DE60031133T2

DE60031133T2 - Verfahren zur darstellung von lh-rh-derivaten

Info

Publication number: DE60031133T2
Application number: DE60031133T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Hikari-shi SASAKI; Katsuji Kumage-gun SHIMIZU
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2020-06-30
Also published as: EP1207167B1; CA2376763A1; EP1777232A1; WO2001002428A1; CA2376763C; DE60031133D1; US20050261195A1; ATE341562T1; EP1207167A1; EP1207167A4; AU5705500A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung liefert ein einfaches und effizientes industrielles Verfahren zur Herstellung von LH-RH-Derivaten und liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von LH-RH-Derivaten mit hoher Qualität.
Hintergrund und Stand der Technik
JP 50-59370 A (entsprechend U.S.-Patent Nr. 4 008 209) beschreibt als Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die LH-RH-Derivate sind, oder von Salzen davon, den folgenden Prozess zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr(oder Phe)-X-Leu(oder Ile oder Nle)-Arg-Pro-NH-R, worin die Aminosäuren L-Form haben, wenn nicht anders angegeben, X D-Leu, D-Nle, D-Nval, D-Ser, D-Abu, D-Phg, D-Phe oder α-Aibu bedeutet und R eine Alkylgruppe bedeutet, die eine Hydroxylgruppe haben kann. Schema
wobei die Symbole wie oben definiert sind.
Auch JP 51-6926 A (entsprechend U.S.-Patent Nr. 3 997 516) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Herstellung eines Peptids mit einer Guanidinogruppe die Guanidinogruppe in einer Ausgangsverbindung, die die Guanidinogruppe enthält, mit einer Niedrigalkoxybenzolsulfonylgruppe oder Triniedrigalkylbenzolsulfonylgruppe geschützt wird.
Weiterhin beschreibt JP 51-100030 A (entsprechend U.S.-Patent Nr. 3 997 516) ein Verfahren zur Trennung/Herstellung eines Peptids, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Herstellung eines Peptids mit einer Guanidinogruppe die Guanidinogruppe in einer Ausgangsverbindung, die die Guanidinogruppe enthält, mit einer Niedrigalkoxy- oder Triniedrigalkylbenzolsulfonylgruppe geschützt wird, die geschützte Verbindung der Peptid kondensation unterzogen wird und dann die Schutzgruppe mit einer Halogensulfonsäure oder einer Niedrigalkylsulfonsäure oder einer Lewis-Säure entfernt wird.
Auch WO 97/48726 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das durch die allgemeine Formel 5-oxo-Pro-R¹-Trp-Ser-R²-R³-R⁴-Arg-Pro-R⁶ (I)dargestellt wird, wobei die Symbole wie unten definiert sind, oder eines Salzes davon, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Peptid der allgemeinen Formel 5-oxo-Pro-R¹-Trp-Ser-R²-R³-OH (II)worin R¹ His, Tyr, Trp oder p-NH₂-Phe bedeutet, R² Tyr oder Phe bedeutet und R³ Gly oder einen α-D-Aminosäurerest bedeutet, die jeweils einen Substituenten haben können, oder ein Salz davon mit einem Peptid der allgemeinen Formel H-R⁴-R⁵-Pro-R⁶ (III)worin R⁴ Leu, Ile oder Nle bedeutet, R⁵ Arg bedeutet, das geschützt ist, und R⁶ eine Gruppe bedeutet, die durch die Formel Gly-NH-R⁷ (worin R⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe, die eine Hydroxylgruppe tragen kann, bedeutet) oder durch die Formel NH-R⁸ dargestellt wird (wobei R⁸ ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, die eine Hydroxylgruppe oder eine Ureidogruppe (-NH-CO-NH₂) tragen kann, bedeutet), oder einem Salz davon umgesetzt wird, um ein Peptid der allgemeinen Formel 5-oxo-Pro-R¹-Trp-Ser-R²-R³-R⁴-R⁵-Pro-R⁶ (I')wobei die Symbole wie oben definiert sind, oder ein Salz davon zu erhalten, und dann das so erhaltene Peptid (I') einer Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen unterzogen wird.
Im Stand der Technik werden viele racemische Isomeren der entsprechenden Aminosäuren während der Herstellungsstufen von LH-RH-Derivaten aus geschützten Peptiden davon als Nebenprodukte erzeugt. Im Stand der Technik wird die Reinigung der LH-RH-Derivate mit Säulenchromatographie unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes durchgeführt, wobei mehrstufige Chromatographiestufen notwendig sind aufgrund der schlechten Effizienz bei der Entfernung racemischer Isomere, so dass es schwierig ist, LH-RH-Derivate mit einer höheren Qualität in guter industrieller Effizienz herzustellen. Die von der vorliegenden Erfindung zu lösenden Probleme bestehen darin, ein Verfahren bereitzustellen zur Herstellung von LH-RH-Derivaten mit hoher Qualität in hohen Ausbeuten mit einem industriell sehr vorteilhaften Verfahren, das ein Reinigungsverfahren verwendet, das die Racemisierung der sie aufbauenden Aminosäuren während der Herstellung der LH-RH-Derivate aus geschützten Peptiden unterdrücken kann, racemische Isomere und andere Verunreinigungen wirksam entfernen kann und auch die Reinigungsstufe einfach und effektiv durchführen kann.
Offenbarung der Erfindung
Als Ergebnis intensiver Forschungen zur Lösung der oben erwähnten Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Verbesserungen in der Reinigungsstufe von LH-RH-Derivaten und Verbesserungen bei der Aufarbeitung nach der Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen erreicht und haben eine Methode zur Unterdrückung der Racemisierung von konstitutiven Aminosäuren während der Herstellungs- und Reinigungsstufen für LH-RH-Derivate etabliert ebenso wie ein Reinigungsverfahren, das wirksam racemische Isomere und andere Verunreinigungen entfernen kann und auch die Säulenbehandlungsstufe einfach und effektiv in einem hohen Ausmaß ausführen kann, ohne eine Stufe zur Behandlung mit einem Ionenaustauschharz zu verwenden, wodurch ein Prozess gefunden wurde zur Herstellung von LH-RH-Derivaten in hoher Qualität und in hohen Ausbeuten. Als Ergebnis weiterer intensiver Forschungen auf Basis dieser Erkenntnis wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Das bedeutet, die vorliegende Erfindung betrifft

(1) ein Verfahren zur Herstellung eines LH-RH-Derivats, das beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, einer Stufe zur Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz und einer Stufe zur Behandlung mit einem synthetischen aromatischen Adsorptionsharz unterzogen wird;
(2) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das LH-RH-Derivat ein Peptid der Formel 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z ist, worin Y einen Rest bedeutet ausgewählt aus DLeu, DAla, DTrp, DSer(tBu), D2Nal und DHis(ImBzl) und Z NH-C₂H₅ oder Gly-NH₂ bedeutet oder ein Salz davon;
(3) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das LH-RH-Derivat ein Peptid der Formel 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ oder ein Acetat davon ist;
(4) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das Verfahren beinhaltet, dass ein synthetisches Methacryladsorptionsharz mit sich wiederholenden Einheiten der Formel
verwendet wird;
(5) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das synthetische aromatische Adsorptionsharz ein synthetisches Styroldivinylbenzoladsorptionsharz ist;
(6) das Verfahren, wie oben in (5) beschrieben, wobei die durchschnittliche Teilchengröße des synthetischen Styroldivinylbenzoladsorptionsharzes 60 μm bis 150 μm ist;
(7) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Behandlungsstufe mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz unter 10°C unterzogen wird;
(8) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Behandlungsstufe mit einem synthetischen aromatischen Adsorptionsharz bei 10°C bis 20°C unterzogen wird;
(9) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Behandlungsstufe mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz unterzogen wird und anschließend der Behandlungsstufe mit einem synthetischen aromatischen Adsorptionsharz unterzogen wird;
(10) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, in der Behandlungsstufe mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz über ein Harz geleitet wird und dann das LH-RH-Derivat, das an dem Harz adsorbiert ist, mit einer wässrigen Lösung von Essigsäure eluiert wird;
(11) das Verfahren, wie oben in (10) beschrieben, wobei die Konzentration der wässrigen Essigsäurelösung 0,01 M bis 0,50 M ist;
(12) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, über ein Harz geleitet wird in der Behandlungsstufe mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz gefolgt davon, dass mit einer wässrigen Lösung von Ethanol gewaschen wird und dann das LH-RH-Derivat, das an dem Harz adsorbiert ist, eluiert wird;
(13) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die ist, die erhalten wird, indem das LH-RH-Derivat, das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt ist, einer Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen unterzogen wird, gefolgt von einer Neutralisierungsreaktion unter 10°C;
(14) das Verfahren, wie oben in (1) beschrieben, wobei eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die ist, die erhalten wird, indem das LH-RH-Derivat, das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt ist, einer Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen und dann einer Neutralisierungsreaktion unter 10°C unterzogen wird gefolgt davon, dass die entstehende Mischung einer Extraktion des LH-RH-Derivats unterzogen wird und dann der Extrakt unter 25°C eingeengt wird;
(15) das Verfahren, wie oben in (13) oder (14) beschrieben, wobei das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützte LH-RH-Derivat durch die folgende Formel 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg(X)-Pro-Z dargestellt wird, worin X eine Schutzgruppe angibt, Y einen Rest ausgewählt aus DLeu, DAla, DTrp, DSer(tBu), D2Nal und DHis(ImBzl) anzeigt und Z NH-C₂H₅ oder Gly-NH₂ bedeutet;
(16) gereinigtes Leuprorelin oder ein Salz davon, wobei der Gehalt aller verwandten Substanzen 1% oder weniger ist;
(17) gereinigtes Leuprorelin oder ein Salz davon, wobei der Gehalt an 5-oxo-Pro-D-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃ oder eines Salzes davon 0,3% oder weniger ist.

