DE3312399A1

DE3312399A1 - Biologisch aktive peptide und arzneimittel, welche diese enthalten

Info

Publication number: DE3312399A1
Application number: DE19833312399
Authority: DE
Inventors: Roberto De 20149 Milano Castiglione; Giuseppe 20033 Desio Perseo; Francesco 20135 Milano Santangelo
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SpA 20159 Milano; Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1982-04-13
Filing date: 1983-04-06
Publication date: 1983-10-13
Also published as: BE896400A; FR2524878B1; DE3312399C2; IT8320494A0; IT1214444B; JPS58183657A; NL8301281A; FR2524878A1; US4474765A

Description

FARMITALIA CARLO ERBA S.ρ.Α., MAILAND / ITALIEN

Biologisch aktive Peptide und Arzneimittel, welche diese enthalten

Die Erfindung betrifft biologisch aktive Peptide, deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
5

Die erfindungsgemässen Peptide sind Fragmente oder modifizierte Fragmente von Sauvagin, einem natürlichen Peptid, bestehend aus 40 Aminosäureresten (P.C. Montecucchi, A. Henschen, Int. J. Peptide Protein Res. 18, 113-120, 1981), und zeigt eine Reihe von interessanten pharmakologischen Aktivitäten, z.B. die Freigabe von ACTH und von ß-Endorphin und die Inhibierung der Freigabe des Wachstumshormons, TSH und von Prolactin (P.C. Montecucchi et al, "Hormone receptor in Digestion and Nutrition, G. Rosselin et al. eds., Elsevier/North-Holland Biomed. Press, 1979, 101-108).

9«α ο · β · »η β

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemässen Peptide ganz oder zum Teil das biologische Aktivitätsspektrum von Sauvagine beibehalten. Die Bedeutung dieser Entdeckung ist ausserordentlich gross. Die Synthese eines Tridecapeptids oder eines kürzeren Homologs ist naturgemäss einfacher als die Synthese eines Peptids von 40 Aminosäureresten. Man erhält reinere oder leichter zu reinigende Produkte.

In der nachfolgenden Beschreibung werden die Symbole und Abkürzungen so verwendet, wie sie in der Peptidchemie üblich sind (siehe J. Biol. Chem., 1972, 247, 977-983).

Die Erfindung betrifft Peptide der allgemeinen Formel:

X-A-Pro-Pro-Ile-Ser-B-C-Leu-D-E-F-G-W

worin bedeuten:

X ein Wasserstoffatom, eine Schutzgruppe für endständigen Stickstoff vom Acyl-, aromatischen Urethan-, Alkyl-, Aralkyl- oder aliphatischen Urethantyp oder einen Rest einer neutralen L-Aminosäure, wobei die freie Aminogruppe des Restes gewünschtenfalls durch eine Schutzgruppe für ein endständiges Stickstoffatom der vorerwähnten Art geschützt ist,

A einen L-Aminosaurerest oder einen Glycinrest, B einen neutralen L-Aminosäurerest,

C einen neutralen L-Aminosäurerest oder einen sauren L-Aminosäurerest,

D einen L-Aminosäurerest, der in der Seitenkette eine alkoholische Hydroxylgruppe enthält, die frei oder durch eine übliche Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion geschützt ist,

E eine Valenzbindung oder einen neutralen L-Aminosäurerest,
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F eine Valenzbindung oder einen L-Aminosäurerest,

G eine Valenzbindung oder einen neutralen L-Aminosäurerest,

W eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Gruppe der Formel OR, NHR, NR₂ oder NH-NH-R¹, worin R eine geradkettige, verzweigte oder zyklische (einschlxesslich kondensierte oder überbrückte Ringe) Alkylgruppe mit bis zu 11 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert ist, eine Phenylgruppe oder eine Aralkylgruppe mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet und worin R^! ein Wasserstoffatom, eine der Gruppen, für die R steht, eine Alkenylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine geradkettige, verzweigte oder

t» · * · α β β

I · β » Ο β

β · β ο * *

zykloaliphatische Acylgruppe mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen , die unsubstituiert ist oder substituiert ist durch eine Hydroxy- oder eine Aminogruppe oder ein Halogenatom, eine aromatische Acylgruppe, unsubstituiert oder substituiert durch eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder ■ durch ein Halogenatom, eine geradkettige, verzweigte oder zyklische aliphatische urethanartige Gruppe mit 3 bis 11 Kohlenstoffatomen oder eine } ο aromatische urethanartige Gruppe bedeutet,

sowie ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

Bevorzugte Schutzgruppen für den endständigen Stickstoff, für welche X steht, schliessen solche vom Acyltyp ein, wie Formyl-, Acetyl-, Trifluoroacetyl-, Propionyl- und Benzoy!gruppen; oder solche vom aromatischen Urethantyp, wie die Benzyloxycarbonylgruppe (Z), 4-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, 4-Methoxybenzyloxy-0 carbony!gruppe, 2,4-Dichlorobenzyloxycarbonylgruppe, 2-Bromobenzyloxycarbonylgruppe, 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe (Fmoc) und 3,5-Dimethoxy- cL·, dj '-dimethylbenzyloxycarbonylgruppe (Ddz); oder solche vom aliphatischen Urethantyp, wie die t-Butoxycarbonylgruppe (Boc), i-Methyl-cyclobutoxycarbonylgruppe, Adamantyloxycarbonylgruppe und Isobornyloxycarbonylgruppe; und solche vom Alkyl- und Aralkyltyp, wie die Tritylgruppe, Benzylgruppe (BzI), Methyl- und Isopropylgruppen. Bevorzugte neutrale L-Aminosäurereste, für welche X steht, schliessen Pyr, GIn, Pro und 2-Oxo-L-pipecolinsäure ein.

