in 80 ml Dimethylformamid, das 40% Wasser enthält, gelöst. Zur Lösung werden 3,7 g Natriumhydrogencarbonat gegeben. Anschließend wird dieser Lösung das in der vorstehdnd beschriebenen
J5 Weise hergestellte Z-GIy-ONBl zugesetzt. Das Gemisch wird eine Stunde unter Kühlung mit Eis und vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zum erhaltenen Reaktionsgemisch werden 150 ml Äthylacetat und 50 ml iN-Salzsäure gegeben, worauf mit 100 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen wird. Die wäßrige Schicht wird zweimal mit je 80 r-.r Äthylacetat evrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit lOO rr' IN-Salzsaure gewaschen und nach einer Wäsche mit Wasser über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die dehydratisierte Flüssigkeit wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei ein kristalliner Rückstand erhalten wird. Die Kristalle werden mit Erdölbenzin behandelt und aus Äthylacetat-Erdölbenzin umkristallisiert. Hierbei werden 14,2 g (100%) Nadeln vom Schmelzpunkt 125° bis 126°C (Literaturwert 126"C)erhalten.[<x] £= +35.2°,(c = 1.7 in Äthanol) (Literaturwert: [<x] 'o° = +335°. c = 4.7, in Äthanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für CoH20O5N2 (35637):
C 64.03. H 5.66. N 7.86.
gefunden:
C 64.01. H 5.72, N 750.
b) Racemisierungstest
In 10 ml Dimethylformamid werden 1,78 g (5 mMol) Z-GIy-Phe-OH und 700 mg (5 mMol) H-Gly-OEt-hydrochlorid gelöst Nach Zusatz von 0,64 ml N-Äthylmorpholin wird die Lösung auf —2° C gekühlt Zur Lösung
werden 1.1 g (1,2 Äquivalente) HONBI und 1.1 g DCC
gegeben. Das erhaltene Gemisch wird I Std. bei -20C und dann 1 Stunde bei 5°C und schließlich 6 Stunden bei 20°C gerührt. Nach Zusatz von 100 ml Äthylacetat wird das Reaktionsgemisch mit einer 4%igen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und IN-SaIzsäure gewaschen. Es wird weiter mit Wasser gewaschen, dehydralisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Petroläther behandelt und isoliert. Ausbeute 2,20 g (100%). Schmelzpunkt: 113° bis 1150C [α] '„'= -12,2° (c= 2,0, Äthanol).
1,0 g dieses Produkts wird in 50 ml Äthanol gelöst, während erhitzt wird. Dann wird eine geringe Menge an Impfkristallen von Z-Gly-DL-Phe-Gly-OEt zugesetzt. Das Gemisch wird eine Woche bei 20C stehen gelassen, is jedoch wird keine Abscheidung von DL-Tryptophan festgestellt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf 20 ml eingeengt und dann bei 2°C stehen gelassen, wobei sich Nadeln abscheiden.
Diese Kristalle werden abfiltriert. Die Ausbeute beträgt 650 mg. Schmelzpunkt 116° bis 118°C. [α] '/ = - 12,5° (c = 2,0, Äthanol). Es handelt sich offensichtlich ym eine optisch reine L-Verbindung. Das Filtrat wird ebenfalls unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird Äther gegeben. Die hierbei gebildeten Kristalle werden abfiltriert.
Ausbeute 170 mg. Schmelzpunkt 116° bis 118° C. [α] <D' = -12,3° (c = 2,0, Äthanol. Dieses Produkt besteht ebenfalls aus der L-Verbindung. Gesamtausbeute: 82%.
Hieraus kann der Schluß gezogen werden, daß JO keinerlei Racemisierung beim Verfahren gemäß der Erfindung stattfindet.
Wenn die vorstehend beschriebene Reaktion in der gleichen Weise, jedoch ohne HONBI durchgeführt wird, wird Z-Gly-DL-Phe-Gly-OEt in einer Ausbeute von 7,05% entsprechend einer Reaktionsausbeute von 86% erhalten.
Ebenso wird bei Verwendung von 20 ml Tetrahydrofuran als Reaktionslösungsmittel nicht das DL-Peptid bei Verwendung von HONBI gebildet, während ohne -to HONBI 5.05% des DL-Peptids gebildet werden.
Beispiel 8
Racemisierungstest durch Synthese von
Z-Phe-IIe-Gly-OBzl 4d
a) Synthese der Ausgangsverbindung Z-Phe-lle-OH
In 40 mi Tetrahydrofuran und 20 ml Äthylacetat werden 6,0 g (20 mMol) Z-Phe-OH und 3.6 g HONBI gelöst Zur Lösung werden 4.4 g DCC gegeben, während mit Eis gekühlt wird. Das Gemisch wird dann 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Hltrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Der Rückstand wird in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und gekühlt Getrennt hiervon werden Z88g (22 mMol) H-Iie-OH in einem Gemisch von 30 ml Dimethylformamid und 22 ml einer wäßrigen lN-Natriumhydroxydlösung gelöst Während mit Eis gekühlt wird, wird die zuerst hergestellte Lösung von Z-Phe-ONBI zugesetzt Das gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 30 ml lN-Salzsäure und 60 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung zugesetzt werden. Das Gemisch wird dann dreimal je 100 ml Äthylacetat extrahiert Die Athylacetatschicht wird zweimal mit Wasser gewäsehen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedämmt. Der kristalline Rückstand wird mit Petroläther behandelt und aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisierV, wobei 7,80 g (94%) Nadeln vom Schmelzpunkt 152—154°C erhalten werden* [<x] 5 = -l,6°(t= 1,06 Äthanol)
Elementaranalyse:
Berechnet für C23H24O5N2 (412,47):
C 66,97, H 6,84,
gefunden:
C 66,95. H 6,89,
N 6,79,
N 6,79.
b) Synthese von Z-Phe-lle-Gly-OBzl
(Racemisierungstest)
In 20 ml Dimethylformamid werden 1,03 g(2,5 mMol) Z-Phe-Ile-OH und 840 mg (2,5 mMol) H-Gly-OBzl-p-toiuolsulfonat gelöst. Zur Lösung werden 0,32 ml (2,5 mMol) N-Äthylmorpholin und 540 mg (1,2 Äquivalente) HONBI gegeben. Während mit Eis gekühlt wird, werden 600 mg DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden unter Kühlung mit Eis und dann 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 100 ml Wasser zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit je 80 ml Äthylacetat extrahiert. Die Athylacetatschicht wird mit einer 4%ig;n wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und 1N-Salzsäure gewaschen. Nach einer Wäsche mit Wasser wird das Produkt dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Erdölbenzin behandelt und abfiltriert. Ausbeute 1,52 g (100%). Dieses Produkt wird zur Analyse auf Aminosäuren 20 Stunden mit 5,7N-HCl bei 110°C hydrolysiert.
