NL8301281A

NL8301281A - Biologisch actieve peptiden.

Info

Publication number: NL8301281A
Application number: NL8301281A
Authority: NL
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1982-04-13
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1983-11-01
Also published as: FR2524878B1; DE3312399C2; DE3312399A1; JPS58183657A; BE896400A; FR2524878A1; US4474765A; IT8320494A0; IT1214444B

Description

•4 ' VO 4649

Biologisch, actieve peptiden.

De uitvinding betreft biologisch actieve peptiden, hun farmaceutisch geschikte zouten, werkwijzen voor hun bereiding en farmaceutische preparaten met deze peptiden daarin.

De onderhavige peptiden zijn fragmenten of gemodificeerde 5 fragmenten van sauvagine, een natuurlijk peptide bestaande uit 40 amino-zuurstukken (Montecucchi, Henschen - Int. J. Peptide Protein Res. 18, 113-120, 1981), dat een aantal belangrijke farmacologische activiteiten ontplooit, zoals vrij gif te van ACTH en (3-endorf ine, remming van de vrijgifte van groeihormoon, TSH en prolactine (P.C. Montecucchi, 10 "Hormone receptor in Digestion and Nutrition, G. Rosselin et al, uitgifte Elsevier/North-Holland Biomed. Press, 1979, blz. 101-108).

Er werd nu verrassenderwijze gevonden, dat de onderhavige peptiden geheel of gedeeltelijk het biologische activiteitsspectrum van sauvagine behouden hebben. Het belang van deze vonst is evident.

15 De synthese van een tridecapeptide of een korter homoloog is kennelijk en duidelijk gemakkelijker dan de synthese van een peptide met 40 aminozuurstukken. Zuiverder en gemakkelijker zuiverbare produkten worden aldus verkregen.

In de onderhavige beschrijving zijn de symbolen en de afkor-20 tingen de gebruikelijke voor de peptidechemie (J. Biol. Chem., (1972), 247, 977-983).

De uitvinding betreft peptiden met de algemene formule: X-A-Pro-Pro-Ile-Ser-B-C-Leu-D-E-F-G-W

waarin 25 X een waterstofatoom, een terminale stikstofschermgroep in de vorm van acyl, aromatisch urethan, alkyl, aralkyl of alifatisch urethan, danwel een rest van een neutraal L-aminozuur, waarbij de vrije amino-groep van dit stuk eventueel is beschermd door een schermgroep van het bovenweergegeven type voor het terminale stikstofatoom; 30 A een L-aminozuurstuk of een glycinestuk, B een neutraal L-aminozuurstuk, C een neutraal L-aminozuurstuk of een zuur reagerend L-aminozuurstuk, D een L-aminozuurstuk met in de zijketen een alcoholische hydroxy1-groep, die al of niet beschermd is door een gebruikelijke hydroxyl-35 schermgroep, 8301281 -2- «, Η Ε een valentiebinding of een neutraal L-aminozuurstuk, F een valentiebinding of een L-aminozuurstuk, G een valentiebinding of een neutraal L-aminozuurstuk, en W een hydroxylgroep, een aminogroep of een groep met de formule OR, 5 NHR, ΜΕ*2 of NH-NH-R', waarbij R een rechte, vertakte of cyclische (met inbegrip van gecondenseerde of brughoudende ringen) alkylgroep met ten hoogste 11 koolstofatomen en al of niet gesubstitueerd, voorts een fenyl- of aralkylgroep met 7-9 koolstof atomen en R' waterstof, één van de groepen die R kan voorstellen, een alkenylgroep met 10 3-8 koolstofatomen, een rechte, vertakte of cyclische alifatische acylgroep met 1-11 koolstofatomen al of niet gesubstitueerd door een hydroxyl- of aminogroep danwel een halogeenatoom, een aromatische acylgroep, al of niet gesubstitueerd door een hydroxyl- of aminogroep danwel een halogeenatoom, een rechte, vertakte of 15 cyclische alifatische urethangroep met 3-11 koolstofatomen of een aromatische urethangroep^voorstellen.