- 10 -

Bevorzugte L-Aminosäurereste, für welche A steht, schliessen GIu und GIn ein. Bevorzugte neutrale L-Aminosäurereste, für welche B steht, schliessen He, Leu, Nie, VaI und Phe ein. Bevorzugte neutrale L-Aminosäurereste/ für welche C steht, schliessen Asn und Gin ein; bevorzugte saure L-Aminosäurereste, für welche C steht, schliessen Asp und GIu ein. Bevorzugte L-Aminosäurereste, für welche D steht, schliessen Ser, Hse und Thr ein. Falls die Hydroxygruppe des durch D dargestellten Restes geschützt ist, dann ist sie vorzugsweise durch eine t-Butylgruppe, Tritylgruppe, Benzylgruppe, 2,4-Dichlorobenzylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe, 2-Bromobenzyloxycarbonylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe oder t-Butoxycarbonylgruppe oder durch eine Niedrigacylgruppe, wie eine Formylgruppe, Acetylgruppe, .Trifluoroacetylgruppe, Propionylgruppe oder Benzoylgruppe, geschützt.

Bevorzugte neutrale L-Aminosäurereste, für welche E steht, schliessen Phe, Leu und Nie ein. Bevorzugte L-Aminosäurereste, für welche F steht, schliessen GIu, GIn und His ein. Bevorzugte neutrale L-Aminosäurereste, für welche G steht, schliessen Leu und Phe ein.

Bevorzugte Gruppen, für welche R stehen kann, sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, s-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, 2,2,2-Trifluoroethyl, Cyclohexyl, Adamantyl, Phenyl, benzyl und Phenethyl. Beispiele für Alkenylgruppe, für welche für R¹ stehen können, sind Allyl und Pentenyl. Beispiele für Acylgruppen, welche für R¹ stehen können, sind Formyl, Acetyl, Trifluoroacetyl, Propionyl, Butyryl, Adamantylcarbonyl, Benzoyl,

α β

- 11 -

Phenylacetyl und Cinnamyl. Die aliphatischen und aromatischen urethanartigen Gruppen, für welche R' stehen kann, sind vorzugsweise solche Gruppen, wie sie als bevorzugte Schutzgruppen X für endständigen Stickstoff angegeben sind, sowie solche vom aromatischen Urethantyp.

Salze der erfindungsgemässen Peptide mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren oder Basen sind in die Erfindung eingeschlossen. Solche Säureadditionssalze können von zahlreichen anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet werden, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoff säure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, salpetrige Säure, Sulfaminsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zimtsäure, Essigsäure, Trifluoroessigsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Glukonsäure, Ascorbinsäure und ähnliche Säuren. Basische Additionssalze können von zahlreichen anorganischen oder organischen Salzen abgeleitet werden, z.B. von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Diethylamin, Triethylamin und Dicyclohexylamin.

Die Synthese der erfindungsgemässen Peptide kann entweder nach der klassischen Lösungsmethode oder durch eine Festphase auf polymeren Trägern erfolgen. Bei der klassischen Lösungsmethode besteht die Synthese im wesentlichen in einer geeigneten Reihenfolge von Kondensationen von geschützten Aminosäuren oder Peptiden. Die Kondensation wird so durchgeführt, dass die gewünschten Peptide die gewünschte Sequenz von 9 bis 13 Aminosäureresten aufweisen. Bei den Aminosäuren und Peptiden, die

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nach den in der Polypeptidchemie an sich bekannten Methoden kondensiert werden, sind die Amino- und Carboxygruppen, die nicht bei der Peptidbindungsbildung benötigt werden, durch eine geeignete Schutzgruppe blokkiert. Die Hydroxyfunktionen von Hydroxyaminosäuren können durch geeignete Schutzgruppen (während der Gesamtsynthese oder nur während einiger Stufen) geschützt werden oder sie können auch ungeschützt bleiben.

Die Schutzgruppen können durch Acidolyse, Verseifung oder Hydrogenolyse entfernt werden. Zum Schutz der Aminogruppen kann man beispielsweise die nachfolgenden Schutzgruppen anwenden: Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Trityl, Formly, Trifluoroacetyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl oder 3,5-Dimethoxy- 00 ,Φ '-dimethylbenzyloxycarbonyl. Zum Schutz der Carboxygruppen kann man beispielsweise die folgenden Schutzgruppen verwenden: Methyl, Ethyl, t-Butyl, Benzyl oder p-Nitrobenzyl.

Zum Schutz der Hydroxygruppen kann man beispielsweise die folgenden Schutzgruppen anwenden: Acetyl/ t-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Bromobenzyloxycarbonyl, Tetrahydropyranyl, t-Butyl, Trityl, benzyl oder 2,4-Dichlorobenzyl.

Die Kondensation zwischen einer Aminogrbppe eines Moleküls und einer Carboxylgruppe eines anderen Moleküls unter Ausbildung der Peptidbindung, kann mittels eines aktivierten Acylderivates, wie einem Mischanhydrid, einem Azid oder einem aktivierten Ester oder durch Direktkondensation zwischen einer freien Aminosäure und

• * · · » β R »β

- 13 -

einer freien Carboxygruppe, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, allein oder zusammen mit einem die Razemisierung verhindernden Mittel, wie N-Hydroxysuccinimid oder 1-Hydroxybenzotriazol, durchgeführt werden.

Hydrazido- oder substituierte Hydrazidoderivate gemäss der Erfindung erhält man durch Kondensation des N-geschützten Peptids oder der Aminosäure mit einem geeignet substituierten Hydrazido/ wie Benzylcabrazat, t-Butylcarbazat, Adamantylcarbazat, Phenylhydrazin oder Adamantylhydrazin, oder indem man das N-geschützte Peptid oder das Aminosäurehydrazid mit einem geeigneten Alkylierung smittel, wie einem Alkylchlorid, oder mit einem geeigneten Acylierungsmittel, wie Benzylchloroformiat, t-Butylchloroformiat, Di-t-butyldikarbonat oder Adamantylfluoroformiat, umsetzt.