0,96 Phe, 0,98 He, 0,0048 allo-Ile, 1,00 GIy.
Die während dieser Reaktion gebildete D-Verbindung macht nicht mehr als 0.7% aus.
Die vorstehend beschriebene Reaktion wird unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne HONBI wiederholt. Ausbeute 1.28 g (84%). Aminosäure-Analyse: 0.93 Phe, 0.62 He. 0.34 allo-Ile. 1.00 GIy. Der Anteil der in diesem Fall gebildeten D-Verbindung beträgt bis zu 30%.
Beispiel 9
Z-GIn-AIa-OBzI
In einem Gemisch von 30 ml Dioxan und 40 ml DMF werden 5,6 g (20 mMol) Z-GIn-OH und 7,05 g (20 mMol) H-Ala-OBzI-p-toluoIsulfonat gelöst. Nach Zusatz von 2,8 ml Triethylamin wird die Lösung mit Eis gekühlt. Dann werden 4 g HONBI und 4,2 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunden unter Kühlung mit Eis und dann 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Dioxan wird abdestilliert Zum Rückstand werden 15OmI Wasser gegeben, wobei sich sofort Kristalle abscheiden. Diese Kristalle werden abfiltriert und aus Äthanol umkristallisiert Hierbei werden 8,0 g (90,5%) Nadeln vom Schmelzpunkt 188°-189° C erhalten.
Etementaranalyse:
Berechnet HUrC2SH27O6Nr-
C 62,75, H 6,! 6, N 9,52,
gefunden:
C 6Z72, H 6,20, N 938.
Beispiel 10
Z-Asn-Gly-OEt
In 40 ml Dimethylformamid werden 2,7 g (10 mMol) Z-Asn-OH und 1,4 g (10 mMol) H-Gly-OEt-hydrochlo-Hd gelöst. Zur Lösung werden 1,4 ml Triäth/lamin und 2g HONBI gegeben, während mit Eis gekühlt wird. Anschließend werden 21 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird I Stunde unter Kühlung mit Eis und dann Über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird dbfiltriert Nach Zugabe von kaltem Wasser in ungefähr der doppelten Menge des Dimethylformamids wird das Gemisch in einem Kühlschrank stehen gelassen. Die hierbei gebildeten Kristalle werden abfiltriert und aus Ä.thanol uinkristallisiert. Hierbei werden 3,26 g (92%) .Nadeln vom Schmelzpunkt 184 — 185°C (Literaturwert ' i84°C)erhalten.
Elementaranalyse:
Berechnet für Ci6H2]O6N3:
C 54,69. H 6.02, N 11,96,
gefunden:
C 54,63. H 6.11, N 12,04
Beispiel 11
H-(Pyr)Glu-GIu-Ala-NH2
In 60 ml Methanol werden 1,11g (5 mMol) Z-AIa-NH2 gelöst. Die Lösung wird 3 Stunden der Hydrierung unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der hierbei erhaltene Rückstand und das gemäß Beispiel 2 hergestellte Z-(Pyr)-Glu-Glu(OBzl)-OH (2.41 g oder 5 mMol) werden in 30 ml Tetrahydrofuran und 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt. Dieser Lösung werden 1 g HONBI und 1,1 g DCC zugesetzt. Qas Gemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Tetrahydrofuran abdestilliert wird. Der Harnstoff wird abfiltriert, worauf 50 ml Äther und 40 ml Äthylacetat zum Filtrat gegeben werden. Hierbei scheiden sich Kristalle ab. Diese Kristalle werden abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert. Als Produkt werden 2,41 g (87%) Z-(Pyr)Glu-Glu(OBzl)-Ala-NH2 vom Schmelzpunkt 212° bis 214°C erhalten [«'] £ = -27,9° (c = 1,05, Eisessig)
Elementaranalyse:
Berechnet für C28H32O8N4 (552,57):
C 60,86, H 5,8^, N 10,14,
gefunden:
C 60,78. H 5,67, N 10,16.
2 g des vorstehend genannten Produkts Z-(Pyr)Glu-GIu-(OBzI)-AIa-NH2 werden in 40 ml Eisessig gelöst Die Lösung wird 5 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei sich Nadeln abscheiden. Nach Zusatz von Methanol werden die Kristalle abfiltriert und mit kaltem Methanol gewaschen. Ausbeute 1,05 g.
Elementaranalyse:
Berechnet für Ci3H20O6N4:
C 47,55, H 6,14, N 17.07,
gefunden:
' C 47,17, H 6,11, N 17,00.
Bei der Papierchromatographie zeigt dieses Produkt bei Rf 5 = 0,37 einen einzelnen Fleck, der positive ίο Peptidreaktionen ergibt.
Beispiel 12
Z-(Pyr)Glu-His-OH
In einem Gemisch von 50 ml Dioxan, 40 ml Wasser und 20 ml Dimethylformamid werden 3,6 g (24 mMol) H-His-OH-hydrochlorid und 2,5 g (24 mMol) wasserfreies Natriumcarbonat gelöst, während erhitzt wird. Die Lösung wird schnell gekühlt, worauf 8,49 g (20 mMol) Z-(Pyr)Glu-ONBI zugesetzt werden. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Dixoan unter vermindertem Druck abdestilliert wird. Dann werden genau 24 ml 1 N-Salzsäure zum Rückstand
gegeben, worauf zweimal mit Älhylacetat gewaschen wird. Die wäßrige Schicht wird unter vermindertem Dmck auf etwa 20 ml eingeengt. Der Rückstand wird über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die hierbei abgeschiedenen stäbchenförmigen Kristalle werden abfiltriert und mit kaltem Wasser gewaschen. Ausbeule 6,9 g (86%). Die Kristalle werden aus Wasser, das eine geringe Methanolmenge enthält, umkristallisiert. Ausbeute 6.67 g (78%). Schmelzpunkt 146-147°C (Zers.). [α] i'= 6.4° (c = 1.12, Methanol)
Elementaranalyse:
Berechnet für CiCiH2OObN4 · 1.5 H2O:
C 53.42. H 5,42. N 13.11,
gefunden:
C 53.50, H 5.23. N 13,02.