Voorkeursschermgroepen voor eindstandige stikstofatomen (X) omvatten formyl, acetyl, trifluoracetyl, propionyl, benzyl, benzyl-oxycarbonyl (Z) , 4-nitrobenzyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, 20 2,4-dichloorbenzyloxycarbonyl, 2-broombenzyloxycarbonyl, 9-fluorenyl-methoxycarbonyl (Fmoc) en 3,5-dimethoxy-a,ct'-dimethylbenzyloxycarbonyl (Ddz) alsmede t-butoxycarbonyl (Boe), 1-methyl-cyclobutoxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, isobomyloxycarbonyl, trityl, benzyl (Bzl) , methyl en isopropyl. Voorkeursneutrale L-aminozuurstukken voor X om-25 vatten Pyr, Gin, Pro en 2-oxo-L-pipecolinezuur.

Voorkeurs—L-aminozuurstukken voor A omvatten Glu en Gin. Voor-keursneutrale-L-aminozuurstukken voor B omvatten Ile, Leu, Nle, Val en Phe. Voorkeursneutrale-L-aminozuurstukken voor C omvatten Asn en Gin; voorkeurszuurreagerende—L-aminozuurstukken voor C omvatten Asp en Glu.

30 Voorkeurs-L-aminozuurstukken voor D omvatten Ser, Hse en Thr; indien de hydroxy lgroep van een groep weergegeven door D beschermd is, is de schermgroep bij voorkeur t-butyl, trityl, benzyl, 2,4-dichloorbenzyl, benzyloxycarbonyl, 2-broombenzyloxycarbonyl, tetrahydropyranyl of t-butoxycarbonyl danwel een acylgroep in de vorm van formyl, acetyl, 35 trifluoracetyl, propionyl of benzoyl.

8301281 * «· -3-

Voorkeurs-neutrale«L-aminozuurstokken voor E omvatten Phe, Leu en Nle. Voorkeurs—L-aminozuurstukken voor F omvatten Glu, Gin en His. Voorkeursneutrale-L-aminozuurstukken voor G kunnen Leu en Phe omvatten.

Voorkeursgroepen voor R omvatten methyl, ethyl, n-propy1, iso-5 propyl, n-butyl, s-butyl, isobutyl, t-butyl, 2,2,2-trifluorethyl, cyclohexyl, adamantyl, fenyl, benzyl en fenethyl. Voorbeelden voor alkenylgroepen voor R' omvatten allyl en pentenyl. Voorbeelden voor acylgroepen voor R' omvatten formyl, acetyl, trifluoracetyl, propionyl, butyryl, adamantylcarbony, benzoyl, fenylacetyl en cinnamyl. De ali-10 fatische en aromatische urethangroepen voor R’ omvatten bij voorkeur dezelfde soort groepen als weergegeven bij de schermgroepen X voor de terminale stikstof.

Zouten van onderhavige peptiden met farmaceutisch geschikte zuren of basen vallen binnen het bestek van de uitvinding. Dergelijke 15 zuuradditiezouten kunnen zijn afgeleid van een reeks anorganische en organische zuren, zoals zwavelzuur, fosforzuur, waterstofchloride, waterstofbromide, waterstofjodide, salpeterzuur, sulfaminezuur, citroenzuur, melkzuur, pyrodruivenzuur, oxaalzuur, malelnezuur, barn-steenzuur, wijnsteenzuur, kaneelzuur, azijnzuur, trifluorazijnzuur, 20 benzoëzuur, salicylzuur, gluconzuur, ascorbinezuur en verwante zuren. Base-additiezouten kunnen zijn afgeleid van een reeks anorganische of organische basen, zoals natriumhydroxyde, kaliumhydroxyde, diëthyl-amine, triëthylamine en dicyclohexylamine.