Beste Ausführungsform für die Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines LH-RH-Derivats, das beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, einer Stufe zur Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz und einer Stufe zur Behandlung mit einem synthetischen aromatischen Adsorptionsharz unterzogen wird.
Beispiele für den LH-RH-Agonisten schließen Peptid-LH-RH-Derivate ein, die die LH-RH-agonistische Aktivität besitzen und Salze davon und sind z.B. Peptid-LH-RH-Derivate, die die LH-RH-agonistische Aktivität besitzen und Salze davon, die wirksam sind gegen hormonabhängige Krankheiten, insbesondere Geschlechtshormon-abhängige Krebsarten (z.B. Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Brustkrebs und Hypophysentumor, Prostatahypertrophie, Endometriose, Gebärmuttermyome, vorzeitige Pubertät, Dysmenorrhö, Amenorrhö, prämenstruelles Syndrom und Syndrom des polyzystischen Eierstocks ebenso wie zur Empfängnisverhütung (oder gegen Unfruchtbarkeit, wenn die nach dem Absetzen überschießende Reaktion ausgewertet wird). Sie schließen außerdem z.B. LH-RH-Derivate und Salze davon ein, die wirksam sind gegen benigne oder maligne Tumoren, die LH-RH-empfindlich sind, obwohl sie Geschlechtshormon-unabhängig sind.
Bezüglich des oben erwähnten Salzes des LH-RH-Derivats ist ein pharmakologisch annehmbares Salz bevorzugt und Beispiele für solch ein Salz in dem Fall, in dem das LH-RH-Derivat eine basische Gruppe, wie eine Aminogruppe hat, schließen ein Salz mit einer anorganischen Säure (auch als anorganische freie Säure bezeichnet) (z.B. Kohlensäure, Bicarbonsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Borsäure), ein Salz mit einer organischen Säure (auch als organische freie Säure bezeichnet) (z.B. Bernsteinsäure, Essigsäure, Propionsäure und Trifluoressigsäure) ein.
Beispiele für solch ein Salz sind in dem Fall, in dem das LH-RH-Derivat eine saure Gruppe wie eine Carboxylgruppe hat, ein Salz mit einer anorganischen Base (auch als anorganische freie Base bezeichnet) (z.B. ein Alkalimetall, wie Natrium, Kalium, ein Erdalkalimetall, wie Calcium, Magnesium), ein Salz mit einer organischen Base (auch als organische freie Base bezeichnet) (z.B. ein organisches Amin, wie Triethylamin, eine basische Aminosäure, wie Arginin) ein. Außerdem kann das LH-RH-Derivat eine Metallkomplexverbindung bilden (z.B. einen Kupferkomplex oder einen Zinkkomplex).
Als Peptid-LH-RH-Derivat, das eine LH-RH-agonistische Aktivität besitzt, gibt es z.B. ein Polypeptid der Formel 5-oxo-Pro-R₁-Trp-Ser-R₂-R₃-R₄-Arg-Pro-R₅ (I)worin R₁ His, Tyr, Trp oder p-NH₂-Phe bedeutet, R₂ Tyr oder Phe bedeutet und R₃ Gly oder einen D-Aminosäurerest bedeutet, der einen Substituenten haben kann, R₄ Leu, Ile oder Nle bedeutet, R₅ eine Gruppe bedeutet, die durch die Formel Gly-NH-R₆ (wobei R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe, die substituiert sein kann, bedeutet) oder die Formel Gly-NH-R_6' (worin R_6' (1) ein Wasserstoffatom, (2) eine Alkylgruppe, die mit einer Aminogruppe oder Hydroxylgruppe substituiert sein kann) oder (3) eine Ureidogruppe (-NH-CO-NH₂) bedeutet, dargestellt wird.
In der oben erwähnten Formel (I) ist der mit R₃ bezeichnete D-Aminosäurerest beispielsweise eine α-D-Aminosäure mit bis zu 11 Kohlenstoffatomen (z.B. D-Leu, Ile, Nle, Val, Nval, Abu, Phe, Phg, Ser, Thr, Met, Ala oder Trp), die jeweils 1 bis 3 geeignete Substituenten haben können (z.B. eine C₁-C₄-Alkylgruppe, wie Methyl, t- Butyl, eine C₁-C₄-Alkoxylgruppe, wie t-Butoxy, eine C₁-C₄-Alkoxycarbonylgruppe, wie t-Butoxycarbonyl, eine C₆-C₁₀-Arylgruppe, wie 2-Naphthyl, eine Indolylgruppe oder eine Imidazolylgruppe, die mit C₁-C₄-Alkyl, C₆-C₁₀-Aryl oder C₆-C₁₀-Aryl-C₁-C₄-alkyl substituiert sein kann, z.B. Indolyl-3-yl, 2-Methylindolyl oder Benzylimidazol-2-yl). Beispiele für den Substituenten einer Alkylgruppe, die substituiert sein kann, die durch R₆ angegeben wird, schließen Hydroxyl oder Amino ein. Die Alkylgruppe einer Alkylgruppe, die mit einer Aminogruppe oder Hydroxylgruppe substituier sein kann, ist beispielsweise eine C₁-C₄-Alkylgruppe und eine C₁-C₃-Alkylgruppe ist besonders bevorzugt. Beispiele für eine C₁-C₄-Alkylgruppe schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl oder tert.-Butyl ein. Die Anzahl der Substituenten ist z.B. 1 bis 3, wobei 1 bis 2 Substituenten bevorzugt sind und ein Substituent besonders bevorzugt ist.
Bevorzugter schließen Beispiele des Peptid-LH-RH-Derivats, das LH-RH-agonistische Aktivität besitzt, ein physiologisch aktives Peptid mit der Formel (II) 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z worin Y einen Rest bedeutet ausgewählt aus DLeu, DAla, DTrp, DSer(tBu), D2Nal und DHis(ImBzl), und Z NH-C₂H₅ oder Gly-NH₂ bedeutet, und ein Salz davon ein. Besonders bevorzugt ist ein solches Peptid, bei dem Y DLeu ist und Z NH-C₂H₅ ist (nämlich das Peptid, das dargestellt wird durch 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅: Leuprorelin). Als Salz des Peptids, das durch 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ dargestellt wird, ist das Acetat (Leuprorelinacetat) besonders bevorzugt von den oben beispielhaft angegebenen.
Die hier verwendeten Abkürzungen zur Angabe von Aminosäuren, Peptiden, Schutzgruppen etc. in den Polypeptiden sind die der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur oder übliche Codes auf diesem Gebiet und auch in dem Fall, in dem ein optisches Isomer existieren kann im Hinblick auf eine Aminosäure, soll die L-Form angegeben sein, wenn nicht anders bezeichnet.
Beispiele der Abkürzungen sind wie folgt.