Beispiel 13
(Pyr)Glu-His-Pro-NH:(TRH)
In 30 ml Dimethylformamid werden 2,15 · (5 mMol) Z-(Pyr)Glu-His-OH, das in Beispiel Il beschrieben wurde, zusammen mit H-PrO-NH2 gelöst. (Zur Herstellung der letztgenannten Verbindung werden 1,25 g (5
so mMol) Z-PrO-NH2 in 50 ml Methanol unter Verwendung von Palladiumschwarz katalytisch reduziert. Nach Entfernung des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.) Nach Zugabe von 1 g HONBI wird das Gemisch auf 00C gekühlt, worauf 1,1g DCC zugesetzt werden.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei 00C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Dann wird das Dimethylformamid unter hohem Vakuum abdestilliert Der Rückstand wird mit 30 ml Äther verrieben, worauf der Äther entfernt wird. Der Rückstand wird in 20 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 60 g Kieselgel gefüllt ist Die Säule wird mit 300 ml 5% Methanol-Chloroform gewaschen und dann mit 20% Methanol-Chloroform eluiert Die mit 20% Methanol-Chloroform erhaltene Fraktion wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Der Rückstand
wird mit Äther behandelt und filtriert Hierbei werden 2,4 g (96%) Z-(Pyr)Glu-His-Pro-NH2 als weißes Pulver erhalten.
Bei der Dünnschichtchromatographie ergibt dieses Produkt einzelne Recken, die mit Pauli-Reagens positiv reagieren (bei Rf 3 = 0,43 und bei Rf = 0,10, entwickelt mit Chloroform-Methanol = 6:1).
Das oben genannte Produkt (2 g) wird in 40 ml Methanol gelöst Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfütriert und das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert Der Rückstand wird mit 30 ml Äthylacetat behandelt, durch Filtration isoliert und getrocknet
Hierbei werden 1,45 g (quantitativ) einer Probe von synthetischem TRH erhalten, das mit üiner authentischen Probe von TRH völlig übereinstimmt [α] ? = -42.0° (c = 1,0, Methanol) [α] f = -43,2° (c = 0,6, Essigsäure). Aminosäure-Analyse: 0,98 GIu, 1,00 His, 1,00 Pro. Papierchromatographie (n- Butanol- Essigsäure- iVidin Wasser - 30 .5 : 20 : 24): Rf = 0/iO.
Beispiel 14 Herstellung von ß-( 1 -24)Corcicotropin
In 20 ml Dimethylformamid werden 1,6 g (1 mMol) Z-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH-p-toIuoIsulfonat gelöst Während die Lösung mit Eis gekühlt wird, werden 270 mg HONBI und 240 mg DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zusatz von weiteren 240 mg DCC wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt
Dann werden 40 ml Äthylacetat und 80 ml Äther gekühlt und zum Reaktionsgemisch gegeben. Die hierbei gebildeten Kristalle werden abfütriert und mit 50 ml Äthylacetat gewaschen. Getrennt hiervon werden 2.28 g (ί mMol) BOC-L>s(Z)-Pro-Val-Glv-Lys(Z)-
Lys(Z)-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lvs(Z)-ValTyr-Pro-OH (hergestellt nach dem Verfahren, das in Chem. Pharm. Bull. 18. 1288 (1970) beschrieben wird) in 30 ml Trifluoressigsäure gelöst, während mit Eis gekühlt wird. Die Lösung wird 25 Minuten bei 10 C gerührt, wobei die Substituentengruppe BOC entfernt wird.
Nach Zusatz von Äther wird die gebildete Fällung aofiltnert und getrocknet. Das erhaltene PuI'h.t wird in 25 ml Dimethvlrormamid gelost Nach Zi|;:nbe von 0.28 ml N Äthvlmorphnlin wird die Lösung mit Eis gekühlt. Dieser Losung wird die erstgenannt? Fällung zugesetzt Das Gemisch v, ird 30 Minuten unter Kühlung mit Fis und dann 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dem Reaktionsgemisch werden 120 ml oxydfreier Äther zugesetzt Die gebildete Fällung wird abfi'tnert und nach der Trocknung erneut aus 10% Wdiser-Methanol ausgefällt, wobei 3.7 g rohes ge schnt/tes Tetracosapeptid erhalten werden. Dieses Produkt wird /ur Entfernung der Schutzgruppen in an sich bekannter Weise mit Fluorwasserstoff behandelt. Nach Entfernung des Fluorwasserstoffs durch Destillation wird das Produkt mit dem Ionenaustauscherhar/. lRA-400 (Acetatform) behandelt, wobei rohesß(\ —24)-Corticotropinacetat erhalten wird. Die Verbindung wird durch übliche Säulenchromatographie an Carboxymethylcellulose in einem Gradienten-Elutionssystem von Ammoniumacetatlösungen (von 0,01 bis 0,4 Mol) gereinigt. Nach Gefriertrocknung wird jS(l— 24)Corticotropin in einer Gesamtausbeute von 30 bis 40% erhalten. Der Ttter beträgt 95— 120 LE, bestimmt durch Ermittlung der Erniedrigung der Konzentration an adrenaler Ascorbinsäure, [a] !? = -84,0 ±2° (c = 0,5, 1% Essigsäure)
Bei der Papierelektrophorese und Papierchromatographie ergibt dieses Produkt jeweils einen einzelnen zusammenhängenden Fleck, der positive Reaktionen bei den Ehrlich-, Ninhydrin-, Pauli- und Sakaguchi-Tests zeigt Aminosäure-Analyse (24 Stunden in 5,7N-HCI bei 1050C hydrolysiert): His 1,00; Lys 4,08; Arg 3,10; GIu 1,02; Ser 1,89; GIy 2,00, Pro 2^5, VaI 3,00, Met 0,89, Tyr 157; Phe 1,00.
Beispiel 15
Mit LH-RH verwandte Verbindungen (I)
1) Z-(Pyr)Glu-His-Trp-OBzl
In 60 ml Dimethylformamid werden 4,27 g (10 mMol) Z-(Pyr)Glu-His-OH,4,66 g (10 mMol) H-Trp-OBzl-p-toiuolsulfonat und 138 rn! N-Äthylmorphoün gelöst Die Lösung wird auf 00C gekühlt, worauf 3 g HONBI und 3,1 g Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt werden. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyciohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Zum Rückstand wird Äther gegeben. Das hierbei gebildete Pulver wird abfütriert und mit
3d Äthylacetat gewaschen. Das Pulver wird in 20 ml 5% Methanol-Chloroform gelöst. Die Lösung wird durch eine Kieselgelsäule (500 ml) geleitet, die mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen worden ist. Die Säule wird mit 1.21 5% Methanol-Chloroform geweih sehen. Das Tripeptid wird mit Chloroform, das 15% Methanol enthält, eluiert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestüliert und der Rückstand mit Äther behandelt. Das Produkt wird abfütriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 5,82 g ■»ο (86%).
