DE2509783C2 - Decapeptidamide und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Decapeptidamide und Verfahren zu deren Herstellung

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Description

15
20
Abu: Ä-Aminobuttersäure
Arg: Arginin
BOC:
R?l< 		tert-Butoxycarbonyl
Benzyl
N.N'-Dicyclohexylcafbodiimid
DZI*
DCC: 		Glycin
GIy: Histidin
His: N-Hydroxy-5-norbornen*23-dicarb
HONB: UaIIHIQ
Isoleucin
tie: Leucin
Leu: Norleucin
Nie: Norvalin
Nva: Methionin
Met: Methylester
OMe: Benzylester
OBzI:
ONB:
OSu;
Pbe;
Pro:
PyrGlu;
Ser:
Thr:
Tos:
Trp:
Tyr:
N-Hydroxy-5-norbornen-2^-di-
carboxjmidester
N-Hydroxysuccinimidester Phenylalanin
Prolin
Pyroglutaminsäure
Serin
Threonin
Tosyl
Tryptophan
Tyrosin
JO
Die Erfindung betrifft neue Decapeptidamide mit starker ovulationsinduzierender Wirkung der allgemeinen Formel
PyrGlu-His-Trp-Ser-RrRrRj-Arg-Pro-Gty-NHj (I)
in der Ri Tyr oder Phe, R2 D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R3 Leu, He oder Nie bedeuten.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Decapeptidamide der Formel (I).
In der Beschreibung und den Patentansprüchen sind Aminosäuren und Peptide und ihre aktivierten Carboxyl- oder Schutzgruppen mit Abkürzungen bezeichnet, wie sie entweder auf dem betreffenden Fachgebiet gebräuchlich sind oder vom Committee on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB vorgeschlagen wurden. Wenn nicht anders angeführt ist, weisen die Aminosäuren L-Konfiguration auf.
Folgende Abkürzungen wurden beispielsweise verwendet:
55
60
65 Es ist bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, welche auf höherer Ebene die Sekretion topischer Hormone aus der Hypophyse regeln.
Nach der Isolierung eines Thyrotropin freisetzenden Hormons (TRH) wurde ein Hormon, das luteinisierende Hormone freisetzt (LH-RH), in reiner Form aus Schweinen und Schafen extrahiert und als ein Decapeptid der folgenden Struktur identifiziert:
PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-N^
[A.V. Schally etaL, Biochem. Biophys. Res. Commun, 43,1334 (1971): R. Gufflemin et aL, Proc. Nat Acad. ScL, USA, 69, 278 (1972)]. Auf diese Erkenntnis folgte die Herstellung einer Anzahl ähnlicher Peptide. Mit den analogen Peptiden wurden auch biologische Tests durchgeführt Da jedoch die physiologische Wirksamkeit des Peptids selbst durch geringfügige Modifikationen in der oben angeführten Aminosäurezusammensetzung stark beeinträchtigt wird, muß die oben angeführte chemische Struktur als wesentlich für die Erzielung der maximalen physiologischen Wirksamkeit angesehen werden [A.V. Schally etaL, Biochem. Biophys. Res. Commun, 4,366 (1972JL. ·
Kürzlich veröffentlichten Monahan et aL in »Biochemistry«, Band 12, Seiten 4616—4620 (1973), daß unter den von ihnen hergestellten LH-RH-Analogen wie z. B.