Abu:: Aminobuttersäure
Aibu:: 2-Aminobuttersäure
Ala:: Alanin
Arg:: Arginin
Gly:: Glycin
His:: Histidin
Ile:: Isoleucin
Leu:: Leucin
Met:: Methionin
Nle:: Norleucin
Nval:: Norvalin
Phe:: Phenylalanin
Phg:: Phenylglycin
Pro:: Prolin
(Pyr)Glu:: Pyroglutaminsäure
Ser:: Serin
Thr:: Threonin
Trp:: Tryptophan
Tyr:: Tyrosin
Val:: Valin
D2Nal:: D-3-(2-Napthyl)alaninrest
DSer(tBu):: O-tert.-Butyl-D-serin
DHis(ImBzl):: N^im-Benzyl-D-histidin
PAM:: Phenylacetamidomethyl
Boc:: t-Butoxycarbonyl
Fmoc:: 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Bzl:: Benzyl
Cl₂-Bzl:: 2,6-Dichlorbenzyl
Tos:: p-Toluolsulfonyl
HONb:: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
HOBt:: 1-Hydroxybenzotriazol
HOOBt:: 3-Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin
MeBzl:: 4-Methylbenzyl
Bom:: Benzyloxymethyl
Bum:: t-Butoxymethyl
Trt:: Trityl
DNP:: Dinitrophenyl
DCC:: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

Bevorzugte Beispiele für das Peptid-LH-RH-Derivat, das LH-RH-agonistische Aktivität besitzt, schließen zusätzlich zu dem oben erwähnten Leuprorelin (Leuprorelinacetat) (1) Goserelin [Chemische Formel 1]
(U.S.-Patent Nr. 4 100 274 und JP 52-136172 A), (2) Buserelin [Chemische Formel 2]
(U.S.-Patent Nr. 4 024 248, Deutsches Patent Nr. 2438352 und JP 51-41359 A), (3) Triptorelin [Chemische Formel 3]
(U.S.-Patent Nr. 4 010 125 und JP 52-31073 A), (4) Nafarelin [Chemische Formel 4]
(U.S.-Patent Nr. 4 234 571, JP 55-164663 A, JP 63-264498 A und JP 64-25794 A), (5) Historelin [Chemische Formel 5]
(6) Deslorelin [Chemische Formel 6]
(U.S.-Patent Nr. 4 569 967 und U.S.-Patent Nr. 4 218 439), (7) Meterelin [Chemische Formel 7]
(PCT WO 91/18016), (8) Gonadrelin [Chemische Formel 8]
(Deutsches Patent Nr. 2213737) und Salze davon.
In den oben erwähnten chemischen Formeln 1 bis 8 ist die Aminosäure, die R₃ in der vorher erwähnten Formel (I) entspricht, in D-Form.
Das synthetische Methacryladsorptionsharz bedeutet ein synthetisches Adsorptionsharz eines Polymers, dessen Substrat ein Methacrylsäureester ist und racemische Isomere des LH-RH-Derivats können unerwarteterweise und effektiv entfernt werden, indem eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, einer Behandlungsstufe mit dem Harz (insbesondere durch Verwendung eines aromatischen synthetischen Adsorptionsharzes wie im Folgenden beschrieben, in Kombination) unterzogen wird, um das LH-RH-Derivat herzustellen (zu reinigen).
Außerdem können racemische Isomere des LH-RH-Derivats wirksam so entfernt werden, dass eine Stufe zur Behandlung mit Säulen in mehreren Stufen, die bisher ausgeführt wurde, verkürzt werden kann.
Spezifische Beispiele der synthetischen Methacryladsorptionsharzsäule schließen HP 2MG (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation), XAD-7 und XAD-8 (hergestellt von Organo Company) (bevorzugt HP 2MG (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation) ein, aber es kann jede verwendet werden, soweit sie das Ziel der wirksamen Entfernung von racemischen Isomeren des LH-RH-Derivats erzielt.
Bevorzugt hat das synthetische Methacryladsorptionsharz eine solche Teilchenverteilung des Harzes, dass 90% oder mehr der Harzteilchen eine Teilchengröße von 300 μm oder mehr haben. Das synthetische Methacryladsorptionsharz mit den in der folgenden Formel dargestellten sich wiederholenden Einheiten
ist bevorzugt.
In dem Fall, in dem das oben erwähnte Leuprorelin (Leuprorelinacetat) hergestellt (gereinigt) wird mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz (bevorzugt HP 2MG (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation), können insbesondere ein racemisches Isomer bei His benachbart zu 5-oxo-Pro in Leuprorelin (Leuprorelinacetat) (im Folgenden abgekürzt als D-His²-Form), ein racemisches Isomer bei Trp benachbart zu His (im Folgenden abgekürzt als D-Trp³-Form) und andere höchst polare verwandte Substanzen effektiv entfernt werden.
Die oben erwähnten "anderen höchst polaren verwandten Substanzen" beziehen sich auf Peptidfragmente, die durch Spaltung des Peptids von Leuprorelin gebildet werden, Reagenzien, die in den Reaktionen verwendet werden, wovon spezifische Beispiele Phenol und dgl. einschließen.
Das aromatische synthetische Adsorptionsharz (bevorzugt ein synthetisches Styroldivinylbenzol-Adsorptionsharz) bedeutet ein synthetisches Adsorptionsharz eines porösen Polymers, das durch Copolymerisation von Styrol und Divinylbenzol hergestellt wird, wobei racemische Isomere des LH-RH-Derivats unerwarte terweise und effektiv entfernt werden können, indem eine Lösung, die LH-RH-Derivat enthält, einer Stufe zur Behandlung mit dem Harz (insbesondere durch Verwendung des synthetischen Methacryladsorptionsharzes, das oben beschrieben wurde, in Kombination) unterzogen wird, um das LH-RH-Derivat herzustellen (zu reinigen). Spezifische Beispiele des aromatischen synthetischen Adsorptionsharzes schließen HP 20 und HP 21 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation), HP 20SS und SP 20SS (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation), XAD-2 und XAD-4 (hergestellt von Organo Company) (bevorzugt HP 20SS (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation) ein, aber jedes kann verwendet werden, solange es die Aufgabe löst, racemische Isomere des LH-RH-Derivats effektiv zu entfernen.
Es ist auch bevorzugt, das aromatische synthetische Adsorptionsharz mit einer Teilchengröße von etwa 60 μm bis etwa 150 μm zu verwenden.
Zusätzlich ist es bevorzugt, das synthetische Styroldivinylbenzol-Adsorptionsharz mit einer solchen Teilchenverteilung des Harzes zu verwenden, dass 15% oder weniger der Harzteilchen eine Teilchengröße von 150 μm oder mehr haben, 70% oder mehr der Harzteilchen eine Teilchengröße von 63 μm oder mehr bis 150 μm oder weniger haben und 20% oder weniger der Harzteilchen eine Teilchengröße von 63 μm oder weniger haben.
In dem Fall, in dem das oben erwähnte Leuprorelin (Leuprorelinacetat) hergestellt (gereinigt) wird unter Verwendung des synthetischen aromatischen Adsorptionsharzes (bevorzugt HP 20SS (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation)) können die D-His²-Form und L-Leu⁶-Form in Leuprorelin (Leuprorelinacetat) ebenso wie weitere höchst polare verwandte Substanzen effektiv entfernt werden.
Die oben erwähnten "weiteren höchst polaren verwandten Substanzen" haben die gleiche Bedeutung, wie oben beschrieben.
Um die oben erwähnte Aufgabe, "racemische Isomere etc. eines LH-RH-Derivats effektiv zu entfernen", zu lösen, ist es bevorzugt, eine Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz und eine Stufe zur Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz in Kombination zu verwenden. In diesem Fall ist die Reihenfolge der Behandlungsstufe mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz und der Stufe zur Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz nicht spezifiziert insbesondere bei dem Verfahren zur Herstellung (Reinigung) des LH-RH-Derivats, aber es ist bevorzugt, das LH-RH-Derivat herzustellen (zu reinigen), indem es der Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz und dann der Stufe zur Behandlung mit einem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen wird.
Im Folgenden wird im Detail das Verfahren zur Herstellung des LH-RH-Derivats beschrieben, das umfasst, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz und der Stufe zur Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen wird.
(1) Reinigungsstufe für LH-RH-Derivat
[1] Das LH-RH-Derivat vor der Reinigung (im Folgenden als rohes LH-RH-Derivat bezeichnet) wird in einer Pufferlösung gelöst, um die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, herzustellen.
Beispiele der zu verwendenden Pufferlösung schließen, obwohl dies nicht spezifisch beschränkt ist solange die Absorption des LH-RH-Derivats auf dem synthetischen Adsorptionsharz nicht gehemmt wird, Wasser (destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser), eine wässrige Lösung von Natriumacetat, eine wässrige Lösung von Ammoniumacetat, eine wässrige Lösung von Natriumphosphat, eine wässrige Lösung von Ammoniumphosphat und eine wässrige Lösung von Ammoniumchlorid (bevorzugt eine wässrige Lösung von Natriumacetat) ein.
Um die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren des LH-RH-Derivats zu unterdrücken, ist es außerdem bevorzugt, den pH-Wert der Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, auf 4 bis 6, bevorzugt 4 bis 5 einzustellen durch Zugabe eines pH einstellenden Mittels (z.B. Essigsäure, Phosphorsäure und Salzsäure).