De synthese van de onderhavige peptiden kan ofwel volgens een 25 klassieke oplosmethode danwel via de vaste fase op polymere dragers plaatsvinden. Bij de klassieke oplossingsmethode wordt in principe een aantal passende opeenvolgende condensaties van beschermde aminozuren of peptiden uitgevoerd. Deze condensatie vindt zo plaats, dat de verkregen peptiden de gewenste volgorde van 9-13 aminozuurstukken 30 bezitten. De aminozuren en peptiden die volgens op zichzelf bekende methoden van de polypeptidechemie worden gecondenseerd, hebben bij de diverse trappen geblokkeerde aminogroepen en carboxylgroepen, ten minste voorzover deze niet bij de condensatiereactie betrokken zijn.

De hydroxyIfuncties van hydroxyaminozuren kunnen zijn beschermd door 35 passende beschermgroepen (tijdens de gehele synthese of alleen maar tijdens enkele trappen) of kunnen ook onbeschermd worden gehouden.

830 1 28 1 * ’ . -4-

De schermgroepen kuimen met een acidolyse, een verzeping of door een hydrogenolyse worden verwijderd. Voor de bescherming van aminogroepen kunnen bijvoorbeeld de volgende schermgroepen worden toegepast: benzyloxycarbony 1, t-butoxycarbonyl, trityl, formyl, trifluor-5 acetyl, o-nitriofenylsulfenyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, 9-fluore-nylmethoxycarbony1 of 3,5-dimethoxy-a,α'-dimethylbenzyloxycarbonyl.

Voor de bescherming van de carboxylgroepen kunnen bijvoorbeeld de volgende schermgroepen worden toegepast: methyl, ethyl, t-butyl, benzyl of p-nitrobenzyl. Voor de bescherming van de hydroxylgroepen kunnen bij-10 voorbeeld de volgende schermgroepen worden gebruikt: acetyl, t-butoxy-carbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-broombenzyloxycarbonyl, tetrahydro-pyranyl, t-butyl, trityl, benzyl of 2,4-dichloorbenzyl.

De condensatie tussen een aminogroep van een molecuul en een carboxylgroep van een volgend molecuul ter vorming van een peptide-15 binding kan worden uitgevoerd via een geactiveerd acylderivaat zoals een gemengd anhydride, een azide of een geactiveerde ester, danwel door een directe condensatie tussen een vrije aminogroep en een vrije carboxylgroep maar dan bij aanwezigheid van een condensatiehulpmiddel, zoals dicyclohexylcarbodilmide, op zichzelf of tezamen met een race-20 misatie-remmend middel, zoals N-hydroxysuccinimide of 1-hydroxybenzo-triazool.

Hydrazicb-of gesubstitueerde hydrazidoderivaten volgens de uitvinding kunnen worden bereid door een condensatie van een N-beschermd peptide of aminozuur met een passend gesubstitueerd hydrazon, zoals 25 benzylearbazaat, t-butylcarbazaat, adamantylcarbazaat, fenylhydrazine of adamantylhydrazine, danwel door het N-beschermde peptide of amino-zuurhydrazide om te zetten met een passend alkyleermiddel, zoals een alkylchoride of met een passend acyleermiddel, zoals benzylchloor-formiaat, t-butylchloorformiaat, di-t-butyldicarbonaat of adamantyΙ-ΒΟ fluorformiaat.

De condensatie kan worden uitgevoerd in een oplosmiddel zoals dimethylformamide, pyridine, acetonitrile, tetrahydrofuran of N-methyl-2-pyrrolidon. De reactietemperatuur kan zijn gelegen tussen -30°C en kamertemperatuur. De reactie duurt gewoonlijk 1 tot 120 uren. Het 35 schema van synthese, de schermgroepen en de condensatiehulpmiddelen moeten bij voorkeur zo worden gekozen, dat het risico van racemisatie wordt vermeden.

8301281 ' -Μ ' : -5-

Ook de verwijdering van de schermgroepen wordt uitgevoerd volgens op zichzelf uit de polypeptidechemie bekend methoden. Peptiden waarin W: OR voorstelt, worden bijvoorbeeld bereid uitgaande van C-, terminale aminozuren, veresterd met een passende alcohol. Peptiden, 5 waarin W: OH voorstelt, kunnen bijvoorbeeld worden bereid door een hydrolyse van peptiden met W is OR. Peptiden, waarin W: NH^, NHR of NR^ voorstelt, kunnen worden bereid door een aminolyse van de overeenkomstige esters of uitgaande van een C-terminaal aminozuur dat met een passend amine is geamideerd.