Elementaranalyse:
Berechnet fur C 17Hj6OrN1, 2 H2O:
C 62.35. H 5 6ο. Ν 11.79.
»■> gefunden:
C 62.54. H 5 8 J. N 11.43.
Gci der Dünnschichti hromatographie an Kieselgel
ergibt diests Produkt jeweils einen Flecken bei Rf 4 =
ί» 0.6Ί und bei Rf i - 0.79 Beide Flecken zeigen positive Ehrlich- und Pauli Reaktionen. Verunreinigungen sind nicht nachzuweisen.
2)H(Pyr)-Glu-His-TrpSer-Tyr-GlyOtBu
Vi In 50 ml Methanol werden 3.40 g (5 mMol) Z (Pyr)Glu-HisTrp -OB/I gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfütriert und das Methanol unter vermindertem Druck abge-
bo dampft. Getrennt hiervon werden 2.60 g (5 mMol) Z-Ser»Tyr'GI)'OtBu in 800 ml Methanol gelöst Die Lösung wird 3 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfütriert und das Filtral unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei Kristalle abgeschieden werden. Die beiden in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Materialien werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 1,1 g HONBI
230 208/126
gegeben, worauf mit Wasser gekühlt wird. Nach Zusatz von 1,30 g Dicyclohexylcarbodiimid zur Lösung wird das Gemisch 3 Stunden unter Kühlung mit Eis und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete DicyclohexylhamstofF wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird Äther gegeben. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, gut gewaschen und getrocknet Das erhaltene Pulver kann unmittelbar in die nächste Reaktion eingesetzt werden, oder man kann es durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Lösungsmittelsystem: Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser = 30 :20 :6 :10) reinigen, die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdampfen und den Rückstand mit Äther waschen, oder man kann das Pulver in Äthanol erhitzen, Äthylacetat zusetzen, das Gemisch kühlen und die gebildeten Kristalle abfiltrieren. Ausbeute 3,10 g (75%). Dünnschichtchromatographie: Rf 2 = 0,42. Aminosäure-Analyse: GIu 1,00; His 034; Ser 0,96; Tyr 1,01; GIy l,01;Trp(UV)l,03.
3)Z-Arg(NO3)-Pro-Gly-NH2
In 100 mlDimethylformamid werden 24,8 g Z-Arg(NO2)-Pro-OH gelöst. Während die Lösung bei 00C gehalten wird, werden 10,7 g HONBI und 12,3g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird gekühlt und mit 7,3 g H-Gly-NH2-Acetat und 7,7 ml Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt. Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf n-Butanol zugesetzt wird. Das Gemisch wird dann mit einer gesättigten wäßrigen Na'riumchloridlösung gewaschen. Die n-ButanoIschicht wird unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf Äther zugesetzt wird. Hierbei wird ein Pulver erhalten. Durch erneute Ausfällung aus Äthanol-Äther werden 26,5 g (96°/o) der gewünschten Verbindung vom Schmelzpunkt 100—116 C erhalten. (Dieses feinteilige Produkt zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich.)
Elementaranalyse:
Berechnet für C21H jnO;NR:
C 49.79. H 5.97. N 22.12.
gefunden:
C 49.81. H b.12. N 21.75.
4) Z-Leu-Arg(NO2)-Pm-GIy-NH2
In 25 ml Eisessig, der 25% HBr enthält, werden 3,5 g (7 mMol) Z-Arg(NO2)-Pm-GIy-NH2 gelöst. Die Lösung wird 40 Minuten geschüttelt und dann mit 200 ml trockenem Älher versetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das hierbei erhaltene Pulver wird in einem Gemisch von 20 ml Dimethylformamid und 20 ml Dioxan gelöst, worauf 1,4 mITriälhylamin zugesetzt werden.
Getrennt hiervon werden 2.12 g (8 mMol) Z-Leu-OH und 1.6 g HONBI in einem Gemisch von 20 ml Äthylacetat und 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Während mit Eis gekühlt Wird, werden 1,7 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff abfiltriert Wird, Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand in IO ml Dioxan gelöst Diese Lösung wird zu der oben beschriebenen Lösung der Aminkomponente gegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt Das Reaktionsgemisch wird dann zur Entfernung des Dioxans unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Wasser zugesetzt wird. Das Gemisch wird zweimal mit Äthylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wird dreimal mit je 100 ml n-Butanoi extrahiert Die n-ButanoIschicht wird mit Wasser gewaschen, unter vermindertem Druck zur
Trockene eingeengt mit Äther gewaschen und filtriert Ausbeute 3,8 g. Schmelzpunkt 135° bis 1.53°C (Zers, kein scharfer Schmelzpunkt).
Elementaranalyse:
Berechnet für C^H-itOeNg:
C 5233, H 6,66, N 20,34,
gefunden
C 52.41, H 6,83, N 1937.
Dünnschichtchromatographie: Das Produkt ergibt je einen einzelnen Flecken von Rf 1 =0,16 und Rf 2 = 0,66. Beide Flecken zeigen positive Peptidreaktionen.
5)Z-Lys(IBOC)-Pro-GIy-NH2
In 50 ml Acetonitril werden 11,8 g Z-Lys(IBOC)-OH-dicyclophexylaminsalz und 3,6 g H-Pro-OMe-hydrochlorid gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird IO Stunden gerührt worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand werden 150 ml Äthylacetat gegeben, wobei sich eine weitere geringe Menge einer Harnstoffverbindung
abscheidet. Die Fällung wird abiiltriert. Die Äthylacetatlösung wird mit einer 4%igen wäßrigen NaHCOj-Lösung und mit 0.1N-HC1 und dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels bleiben 9,8 g
eines öligen Rückstandes zurück. Dieses Öl wird in 40 ml Methanol gelöst. Zur Lösung werden 20 ml 1N-Natriumhydroxyd gegeben. Die Lösung wird zur Verse'fiing ι . Esters I Slunde gerührt und nach Neutralisation mit 22 ml I Nf)CI mit 100 ml Äthylacetat extrah'crt. mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Nairiumsulfat getrocknet Das Äthyla^etüt wird abdestilliert, wobei 5.9 g eines öligen Ruckst.indcs erhalten werden. Dieses Öl (5 g) wird in I > ml Dimethylformamid gelöst. Während mit Kis gekühlt wird, werden 1.35 ml Triäthylamin und 4.45 g Trichloressigsäurepentachlorphenylester zugesetzt Das Gemisch wird 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden 1.34g HGIyNH-acetat und 1.5ml Inathylamin dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann 8 Stunden gerührt wird. Die durch Zusatz von Äther gebildete Fällung wird abfiltriert und aus Äth.inol Äther erneut ausgefällt, ^isbeute i.5 g. Schmelzpunkt 90--91 C(Zers.).[x] '„'= 20.0 (C= O.S.Methanol.