In dem Fall, in dem das LH-RH-Derivat das oben erwähnte Leuprorelin (Leuprorelinacetat) ist, ist es weiterhin bevorzugt, die Temperatur der Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, auf unter 10°C, bevorzugt 3 bis 7°C zu kontrollieren, um die Nebenproduktbildung eines racemischen Isomers bei Trp benachbart zu His in Leuprorelin (Leuprorelinacetat) (im Folgenden abgekürzt als D-Trp³-Form) und ein racemisches Isomer bei Ser benachbart zu Trp in Leuprorelin (Leuprorelinacetat) (im Folgenden abgekürzt als D-Ser⁴-Form) zu verhindern.
Um die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren (spezifisch die D-Trp³-Form im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetat)) und hochpolaren verwandten Substanzen zu verhindern, ist es außerdem bevorzugt, die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, sofort nach der Herstellung dem nächsten Schritt zu unterziehen (der Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz).
[2] Die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die bei dem oben erwähnten Punkt [1] erhalten wurde, wird der Stufe der Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz unterzogen.
Spezifisch wird zuerst das LH-RH-Derivat an dem Harz adsorbiert, indem die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die oben im Abschnitt [1] erhalten wurde, über das synthetische Methacryladsorptionsharz geleitet und dann mit einer Pufferlösung und/oder einer wässrigen Lösung eines Alkohols gewaschen wird (z.B. eine wässrige Lösung von Ethanol, eine wässrige Lösung von Methanol, eine wässrige Lösung von n-Propanol oder eine wässrige Lösung von Isopropanol (bevorzugt eine wässrige Lösung von Ethanol)). Beispiele der Pufferlösung, die verwendet werden kann, schließen Wasser (destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser), eine wässrige Lösung von Natriumacetat, eine wässrige Lösung von Ammoniumacetat, eine wässrige Lösung von Natriumphosphat, eine wässrige Lösung von Ammoniumphosphat und eine wässrige Lösung von Ammoniumchlorid (bevorzugt eine wässrige Lösung von Natriumacetat oder eine wässrige Lösung von Ammoniumacetat) ein. Die hochpolaren verwandten Substanzen (spezifisch siehe oben) können auch wirksam entfernt werden, indem das Harz mit einer wässrigen Lösung von Ethanol gewaschen wird. In diesem Fall ist es bevorzugt, dass die Konzentration der wässrigen Lösung von Ethanol etwa 0 bis 20 Vol.-%, bevorzugt 5 bis 15 Vol.-% ist.
Als nächstes wird das LH-RH-Derivat, das an dem Harz adsorbiert ist, mit einem Elutionsmittel eluiert (z.B. eine wässrige Lösung von Essigsäure, eine wässrige Lösung von Propionsäure, Salzsäure oder eine wässrige Lösung von Phosphorsäure, bevorzugt eine wässrige Lösung von Essigsäure). In diesem Fall ist es bevorzugt, dass die Konzentration des Elutionsmittels etwa 0,01 M bis 0,50 M, bevorzugt 0,05 M bis 0,20 M, bevorzugter 0,05 M bis etwa 0,10 M ist. Zusätzlich ist es bevorzugt, den pH-Wert des Elutionsmittels neutral oder darunter, bevorzugt auf pH 3 bis 6 zu halten. Indem die Elution unter diesen Bedingungen ausgeführt wird, ist es möglich, wirksam die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren zu verhindern (spezifisch D-Trp³-Form und D-Ser⁴-Form im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetat)).
Es ist auch möglich, wirksam die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren (spezifisch D-Trp³-Form und D-Ser⁴-Form im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetat)) zu verhindern, indem die Betriebstemperatur unter 10°C, bevorzugt auf 0 bis 10°C, bevorzugter etwa 3 bis 7°C gehalten wird während des Verfahrens, bei dem die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die oben in Abschnitt [1] erhalten wurde, der Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz unterzogen wird.
Eine mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz gepackte Säule wird für die Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz verwendet.
[3] Die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, das durch Einengen der Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält (des Eluats), oben in [2] erhalten wurde, mit einer an sich bekannten Methode wird der Stufe zur Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen.
Spezifisch wird als erstes die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die durch Einengen der Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält (das Eluat), das oben in [2] mit einer an sich bekannten Methode erhalten wurde, an einem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz adsorbiert und dann mit einer Pufferlösung gewaschen. Beispiele für die zu verwendende Pufferlösung schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, soweit es die Absorption des LH-RH-Derivats an dem synthetischen Adsorptionsharz nicht hemmt, Wasser (destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser), eine wässrige Lösung von Natriumacetat, eine wässrige Lösung von Ammoniumacetat, eine wässrige Lösung von Natriumphosphat, eine wässrige Lösung von Ammoniumphosphat und eine wässrige Lösung von Ammoniumchlorid ein (bevorzugt eine wässrige Lösung von Natriumacetat). Außerdem kann das Waschen durch Verwendung einer wässrigen Lösung eines Alkohols, wie einer wässrigen Lösung von Ethanol, einer wässrigen Lösung von Methanol, einer wässrigen Lösung von n-Propanol oder einer wässrigen Lösung von Isopropanol durchgeführt werden (bevorzugt eine wässrige Lösung von Ethanol).
Als nächstes wird das LH-RH-Derivat mit einem Elutionsmittel eluiert (z.B. einer wässrigen Lösung eines Alkohols, wie einer wässrigen Lösung von Ethanol, einer wässrigen Lösung von Methanol, einer wässrigen Lösung von n-Propanol oder einer wässrigen Lösung von Isopropanol (bevorzugt eine wässrige Lösung von Ethanol)). In diesem Fall ist es bevorzugt, dass die Konzentration des Elutionsmittels 10 Vol.-% bis 50 Vol.-%, bevorzugt etwa 15 Vol.-% bis 40 Vol.-% ist. Es ist außerdem bevorzugt, die Elution durchzuführen, indem auf mehrere Male (bevorzugt zweimal) aufgeteilt wird und indem die Elution unter diesen bevorzugten Bedingungen durchgeführt wird, ist es möglich, racemische Isomere (spezifisch ein racemisches Isomer bei D-Leu benachbart zu Trp in Leuprorelin (Leuprorelinacetat) (im Folgenden abgekürzt als L-Leu⁶-Form) und die hochpolaren verwandten Substanzen (spezifisch siehe oben) effizienter zu entfernen. Es ist außerdem bevorzugt, dass das Elutionsmittel 0 Vol.-% bis 0,1 Vol.-% Essigsäure, bevorzugt 0,005 Vol.-% bis 0,01 Vol.-% Essigsäure enthält und indem die Elution unter diesen bevorzugten Bedingungen durchgeführt wird, ist es möglich, die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren (spezifisch D-Trp³-Form und D-Ser⁴-Form im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetat)) effizient zu verhindern.
In dem Fall, in dem die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die durch Einengen der Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält (das Eluat) im oben erwähnten Abschnitt (2) erhalten wurde, mit einer an sich bekannten Methode erhalten wurde, der Stufe der Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen wird, wird die Entfernung der racemischen Isomeren (spezifisch ein racemisches Isomer bei D-Leu be nachbart zu Trp in Leuprorelin (Leuprorelinacetat)) (im Folgenden abgekürzt als L-Leu⁶-Form) und der hochpolaren verwandten Substanzen (spezifisch siehe oben) effektiver, indem die Betriebstemperatur unter Raumtemperatur, bevorzugt bei 10°C bis 20°C, bevorzugter auf 13°C bis 17°C gehalten wird.
Eine mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz gepackte Säule wird angewendet für die Stufe zur Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz.
Anschließend kann das LH-RH-Derivat mit einer sehr hohen Qualität in hoher Ausbeute erhalten werden durch Einengen der so erhaltenen Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält (das Eluat) mit einer an sich bekannten Methode.
Obwohl die Reihenfolge der Stufen [1] und [2] in dem Reinigungsverfahren des LH-RH-Derivats umgekehrt werden kann, wird die Entfernung und Nebenproduktbildung racemischer Isomerer (spezifisch D-Trp³-Form und D-Ser⁴-Form im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetat)) effektiver, wenn die Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz gefolgt wird von der Stufe der Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz.
(2) Behandlungsstufe vor Reinigung und nach Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft das zur Reinigung des LH-RH-Derivats, das beinhaltet, dass die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Methacryladsorptionsharz und der Stufe zur Behandlung mit dem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des LH-RH-Derivats mit höherer Qualität, indem eine Stufe durchgeführt wird, um die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, herzustellen, das erhalten wird, indem das LH-RH-Derivat, das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt ist, einer Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen unterzogen wird vor den Stufen zur Behandlung mit den synthetischen Adsorptionsharzen (eine Stufe zur Behandlung vor der Reinigung) bei niedriger Temperatur.