[AIa«]LH-RH, [D-AIa6JLH-RH, [VaIS]LH-RH, [D-Val«]LG-RH, [Pro^LH-RH und rD-Pro«]LH-RH
jene der Formel [D-AIa8JLH-RH die stärkste Wirksamkeit aufweist, nämlich 350—450% der Wirksamkeit der Stamm-LH-RH-Verbindung. Die Literatur lehrt weiterhin, daß LH-RH-Analoge, die in Stellung 6 eine D'Aminosäure mit einer größeren Anzahl von Seitenketten aufweisen, als D-AIa, weniger wirksam sind als das Stammhormon. Trotz des oben angeführten Standes der Technik ist es gelungen, Polypeotide der Formel (I), in welchen die D-Aminosäure in Stellung 6 eine größere Anzahl von Seitenketten aufweist als D-AIa, herzustellen und auf ihre LH-RH-Wirksamkeit zu testen. Dabei wurde überraschend gefunden, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide der Formel (I) um wenigstens 1000% wirkungsvoller sind als ihre Stamm-LH-RH-Hormone. Die Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.
Hauptziel der Erfindung ist daher die Bereitstellung von neuen Decapeptidamiden der Formel (1) und starker ovulationsinduzierender Wirksamkeit
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Decapeptidamide der Formel (I).
Die Gegenstände der Erfindung gehen aus den Ansprüchen hervor.
Der Reaktant (A) ist daher L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment, das eine N-endständige L-Pyroglutaminsäure aufweist und außerdem von dort an die
Aminosäuresequenz der Formel (I) besitzt, Der mit dem Reaktanten (A) zu kondensierende Reaktant (B) ist eine Aminkomponente, welche dem Rest des Decapeptidamidderivates der Formel (I) entspricht, wobei die
Reaktanten (A) und (B) gegebenenfalls geschützt sind-
Grundlegende Kombinationsmöglichkeiten der Reakianten (A) und (B) sind aus der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich.
Tabelle 1
Korn- Reaktant bina- (A) tion
(B)
1 PyiGlu-OH
2 PyrGlu-His-OH
3 PyiGIu-His-Trp-OH
4 PyrGlu-His-Trp-Ser-OH
5 PyiGlu-His-Trp-Ser-Rj-OH
6 PyiGlu-His-Trp-Ser-Ri-R2-OH
7 PyTGIu-HiS-TiP-SCr-R1-R2-R3-OH
S PyrGiu-His-Trp-Ser-Ri-Rz-Rj-Äig-OH
9 PyrGlu-His-Trp-Ser-Ri-Rz-Rs-Arg-Pro-OH
10 PyrGlu-His-Trp-Ser-Rj-Ri-Ra-Arg-Pro-Gly-OH
H-HiS-TrP-SCr-R1-R2-R3-AIg-PrO-GIy-NH2 H-TrP-SeT-R1-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2 H-SeT-Ri-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2 H-R1-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2 H-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2 H-R3-AiB-PrO-GIy-NH2 H-Aig-Pro-Gly-NH2
H-PrO-GIy-NH2
H-GIy-NH2
NH3
Es ist auch bekannt, daß eine geschützte L-Glutamylgruppe der allgemeinen Formel (II)
R4CO- CHjCH2CH(NH2)CO —
worin R4 eine Alkoxygruppe wie z. E. Methoxy, Äthoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy od. dgL, eine Aralkyloxygruppe wie z. B. Benzyloxy od. dgl., oder Amin bedeutet, leicht in die L-Pyroglutamylgnippe der Formel
XO-
durch in Kontaktbringen mit einer Base wie z.B. Ammoniak u. dgl. oder einer Säure wie z. B. Essigsäure od. dgL umgewandelt werden kann und daß die Gruppe der Formel (H) in dieser Hinsicht der l^Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf der Annahme aufgebaut, daß das ly-Pyroglutamyl (d. α PyrGlu-) des Reaktanten (A) nicht nur die L·PyroglutamylgΠlppe selbst, sondern auch die geschützte l^Glutamylgruppe der Formel (II) einschließt Wenn das (P>r)Giu- des Reaktanten (A) die Gruppe (H) darstellt, kann die Gruppe (H) leicht nach an sich bekannten Verfahren in die I^Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden.