10 Bij de vaste-fasesynthese wordt een polymere drager gebruikt.

Dit polymeer is bij voorkeur een polymeer van styreen met 1 tot 2 gew.% divinylbenzeen als een verknoper waardoor het polystyreen volledig onoplosbaar wordt in de meeste organische oplosmiddelen.

Deze synthese wordt aangevangen bij het C-terminale uiteinde van het 15 peptide, door het betreffende aminozuur aan een gechlooxmethyleerde hars, een hydroxymethylhars of een benzhydrylaminehars te hechten.

De amino- en zijketen-schermgroepen zijn dezelfde als beschreven bij de klassieke synthese in oplossing;

Bij de bereiding vein de onderhavige verbindingen wordt een 20 araino-beschermd aminozuur gekoppeld aan een gechloormethyleerde hars via een caesiumzout of aan een hydroxymethyl- of benzhydrylaminehars met behulp van een condensatiemiddel, zoals dicyclohexylcarbodiïmide.

Na de aanvankelijke koppeling wordt de amino-schermgroep verwijderd door een keuze aan reagentia met inbegrip van trifluorazijn-25 zuur of waterstofchlorideoplossingen in organische oplosmiddelen en wel bij kamertemperatuur. Na verwijdering van de amino-schermgroep worden de overige beschermde aminozuren trapsgewijze in de gewenste volgorde aangehecht, waardoor het gewenste peptide wordt verkregen.

Elk beschermd aminozuur wordt gewoonlijk in een drievoudige overmaat 30 toegepast onder toepassing van een passende carboxylgroepactivator zoals dicyclohexylcarbodiimide in oplossing, bijvoorbeeld in methyleen-dichloride: dimethylformamide-mengsels.

Nadat de gewenste aminozuurvolgorde is verkregen, wordt het peptide van de harsdrager verwijderd door een behandeling met een reagens, 35 zoals waterstoffluoride, dat niet alleen het peptide van de hars losmaakt, maar tevens het merendeel van de nog overgebleven zijketen- ---«4» 83 0 1 28 1 Λ ν : -6- schermgroepen verwijdert. Wanneer een gechloormethyleerde of gehydroxy-methyleerde hars wordt gebruikt, resulteert een behandeling met waterstof fluoride in de vorming van het vrije peptidezuur (W = OH). Wanneer een benzhydrylaminehars wordt toegepast leidt éen behandeling met 5 waterstoffluoride direct tot het vrije peptide-amide (W = N^). Ook kan bij toepassing van een gechloormethyleerde of gehydroxymethyleerde hars het zijketen-beschermde peptide worden afgesplitst door een behandeling van de peptide-hars met ammoniak of een mono- of dialkylamine waardoor het gewenste zijketen-beschermde amide, alkylamide of dialkyΙ-ΙΟ amide (W = , NHR of Nï^) wordt verkregen. Zij ketenbescherming kan vervolgens volgens elke bekende methode worden verwijderd. Bij het bereiden van onderhavige esters (W = OR) worden dezelfde harsen gebruikt als voor het bereiden van het zuur en wordt het zijketen-beschermde peptide gesplitst met een base en een passende alcohol.

15 De zijketen-bescherming wordt vervolgens verwijderd op een gebruikelijke wijze.

Ook kunnen peptidezuren en-amiden uit peptideesters worden verkregen door een verzeping of een aminolyse.

De onderhavige verbindingen bezitten een goede farmacologische 20 activiteit door remming van de prolactine-afgifte. Bovendien bezitten sommige onderhavige verbindingen de volgende farmacologische activiteiten: vrijgifte van ACTH en β-endorfine, remming van de vrijgifte van groeihormoon en TSH. De remming van de prolactinesecretie werd zowel in vitro als in vivo bepaald; de in vitro-proef omvatte een toe-25 passing van pituitaire cellen (verkregen uit ratten of vlees) gesuspendeerd in Bio-gelkolommen; de in vivo-proef omvatte een meting van de remming van de basale prolactinesecretie bij mannelijke ratten en de remming van de gestimuleerde prolactinesecretie bij melkgevende ratten.