Im Folgenden wird die Stufe zur Behandlung vor der Reinigung im Detail beschrieben.
[1] Herstellung des rohen LH-RH-Derivats
Wie oben beschrieben, ist das LH-RH-Derivat, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, ein Peptid, so dass ein rohes LH-RH-Derivat synthetisiert werden kann mit einer an sich bekannten Methode zur Peptidsynthese. Die Methode zur Peptidsynthese kann z.B. entweder mit einer Festphasensynthesemethode oder einer Flüssigphasensynthesemethode durchgeführt werden. Das bedeutet, das jeweilige Peptid kann hergestellt werden, indem ein Teilpeptid oder eine Aminosäure, die das rohe LH-RH-Derivat bilden kann, mit dem restlichen Teil kondensiert wird, und, in dem Fall, in dem das Produkt eine Schutzgruppe hat, die Schutzgruppe entfernt wird. Beispiele für eine bekannte Kondensationsmethode und Entfernung der Schutzgruppe schließen die in den folgenden Literaturstellen 1 bis 5 beschriebenen Methoden ein.

1. M. Bodansky und M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1996)
2. Schroeder und Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
3. Nobuo Izumiya et al., Bases and Experiments for Peptide Synthesis, Maruzen Kabushiki Kaisha (1975)
4. Haruaki Yajima und Syunpei Sakakibara, Lectureships in Biochemistry Experiments 1, Protein Chemistry IV, 205 (1977)
5. Haruaki Yajima, Herausg., Continuation of Development of Drugs, Bd. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten.

Zur Synthese des rohen LH-RH-Derivats kann gewöhnlich ein im Handel erhältliches Harz für eine Peptidsynthese angewendet werden. Beispiele für ein solches Harz können ein Chlormethylharz, ein Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz und 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz einschließen. Unter Verwendung eines solchen Harzes können Aminosäuren, bei denen die α-Aminogruppe und eine funktionelle Gruppe an einer Seitenkette in geeigneter Weise geschützt wurden, an dem Harz kondensiert werden gemäß der Sequenz des jeweiligen rohen LH-RH-Derivats mit einer Vielzahl von an sich bekannten Methoden, um das LH-RH-Derivat zu erhalten, das mit Schutzgruppen geschützt ist. Nach der letzten Reaktion wird das rohe LH-RH-Derivatpeptid von dem Harz isoliert und eine Vielzahl von Schutzgruppen werden gleichzeitig entfernt, um das jeweilige rohe LH-RH-Derivat zu erhalten.
Zur Kondensation der oben erwähnten geschützten Aminosäuren kann eine Vielzahl von aktivierenden Reagenzien für eine Peptidsynthese angewendet werden, aber Carbodiimide sind besonders vorteilhaft. Beispiele für Carbodiimide, die verwendet werden können, schließen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid ein. Bei der Aktivierung dieser Reagenzien kann eine geschützte Aminosäure direkt dem Harz zugefügt werden zusammen mit einem Additiv, um die Racemisierung zu hemmen (z.B. HOBt, HOOBt oder HONb), oder eine geschützte Aminosäure kann vorher als symmetrisches Säureanhydrid oder HOBt-Ester oder HOOBt-Ester aktiviert werden und dann dem Harz zugefügt werden.
Ein für die Aktivierung einer geschützten Aminosäure und die Kondensation des Harzes zu verwendendes Lösungsmittel kann in geeigneter Weise ausgewählt werden aus Lösungsmitteln, von denen bekannt ist, dass sie in Kondensationsreaktionen von Peptiden verwendbar sind. Beispiele für das zu verwendende Lösungsmittel schließen ein Säureamid, wie N,N-Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon, einen halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid oder Chloroform, einen Alkohol, wie Trifluorethanol, ein Sulfoxid, wie Dimethylsulfoxid, Pyridin, einen Ether, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, ein Nitril, wie Acetonitril oder Propionitril, einen Ester, wie Methylacetat oder Ethylacetat und eine entsprechende Mischung davon ein. Die Reaktionstemperatur wird geeigneterweise aus Bereichen ausgewählt, von denen bekannt ist, dass sie für Reaktionen zur Bildung von Peptidbindungen geeignet sind und sie werden üblicherweise ausgewählt aus einem Bereich von –20 bis 50°C. Das aktivierte Aminosäurederivat wird gewöhnlich in einem 1,5- bis 4-fachen Überschuss verwendet. In dem Fall, in dem sich die Kondensation als ungenügend erweist als Ergebnis eines Tests unter Verwendung der Ninhydrinreaktion, kann eine ausreichende Kondensation erreicht werden, indem die Kondensationsreaktion wiederholt wird, ohne die Schutzgruppen zu entfernen. Sogar in dem Fall, wo eine ausreichende Kondensation nicht erreicht werden kann, indem die Reaktion wiederholt wird, kann ein Einfluss auf die folgenden Reaktionen vermieden werden durch Acetylierung nicht umgesetzter Aminosäuren mit Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol.
Beispiele für Schutzgruppen, die für die Aminogruppe in den Ausgangsmaterialien verwendet werden können, schließen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Nitro, Formyl, 2-Nitrophenylsulfonyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc und p-Methoxybenzolsulfonyl ein.
Die Carboxylgruppe kann z.B. durch Alkylveresterung (z.B. die Bildung eines Esters eines geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Alkyls, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl oder 2-Adamantyl), Aralkylveresterung (z.B. Veresterung unter Bildung des Benzylesters, des 4-Nitrobenzylesters, des 4-Methoxybenzylesters, des 4-Chlorbenzylesters oder des Benzhydrylesters), Phenacylveresterung, Benzyloxycarbonylhydrazidbildung, t-Butoxycarbonylhydrazidbildung oder Tritylhydrazidbildung geschützt werden.
Die Hydroxylgruppe von Serin kann z.B. durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele für Gruppen, die für diese Veresterung geeignet sind, schließen eine Niedrig-(C₁-C₆)-alkanoylgruppe, wie eine Acetylgruppe, eine Aroylgruppe, z.B. Benzoylgruppe, eine Gruppe, die von einer Kohlensäure abgeleitet sein kann, wie eine Benzyloxycarbonylgruppe oder Ethoxycarbonylgruppe ein. Zusätzlich schließen Beispiele für eine Gruppe, die für die Veretherung geeignet ist, die Benzylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe und t-Butylgruppe ein.
Bezüglich einer Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyrosin wird z.B. Bzl, Cl₂-Bzl, p-Nitrobenzyl, Br-Z oder t-Butyl verwendet.
Bezüglich der Schutzgruppe für das Imidazol in Histidin wird z.B. Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt oder Fmoc verwendet.
Beispiele für das (rohe) LH-RH-Derivat, das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt werden soll, schließen das Derivat ein, bei dem die α-Aminogruppe und eine funktionelle Gruppe an der Seitenkette irgendeiner der das Derivat bildenden Aminosäuren in dem oben erwähnten LH-RH-Derivat geschützt sind, mit den oben erwähnten Schutzgruppen ein.
Spezifisch schließen Beispiele für das LH-RH-Derivat, das mit Schutzgruppen geschützt ist, ein Peptid der Formel (III) 5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg(X)-Pro-Z ein, worin X eine Schutzgruppe zeigt, Y einen Rest ausgewählt aus DLeu, DAla, DTrp, DSer(tBu), D2Nal und DHis(ImBzl) zeigt, und Z NH-C₂H₅ oder Gly-NH₂ bedeutet oder ein Salz davon.
Als Schutzgruppe, die durch X in der Formel (III) dargestellt wird, kann Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Nitro, Formyl, 2-Nitrophenylsulfonyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc und p-Methoxybenzolsulfonyl verwendet werden, wobei p-Methoxybenzolsulfonyl besonders bevorzugt ist.
Beispiele für das Salz des in Formel (III) dargestellten Peptids schließen Salze ein, wie die vorher beschriebenen.
Das in Formel (III) dargestellte Peptid oder ein Salz davon kann außerdem mit an sich bekannten Methoden zur Peptidsynthese, wie oben beschrieben, hergestellt werden, z.B. kann das Peptid mit der in WO Nr. 97/48726 beschriebenen Methode oder einer Modifikation davon hergestellt werden.