Die Kondensation kann in einem Lösungsmittel, wie Dimethy!formamid, Pyridin, Acetonitril, Tetrahydrofuran oder N-Methyl-2-pyrrolidon durchgeführt werden. Die Um- · Setzungstemperatur kann von -30⁰C bis zu Umgebungstemperatur betragen. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 1 bis 120 Stunden. Das Syntheseschema, die Schutzgruppen und die Kondensationsmittel werden so ausgewählt, dass man eine Razemisierung möglichst vermeidet. Die Abspaltung der Schutzgruppen wird nach in der Polypeptidchemie üblichen Methoden durchgeführt. Peptide, bei denen W OR bedeutet, stellt man beispielsweise her, indem man von der C-endständigen Aminosäure, die mit einem geeigneten Alkohol verestert ist, ausgeht.

Peptide, bei denen W OH bedeutet, kann man beispielsweise herstellen durch Hydrolyse von Peptiden, worin W OR bedeutet. Peptide, bei denen W NH₀, NHR oder NR₀ bedeutet, kann man herstellen durch Amynolyse des entsprechenden Esters oder indem man von C-endständigen Aminosäuren, die mit einem geeigneten Amin amidiert sind, ausgeht.

Bei der sogenannten Festphasenmethode wird ein polymerer Träger verwendet. Das Polymer ist vorzugsweise ein Copolymer aus Styrol mit 1 bis 2 Gew.% Divinylbenzol als Vernetzungsmittel, wodurch das Polystyrolpolymer in den meisten organischen Lösungsmitteln vollständig unlöslich wird. Die Synthese beginnt an dem C-endständigen Ende des Peptids, indem man die gewünschte Aminosäure an ein chloromethyliertes Harz, ein Hydroxymethylharz oder ein Benzhydrylaminharz anbringt. Die Amino- und Seitenkettenschutzgruppen sind solche, wie sie auch bei der klassischen Lösungssynthese beschrieben werden.

Bei der Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen wird eine aminogeschützte Aminosäure an das chloromethylierte Harz über das Cäsiumsalz oder an ein Hydroxymethyl- oder Benzhydrylaminharz mit Hilfe eines Kondensationsmittels, wie CyclohexyIcarbodiimid, gekuppelt.

Nach dem Anfangskuppeln wird die Aminoschutzgruppe unter geeigneter Auswahl eines Reagens, einschliesslich Trifluoroessigsäure oder einer Salzsäurelösung in einem organischen Lösungsmittel bei Raumtemperatur, entfernt. Nach Entfernen der Aminoschutzgruppe werden die restlichen geschützten Aminosäuren stufenweise in der gewünschten

» ft ft β » * * *

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- 15 -

Reihenfolge gekuppelt, unter Erhalt des gewünschten Peptids. Jede geschützte Aminosäure wird im allgemeinen in einem dreifachen Überschuss unter Verwendung eines geeigneten Carboxygruppenaktivators, wie Dicyclohexylcarbodiimid in Lösung von z.B. Methylendichlorid:Dimethylformamid-Mischungen umgesetzt.

Nachdem man die gewünschte Aminosäuresequenz erzielt hat, wird das Peptid von dem Harzträger mittels eines Reagenzes, wie Fluorwasserstoff, welches das Peptid auf dem Harz nicht spaltet, sondern nur die meisten der verbleibenden Seitenkettenschutzgruppen abspaltet, entfernt. Verwendet man ein chloromethyliertes oder hydroxymethyliertes Harz, ergibt die Behandlung mit Fluor-Wasserstoff die Bildung der freien Peptidsäure (W =OH). Verwendet man ein Benzhydrylaminharz, so ergibt die Fluorwasserstoffbehandlung direkt das freie Peptidamid (W = NH2). Alternativ kann man dann, wenn ein chloromethyliertes oder hydroxymethyliertes Harz angewendet wird, das in der Seitenkette geschützte Peptid spalten durch Behandlung des Peptidharzes mit Ammoniak oder mit einem Mono- oder Dialkylamin unter Erhalt des gewünschten seitenkettengeschützten Amids, Alkylamids oder Dialkylamids (W = NH₂, NHR, NR₂). Den Seitenkettenschutz kann man nach den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren entfernen. Bei der Herstellung von erfindungsgemässen Estern (W = OR), wendet man die Harze, wie sie zur Herstellung der Säure (W = OH) verwendet werden, an und das seitenkettengeschützte Peptid wird mit einer Base und dem entsprechenden Alkohol abgespalten. Der Seitenkettenschutz wird dann in üblicher Weise entfernt.

Alternativ kann man die Peptidsäure und die Peptidamide aus den Peptidestern durch Verseifung oder Ammonolyse gewinnen.

Die erfxndungsgemässen Verbindungen weisen eine interessante pharmakologische Aktivität bei der Inhibierung der Prolactinfreigabe auf. Darüber hinaus weisen einige der erfindungsgemässen Verbindungen die folgenden pharmakologischen Aktivitäten auf: Freihabe von ACTH und von ß-Endorphin, Inhibierung der Freigabe von Wachstumshormon und von TSH. Die Inhibierung der Prolactinsekretion wurde sowohl in vitro als auch in vivo bestimmt; bei den in vitro-Versuchen wurden Hypophysezellen (von Ratten oder Rindern), suspendiert in Bio-Gel-Säulen, verwendet und bei den in vivo-Versuchen wurde die Inhibierung der Serumbasalprolactinsekretion bei männlichen Ratten und die Inhibierung der durch Saugen simulierten Prolactinsekretion bei milchgebenden Ratten gemessen.

Die Inhibierung der Prolactinfreigabe wurde in vitro nach der Methode von P.J. Lowry in J. Endocrinol. 63, 163 (1974) bestimmt.

Die synthetisierten Peptide waren in der Lage, die Prolactinsekretion in isolierten und durchbluteten Hypophysezellen bei einer Konzentration im Bereich von

— 4 —6
10 bis 10 M zu inhibieren.

Die erfindungsgemässen Verbindungen haben auch eine angstlösende Aktivität, die durch eine Modifizierung

der qualitativen und quantitativen spontanen Aktivität bei Ratten nach der Methode von A.E. Whimbey und V.H. Denenberg in J. Comparative Physiology and Psychology/ §3_, 500-504 (1967) bestimmt wurde. 5

Die synthetisierten Verbindungen konnten bei subkutaner Verabreichung an Ratten in Dosen im Bereich von 20 meg bis 100 mcg/kg das Angstniveau, das durch eine neue Umgebung (offenes Feld) verursacht wurde, zu vermindern und die Neugier (explorativity) in einer gewohnten Umgebung (Wohnkäfig) zu erhöhen.