Die erfindungsgemäße Kondensationsreaktion kann nach für die Herstellung von Peptidbindungen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispiele für solche Kondensationsverfahren sind das DCC/HON B-Verfahren (BB-PS 7 96 399), das Azidverfahren, das Chlorid' verfahren, das Slufeanhydridverfahrenf das gemischte Säureanhydridverfahren,das DCC- Verfahren, das Aktivesterverfahren, das des Woodward-Reagens-K-Verfahrens, das Carbodiimidazolverfahren, das Oxidationsreduktionsverfahren und andere [vgl. The Peptides Band 1 (1966), Schröder und Lübke, Academic Press, New York!
Vor der Kondensation können die Carboxyl- und
Aminogruppen, welche an der beabsichtigten Reaktion nicht teilnehmen sollen, geschützt werden oder die an (Π) der Reaktion teilnehmenden Carboxyl- und/oder
Aminogruppen nach an sich bekannten Verfahren aktiviert werden. Die Carboxylgruppen in den Aus gangsstoffen können in Form von Metallsalzen (z.B. Natrium- und Kaüumsalzen) oder von Estern (wie z. B. Methyl, Äthyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, tert-Butyl- oder tert-Amylestem) geschützt werden. Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien sind alle bei der Herstellung der Peptide gebräuchlichen Schutzgruppen/Qr Aminogruppen, wie z. B. die Benzyloxycarbonyl-, tert-Butoxycarbonyl-, Isobornyioxycarbonylgruppen geeignet Die Iminogruppe des Histidins kann durch jede herkömmliche Schutzgruppe wie z. B. die Benzyl-, Tosyl-, 2,4-Dinitrophenol-, tert-Butoxycarbonyl- oder Carbobenzoxygruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Serins kann durch jede herkömmliche Schutzgruppe wie z. B. die Benzyl-, tert.-Butylgruppe und andere ätherbildende
so Gruppen geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Tyrosins kann mit der Benzyl-, tert-Butyl- und anderen ätherbildenden Gruppen, die Guanidinogruppe des Arginins mit Gruppen wie z.B. die Nitro-, Tosyl·, Carbobenzoxy-.Isobornyloxycarbonyl-oderAdamantyl oxycarbonylgnippe geschützt werdea Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsmaterialien seien das entsprechende Säureanhydrid, Azid oder aktive Ester [d. h. Ester mit Alkoholen wie z. B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophe-
nol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, N-Hydroxy-5-norbornen-23'dicarboximid, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxybenztriazol] genannt Die aktivierten Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können z. B. das entsprechende Phosphor- säureamid sein.
Aus der nachstehenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen solcher Formen von Carboxyl- und Aminogruppen in den Produkten (A) und (B) ersichtlich.
Tsbslie 2 5 25 09 783 (B)
COOH 		6 NH2
Beispiele für
Kombina
tionen 		Ausgangsmaterialien
(A)
COOH 		NH2 geschützt
frei
geschützt 		frei
frei
aktiviert
1*>
2
3
Anmerkung: 		frei
aktiviert
frei 		geschützt
geschützt
geschützt
In dem mit *) bezeichneten Fall liegt im Reaktionssystem vorzugsweise ein Dehydratisierungsmittel wie z. B. ein Carbodiimid wie Dicyclohexyjcarbodiimid vor. Eine Ausführungsform der Erfindung ist im nachstehenden Reaktionsschema dargestellt
PyrGlu-His-Trp + Ser-Ri-Schutzgruppe
I Kondensation (z. B. DCC/HONB) PyiGlu-His-Trp-Ser-Ri-Schutzgruppe
Entfernung einer Schutzgruppe (z. B. katalytische Reduktion mit Pd Katalysator)
PyrGlu-His-Trp-Ser-R,
I
NO2
Z-Rj-R3-AIg-PrO-GIy-NH2
I Entfernung einer Schutzgruppe I (z. B. in Gegenwart von HBr) ■
NO2
R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2
Kondensation (z. B. in Gegenwart von DCC/HONB oder DCC/1-Hydroxybenztriazol)
NO2
PyrGlu-His-Trp-Ser-R,-R?-R3-Arg-Pro-Gly-NH2
Entfernung einer Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart von SnCl2 in Ameisensäure-Wasser, katalytischer Reduktion mit einem Pd Katalysator oder HF)
PVrGIu-HiS-TrP-SeT-Ri-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2
Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann das gleiche sein wie es bei Peptidkondeiisationsreaktionen verwendet wird, z.B. können wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin. Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran sowie geeignete Mischungen solcher Lösungsmittel als Beispiele angeführt werden.