Als Methode zur Entfernung der Schutzgruppen (Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen) kann z.B. eine Hydrogenolyse in einem Wasserstoffstrom in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Schwarz, Pd-Kohle oder dgl.; eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder einer gemischten Lösung davon (bevorzugt Methansulfonsäure); eine basische Behandlung mit Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin oder Piperazin; eine Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak angewendet werden. Die oben erwähnte Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen wird allgemein bei einer Temperatur von 40°C oder darunter durchgeführt, wobei durch Ausführung der Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen unter 25°C, bevorzugt bei 5 bis 15°C, bevorzugter bei 8 bis 12°C, die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren des LH-RH-Derivats (spezifisch D-His²-Form in Leuprorelin (Leuprorelinacetat) im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetat)) wirksam gehemmt werden kann. Bei der Säurebehandlung ist zusätzlich ein Kationenfänger, wie z.B. Anisol, Phenol, Thioanisol, meta-Kresol, para-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butanthiol oder 1,2-Ethanthiol (bevorzugt Phenol) wirksam. Auch die als Schutzgruppe für Imidazol in Histidin zu verwendende 2,4-Dinitrophenylgruppe wird durch Behandlung mit Thiophenol entfernt und die Formylgruppe, die als Schutzgruppe für Indol in Tryptophan verwendet wird, wird durch Abspaltung durch Säurebehandlung in Gegenwart des oben erwähnten 1,2-Ethanthiols oder 1,4-Butanthiols entfernt ebenso wie durch alkalische Behandlung mit einer verdünnten Säure von Natriumhydroxid oder verdünntem Ammoniakwasser.
Die Reaktionszeit bei der oben erwähnten Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen ist gewöhnlich etwa 1 Stunde bis 10 Stunden, bevorzugt 2 bis 5 Stunden, bevorzugter 2 bis 3 Stunden.
Bezüglich einer spezifischeren Methode zur Entfernung der Schutzgruppen (Abspaltung der Schutzgruppen), z.B. in dem Fall, in dem das durch die Formel (III) dargestellte Peptid oder ein Salz davon der Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen unterzogen wird, ist eine bevorzugte Methode beispielhaft eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder einer gemischten Lösung davon (bevorzugt Methansulfonsäure). In diesem Fall ist es außerdem bevorzugt, einen Kationenfänger, wie z.B. Anisol, Phenol, Thioanisol, meta-Kresol, para-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butanthiol oder 1,2-Ethanthiol (bevorzugt Phenol) zuzufügen. Die Abspaltung der Schutzgruppen wird allgemein bei einer Temperatur von 40°C oder weniger durchgeführt, wobei durch Ausführung der Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen unter 25°C, bevorzugt bei 5 bis 15°C, bevorzugter bei 8 bis 12°C, die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren des LH-RH-Derivats (spezifisch D-His²-Form bei Leuprorelin (Leuprorelinacetat) im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetats)) wirksam verhindert werden kann.
Der Schutz funktioneller Gruppen, die nicht an den Reaktionen der Ausgangsmaterialien teilnehmen sollten und die Schutzgruppen ebenso wie die Entfernung der Schutzgruppen, die Aktivierung der funktionellen Gruppen, die an den Reaktionen teilnehmen und dgl. können in geeigneter Weise aus bekannten Gruppen oder bekannten Mitteln ausgewählt werden.
[2] Aufarbeitungsstufe nach der Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen
Als erstes wird die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, das durch die Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen oben in [1] erhalten wurde (Reaktionslösung) neutralisiert. Die Neutralisierungslösung wird ausgewählt aus bekannten Lösungen, wobei z.B. in dem Fall, in dem die Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen durch Säurebehandlung ausgeführt wird, eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid, eine wässrige Lösung von Kaliumhydroxid, eine wässrige Lösung von Natriumcarbonat, eine wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat, Ammoniakwasser oder Triethylamin (bevorzugt eine wässrige Lösung von Natriumcarbonat) verwendet wird und in dem Fall, in dem die Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen durch basische Behandlung ausgeführt wird, Salzsäure oder Essigsäure (bevorzugt Salzsäure) verwendet wird.
Die Neutralisierungsreaktion wird allgemein bei einer Temperatur von 40°C oder weniger ausgeführt, wobei durch Ausführung der Neutralisierungsreaktion unter 10°C, bevorzugt unter 5°C, noch bevorzugter bei –5°C bis 5°C die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren des LH-RH-Derivats (spezifisch D-Trp³-Form bei Leuprorelin (Leuprorelinacetat) im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetats)) wirksam verhindert werden kann.
Als nächstes wird, nachdem eine organische Phase aus der neutralisierten Mischung abgetrennt worden ist, eine Pufferlösung (z.B. eine wässrige Lösung von Natriumacetat, eine wässrige Lösung von Ammoniumacetat, eine wässrige Lösung von Ammoniumchlorid, eine wässrige Lösung von Natriumphosphat oder eine wässrige Lösung von Ammoniumphosphat (bevorzugt eine wässrige Lösung von Natriumacetat) zugefügt, um das LH-RH-Derivat in eine wässrige Phase zu überführen. Zusätzlich ist es bevorzugt, den pH-Wert auf 3 bis 5, bevorzugt 3,9 bis 4,3 einzustellen.
Die wässrige Phase wird mit Ethylacetat, Methylacetat, Toluol, Methylenchlorid oder Ether (bevorzugt Ethylacetat) gewaschen und wird mit an sich bekannten Methoden eingeengt und der pH-Wert der Lösung wird auf 4 bis 6, bevorzugt 4,3 bis 4,7 mit einem den pH-Wert einstellenden Mittel, wie Essigsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure (bevorzugt Essigsäure) eingestellt, um die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, zu erhalten.
Eine Reihe von Stufen, die umfassen, dass die organische Phase aus der neutralisierten Mischung erhalten wird, bis dass die Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, gewonnen wird, wird allgemein bei einer Temperatur von 40°C oder weniger ausgeführt, wobei dadurch, dass diese Stufen bei 0 bis 10°C, bevorzugt 3 bis 7°C durchgeführt werden, die Nebenproduktbildung von racemischen Isomeren des LH-RH-Derivats (spezifisch D-Trp³-Form bei Leuprorelin (Leuprorelinacetat) im Fall des oben erwähnten Leuprorelins (Leuprorelinacetats)) wirksam gehemmt werden kann.
Das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene LH-RH-Derivat ist das LH-RH-Derivat mit extrem hoher Qualität, bei dem die Menge an Verunreinigungen (racemische Isomere des LH-RH-Derivats, hochpolare verwandte Substanzen und andere Verunreinigungen) viel geringer ist als bei solchen LH-RH-Derivaten, die mit vorbekannter Technik erhalten wurden. Bei vorbekannter Technik muss zusätzlich eine Stufe zur Behandlung mit einem synthetischen Adsorptionsharz oder eine Stufe zur Behandlung mit einem Ionenaustauschharz mehrere Male wiederholt werden, wohingegen bei der vorliegenden Erfindung eine ausreichende Reinigung wirksam erfolgen kann, indem die Stufe zur Behandlung mit dem synthetischen Adsorptionsharz zweimal durchgeführt wird, wobei das LH-RH-Derivat in hohen Ausbeuten erzeugt werden kann, während die Verarbeitungszeit verkürzt wird. Von diesem Standpunkt aus ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein extrem vorteilhaftes Verfahren als industrielles Verfahren zur Herstellung des LH-RH-Derivats im Vergleich zu der vorbekannten Technik.
Wie oben beschrieben, kann ein LH-RH-Derivat mit extrem hoher Qualität mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
Ein spezifisches Beispiel für "das LH-RH-Derivat mit hoher Qualität" ist ein gereinigtes LH-RH-Derivat (bevorzugt gereinigtes Leuprorelin oder Salz davon, bei dem der Gehalt aller verwandten Substanzen 1% oder weniger (bevorzugt 0,9% oder weniger, bevorzugter 0,8% oder weniger, weiter bevorzugt 0,7% oder weniger) ist.
Alle verwandten Substanzen bedeutet hier die Gesamtheit aller Verunreinigungen, die mit Hochleistungsflüssigchromatographie nachgewiesen werden können und die Verunreinigungen sind racemische Isomere der LH-RH-Derivate, hochpolare verwandte Substanzen und andere Verunreinigungen.
Spezifischere Beispiele zum Beispiel in dem Fall, wo das gereinigte LH-RH-Derivat gereinigtes Leuprorelin oder ein Salz davon ist, sind [1] gereinigtes Leuprorelin oder ein Salz davon, bei dem der Gehalt an 5-oxo-Pro-D-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃ oder eines Salzes davon 0,3% oder weniger (bevorzugt 0,25% oder weniger, noch bevorzugter 0,2% oder weniger) ist und [2] gereinigtes Leuprorelin oder ein Salz davon, bei dem der Gehalt an 5-oxo-Pro-His-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃ oder eines Salzes davon 0,15% oder weniger (bevorzugt 0,1% oder weniger, bevorzugter 0%) ist.