Erfindungsgemäss werden weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen aus einer der erfindungsgemässen Verbindungen oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger zur Verfügung gestellt, wobei solche Zubereitungen den aktiven Bestandteil direkt oder auch verzögert freigeben können.

Bevorzugte erfindungsgemässe Peptide sind die folgenden:

• «v · · * m ψ ·

• «0*· .· * ν ν «Ο ·

- 18 -

1. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

2. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu'-Ser-Leu-Glu-Leu-NH-

3. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-OH

4. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-N^

5. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Gln-Leu-OH

6. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Gln-Leu-N^ 7· H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-OH

8. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH-

9. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-OH

10. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-NH

11. H-Pyr~Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-OH

12. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-LeU-NH₂

13. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

14. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH-

15. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

16. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH₂

17. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

18. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH₂

19. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

20. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH₂

21. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

22. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH

23. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

24. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-LeU-NH₂

25. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

26. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH-

• β «ο ί

* α β ·
β ο β » β β

• α β * λ ' α

- 19 -

R · ββαβ

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27° H-Pyr-Gly-Pro-Pro-28. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-29-H-Pyr-Gly-Pro-Pro-3Oo H-Pyr-Gly-Pro-Pro-31«, H-Pyr-Gly-Pro-Pro-32ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-33ο H-Pyr-Glu-Pro-Pro-34ο H-Pyr-Glu-Pro-Pro-35 ο H-Gln-Glu-Pro-Pro-3βο H-GIn-Glu-Pro-Pro-37. H-GIn-Glu-Pro-Pro-

38 ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-

39 ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-4 0 ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-41 ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-42ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-43ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-4 4 ο H-GIn-Glu-Pro-Pro-4 5 ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-

4 6 ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-47« H-Pyr-Gly-Pro-Pro-

48 ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-

49 ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-SO» H-Pyr-Gly-Pro-Pro-51 ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-

5 2«. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-

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-Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- - Asp- Le u- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu- -Asp-Leu·

Ser-Phe Ser-Phe-Thr-Phe- Thr-Phe-Thr-Phe- Thr-Phe-Thr-Phe- Thr-Phe-Thr-Phe- Thr-Phe· ■Ser-Leu-•Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu-•Thr-Leu· ■Thr-Leu· •Thr-Phe-■Thr-Phe- •Ser-Leu· •Ser-Leu· ■Ser-Leu· •Ser-Leu •Ser-Phe ■Ser-Phe ■Thr-Leu ■Thr-Leu

-His-Leu-OH

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■His-Leu-NH,

His-Leu-OH

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•Gl u-Leu-OH

-Gl u-Leu-NH,

•Gl u-Leu-OH

-Glu-Leu-NH,

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•Glu-Leu-OH

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■Glu-OH

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53. H~Pyr-Gly-

54. H-Pyr-Gly-

55. H-Pyr-Gly-

56. H-Pyr-Gly-

57. H-Pyr-Gly-

58. H-Pyr-Gly-

59. H-Pyr-Gly-

60. H-Pyr-Gly-

61. H-Pyr-Glu-

62. H-Pyr-Glu-

63. H-Pyr-Gln-

64. H-Pyr-Gln-

65. H-Gln-Gly-

66. H-Gln-Gly-

67. H-Gln-Glu-

68. H-GIn-Gl u-

69. H-Pyr-Gly-

70. H-Pyr-Gly-

71. H-Pyr-Gly-

72. H-Pyr-Gly-

73. H-Pyr-Gly-

74. H-Pyr-Gly-

75. H-Pyr-Gly-

76. H-Pyr-Gly-

77. H-Pyr-Gly-

78. H-Pyr-Gly-

■Pro-Pro· ■Pro-Pro· •Pro-Pro· •Pro-Pro· •Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-•Pro-Pro-•Pro-Pro-■Pro-Pro-■Pro-Pro-Pro-Pro· •Pro-Pro-Pro-Pro· •Pro-Pro· ■Pro-Pro-Pro-Pro· •Pro-Pro-Pro-Pro· Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro· Pro-Pro· Pro-Pro-

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■Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu-•Ser-Leu-•Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu· •Ser-Leu· ■Ser-Leu· ■Ser-Leu· •Ser-Leu· •Thr-Phe-•Thr-Phe-•Ser-Leu· •Ser-Leu· ■Ser-Phe •Ser-Phe-•Thr-Leu· •Thr-Leu· •Ser-Leu· ■Ser-Leu· Ser-Leu· Ser-Leu·

-GIu-OH

-GIu-NH.

-GIu-OH

-GIu-NH.

-GIu-OH

-GlU-NH.

-GlU-OH

-GIu-NH.

-GIu-OH

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-GIu-OH

-GlU-NH,

-His-OH

-His-NH.

-OH

■OH

-NH.

% ft β β O β AAO Φ »

- 21 - ♦

79 - H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

0O . H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-NH-81ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-OH 82ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-NH-83ο H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH 8 4» H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH 85» H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH 8 6. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH« 87o H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH 88 e H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH-

8 9 ο H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-OH

9 O ο H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-NHj 9Io H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH 92ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH-93. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-OH 94ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-NH-95ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-OH 96ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-NH-97» H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-OH 98ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-NH₂ 99 ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-OH ■ 100ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-NH 101«, H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-OH ο H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-NHL

103. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

104. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH-

il ■ kl

- 22 -

105. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

106. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH

107. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

108. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH₂

109. H-Gln-Glu-Prö-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-OH

110. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-NH

111. H-GIy-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

112. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH

113. H-Gly-Pro-Pro-rie-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-OH

114. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-NH₂

115. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-OH

116. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-NH-

117. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-OH

118. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-NH

119. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Le'u-Asp-Leu-Ser-OH

120. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-NH₂

121. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-OH

122. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-NH₂

123. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

124. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH

125. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-OH

126. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-NH₂

127. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

128. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH

129. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-OH

130. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-NH-

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- 23 -

131.
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■Pro-Pro-•Pro-Pro- ■Pro-Pro- -Pro-Pro-•Pro-Pro-•Pro-Pro- -Pro-Pro· ■Pro-Pro-■Pro-Pro· ■Pro-Pro· -Pro-Pro- -Pro-Pro· "Pro-Pro- -Pro-Pro- -Pro-Pro- -Pro-Pro-■Pro-Pro· ■Pro-Pro- -Pro-Pro- -Pro-Pro· -Pro-Pro· -Pro-Pro· -Pro-Pro· -Pro-Pro· -Pro-Pro -Pro-Pro

-Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser-■Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser- -Ile-Ser· ■Ile-Asp-•Ile-Asp-•Ile-Asn-•Ile-Asn-■Ile-Glu-•Ile-Glu-•Leu-Asp-•Leu-Asp-•Phe-Asp-•Phe-Asp-■Ile-Asp-•Ile-Asp-•Leu-Asp-•Leu-Asp-•Ile-Asp-■Ile-Asp-•Ile-Asp-•Ile-Asp-■Ile-Asp-■Ile-Asp-'Ile-Asp-•Ile-Asp-■Ile-Asn-•Ile-Asn-
-Ile-Glu-■Ile-Glu-

Leu-Leu- Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-Leu-■Leu-Leu-■Leu-Leu-■Leu-■Leu-Leu-•Leu-Leu-■Leu-■Leu· •Leu· ■Leu· •Leu· ■Leu· ■Leu· ■Leu •Leu

•Thr-Leu

■Thr-Leu

-Ser-Leu

■Ser-Leu

•Ser-Leu

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-Thr-Phe

-Thr-Phe-

-Ser-Leu-

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-Thr-Leu

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-OH

■OH •NH. -OH

-OH

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■Glu-NH,

■His-OH

■His-NH,

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■Glu-NH,

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-Glu-OH

-Glu-NH,

-Glu-OH

-Glu-NH.

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-2A-

157. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

158. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH

159. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

160. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH

161. H-GlU-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

162. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH-

163. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-OH

164. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-NH₂

165. H-Gly-ProrPro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

166. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH

167. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-OH

168. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-NH₂

169. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-OH

170. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH₂

171. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-OH

172. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-NH₂

173. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-OH

174. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-NH-

17 5. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

176. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH-

177. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

178. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH₂

179. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

180. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH₂

181. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

18 2. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH-

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- 25 -

183. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

184. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-GlU-LeU-NH₂ 18 5. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-OH 18 6. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-NHj

It W W · M

- 26 -

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung beschrieben. Die Rf-Werte wurden auf vorbeschichteten Kieselgelplatten 60 F-^₄ (Merck) mit einer Schichtdicke von 0,25 mm und einer Länge von 20 cm nach den folgenden Entwicklungssystemen bestimmt:

System A: n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:1 Volumen)

System B: Chloroform:Methanol:32 %-iges Ammoniumhydroxid (65:45:20 Volumen).

"Merck" ist eine Handfelsbezeichnung. 15

Die TLC-Analyse wurde bei einer Temperatur im Bereich von 18 bis 25⁰C durchgeführt, so dass die Rl-Werte um +^ 5 % variieren können.

Die Hochdruck-Flüssigchromatografie (HPLC) wurde über einer Säule mit Hibar Lichrosorb R9-18 (5 μπι) unter Verwendung von

Eluiermittel A: KH₃PO₄ 0,02 M, pH 7, 10 % Acetonitril Eluiermittel B: KH₃PO₄ 0,02 M, pH 7, 60 % Acetonitril

durchgeführt. Mobile Phase: Man mischt A und B und erhält eine Lösung, die 10 % B enthält. Dann erhöht man den Prozentsatz von B innerhalb von 25 Minuten von 10 auf 60 %.

Ο t>

Ο« »Ο β β * β«

- 27 -

Eine Hochspannungs-Papierelektrophorese wurde mit einer Pherograph-Original-Frankfurt-Typ 64-Vorrichtung mit Schleicher und Schull-Papier Nr. 2317 bei pH 5,8 durchgeführt. (Pyridin:Essigsäure:Wasser 45:5:450 VoIumen; 32,5 V/cm). Elektrophoretische Mobilitäten (E_{c Q})

D ι Ο

werden in bezug auf Glutaminsäure angegeben.

Die Synthese auf einem polymeren Träger kann z.B. nach folgenden Verfahren erfolgen:
10

Verfahren_A

Herstellung von Boc- (AA) —(AA) .... (AA) .,-Hydroxy-

n η—ι 1

methyl-polystyrolester.

Chlormethyliertes Polystyrolharz wird mit der ersten Boc-Aminosäure (Boc-AA.-OH) gemäss Gisin, HeIv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) verestert. Dann wird der Polystyrolester nach dem Schema A zum Einführen von BoC-(AA)₉—OH...Boc(AA) -OH behandelt, wobei man das obige Harz erhält.

Schema_A

(1) ' man wäscht 3 mal mit Dichlormethan;

(2) man behandelt 2 mal 1 Monute mit Trifluoroessigsäure:Dichlormethan (10:40 Volumen);

(3) man behandelt 30 Minuten mit Trifluoroessigsäure:Dichlormethan (40:60 Volumen);

(4) man wäscht 4 mal mit Dichlormethan;

(5) man behandelt 2 mal 1 Minute mit 10 % N-Methylmorpholin in Dichlormethan;

(6) man behandelt 5 Minuten mit 10 % N-Methylmorpholin in Dichlormethan;

(7) man wäscht 8 mal mit Dichlormethan;

(8) man gibt 2 oder 3 Äquivalente des symmetrisehen Anhydrids des entsprechenden Aminosäurederivats, zubereitet gemäss Hagenmayer und Frank, Hoppe-Seyler·s Z Physiol. Chem., 353, 1973 (1972), gelöst in Dichlormethan, zu. Die Reaktionszeit beträgt 0,5 bis 2 Stunden;

(9) man wäscht 3 mal mit Dichlormethan;

(10) man wäscht 3 mal mit Isopropanol;

(11) man wäscht 3 mal mit Dichlormethan;

(12) man prüft mit der Ninhydrin-Reaktion gemäss Kaiser et al., Annal. B'iochem., 34, 595

(1970). Im Falle einer unvollständigen Reaktion wiederholt man die Stufen (4) bis (11).