b)/. Leu I.ys',1 BOC) Pro-Gly-NH,
In 50 ml Methanol werden 3,0g Z-Lys-()
GIy1NIb gelöst. Die Lösung wird der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen. Nach 4stündiger Hydrogenolyse wird der Katalysator abfiltrieft und das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 2,8 g Z'LeuOPCP gegeben. Das
Gemisch wird 8 Stunden gerührt, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und Äther zugesetzt wird. Das hierbei gebildete Pulver wird abnitriert, mit Äther gewaschen und aus Äthanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute 3,0 g (82,6%). Schmelzpunkt 124° bis 125° C (Zers.). [α] ?= -44,2° (c = 0,5, Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C38H58O8N6:
C 62,78, H 8,04, N 11,56,
gefunden:
C 62,64, H 8,20, N 11,39.
7) BOC-LeU-Om(Z)-PrO-GIy-NH2
In 5OmI Dioxan werden 6,5 g IBOC-Om(Z)-OH gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 1,8 g N-Hydroxysuccinimid und 3,1 g DCC zugesetzt. Das ;>o Gemisch wird 6 Stu.iden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfihriert. Dem Filtrat werden 2,5 g H-Pro-OMe-hydrochlorid zugesetzt Nach Zusatz von 2,2 ml Triethylamin wird das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wird.
Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst, mit 4%igem Natriumhydrogencarbonat und 0,1N-HCI und dann mit Wasser gewaschen und schließlich über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Das nach Entferr 1Hg des Äthylacetats erhaltene Öl (7,0 g) wird in 20 ml Methanol gelöst und, während mit Eis gekühlt wird, durch Zusatz von 12.3 ml IN-Natriumhydroxyd verseift. Das Gemisch wird fiO Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann m.c lN-Salzsäure neutralisiert Es wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird dehydratisiert und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2 g eines Öls erhalten werden. Dieses Öl (1.5 g) wird in IO ml Trifluoressigsäure gelöst und 30 Minuten deisobornvloxycarbonylicrt. Dem Reaklionsgemisch wird Äther zugesei/i. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das erhaltene Pulver wird in 10 ml 4") Dimethylformamid gelöst. Während auf 0°C gekühlt wird, werden 0.6 ml Triethylamin und dann 1.04 g BOC-Leu-OPCP /ugeset/t. Das Gemisch wird IO Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck entfernt und ;o der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit 0.1 N-HCI und Wasser gewaschen, getrocknet und /ur F.ntfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck destilliert. Der erhaltene ölige Rückstand wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Während mit 5j Eis gekühlt wird, werden 368 mg HC)NBI. 420 mg DCC und 290 mg H-Gly-NHj-hydrobromid /ugeset/t. Nach Zusal/ von 0.26 ml N Äthylmorpholin wird das Gemisch 8 Stunden gerührt. Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in Äthylacelat gelöst. Die Lösung wird mit 0.1 N Salzsäure und 4%igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Nach einer Wäsche mit Wasser wird die Lösung dehydratisiert und unter Vermindertem Drück zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Erdölbenziri behandelt und filtriert, wobei ein Pulver erhalten wird, Ausbeute 740 mg (62%). Schmelzpunkt 93°-95°α(ΖεΓ5,).|>] »'= -33,0° (c= 0,5,Methanol).
8)H-(Pyr)Glu-Hiti-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pm-GIy-NH3
In 50 ml Eisessig werden 1,86 g (3 mMol) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 gelöst Die Lösung wird 20 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Dem Reaktionsgemisch werden 7 ml lN-HCl-Eisessig zugesetzt, worauf es unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft wird. Der Rückstand wird über Natriumhydroxyd gut getrocknet Getrennt hiervon werden 2,50 g (3 mMol) H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu in 20 ml Trifluoressigsäure (die 0,1 ml Mercaptoäthanol und 3 ml lN-HCl-Eisessig enthält) gelöst Die Lösung wird 50 Minuten bei Raumtemperatur unter strömendem Stickstoff stehen gelassen.
Bei gesenkter Temperatur wird die Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck abdestilliert. Dem Rückstand wird Äther zugesetzt Die erhaltene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und über Nat. iumhydroxyd getrocknet Die in der beschriebenen Weise hergestellten beiden trockenen Pulver werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst Zur Lösung werden 0,75 ml N-Äthylmorpho!in und 600 mg HONBI gegeben. Dann werden bei 5°C 700 mg DCC zugesetzt Das Gemisch wird 2 Stunden bei 5° C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abnitriert und das Dimethylformamid tnte/ vermindertem Druck abdestilliert, worauf 50 ml Äther zugesetzt werden. Das hierbei gebildete Pulver wird abfiltriert und in 0,05moralem wäßrigem Ammoniumacetat gelöst Die Lösung wird durch eine Säule des Ionenaustauscherharzes Amberiite XAD-II (62 —74 μ) geleitet Die Säule wird in einem Gradienten-EIutionssystem aus einer wäßrigen 0,05molaren Ammoniumacetatlösung und 80% Äthanol eluiert. Das gewünschte· LH-RH erscheint in der Nähe einer Äthanolkonzentration von 50%. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Drurk eingeengt. Nach Entfernung des Äthanols wird der Rückstand gefriergetrocknet, wobei 2»"1 e einer chromatographisch homogenen Probe des Hormons als reinweißes Pulver erhalten werden. [*j £ = —43" bis 49° (c = 0.5. l%ige Essigsäure: je nach dem Trocknungsgrad etwas veränderlich). Papierchromatographie (Toyo Roshi Nr. 50) : Rf 5 = 0.70 bis 0.72.
Papierelektrophorese (Toyo Roshi Nr. 50): pH 6.5. Pyridinessigsäure. 500 V. 3 Stunden: Pf (Arg) = 0.58 bis 0.60. Das Produkt ergibt einen einzelnen Flecken, der bei den Ehrlich-, Sakaguchi- und Pauli-Tests positiv reagiert.