Die Reaktionstemperatur liegt innerhalb eines Bereichs, welcher als für Reaktionen zur Peptidbindungsbildung geeignet bekannt ist, d. h. gewöhnlich innerhalb eines Bereichs von etwa -20 bis etwa 30° C. Die Precursorprodukte (die geschützten Peptide) der herzustellenden erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht nach dem Festphasesyntheseverfahren hergestellt werden.
Nach Beendigung der Kondensationsreaktion können die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen nach bekannten Verfahren entfernt werden. Als Beispiele hierfür seien katalytische Reduktion in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle, Platin, Solvolyse mittels Fluorwasserstoff, Trifluoressigsäure, und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak genannt.
Das so hergestellte Peptid der Formel (1) kann aus dem Reaktionsgsmisch nach an sich für die Gewinnung von Peptiden bekannten Verfahren wie z. B. Extraktion,
Verteilung, Säulenchromatographie gewonnen werden.
Die erfindungsgemäße Reaktion kann nach jedem an sich bekannten herkömmlichen Festphaseverfahren ♦s durchgeführt werden. .
Das Peptid der Formel (I) kann auch in Form eines Salzes gewonnen werden.
Als Säuren, die mit den Peptiden der Formel (I) Salze bilden, seien anorganische Säuren wie Salzsäure, » Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Rhodanwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und organische Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Malein· s/aufe, Fumarsäure, Anthraitylsäure, Zimtsäure, Napthalinsulfonsäure oder Sulfanylsäure genannt.
Die erfindimgsgemäßen Decapeptide der Formel (I) besitzen LH'RH-Wirkung (d. h, sie setzen ein luteinisierendes Hormon frei) und fördern daher die Sekretion von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH). Die Polypeptide der Formel (I) sind daher für die Verwendung zur Förderung der Ovulation bei Frauen und Tieren wte ü. B. Ratten, Schafen, Schweinen, Kühen, Stuten, Wachteln oder Hühnern geeignet, sie können auch für andere pha: rnazeutische. Zwecke, für welche bisher herkömmliche LH-RH, ^H und FSH-Präparate eingesetzt worden sind, verwendet werden.
Da die LH-RH-Wirkung der Decapeptide der Formel (I) etwa 10- bis 25mal stärker ist als die LH-RH-Wirkung der in der Natur vorkommenden Verbindungen, kann ihre Dosierungsmenge für jede Anwendung auf der Basis dieses Vielfachen ermittelt werden, wobei 5 auch andere Faktoren (wie z. B. der Empfänger der Verabreichung oder die Art der Krankheit) in Betracht zu ziehen sind. So kann z. B. eine geeignete Dosierungsmenge innerhalb eines Bereiches von etwa 5 ng (Nanogramm) bis 10 μg täglich pro Kilogramm ι ο Körpergewicht liegen.
Decapeptide der Formel (I) werden vorwiegend nichtperoral, d. h. mittels Injektion, rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.
Als Beispiele für geeignete Darreichungsformen seien Injektionen, Suppositorien, Pessarien und Pulver genannt Die Injektionen können durch Lösen von etwa I0—500)> eines Polypeptides der Formel (I) in 1 ml
pii^jiuivgi«.ii\.i i^uvitaai^iuauiig nci gestein WCIUCIl. l~ric £u Decapeptide der Formel (I) können auch durch Zugabe von Mannit als Excipienten in lyophiiisierte Ampullenprodukte übergeführt werden und sind in dieser Form jederzeit als Injektionen gebrauchsfertig.