Verfahren_B

Herstellung von H-(AA) —(AA) ....(AA).-Hydroxymethylpolystyrolester.

Nach Einführung von wenigstens einem Aminosäurederivat nach dem Schema A (Verfahren A) wiederholt man die Stufen (1) bis (7) von Schema A und wäscht 4 mal mit Isopropanol .

Herstellung von Boc-(AA) —(AA) . .. . (AA) _Λ -Benzhydryl-

n n~ ι ι

aminharz. 5 BoC-(AA)₁-OH wird an ein Benzhydrylaminharz mittels Dicyclohexylcarbodiimid gemäss Pietta et al., J. Org. Chem. 39, 44 (1974) , gebunden. Nicht-umgesetzte Aminogruppen werden mit Essigsäureanhydrid:Pyridin:Dichlormethan (2:1:10 Volumen) acetyliert. Das Polystyrolamid wird dann nach dem Schema A (Verfahren A) zum Einführen der anderen Aminosäurereste unter Erhalt des im Titel angegebenen Harzes behandelt.

Herstellung von H-(AA) _₁...(AA).-Benzhydrylaminharz. 20 Man arbeitet wie beim Verfahren B und geht von dem Peptidharz des Verfahrens C aus.

Beispiel 1

1 g des nach Verfahren A festgehaltenen Peptidharzes mit der gewünschten Aminosäurerestesequenz (eingeführt als Boc-Leu-OH, Boc-Glu(OBzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(BzI) OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(BzI) OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Gly-OH, H-Pyr-OH in dieser Reihenfolge) wurde 1 Stunde bei 0⁰C in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff (destilliert über 500 mg Kobalttrifluorid), enthaltend 1 ml Anisol, suspendiert. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol wurde durch Waschen mit Diisopropylether (3 mal 10 ml) entfernt. Das Rohpeptid wurde aus dem Harz mit Dimethylformamid (3 mal 10 ml) extrahiert und durch Gelfiltration über Sephadex LH-20 unter Verwendung von Dimethylformamid als Eluiermittel und durch Austauschchromatografie über DEAE-Sephadex A-25 unter Verwendung eines Ammoniumacetatpuffers bei pH 6 als Eluiermittel gereinigt. Das Produkt wurde dann mit einem Überschuss an Natriumbikarbonat in das Natriumsalz überführt, über Sephadex G-15 entsalzt und lyophilisiert. 0,120 g des Peptids (1) wurden erhalten.

R1_A 0,17; Rf_B 0,44;

E_co 0,60 GIu; R. (HPLC) ca. 15'

φ O · ff · b «· * Λ · · Ö

- 31 -

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,94; GIu 1,96; Pro 1,98; GIy 1,01; Leu 2,96; He 1 ,97.

Beispiel 2

0 NH_2lNatriumsalz__(2)_

1 g des nach Verfahren C erhaltenen Peptidrestes mit der gewünschten Sequenz an Aminosäureresten (eingeführt als Boc-Leu-OH, Boc-Glu(OBzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Gly-OH, H-Pyr-OH in dieser Reihenfolge) wurde 1 Stunde in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff (destilliert über 500 mg Kobalttrifluorid), enthaltend 1 ml Anisol, suspendiert. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol wurde durch Waschen mit Diisopropylether (3 χ 10 ml) entfernt. Das Rohpeptid wurde aus dem Harz mit Dimethylformamid (3 χ 10 ml) extrahiert und durch Gelfiltration über Sephadex LH-20 unter Verwendung von Dimethylformamid als Eluiermittel und durch Ionenaustauschchromatografie über DEAE-Sephadex A-25 unter Verwendung eines Ammoniumacetatpuffers bei pH 6 als Eluiermittel gereinigt. Das Produkt wurde dann in das Natriumsalz mit einem überschuss an Natriumbikarbonat überführt, über Sephadex G-15 entsalzt und dann lyophilisiert. Man erhielt 0,130 g des Peptids (2).

- 32 -

^E5,8 °'³⁰·

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,95; GIu 1,97; Pro 1,96; GIy 1,00; Leu 2,94; He 1 ,98.

Beispiel 3
10

1 g des gemäss Verfahren B erhaltenen Peptidharzes mit der gewünschten Sequenz der Aminosäurereste (eingeführt als Boc-Leu-OH, Boc-Glu(OBzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, Boc-GIy-OH in der genannten Reihenfolge) wurde 1 Stunde bei O⁰C in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff (destilliert über 500 mg Kobalttrifluorid), enthaltend 1 mg Anisol, suspendiert. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol wurde durch Waschen mit Diisopropylether (3 χ 10 ml) entfernt.

Das Rohpeptid wurde aus dem Harz mit Dimethylformamid (3x10 ml) extrahiert und durch Gelfiltration über Sephadex LH-20 unter Verwendung von Dimethylformamid als Eluiermittel und durch Ionenaustauschchromatografie über CH-Sephadex C-25 unter Verwendung eines Ammoniumacetatpuffers bei pH 4 gereinigt. Das Produkt wurde dann mit einem überschuss an Natriumbikarbonat in das

» f> * β

Natriumsalz überführt, über Sephadex C₁-IS entsalzt und lyophilisiert. Man erhielt 0,110 g des Peptids (165) .

Rf_Ä 0,16; Rf_B 0,44;

E_{c Q} 0,-34; R '(HPLC) ca. 17'
b, ο t

Äminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,97; GIu 1,00; Pro 1,99; GIy 0,99; Leu 2,97; He 1,98.