30 De remming van de prolactine-vri j gif te werd in vitro bepaald volgens P.J. Lowry in J. Endocrinol. 63, 163 (1974).

De gesynthetiseerde peptiden bleken de prolactinesecretie bij geïsoleerde en geperfundeerde ratte-pituitaire cellen in een concen--4 -6 tratie van 10 tot 10 molair met 60-80% te remmen.

35 Tevens bezitten de onderhavige verbindingen een anxiolytische activiteit die werd bepaald via modificaties van de kwalitatieve en 8301281 fc -7- kwantitatieve spontane activiteit bij ratten volgens A.E. Whimbey en V.H. Denenberg in J. Comparative Physiology and Psychology, 63, 500-504 (1967).

De gesynthetiseerde verbindingen, subcutaan toegediend aan rat-5 ten in dozes van 20 tot 100 microgram per kilogram bleken de angst veroorzaakt door een nieuwe omgeving (open veld) te verminderen en de exploratieneiging in een vertrouwde omgeving (de eigen kooien) te verhogen.

De uitvinding betreft voorts farmaceutische preparaten met 10 daarin een onderhavige verbinding of een farmaceutisch geschikt zout daarvan, gemengd met een farmaceutisch geschikt verdunningsmiddel of drager; bovendien kunnen deze preparaten de actieve stof direct of vertraagd aan het organisme afgeven.

83 0 1 28 1 : -8-

Voorkeurspeptiden volgens de uitvinding zijn de volgende:

1. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Lëu-Glu-Leu-OH

2. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

3. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-OH

4· H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-ïle-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-NH,.·

5. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Gln-Leu-OH

6. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Gln-Leu-NH, * 4 «b

7« H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-OH

8. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH_

9. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-OH

10. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-NH2 11· H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-OH

12. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-NH2 '13. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

14. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Sér-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

15. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

16. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-I«eu-Glu-I»eu-NH2 17. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-l.eu-Glu-Leu-.OH 18· H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

19. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-A‘sp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

20. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

21. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

22. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

23. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

! 24. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

25. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

26. H—Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu—Glu-Leu—NH2 830 1 28 1 -9-

27. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-His-Leu-OH

28. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-I'le-Asp-Leu-Ser-Phe-His-Leu-NH2

29. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-OH

30. H-Pyr-Gly-Pro-?ro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-NH2

31. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-OH

32. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-NH2

33. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-OH

34. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-NH2

35. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-OH

36. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-NH2

37. H-Gln-Glu-?ro-Pro-Ilei-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

38. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2 39. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH 4 0. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2 41. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-OH .

42. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-NH2 43. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-OH 44'. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-NH2

45. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

46. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH2

47. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-O'H

48. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-NH2

49. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-OH

50. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-NH2

51. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-OH

52. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-NH2 8301281 -10-

53. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

54. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-NH

« 4

55. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

56. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-NH2

57. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

58. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH2 59. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH . - - 60. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NHj

61. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

62. H-Pyr-Glu-Pro~Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH2

63. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

64. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH2 65. H-Gln-Gly-Pro-Pro-ïle-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH 6 61 J0-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-*Asp--Leu-Ser-Leu-Gru-NH2

67. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-OH

68. K-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-NH2

69. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ilè-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

70. H-Pyr-Gly~Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH2

71. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-OH

72. H"-Pyr-Gly-Pro-_Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-NH2 .73. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-OH

74. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-NH2

75. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-OH

76. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-NH2

77. H-Pyr-Gly-?ro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-OH

78. H-Pyr-C31y-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-NH2 8301281 -11-

79. H-?yr-Gly-Pro-?ro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

80. H-Pyr-Gly-Pro-?ro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-NH2 82. K-Pyr-Gly-Pro-?ro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-OH 8 2. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-NH^

83. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

84. H-Pyr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH.

• »

85. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

86. H-Pyr-Gln-?ro-?ro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH2

87. H-Gln-Gly-?ro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

88. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH-

89. H-Gin-Glu-Pro-?ro-Ile-Ser-Leu~Asp-Leu-Thr-?he-OH

90. H-Gln-Glu-Pro-Pro-21e-Ser-Leu^Asp-Leu-Thr-?he-NH2

91. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

92. H-Pyr-Gly-?ro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH_

93. H-?yr-Giy-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-OH

94. H-?yr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-NH2

95. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-OH

96. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-NH2

97. H-Pyr-Gly-Pro-?ro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-OH

98. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-NH2

99. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-OH

100. E-Pyr-Gly-?ro-?ro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-NH2

101. H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-OH

102. H-Pyr-Gly-?ro-?ro-Ile-Ser-?he-A£p-Leu-Ser-NH2

103. E-?yr-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

104. H-Pyr-Glu-Pro-?ro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH2 8301281 r -12-

105. H-Pyr-Gln-Pro-Pro-IIe-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

106. H-Pyr-Gln~Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH2

107. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH

108. H-Gln-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH2

109. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-OH

110. H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-NH2 111. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH • ' « 112. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH.

M

113. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-OH

• 114. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-NH2

115. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-OH

116. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Xle-Asn-Leu-Ser-NH2 117. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Xle-Glu-Leu-Ser-OH 1*18. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-NH2

119. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Léu-Asp-Leu-Ser-OH

120. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Lau-Asp-Leu-Ser-NH2

121. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-OH

122. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-NH2

123. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-ÓH

124. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH2

125. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-OH

126. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-N^

127. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Xle-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

128. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH

129. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-OH

130. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-NH

83 0 1 28 1 -13-

131. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-OH

132. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Aso-Leu-Thr-Leu-NH* 2

133. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-OH

134. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-NH2

135. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leü-OH

136. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-NH2

137. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

138. H-Gly-Pro-?ro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-NH2

139. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

140. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-NH2

141. H-Glu-?ro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH

142. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH.

143. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-OH

144. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-NH^ 145. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH·

146. K-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH^ '147. K-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-OH

148. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-NH2

149. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-OH

150. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-NH2

151. H-Giy-Pro-Piro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-OH

152. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-NH2

153. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

154. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu--Ser-Leu-Glu-NH2

155. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

156. H-Gly~Pro-Pro-Ilè-Ser-Ile-Glu~Leu-Ser-Leu-Glu-NH2 8301281 -14-

157. H-Gly-Pro-Prorlle-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

158. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp~Leu-Ser-Leu-Glu-NH2

159. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

160. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH^

161. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH

162. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-ïlë-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH2 163. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-OH lë4.’ H*-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-NH2

165. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

166. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

167. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-OH

168. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile”Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-NH2

169. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-OH

170. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2

171. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-OH

172. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-NH2

173. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-OH

174. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile~Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-NH2

175. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

17 6. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2 ' 177. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

178. fi-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Glu-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2

179. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

180. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu--Leu-NH2 ' 181. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH

18 2. H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-?he-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH2 830 1 28 1 -15-

183. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-QH

184. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NHj

185. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-OH

186. H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-N^.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

De Rf-waarden werden bepaald op tevoren beklede platen silicagel 60 ^254 met een laagdikte van 0,25 mm, een lengte van 20 αη? onder toepassing van de volgende loopvloeistoffen: 5 Systeem A: n-butanol:azijnzuur:water (4:1:1 volumina)

Systeem B: chloroform:methanol:32% ammonia (65:45:20 volumina)

De DLC-analyse werd uitgevoerd bij een temperatuur tussen 18 en 25°C 10 en de Rf-waarden kunnen dus ±5% wisselen. Een hoge-druk vloeistof-chromatografie (HPLC) analyse werd uitgevoerd over een kolom Hibar Lichrosorb R9-18 (5 ƒ0 onder toepassing van:

Loopmiddel A: KH^PO^ 0,02 M, pH 7, 10% acetonitrile?

Loopmiddel B: K^PO^ 0,02 M, pH 7, 60% acetonitrile; 15 Mobiele fase: een mengsel van A en B met daarin 10% B.