Aminosäure-Analyse: His 0.98: Arg 0.97; GIu 1.00. Ser 0.96; Pro 1.08; GIy 2.00; Leu 1.03; Tyr 1.02; Trp (durch UV) 1.08.
Wenn dieses Produkt Ratten subkutan injiziert wird wird Ovulation bei einer Dosis von 40 ng/100 g Körpergewicht ausgelöst. Bei intravenöser Injektion tritt die Ovulation bei einer Dosis von 20 μg ein.
In 2 I destilliertem Wasser für Injektionen werden 100 mg dieses Produkts und 200 g Mannit gelöst Die Lösung wird durch ein bakterienfreies Membranfilter filtriert, in 1-ml-Ampullen gefüllt und gefriergetrocknet. Hierbei wird ein Präparat erhalten, das 50 ng LH-RH pro Ampulle enthält
9)H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr'Gly*LeU'Lys'
PfO^GIy-NH2
in 20 ml Methanol Werden 500 mgZ'Leu-Lys(iBÖC)8-PrO-GIy-NH2 gelöst. Die Lösung wird der katalytischen
Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol abdestilliert. Dem Rückstand wird Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, wobei 400 mg H-LeU-LyS-(IBOC)-PrO-GIy-NH3 erhalten werden. Dieses Pulver (188 mg) wird in 300 ml Dimethylformamid gelöst. Während bei 00C gehalten wird, werden 240 mg H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-GIy-OH-HCi, 0,084 ml Triäthylamin 80,6 mg DCC und 70,2 mg HONBI zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei 00C und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Dem Filtrat wird Äthylacetat zugesetzt. Die hierbei gebildete Fäüung wird abfiltriert. Ausbeute 270 mg. Bei der Dünnschichtchromatographie zur Identifizierung dieses Produkts ergeben sich Anzeichen von Verunreinigungen. Das Produkt wird durch Chromatographie an einer Säule des Ionenaustauscherharzes Amberlite XAD-II (2,4 χ 19 cm) in einem Gradienten-EIutionssystem von 0,05 molarem Ammoniumacetat und 5 bis 7O°/oigem Äthanol gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zu- Entfernung des Äthanols unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei werden 147 mg reines Produkt erhalten.
Dieses Produkt (100 rng) wird mit 3 ml Trifluoressigsäure. die 0,1 ml Anisol enthält, gerührt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule des lonenaustauscherharzes IRA-400 (Acetatform) geleitet, wobei das entsprechend!; Acetat erhalten wird, das dann gefriergetrocknet wird. Ausbeute 88 mg.[λ] Ό = - 55,4° (c = 0,5, 5% Essigsäure). Papierchromacographie: Rf 5 ■= 0.51. Aminosäure-Analyse: Lys 0,96; His 1.04; Ser 0.85; GIu 1.00; Pro 1.00: GIy 2.00: Leu 1,00; Tyr 1,04; Trp(UV)0.98.
10)H-(Pyr)Glu-His Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Orn-PrC-GIy-NH2
In 5 ml 50% Trifluoressigsäure-Dichlormethan werden 380 mg BOC-LeU-Om(Z)-PrO-GIy-NH2 gelöst. Die Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Dem Rückstand wird 1 ml 3N-HCI-Eisessig zugesetzt. Das Gemisch wird mit Äther behandelt und das gebildete Pulver abfiltriert. Hierbei werden 280 mg H-Leu-Orn(Z)-Pro-Gly-HCI erhalten.
Dieses Produkt (170 mg) wird in 3 ml Dimethylformamid gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 240 mg H-(Pyr)-Glu-His-TrpSer-Tyr-Gly-OH-Ha. 0.084 ml Triäthylamin und 64.4 mg HONBI zugesetzt. Nach Zusatz von 74.2 mg DC C wird das Gemisch 2 Stunden bei OT und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexvlharnstoff wird abfiltriert. Dem FiItMi werden 20 ml Äthylacetat zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und getrocknet Ausbeute 2^0 mg. F.in Teil von 280 mg dieses Produkts wird an einer Säule (2,4 Κ 19 cm) Ambcrlue XAD-II adsorbiert und in einem Gradienten-EIutionssystem von 5%igem Äthanol und 7Ö%igem Äthanol desorbiert,
Die [Orn(Z)]8-LH-RH-Frakliohen werden vereinigt und zur Entfernung des Äthanols unter vermindertem Drück deslilütTt und anschließend gefriergetrocknet. Hierbei werden 170 mg einer reinen Probe erhalten. Hiervon werden 15(/ mg in 20 nil Methanol gelöst. Nach Zugabe von 1 ml Essigsäure wird die Lösung der katalytischen Hydrierung mit Palladiumschwarz unterworfen. Nach 6slündiger Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute 120 mg. [Λ] *· = -61,0° (c = 0,5,5% Essigsäure).Papierchroma tographie: Rf 5 = 0,51. Aminosäure-Analyse: His 1,09; Orn 1,05; Ser 0,93; GIu 0,93; Pro 0,93; GIy 1,90; Leu 1,01; ίο Tyr0,93;Trp (UV) 0,97.
Beispiel 16
Mit LH-RH verwandte Verbindungen (II)
1) IBOC-GIy-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2
In 5 ml Dimethylformamid werden 1,8 g IBOC-GIy-OH und 1,76 g p-Nitrophenol gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 1.6 g DCC zugesetzt Das
jo Gemisen wird über Nacht gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylhar.i ioff wird abfiltriert, wobei eine Lösung von IBOC-Gly-O.JP erhalten wird. Getrennt hiervon werden 1,8 g Z-Arg(NO2)-Pro-GIy-NH2 auf die vorstehend beschriebene Weise
Ji behandelt, um ein Z-freies pulverförmiges Produkt zu bild .-.ι, das dann in 5 ml Dimethylformamid gelöst wird. Während mit Eis gekühlt wird, werden 0,6 ml Triäthylamin und dann das vorstehend genannte IBOC-GIy-ONP zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht
«ι gerührt. Dem Reaktionsgemisch wird Äther zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und erneut aus Äthylacetat-Äther ausgefällt. Ausbeute 1,8 g (82%). Scnmelzpunkt 129° bis 131°C(Zers.). Rf 1 = 0.6.
r> Elementaranalyse:
Berechnet für C26H4JO8N9 HjO:
C 49,73. H 7.22, N 20.09.
gefunden:
C" 49.93, H 7.13. N 19.34.