Beispiel 4
15

1 g des gemäss Verfahren D erhaltenen Peptidharzes mit der gewünschten Sequenz an Aminosäureresten (eingeführt als Boc-Leu-OH, Boc-Glu(OBzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBzI)-OH, Boc-He-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Gly-OH in der genannten Reihenfolge) wurde 1 Stunde bei 0⁰C in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff (destilliert über 500 mg Kobalttrifluorid), enthaltend 1 ml Anisol, suspendiert. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol wurde durch Waschen mit Diisopropylether entfernt. Das Rohpeptid wurde von dem Harz mit Dimethylformamid (3x10 ml) extrahiert und durch Gelfiltration über Sephadex LH-20 unter Verwendung von

- 34 -

Dimethylformamid als Eluiermittel und durch Ionenaustauschchromatografie über CH-Sephadex C-25 unter Verwendung eines Ammoniumacetatpuffers bei pH 4 gereinigt. Das Produkt wurde dann mit einem überschuss an Natriumbikarbonat in das Natriumsalz überführt, über Sephadex G-15 entsalzt und lyophilisiert. Man erhielt 0,110 g des Peptids (166) .

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,97; GIu 0,99; Pro 1,97; GIy 1,00; Leu 2,96; He 1,96.

Beispiel 5

1 g des nach Verfahren B erhaltenen Peptidharzes mit der gewünschten Sequenz an Aminosäureresten (Boc-Phe-OH, Boc-Thr(BzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBzI)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(BzI)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH-Boc-Pro-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-Gln-0H in der genannten Reihenfolge) wurde 1 Stunde bei O⁰C in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff (destilliert über 500 mg Kobalttrifluorid), enthaltend 1 ml Anisol, suspendiert.

Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol wurde durch Waschen mit 3 χ 10 ml

• « · »es * * β

• β *» λ β α·β ·« α

- 35 -

Diisopropylether entfernt. Das Rohpeptid wurde von dem Harz mit Dimethylformamid (3 χ 10 ml) extrahiert und durch Gelfiltration über Sephadex LH-20 unter Verwendung von Dimethylformamid als Eluiermittel und durch Ionenaustauschchromatografie über CH-Sephadex C-25 unter Verwendung von Ammoniumacetat als Eluiermittel bei pH 4 gereinigt. Das Produkt wurde dann mit einem Überschuss an Natriumbikarbonat in das Natriumsalz überführt, über Sephadex G-15 entsalzt und lyophilisiert. Man erhielt 0,130 g des Peptids (89).

Rf_A 0,22; Rf_B 0,45;

,. _Q 0,75; R. (HPLC) ca 12 ·

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Thr 0,88; Ser 0,96; GIu 1,98; Pro 1,98; Leu 2,00; He 0,98; Phe 0,99.

In ähnlicher Weise wurden die nachfolgenden Verbindungen hergestellt.

(6)

E₅,8 0,63

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,96; Glu 1,98; Pro 1,99; GIy 1,00; Leu 1,97, He 1,98.

(7)

(8)

- 36 -

5,8 °'³⁰

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,95; GIu 1,97; Pro 1,98;

GIy 1,00; Leu 1,98; He 1,97.

^E5,8 °>³² 15

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,97; GIu 0,98; Pro 1,98;

GIy 1 ,00; Leu 1,99.

(9)

NH₂zi?atriumsalz__(70)_

^E5,8 °'¹⁵ 25

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,98; GIu 0,99; Pro 1,97;

GIy 1,00; Leu 1,99; He 1,99.

(11)

β · ·. e *

O # β

- 37 -

(10)

Natriumsalz (91)

_ς a 0,35 5,8

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,97; Ser 1,96; GIu 0,97; Pro 1,96;

GIy 0,99; Leu 1,00; He 1,98.

E_5/8 0,16

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,97; GIu 1,01; Pro 1,97; GIy 1,00; Leu 1,00; He 1,97. 20

(12) 25

^E5,8

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,98; Pro 1,99; GIy 1,01; Leu 1 ,00; He 1 ,99.

- 38 -

(13) H^Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH,

N§triumsalz__(jn2I

E- ₈ ca. 0

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,98; Pro 1,98; GIy 0,99;

Leu 1 ,00; He 1 ,98.

(14)

E_5/8 0,15

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,97; Pro 1,99; GIy 1,00; Leu 1 ,99; He 1 ,98. 20

(15) S

NH₂zNatriumsalz_j(1_28)_

E_ _o ca. 0
5 ,ö

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,97; Pro 1,97; GIy 1,00; Leu 2,00; He 1 ,99.

(17)

* m β & » ο«

* 0 A ·* ö O » ·» AA Pl? β β ~ · (ί * # O · β P

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- 39 -

Glu-OH-Natriumsalz (145)

E₁. 0,32

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,98; GIu 0,97; Pro 1,98;

GIy 1,00; Leu 2,01; He 1,99.

E₅^₈ 0,16

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,98; GIu 0,98; Pro 1,99; GIy 1,00; Leu 1,98; He 1,98. 20

(18)
25

E _R 0,28

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,99; GIu 1,99; Pro 1,98; GIy 1,00; Leu 2,97; He 1,97.

(19)

(20)

a β

β ·

9«

3312393

40 -

^E5_/8

Aminösäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,97; GIu 1,97; Pro 1,99;

GIy 1,00; Leu 2,98; lie 1,99.

E 0,28

5,8

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,97; Ser 1,98; GIu 1,96; Pro 1,97; GIy 1,00; Leu 2,97; He 1,97. 20

(21

^E5,8

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,97; GIu 1,97; Pro 1,99; GIy 1,00; Leu 3,01; He 1,99.

(22)

(23)

λ» « *% QA* AA

- 41 -

Rf_A 0,16; Rf_B 0,42; E₅^₈ 0,60

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,99; Ser 1,95; GIu 1,99; Pro 1,00;

GIy 1,00; Leu 1,97; He 1,98; Phe 1,00.