Die als Ausgangsmaterialien im erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Peptide können u. a. nach für die Peptidherstellung bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert
In den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie an Silikagel mi:den folgenden Lösungsmittelsystemen:
Rf: Chloroform/Methanol/Essigsäure 9 :1 :0,5
RP: Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/
Wasser 30:10:3:5
RP: n-Butanol/Äthylacetat/Essigsäure/
Wasser 1:1:1.1
Beispiel 1
Herstellung von PyrGlu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Nva-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
a) Herstellung von
Z-(D)-Nva-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2
35
40
45
Einer Lösung von Z-(D)-Nva-OH (380 mg),1 H-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 (690 mg) und HONB (300 mg) in 5 ml Dimethylformamid werden 340 mg DCC bei 0° C M unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden lang bei 00C und weitere 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wird abfiltriert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, das Filtrat wird zur Trockne eingeengt κ Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit einer 4%igen wässerigen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus Äthylacetat (25 ml) und Äther (25 ml) digeriert, man erhält ein weißes Rührer, das abfiltriert und aus Äthanol-Äther nochmals ausgefällt wird Die Ausbeute beträgt 1,12 g, [ä]? - 50,5° (C= 1,1 in Methanol), Rf > = 032 ω
Analyse für C32Hs2O9N10
berechnet C 5332;
gefunden C 53,49;
b) Herstellung von PyrGlu-His-TRp-Ser-Phe-(D)-Nva-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Z-(D)-Nva-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 (I1Og) wird in 10 ml 25%igem Bromwasserstoff in Essigsäure gelöst und die Lösung 50 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 200 ml trockenem Äther verdünnt, um einen Niederschlag zu erhalten, dieser wird abfiltriert und gut mit trockenem Äther gewaschen. Das gesammelte Pulver wird über Natriumhydroxid bei vermindertem Druck getrocknet. Dieses Pulver wird in 10 ml Dimethylformamid zusammen mit (Pyr)Glu-His-Trp-Ser Phe-OH (1,0 g) und HONB (440 mg) gelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt und unter Rühren mit 400 mg DCC versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden lang bei 0°C und weitere 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, das Filtrat wird unter Zugabe von
UIfI Clllt.ll
:.j. ui
*iiu4i suiiiag cu
H 7,27;
H 7,56;
N 19,43
N 19,19
erhalten, welcher abfiltriert wird. Der gesammelte Niederschlag wird in 10%igem wässerigem Äthanol gelöst und die Lösung über eine mit Polystyrolharz [Amberlite* XAD-2, 3,5 χ 25 cm] gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird nach dem Gradientenelutionsverfahren mit 10%igem wässerigem Äthanol und lOOVoigem Äthanol (500:550 ml) eluiert Die Hauptfraktion (380—520 ml) wird gesammelt und zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird in 5 ml heißem Methanol gelöst und durch Zugabe von Äthylacetat nochmals ausgefällt, um das geschützte Decapeptidamid zu erhalten. 1,41 g [«]?-35,4° (c=0,12, in Methanol), RP = 0,20, RP = 0,56.
Das geschützte Decapeptidamid (500 mg) wird in 5 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff zusammen mit 03 ml Anisol bei -700C gelöst Nach 30 Minuten langem Rühren bei — 5GC wird der Fluorwasserstoff abgedampft Der entstandene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung zweimal mit 10 ml Äthylacetat extrahiert Die wässerige Schicht wird über eine mit Carboxymethylcellulose (2 χ 33 cm) gefüllte Kolonne geleitet, die Kolonne wird nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Einsatz eines Ammoniumacetatpuffers als Eluens eluiert [0,005 M, pH 6,8 (500 ml)... 0,2 M, pH 6,8 (500 ml)} Die Hauptfraktion wird gesammelt (420—68OmI) und lyophilisiert, wobei ein weißes Pulver erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 380 mg, [λ]?-32,4° (c=032, in 5%iger Essigsäure, RP = 0,05, RP=0,68.