2)/PheArg(NO..) Pm-GIy-NH2
Auf die in Beispiel 15 (t>) beschr.ebcne Weise werden 4» 0.50g (1 mMol) Z-Arg(NO2)-Pro-Gly NH2 behandelt, wobei pulverförmiges H-Arg-(NO2J-Pro GIy-NH2 ■ HBr erhalten wird. Dieses Produkt wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden OJO g (1 mMol) Z-Phe-OH und 0.18 g (\ mMol) HONBI gegeben. v> Dann werden 0.15 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wird auf 0"C gekühlt und mit 0,22 g DCC versetzt. Das Gemisch wild 8 Stunden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und d*s Dimethylformamid unter vermindertem Druck j"> abdestilliert. Zum Rückstand werden Äthylacetat und Äther gegeben worauf die gebildete Füllung abfiltriert wird. Ausbeute 0.50 g (90%). Dieses Produkt zeigt ei".en einzelnen Fleck, der positive Peptidreaktionen bei RfI = 0.20 zeigt.
w> 3)Z-Ala-Arg(NO>) Pro-Gly NH2
Z-Arg(N H2)^PrO-GIy-N H2 wird auf die in Beispiel 15 (6) beschriebene Weise behandelt, wobei H-ATg-(NO2)-Pro-Gly-NH2 erhalten wird, das mit Z-AIa-OH nach dem N-Hydroxysuccinimidverfahreii kondensiert wird. Das ReaktionsgeSnisch wird mit Äther behandelt und die hierbei gebildete Fällung aus Chloroform-Älhylacetat erneut ausgefällt. Hierbei wird Z-AIa-Arg(NO2)-Pro-
GIy-NH2 (84,8%) erhalten. Bei der Identifizierung durch Dünnschichlchromalographie zeigt dieses Produkt einen einzelnen Flecken, der positive Peptidreaktionen bei RfI = 0.10 zeigt.
4) IBOC-Val-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2
Z-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 (450 mg) wird mit 25% Bromwasserstoff-Eisessig 50 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Äther behandelt. Die hierbei gebildete Fällung, das Hydrobromidsalz von H-Arg(NOj)-Pro-Gly-NH2, wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 0,14 ml N-Äthylmorpholin gegeben. Dann wird das IBOC-VaI-ONBI (aus 320 mg IBOC-VaI-OH synthetisiert) zugesetzt, worauf das Gemisch 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt wird. Zum Reaktionsgemisch wird Äther gegeben. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und in Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit 4%igem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wird über Magnesiumsulfat dehydratisiert und Unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Ausbeute 330 mg (60%). RfI = 0.24.
5)Z-ILe-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2
Dieses Produkt wird in der vorstehend unter (1) beschriebenen Weise aus H-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2, das durch Behandlung von Z-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 mit Bromwasserstoff-Eisessig erhältlich ist, und Z-IIe-ONBI hergestellt. In der vorstehend beschriebenen Weise wird eine reine Probe des Tetrapeptidderivats erhalten (Ausbeute 77,0%). Dieses Produkt ergibt jeweils einen einzelnen Flecken bei RfI = 0.17 und Rf2 = 0.68.
6)H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Gly-Arg-PrO-GIy-NH2
H-(Pyr)Gly-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu (488 mg) wird zur Abspaltung des tert.-Butylesters in üblicher Weise mit 0.5 ml 5N-HCI und 10 ml Trifluoressigsäure. die Eisessig enthält, behandelt, wobei die freie Verbindung als trockenes Pulver erhalten wird. Getrennt hiervon werden 366 mg IBOC-Gly-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 in 2 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten gerührt und dann mit 0.1 ml 6.67N-HCI-Dioxan versetzt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt worauf Äther zugesetzt wird. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und getrocknet Dieses Pulver und das erstgenannte Pulver werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 0.17 ml Triäthytamin. 129 mg HONBI und 148.6 mg DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden gerührt. Der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert Dem Rückstand wird Äthylacetat zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltnert und aus Äthanol-Äthylacetat erneut ausgefällt Ausbeute 1,0 g. Dieses [GIy7. Arg(NO2)»]-LH-RH (150 mg) wird mit 0.1 ml Anisol und 0,05 ml Mercaptoäthanol benetzt und dann in 10 ml trockenem Fluorwasserstoff gelöst Die Lösung wird 60 Minuten gerührt und hierbei gekühlt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Rückstand über Natriumhydroxyd getrokcnet Der getrocknete Rückstand wird in Wasser gelöst und mit Äther extrahiert. Der Extrakt wird durch eine Säule des iorisnau£tauscherh3r7es Amberlite IRA^tOO (Acetatform) geleitet und dann an einer Säule von Amberlite XAD-I! Chromatographien.
Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingedampft und getrocknet. Hierbei werden 107 mg [GIy']-LH-RH erhallen. [«]»= -40,0 ±4"Yc= 1.0, 5% Essigsäure) Aminosäure-Analyse: Ser 0,91; GIu 0,87: Pro 0,93; GIy 3,00; Tyr 1.01; His 1.10: Arg 1.15;Trp(UV) 1,03.
Elementaranalyse:
BerechnetfürC5lHMOl2Nl7 · 3CHjCOOH · 8 H2O: C 48.92. H 6.63. N 17.02,
gefunden:
C 48.70. H 6.39. N 16.92.
7) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Arg-Pr0-GIy-NH2
Z-Phe-Arg(NOj)-PrO-GIy-NH2 wird der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz in üblicher Weise unterworfen, wodurch die Substituentengruppe L entfernt wird. Das erhaltene H-Phe-Arg-Pro-Gly-NH2 · HCI (92,1 mg) und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-GIy-OH-HCI werden in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 36 mg HONBI und 0,44 ml
10% N-Äthylmorpholin-Dimethylformamid zugesetzt. Dann werden bei 00C 41 mg DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei 00C und dann 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wird mit 15 ml Äifiylacetat behandelt Die hierbei gebildete
Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacelat gewaschen, getrocknet und in Wasser gelöst. Die unlöslichen Stoffe werden dufiltriert. Das Filtrat wird durch eine Säule (1,5 χ 22 cm) des lonenaustauscherharzes Amberlite XAD-Il geleitet. Das gewünschte Produkt wird in einem
Gradienten-Elutionssystem von 5%igem Äthanol bis 70%igem Äthanol desorbiert. Die [Phe7]-LH-RH-Fraktionen werden vereinigt. Das Äthanol wird abdestilliert. Durch Gefriertrocknung des Rückstandes werden 82 mg einer reinen Probe der gewünschten Verbindung
AO erhalten. Aminosäure-Analyse: His 0,93: Arg 0,93; Ser 0.97: GIu 1,00; Pro 1.03; GIy 2.00; Tyr 1,00; Phe 0.97; Trp(UV) 038.