E_5#8 0,30

Aminosäureverhältnis:

Asp 0,98; Ser 1,98; GIu 1,96; Pro 1,98; GIy 1,01; Leu 1,99; He 1,98; Phe 1,00. 20

Beispiele 24 bis 186

Unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsmaterialien und von entsprechenden Zwischenverbindungen wurden die Peptide mit den Nummern 7 bis 12, 15 bis 44, 47 bi-s 68, 71 bis 90, 93 bis 110, 113 bis 126, 129 bis 144 und 147 bis 186 analog zu den vorerwähnten Beispielen her-* gestellt.

Claims

-»""··* QO -J 0 O Q Q HOFFMANN · EITLE & PARTNER PATENT-UND RECHTSANWÄLTE PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · D1PL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K, FÜCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DlPL.-ΙΝβ. K. GORG DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE 38 339 o/wa - 1 FARMITALIA CARLO ERBA S.p.A., MAILAND / ITALIEN Biologisch aktive Peptide und Arzneimittel/ welche diese enthalten PATENTANSPRÜCHE

1./ Peptid der allgemeinen Formel

X-A-Pro-Pro-Ile-Ser-B-C-Leu-D-E-F-G-W worin bedeuten:

ABELLASTRASSE A ■ D-SOOO MÖNCHEN 81 . TELEFON COBQ^ 9110B7 . TELEX 05-29619 CPATHE^ · TELEKOPIERER BIHSSfi

A einen L-Aminosäurerest oder einen Glycinrest, B einen neutralen L-Aminosäurerest,

C einen neutralen L-Aminosäurerest oder einen sauren L-Aminosäurerest/

E eine Valenzbindung oder einen neutralen L-Aminosäurerest,
15

F eine Valenzbindung oder einen L-Aminosäurerest,

G eine Valenzbindung oder einen neutralen L-Aminosäurerest,

W eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Gruppe der Formel OR, NHR, NR„ oder NH-NH-R¹, worin R eine geradkettige, verzweigte oder zyklische (einschliesslich kondensierte oder überbrückte Ringe) Alkylgruppe mit bis zu 11 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert ist, eine Phenylgruppe oder eine Aralkylgruppe mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet und worin R¹ ein Wasserstoffatom, eine der Gruppen, für die R steht, eine Alkenylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine geradkettige, verzweigte oder

zykloaliphatische Acylgruppe mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen, die iinsubstituiert ist oder substituiert ist durch eine Hydroxy- oder eine Aminogruppe oder ein Halogenatom, eine aromatische Acylgruppe, unsubstituiert oder substituiert durch eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder durch ein Halogenatom, eine geradkettige, verzweigte oder zyklische aliphatische urethanartige Gruppe mit 3 bis 11 Kohlenstoffatomen oder eine aromatische urethanartige Gruppe bedeutet,

sowie ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Peptid gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, dass

X ein Wasserstoffatom, eine Formylgruppe, eine Acetylgruppe, eine Trifluoracetylgruppe, eine Propionylgruppe oder eine Benzoylgruppe, eine Benzyloxycarbonyl (Z)-gruppe, eine 4-Nitrobenzyloxy-

carbonylgruppe, eine 4-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, eine 2,4-Dichlorobenzyloxycarbonylgruppe, eine 2-Bromobenzyloxycarbonylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe (Fmoc) oder eine 3,5-Dimethoxy- oi , oO'-dimethylbenzyloxycarbonylgruppe (Ddz) oder eine t-Butyloxycarbonyl (Boc)-gruppe, eine 1-Methyl-cyclobutyloxycarbonylgruppe, eine Adamantyloxycarbonylgruppe oder eine Isobornyloxycarbonylgruppe, oder eine Tritylgruppe, eine Benzylgruppe (BzI), eine Methyl- oder Isopropylgruppe oder Pyr, Gin, Pro und 2-Oxo-L-pipecolinsäure bedeutet,

A GIu, Gin oder GIy bedeutet,
B lie, Leu, Nie, VaI oder Phe bedeutet, C Asn, Gin, Asp oder GIu bedeutet,

D Ser, Hse und Thr bedeutet und, falls die Hydroxygruppe des durch D dargestellten Restes geschützt ist, als Schutzgruppe eine t-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, 2,4-Dichlorobenzyl-, Benzyloxycarbonyl-, 2-Bromobenzyloxycarbonyl-, Tetrahydropyranyl-, t-Butyloxycarbonyl- oder eine Niedrigacylgruppe, wie Formyl-, Acetyl-, Trifluoroacetyl-, Propionyl- oder Benzoylgruppen, vorliegen,

E Phe, Leu und Nie oder eine Valenzbindung bedeutet,

F Glu, GIn und His oder eine Valenzbindung bedeutet,

G Leu und Phe oder eine Valenzbindung bedeutet, und

W folgende Bedeutung hat: eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Gruppe der Formel OR, NHR, NR₂ oder NH-NH-R¹, worin R eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, s-Butyl-, Isobutyl-, t-Butyl-, 2,2,2-Trifluoroethyl-, Cyclohexyl-, Adamantyl-, Phenyl-, Benzyl- und Phenethylgruppe bedeutet,

»ο * * »β β. <· · ff

R' ein Wasserstoffatom, eine Allyl- oder Pentylgruppe oder eine der für R in diesem Anspruch genannten Gruppen bedeutet, oder Formyl-, Acetyl-, Trifluoroacetyl-, Propionyl-, Butyryl-/ Adamantylcarbonyl-, Benzoyl-, Phenylacetyl- oder Cinnamylgruppe, oder Benzyloxycarbonyl- (Z), 4-Nitro- benzyloxycarbonyl-, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 2,4-Dichlorobenzyloxycarbonyl-, 2-Bromobenzyloxycarbonyl-, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)- und '3,5-Dimethoxy-&,cO '-dimethylbenzyloxycarbonyl

(Ddz)-gruppe; t-Butyloxycarbonyl (Boc)-, 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Isobornyloxycarbonylgruppe bedeutet,

sowie ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

3. Peptid gemäss Anspruch 1, nämlich H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH.

4. Arzneimittel, enthaltend ein Peptid gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Lösungsmittel oder Träger.