Aminosäureanalyse: His 1,01; Arg 0^8; Trp 0,87; Ser 034; GIu 1,00; Pro 1,02; GIy 1,00; Nva 1,01; Leu 1,00; Phe 037(PeptidgehaIt84%).
Beispiel 2
Herstellung von PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-NIe-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2 nach dem Festphaseverfahren
a) Herstellung von BOC-Gly-Harz
In 60 ml Chloroform-Äthanol (2:1) werden 10 g Chlormethylharz eingebracht (Cl-Gehalt 2,0 mMol/g), darauf folgt die Zugabe von 103 g BOC-GIy und 8,4 ml Triäthylamin. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 13 Stunden gerührt und dann 24 Stunden lang erhitzt Das Harz wird abfUtriert und gut mit Dimethylformamid, dann mit Äthanol, Wasser. Äthanol und Äther in angegebener Reihenfolge gewaschen und getrocknet Die Ausbeute beträgt 1735 g. Die Aminosäureanalyse zeigt, daS dieses Harz 0,88 mMol/g BOC-GIy enthält
2* «7/121
b) Herstellung des PyrGlu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-Harzes
In das Reaktionsgefüß einer automatischen Peptidherstellungsvorrichtung (Modell APS-800 von Simadzu Seisakusho K.K., Japan) werden 2,177 g BOC-Gly-Harz, das wie oben angeführt hergestellt wurde, eingebracht und mit Dichlormethan 12 Stunden lang angequollen. Dann werden folgende Aminosäuren nach dem unten angeführten Schema eingebracht:
BOC-Pro, BOC-Arg(Tos), BOC-Uu,
BOC-DNIe, BOC-Tyr(Bzl), BOC-Ser(Bzl),
BOC-Trp, BOC-His(Tos), PyrGlu.
Dichlormethan (3 Minuten χ 3), ->■ 50% Trifluoressigsäure/Dichlormethan (10 bzw. 30 Minuten),
— Dichlormethan (3 Minuten χ 3), — Äthanol (3 Minuten χ 3), -► Dichlormethan (3 Minuten χ 3)
— 10% Triäthylamin/Chloroform (10 Minuten) -» Chloroform (3 Minuten χ 3) : Dichlcrmethan (3 Minuten x2)-> BOC-Aminosäureanhydrid (hergestellt aus BOC-Aminosäure und DCC nach einem bekannten Verfahren) (30 und 60 Minuten) -► Acetylierung (mit Säureanhydrid in Dichlormethan und Triäthylamin) (1 Stunde) -► Dichlormethan (3 Minuten χ 3) [nur PyrGlu wird direkt mit DCC in Dimethylformamid kondensiert].
Das Harz wird mit Äthanol, Chloroform und Dimethylformamid, dann mit Äther gewaschen und getrocknet, die Ausbeute beträgt 6,20 g.
c) Herstellung von PyrGlu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2
In 50 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol werden 2,622 g des nach b) hergestellten Harzes suspendiert, die Suspension wird bei Raumtemperatur Stunden lang gerührt.
Das Harz wird abfiltriert' und mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer werden zusammengegeben, bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und mit Äther behandelt Nach diesem Verfahren erhält man 1,187 g rohes Pulver.