8)H-(Pyr)-Glu-His-rrp-Ser-Tyr-Gly-Ala-Arg-Pro-Gly-NH2
Diese Verbindung wird aus Z-Ala-Arg(NO2)-Pro-GIy-NH2 und (Pyr)Glu-His-Trp-SerTyr-Gly-OtBu in ähnlicher Weise, wie vorstehend in Abschnitt (7) beschrieben, hergestellt Das Produkt wird durch Chromatographie an einer Säule von Carboxymethylcellulose (in einem Gradienten-Elutionssystem vv>ii 0,005 bis 0,1 MoI Ammoniumphosphatpuffer, pH 6,8] weiter gereinigt [cc] % = -48,2C (c = 0,35. 5% Essigsäure). Papierchromatographie: Rf5 = 0,55 Aminosäureanalyse: His 034: Arg 1,00; Ser 1.00: Gk 1.00: Pro 1.06: GIy ZOO: AIa 1.06: Tyr 1.00: Trp (UV) 1.06.
9)H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-GIy-VaI-Arg-PrO-GIy-NH2
Dieses Produkt wird aus IBOC-Val-Arg(NO2)-Pro GIy-NH2 und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH ii ähnlicher Weise, wie vorstehend unter (6) beschrieben hergestellt, [α] g= -47,8° (c = 0.56, 5% Essigsäure] Papierchromatographie: Rf5 = 0,57. Aminosäure-Ana lyse: His 1,06: Arg 033; Ser 034; GIu 1.00; Pro 034; Gl· Z06; VaI 034; Tyr 1,03: Trp(UV) 1.08.
IO)H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-lle-Arg-PrO-GIy-NH2
Unter Verwendung von Z-lle-Arg(NOj)-Pro-Iy-NIh wird diese Verbindung in der gleichen Weise synthetisiert, wii: vorstehend unter (7) beschrieben. [«] *· = -84,0 (c = 0,5, 5% Essigsäure). Papierchroniaiographie: Rf5 = 0,52. Aminosäure-Analyse: His 1,04; Arg 1.00: Scr 0,97; GIu 0.89; Pro 0,92; GIy 1,89; He 1,08; Tyr 1.00: Tl-P(U V) 1,01.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Peptiden nach der Carbodiimid/N-Hydroxyimid-Methode, dadurch gekennzeichnet, daß man
    A) N-geschützte Aminocarbonsäuren oder Peptide in Gegenwart eines Carbodiimids mit N-Hydroxy-5-norbornen-2^3-dicarboximid und
    B) den gemäß Verfahrensstufe A) erhaltenen
    N-Hydroxy-S-norbornen-^-dicarboximidester entweder nach vorangehender Isolierung oder in situ mit Aminocarbonsäuren, Peptiden oder deren Derivaten, deren N-terminale Amino- oder lminogruppe ungeschützt ist, umsetzt
DE2311786A 1972-03-14 1973-03-09 Verfahren zur Herstellung von Peptiden Expired DE2311786C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP47026467A JPS5025442B2 (de) 1972-03-14 1972-03-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2311786A1 DE2311786A1 (de) 1973-09-20
DE2311786C2 true DE2311786C2 (de) 1982-02-25

Family

ID=12194307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2311786A Expired DE2311786C2 (de) 1972-03-14 1973-03-09 Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPS5025442B2 (de)
BE (1) BE796399A (de)
DE (1) DE2311786C2 (de)
ZA (1) ZA731695B (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR205114A1 (es) * 1974-05-23 1976-04-05 Bristol Myers Co Procedimiento mejorado para la preparacion de - 1 - (l-(-)-gamma - amino - alpha - hidroxi - butiril) - kanamicina
EP2581440B1 (de) 2005-06-08 2016-03-16 The University of North Carolina At Chapel Hill Verfahren zur Ermöglichung des Überlebens von Nervenzellen anhand nicht-peptidischer und peptidscher BDNF-Neurotrophin-Mimetika
US9828330B2 (en) 2013-03-15 2017-11-28 Pharmatrophix, Inc. Non-peptide BDNF neurotrophin mimetics
KR20150134368A (ko) 2013-03-15 2015-12-01 파마트로픽스 인코포레이티드 비펩타이드 bdnf 뉴로트로핀 모방체

Also Published As

Publication number Publication date
JPS4892302A (de) 1973-11-30
BE796399A (fr) 1973-07-02
DE2311786A1 (de) 1973-09-20
ZA731695B (en) 1973-12-19
JPS5025442B2 (de) 1975-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2321174C2 (de) Nonapeptidamid und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2509783C2 (de) Decapeptidamide und Verfahren zu deren Herstellung
DE2446005C2 (de) Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2435027C2 (de) Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2858718C2 (de)
DE2544348C3 (de) L-Leucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel
DE2528935A1 (de) Aminosaeuren oder peptide mit geschuetzten guanidinogruppen und verfahren zu ihrer herstellung
DE2831271C2 (de) Heptapeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Heptapeptide enthaltende, angiotensin-II-antagonistisch wirkende Arzneimittel
DE2112553C3 (de) 1 -alpha-Aminolsobuttersäurecorticotropinpeptide, deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe sowie Arzneipräparate
DE2311786C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden
DE2408324A1 (de) Tripeptide und verfahren zu ihrer herstellung
DE3586940T2 (de) Polypeptid und dessen Verfahren zur Herstellung.
DE2831534C2 (de) Octapeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Octapeptide enthaltende Angiotensin-II-antagonistisch wirkende Arzneimittel
DE3340208C2 (de)
US3870694A (en) Peptide synthesis with n-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DE2324239C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden
DE2026606A1 (de) Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung
DE2327396A1 (de) Synthetisches polypeptid und verfahren zur herstellung desselben
DE1205546B (de) Verfahren zur Herstellung neuer Dekapeptide
DE68914544T2 (de) Peptid und Wirkstoff gegen Dementia.
DE1643496C3 (de) Verfahren zur Herstellung von menschlichem Corticotropin bzw. analoger Verbindungen
DE3312399A1 (de) Biologisch aktive peptide und arzneimittel, welche diese enthalten
DE2341775A1 (de) Verfahren zur herstellung von neuen, in n-terminaler stellung alpha-aminooxysaeuren enthaltenden peptiden mit acthwirkung
DE2114300C3 (de) Octadekapeptide und Arzneipräparate
DE1493559C3 (de) Neue Peptide mit adrenocorticotroper Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
OD Request for examination
D2 Grant after examination