Die oben erwähnten gereinigten LH-RH-Derivate haben eine geringe Toxizität und können an Säugetiere (z.B. Menschen, Affen, Hunde, Ratten und Mäuse) als prophylaktische oder therapeutische Mittel für geschlechtshormonabhängige Krankheiten, wie Prostatakrebs, benigne Prostatahypertrophie, Endometriose, Gebärmuttermyome, Gebärmutterfibroidtumoren, vorzeitige Pubertät, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Gebärmutterhalskarzinom und dgl. oder Alzheimer-Krankheit verabreicht werden.
Es kann auch jedes der oben erwähnten gereinigten LH-RH-Derivate oral als Tablette, die nach Bedarf beschichtet ist, als Kapsel, Elixier, Präparat mit verzögerter Freisetzung oder dgl. verabreicht werden oder kann parenteral verabreicht werden als injizierbares Präparat, z.B. als sterile Lösung in Wasser oder in einer anderen pharmazeutisch annehmbaren Lösung oder als Präparat in einer Form für die nasale Verabreichung, z.B. eine Lösung, Suspension oder dgl. Das oben erwähnte Präparat kann hergestellt werden, indem das oben erwähnte gereinigte LH-RH-Derivat mit einem physiologisch annehmbaren bekannten Träger, einem Aromatisierungsmittel, einem Hilfsstoff, einem Vehikel, einem Konservierungsmittel, einem Stabilisator und einem Bindemittel vermischt wird zu einer Einheitsdosierungsform, die für die allgemein pharmazeutische Praxis erforderlich ist.
Beispiele für Additive, die zum Vermischen zu einer Tablette, einer Kapsel und dgl. verwendet werden können, schließen ein Bindemittel, wie Gelatine, Maisstärke, Traganth oder Gummi arabicum, einen Hilfsstoff, wie kristalline Cellulose, ein Quellmittel, wie Maisstärke, Gelatine oder Alginsäure, ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, einen Süßstoff, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, ein Aromatisierungsmittel, wie Pfefferminz und Akamonoöl oder Kirsch ein. In dem Fall, in dem die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann weiterhin ein flüssiger Träger, wie ein Öl oder Fett zusätzlich zu den oben erwähnten Arten von Materialien enthalten sein. Eine sterile Zusammensetzung zur Injektion kann gemäß üblicher pharmazeutischer Praxis formuliert werden, was ausgeführt wird, indem eine aktive Substanz, ein natürlich vorkommendes pflanzliches Öl, wie Sesamöl oder Kokosnussöl, in einem Träger, wie Wasser zur Injektion, gelöst oder suspendiert wird. Eine wässrige Lösung, die zur Injektion verwendet werden soll, ist beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, eine isotonische Lösung, die Glucose und andere Hilfsstoffe enthält (z.B. D-Sorbit, D-Mannit, Natriumchlorid und dgl.), wobei ein adäquates solubilisierendes Mittel, wie ein Alkohol (z.B. Ethanol), ein Polyalkohol (z.B. Propylenglycol und Polyethylenglycol), ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel (z.B. Polysorbat 80 (TM) und HCO-50) in Kombination verwendet werden können. Eine ölige Flüssigkeit, die verwendet werden kann, ist beispielsweise Sesamöl oder Sojaöl, wobei ein solubilisierendes Mittel, wie Benzylbenzoat oder Benzylalkohol in Kombination verwendet werden kann.
Die oben erwähnten Präparate können auch mit einem Puffermittel (z.B. einer Phosphatpufferlösung oder einer Natriumacetatpufferlösung), einem Analgetikum (z.B. Benzalkoniumchlorid oder Procainhydrochlorid), einem Stabilisator (z.B. Humanserumalbumin oder Polyethylenglycol), einem Konservierungsmittel (z.B. Benzylalkohol oder Phenol), einem Antioxidans und dgl. compoundiert werden. Die so hergestellte injizierbare Lösung wird gewöhnlich in geeignete Ampullen abgefüllt.
Ein Depotpräparat, das das oben erwähnte gereinigte LH-RH-Derivat enthält, kann hergestellt mit an sich bekannten Methoden, z.B. mit der in JP 60-100516 A, JP 62-201816 A, JP 4-321622 A, JP 6-192068 A, JP 9-132524 A, JP 9-221417 A, JP 11-279054 A, WO 99/360099 beschriebenen Methode.
Die Dosierung des oben erwähnten gereinigten LH-RH-Derivats variiert breit abhängig von der jeweiligen Krankheit, dem jeweiligen Wesen und dgl., aber die Dosierung pro Einheit kann in geeigneter Weise ausgewählt werden, z.B. bevorzugt in einem Bereich von 0,01 mg bis 100 mg/kg Körpergewicht für einen erwachsenen Patienten mit Prostatakrebs. Bevorzugter kann die Dosierung in geeigneter Weise ausgewählt werden aus einem Bereich von 0,05 mg bis 50 mg/kg Körpergewicht.
Die Dosierung des Depotpräparats, das das oben erwähnte gereinigte LH-RH-Derivat enthält, z.B. im Fall eines Depotpräparats mit Wirkstoffeffizienz für einen Monat, kann als Dosierung des Depotpräparats pro Einheit in geeigneter Weise ausgewählt werden bevorzugt aus einem Bereich von 0,1 mg bis 500 mg/kg Körpergewicht für einen erwachsenen Patienten mit Prostatakrebs. Bevorzugter kann die Dosierung geeigneterweise ausgewählt werden aus einem Bereich von 0,2 mg bis 300 mg/kg Körpergewicht.
Beispiele
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung detaillierter, sollen aber den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
Beispiel 1 – Herstellung von 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid (Leuprorelin, Leuprolide) (1)
Zu einer gemischten Lösung von 748 g Methansulfonsäure und 56 g Phenol wurden 68,35 g (52,92 g als reines Leuprolide) 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-N^ω-p-methoxybenzolsulfonyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid zugegeben und die entstehende Lösung wurde bei 8 bis 12°C etwa 3 Stunden lang umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde bei –5 bis 5°C zu einer gemischten Lösung von einer Lösung von Kaliumcarbonat (646 g) in Wasser (1896 ml) und 396 ml Ethylacetat zugegeben und die entstehende Mischung wurde dann bei 3 bis 7°C 30 Minuten lang gerührt und dann neutralisiert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 2316 ml einer 0,11 M Natriumacetatpufferlösung (pH: 3,9 bis 4,3) gemischt und bei 3 bis 7°C gerührt, um die Extraktion auszuführen. Der pH-Wert der wässrigen Phase wurde auf 4,3 bis 4,7 mit Essigsäure eingestellt und mit 372 ml Ethylacetat vermischt und die entstehenden Phasen wurden dann getrennt. Die wässrige Phase wurde bei 3 bis 7°C mit 372 ml Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Phase wurde bei vermindertem Druck unter 25°C eingeengt und dann der pH-Wert mit Essigsäure auf 4,3 bis 4,7 eingestellt, um eine wässrige Lösung (1) von Leuprolide zu erhalten.
Ausbeute von Leuprolideacetat: 44,26 g (90,9%).
Qualität gemäß Hochleistungsflüssigchromatographie (Peakflächenprozentanteil für Leuprolide): D-Trp³-Form: nicht nachgewiesen; D-Ser⁴-Form: nicht nachgewiesen; D-His²-Form: 0,27%; L-Leu⁶-Form: 1,14%.
Beispiel 2 – Herstellung von 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid (Leuprolide) (2)
Durch eine Säule, die mit 5500 ml eines synthetischen Methacryladsorptionsharzes gepackt war (HP 2MG: Mitsubishi Chemical Corporation) wurden bei 3 bis 7°C 5600 g der wässrigen Lösung (1) von Leuprolide (Leuprolideacetat: 85,46 g) geleitet. Die entstehende Säule wurde gewaschen, indem aufeinander folgend 11.000 ml einer 0,3 M wässrigen Lösung von Natriumacetat (pH 6,3), 13.750 ml einer 0,025 M wässrigen Lösung von Ammoniumacetat und 19.250 ml einer 10 vol.-%igen wässrigen Lösung von Ethanol bei 3 bis 7°C durchgeleitet wurden. Die Elution wurde ausgeführt, indem 41.250 ml einer 0,05 M wässrigen Lösung von Essigsäure bei 3 bis 7°C durchgeleitet wurden. Die Fraktionen, die Leuprolide enthielten, wurden gesammelt und bei vermindertem Druck unter 35°C eingeengt, um eine wässrige Lösung (2) von Leuprolide zu erhalten.