Tabelle
588 mg dieses Produktes werden in einer trockenen Säule an 50 g Silikagel gereinigt, als Entwicklerflüssigkeit wird ein Lösungsmittelsystem aus Methanol und Chloroform verwendet. Man erhält 186 mg des gewünschten Produktes.
d) Herstellung von PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
In Gegenwart von 0,2 ml Anisol und 0,2 ml Mercaptoäthanol werden 173,3 mg des nach c) hergestellten, geschützten Peptides in 5 ml trockenem Fluorwasserstoff gelöst, die Lösung wird bei O0C 1 Stunde lang gerührt. Nach Ablauf dieses Zeitraumes wird sie bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und das Konzentrat in 20 ml Wasser gelöst. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert und das Filter über eine Kolonne (13 cm Durchmesser χ 20 cm) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite® IRA-410 Acetat-Form) geleitet. Die vorgereinigten Efflusriteii werden, anschließend mittels Ce.rbo*vlT>fithyicellulose (1,5 χ 22 cm; nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Einsatz von 0,005 M bis 0,2 M Ammoniumacetat mit einem pH-Wert von 6,8) und hierauf über Polystyrolharz (Amberlite® XAD-2) (1,5 χ 7,5 cm, nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Verwendung von 5—70%igem wässerigem Äthanol) gereinigt. Das Eluat wird der Gelfiltrationschromatographie an Sephadex® LH-20 (0,9 χ 53,5 cm, 0,1 N Essigsäure) unterworfen. Man erhält 39 mg der gewünschten Verbindung, [α] £-40,5° (c= O^ in 5%iger wässeriger Essigsäure).
Aminosäureanalyse (Säurehydrolyse in Gegenwart von Thioglycolsäure): GIu 0,97; His 0,97; Trp 0,94; Ser 0,88; Tyr 1,0; Leu 1,00; Nie 1,06; Arg 1,03; Pro 1,00; GIy 1,03 (87% Ausbeute).
Beispiele 3—13
In der nachstehenden Tabelle sind Decapeptidamide der Formel (I) angeführt welche nach einem in Beispiel 2 angeführten ähnlichen Verfahren, jedoch unter Einsatz der in der Tabelle angegebenen Ausgangsmaterialien anstelle der in Beispiel 2 angeführten hergestellt wurden.
Bei Decapeptidamide (I) (c = 0,5) Aminosäureanalyse Ausgangsmaterialien, die anstelle der in Beispiel 2
spiel in 5%iger angeführten eingesetzt wurden
Ri R2 R3 wäßriger
Essigsäure BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-NIe BOC-Leu
Tyr D-Ser Leu -44.8°
Tyr D-Abu Leu -43.2°
Tyr D-Nva Leu -38.9°
His 1.02;. Trp 0.97; GIu 1.00; GIy 1.03; Tyr 0.96
His 0.96; Trp 0.89; GIu 1.00; GIy 0.99; Leu 1.00;
His 1.00; Trp 0.92; GIu 1.00; GIy 1.01; Leu 0.98;
Arg 1.01; Ser 1.91; Ao 1.01; Leu 0.97; BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Ser(Bzl) BOC-Leu
Arg 1.00; BOC-TyT(BzI) BOC-D-Abu BOC-Leu
S 0.92; 1.00;
AbuO.97; Tyr 0.98
Arg 0.99; BOC-Tyr(Bzf) BOC-D-Nva BOC-Leu Scr 0.91; Pro 1.00;
NyaO-97;
Tyr 0.98
Fortsetzung
Bei Decapeptidamide (1) Ia]2D Aminosäureanalyse Ausgangsmaterialien, die anstelle der in Beispiel 2
spiel (<■ = 0,5) angeführten eingesetzt wurden
R1 R2 R3 in 5%iger
wäßriger BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-NIe BOC-Leu
Essigsäure
6 Tyr D-Thr Leu -37.5°
7 Tyr D-Phe Leu -52.4°
8 Tyr D-Met Leu
10 Tyr D-Abu He
-42.0°
9 Phe D-Phe Leu -69.5°
-38.5°
11 Phe D-Ser Nie -32.5°
12 Phe D-NIe Nie -35.1°
13 Phe D-Nva He -35.5°
His 1.01; Trp 0.95; Ser 0.92; Pro 1.00; Leu 1.00;
His 1.00; Trp 0.87; GIu 1.00; GIy 1.01; Phe 1.00; His 0.98; Trp 0.89; GIu 0.99; GIy 1.00; Leu 1.00; His 1.00; Trp 0.87; GIu 1.01; GIy 1.00; Phe 1.98
His 1.00; Trp 0.92; GIu 1.03; GIy 1.00; He 0.98;
His 0.96; Trp 0.87; GIu 1.00; GIy 1.00; Phe 1.02
His 1.00; Trp 0.82; GIu 1.02; GIy 1.00; Phe 0.97
His 0.96; Trp 0.86; GIu 1.00; GIy 0.98; He 0.92;
Arg 0.98; Thr 1.00; GIu 1.00; GIy 0 99; Tyr 0,98
Arg 0.99; Ser 0.89; Pro 0.99; Leu 0.98; Tyr 0.96
Arg 1.00; Ser 0.92; Pro 0.98; Met 0.79; Tyr 1.00 Arg 0.98; Ser 0.98; Pro 0.98; Leu 1.00;
Arg 1.00; Ser 0.88; Pro 1.00; AbuO.96; Tyr 0.98 Arg 0.94; Ser 1.87; Pro 0.99; Nie 0.96;
to
Arg 1.01; Ser 0.89; Pro 1.00; Nie 2.03;
Arg 1.00; Ser 0.89; Pro 1.00; Nva 0.90; Bhe 0.99
BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Thr BOC-Leu BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Phe BOC-Leu BOC-TyKBzI) BOC-D-Met BOC-Leu BOC-Phe DOC-D-Phe BOC-Leu BOC-TyKBzI) BOC-D-Abu BOC-IIe BOC-Phe BOC-D-SeKBzI) BOC-NIe BOC-Phe BOC-D-NIe BOC-NIe BOC-Phe BOC-D-Nva BOC-IIe
Vergleich der orulationsinduzierenden Wirksamkeit der erfindungsgemäßen DecapeptidPyrGlu-His-Trp-Ser-R,-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2 mit LH/RH
Beispiel
Ovulationsifiduzierende Wirksamkeit
EDa(BfZlOOg b.w.)
Vergleich Tyr GIy Uu 215 (LH/RH)
2 Tyr D-NIe Uu 9,8
3 Tyr D-Ser Uu 8,0
4 Tyr D-Abu U* 8,6
5 Tyr D-Nva " Uu M
Tyr D-Thr Leu 9»
7 Tyr D-ifee Uu 7,7
13 Ri 25 09 R2 783 14
Fortsetzung Ovulationsinduzierende
Beispiel Tyr D-Met R3 Wirksamkeit
Phe D-Phe EDso(ng/lOOgb.w.)
Tyr D-Abu 8,6
8 Phe D-Ser Leu 10,8
9 Leu 12,7
!0 He 12,0
11 Nie
Die ovulationsinduzierende Wirksamkeit wurde nach der in J. Med. Chem. 16, 1144 (1973) beschriebenen Methode bestimmt.

Claims (4)

Patentansprüche;
1. Decapeptidamide der allgemeinen Formel PyrGlu-His-Trp-Ser-Ri-RrRrArg-Pro-Gly-Nfo
in der Rj Tyr oder Phe, R2 D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R3 Leu, Ue oder Nie bedeuten.
2. Decapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ri Tyr, R2 D-Ser und R3 Leu bedeuten.
3. Decapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ri Tyr, Ri D-Phe und R3 Leu bedeuten.
4. Verfahren zur Herstellung der Decapeptidamide nach Anspruch T, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise L-Pyroglutaminsäure oder ein der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz entsprechendes, N-terminal einen L-Pyroglutaminsäurerest aufweisendes Peptidfragment mit einer. Aminokomponente, die dem restlichen Teil des gewünschten Decapsptidamids entspricht, kondensiert, wobei die beiden Reaktionspartner wahlweise eine oder mehrere Schutzgruppen enthalten können, und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.
IO
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