Ausbeute an Leuprolideacetat: 73,77 g (86,3%)
Qualität gemäß Hochleistungsflüssigchromatographie (Peakflächenprozentanteil für Leuprolide): D-Trp³-Form: 0,11%; D-Ser⁴-Form: 0,03%; D-His²-Form: 0,24%; L-Leu⁶-Form: 0,42%.
Beispiel 3 – Herstellung von 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid (Leuprolide) (3)
Durch eine Säule, die mit 2200 ml kleinen Teilchen eines synthetischen aromatischen Adsorptionsharzes (HP 20SS: Mitsubishi Chemical Corporation) gepackt war, wurden bei 13 bis 17°C 3731 g der wässrigen Lösung (2) von Leuprolide (Leuprolideacetat: 73,54 g) geleitet. Die entstehende Säule wurde gewaschen, indem aufeinander folgend 6600 ml einer 0,1 M wässrigen Lösung von Natriumacetat (pH 6,3), 9900 ml einer 0,01 M wässrigen Lösung von Ammoniumacetat und 2200 ml Wasser bei 13 bis 17°C geleitet wurden. Die Elution wurde durchgeführt, indem aufeinander folgend 8800 ml einer 20 vol.-%igen wässrigen Lösung von Ethanol und 8800 ml einer 35 vol.-%igen wässrigen Lösung von Ethanol bei 13 bis 17°C durchgeleitet wurden. Die Fraktionen, die Leuprolide enthielten, wurden gesammelt und bei vermindertem Druck unter 35°C eingeengt, um eine wässrige Lösung (3) von Leuprolide zu erhalten.
Ausbeute an Leuprolideacetat: 64,55 g (87,8%)
Qualität gemäß Hochleistungsflüssigchromatographie (Peakflächenprozentanteil für Leuprolide): D-Trp³-Form: 0,12%; D-Ser⁴-Form: 0,04%; D-His²-Form: 0,18%; L-Leu⁶-Form: nicht nachgewiesen.
Beispiel 4 – Herstellung von 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamidmonoacetat (Leuprolideacetat) (4)
Die Säulenchromatographie von 436,7 g der wässrigen Lösung (3) von Leuprolide (Leuprolideacetat: 63,90 g) wurde ausgeführt, indem 2350 ml vernetztes Dextrangel (Sephadex LH-20: Pharmacia) verwendet wurden, wobei mit einer 0,005 M wässrigen Lösung von Essigsäure eluiert wurde. Die Fraktionen, die Leuprolide enthielten, wurden gesammelt und einer Entfärbung mit 1,16 g Aktivkohle unterzogen. Die Aktivkohle wurde filtriert, das Filtrat bei vermindertem Druck unter 35°C eingeengt und das Konzentrat einer Ultrafiltration unterzogen. Das Filtrat wurde lyophilisiert, um 60,38 g gefriergetrocknetes Leuprolideacetat zu erhalten.
Ausbeute an Leuprolideacetat: 60,02 g (98,9%)
Qualität gemäß Hochleistungsflüssigchromatographie (Peakflächenprozentanteil für Leuprolide): D-Trp³-Form: 0,11%; D-Ser⁴-Form: 0,03%; D-His²-Form: 0,18%; L-Leu⁶-Form: nicht nachgewiesen.
Beispiel 5 – Herstellung von 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid (Leuprolide) (3')
Durch eine Säule, die mit 120 l kleinen Teilchen eines aromatischen synthetischen Adsorptionsharzes (HP 20SS: Mitsubishi Chemical Corporation) gepackt war, wurden bei 13 bis 17°C 200 l der wässrigen Lösung (2) von Leuprolide (Leuprolideacetat: 4080 g) geleitet. Die entstehende Säule wurde gewaschen, indem aufeinander folgend 360 l einer 0,1 M/l wässrigen Lösung von Natriumacetat (pH 6,3), 540 l einer 0,01 M/l wässrigen Lösung von Ammoniumacetat und 120 l Wasser bei 13 bis 17°C durchgeleitet wurden. Die Elution wurde durchgeführt, indem aufeinander folgend 960 l einer 15 vol.-%igen wässrigen Lösung von Ethanol (die 0,01% G/V Essigsäure enthielt), 480 l einer 20 vol.-%igen wässrigen Lösung von Ethanol (die 0,01% G/V Essigsäure enthielt) und 360 l einer 30 vol.-%igen wässrigen Lösung von Ethanol (die 0,01% G/V Essigsäure enthielt) bei 13 bis 17°C durchgeleitet wurden. Die Fraktionen, die Leuprolide enthielten, wurden gesammelt und bei vermindertem Druck unter 35°C eingeengt, um eine wässrige Lösung von Leuprolide zu erhalten.
Ausbeute an Leuprolideacetat: 3527 g (86,4%)
Qualität gemäß Hochleistungsflüssigchromatographie (Peakflächenprozentanteil für Leuprolide): D-Trp³-Form: 0,13%; D-Ser⁴-Form: 0,04%; D-His²-Form: 0,25%; L-Leu⁶-Form: nicht nachgewiesen.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird es möglich, die Nebenproduktbildung von Verunreinigungen, wie racemischen Isomeren der LH-RH-Derivate zu unterdrücken und die Verunreinigungen, wie die racemischen Isomeren, wirksam zu entfernen, so dass es möglich wird, die LH-RH-Derivate in extrem hoher Qualität zu erzeugen. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine ausreichende Reinigung effektiv erfolgen, indem zweimal eine Stufe zur Behandlung mit einem synthetischen Adsorptionsharz durchge führt wird, wodurch die LH-RH-Derivate in hohen Ausbeuten wirksam durch einfache Arbeitsschritte erzeugt werden können und ohne komplizierte Verfahren zur Fest-Flüssig-Trennung einzuschalten.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Derivats des luteinisierenden Hormon freisetzenden Hormons (LH-RH-Derivat), das beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, einer Stufe der Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz und einer Stufe der Behandlung mit einem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das LH-RH-Derivat ein Peptid der Formel 5-Oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z ist, worin Y einen Rest ausgewählt aus DLeu, DAla, DTrp, DSer(tBu), D2Nal und DHis(ImBzl) bedeutet und Z NH-C₂H₅ oder Gly-NH₂ bedeutet, oder ein Salz davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das LH-RH-Derivat ein Peptid der Formel 5-Oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ oder das Acetat davon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren beinhaltet, dass ein synthetisches Methacryladsorptionsharz mit sich wiederholenden Einheiten der Formel
verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das aromatische synthetische Adsorptionsharz ein synthetisches Styroldivinylbenzoladsorptionsharz ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die durchschnittliche Teilchengröße des synthetischen Styroldivinylbenzoladsorptionsharzes 60 μm bis 150 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Stufe der Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz bei einer Temperatur unter 10°C unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Stufe der Behandlung mit einem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz bei einer Temperatur von 10 bis 20°C unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, der Stufe der Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz unterzogen wird und anschließend der Stufe der Behandlung mit einem aromatischen synthetischen Adsorptionsharz unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, in der Stufe der Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz über ein Harz geleitet wird und dann das LH-RH-Derivat, das an dem Harz adsorbiert ist, mit einer wässrigen Essigsäurelösung eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Konzentration der wässrigen Essigsäurelösung 0,01 M bis 0,50 M ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, in der Stufe der Behandlung mit einem synthetischen Methacryladsorptionsharz über ein Harz geleitet wird und anschließend mit einer wässrigen Lösung von Ethanol gewaschen wird und dann das LH-RH-Derivat, das an dem Harz adsorbiert ist, eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die ist, die erhalten wird, indem das LH-RH-Derivat, das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt ist, einer Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen und anschließend einer Neutralisierungsreaktion bei einer Temperatur unter 10°C unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Lösung, die das LH-RH-Derivat enthält, die ist, die erhalten wird, indem das LH-RH-Derivat, das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt ist, einer Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppen und dann einer Neutralisierungsreaktion bei einer Temperatur unter 10°C unterzogen wird und anschließend die entstehende Mischung einer Extraktion des LH-RH-Derivats unterzogen wird und dann der Extrakt bei bei einer Temperatur unter 25°C eingeengt wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützte LH-RH-Derivat durch die Formel 5-Oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg(X)-Pro-Z dargestellt wird, worin X eine Schutzgruppe bedeutet, Y einen Rest ausgewählt aus DLeu, DAla, DTrp, DSer(tBu), D2Nal und DHis(ImBzl) bedeutet und Z NH-C₂H₅ oder Gly-NH₂ bedeutet.