Het percentage B werd in de loop van 25 minuten verhoogd van 10 op 60%.

Een hoog—voltage-papierelektroforese werd uitgevoerd met een Pherograph-Original-Frankfurt Type 64-apparatuur op Schleicher en Schull-papier No. 2317 bij pH 5,8.

20 (pyridine:azijnzuur:water, 45:5:450 volumina)? 32,5 V/cm).

De elektroforetische mobiliteiten (E^ g) zijn opgegeven in verhouding tot glutaminezuur.

De synthese op een polymere drager kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd volgens één van de volgende procedures: 25 Procedure A. Bereiding van Boe- (AA) - (AA) .... (AA), -Hydroxy-

n η—1 X

methylpolystyreenester.

Een gechloormethyleerde polystyreenhars wordt veresterd met het eerste Boc-aminozuur (Boc-AA^-OH) volgens Gisin, Helv. Chim.

Acta, _56, 1476 (1973). De polystyreenester wordt vervolgens behandeld 830 1 28 1 -16-

volgens schema A voor incorporatie van Boe-(AA).-OH...Boe (AA) -OH

2 n waardoor de titelhars ontstaat.

Schema A

1. Was 3 maal met dichloormethaan.

5 2. Behandel 2 maal gedurende 1 minuut met trifluorazijnzuur: dichloormethaan (40:60 volumina).

3. Behandel gedurende 30 minuten met trifluorazijnzuur: dichloormethaan (40:60 volumina).

4. Was 4 maal met dichloorethaan.

10 5. Behandel 2 maal gedurende 1 minuut met 10% N-methylmorfoline in dichloormethaan.

6. Behandel 5 minuten met 10% N-methylmorfoline in dichloormethaan, 7. Was 8 maal met dichloormethaan.

8. Voeg 2 of 3 equivalenten van het symmetrische anhydride van het 15 corresponderende aminozuurderivaat toe, bereid volgens

Hagenmayer en Frank, Hoppe-Seyler's Z Physiol. Chem., 353, 1973, (1972), opgelost in dichloormethaan? reactieduur 0,5-2 uren.

9. Was 3 maal met dichloormethaan.

10. Was 3 maal met isopropanol.

20 11. Was 3 maal met dichloormethaan.

12. Onderzoek met de ninhydrine-reactie volgens Kaiser et al.,

Annal. Biochem. 34, 595, (1970). Bij een onvolledige reactie moeten de trappen 4-11 worden herhaald.

Procedure B. Bereiding van H-(AA) -(AA) ....(AA).-hydroxy- n η—1 1 25 methylpolystyreenester.

Na invoering van het laatste aminozuurderivaat volgens schema A (Procedure A) worden de trappen 1-7 van schema A herhaald en viermaal met isopropanol gewassen.

Procedure C. Bereiding van Boc-(AA)n-(AA)n ^...(AA)^-benzhydryl- 30 aminehars.

Boe-(AA)^-OH wordt gehecht aan een benzhydrylaminehars via dicyclohexylcarbodiimide als beschreven door Pietta et al. in J. Org. Chem. 39, 44 (1974). Onomgezette aminogroepen worden geacety-leerd met azijnzuuranhydride:pyridine:dichloormethaan (2:1:10 volumina). 35 Het polystyreenamide wordt vervolgens behandeld volgens schema A

(procedure A) ter aanhechting van de andere aminozuurstukken waardoor de titelhars wordt gevormd.

830 1 28 1 -17-

Procedure D. Bereiding van H- (AA) .... (AA), -benzhydrylaminehars.

η—1 1

Hierbij wordt als bij procedure B tewerkgegaan maar uitgaande van de peptidehars van procedure C.

VOORBEELD I

5 Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH natriumzout (1) 1 g peptidehars verkregen volgens procedure A met de benodigde volgorde aam amino zuurstukken (ingevoerd als Boc-Leu-OH, Boc-Glu(OBz 1) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(Bz 1)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBz 1)-0H, Boc-Ile-OH, Boc-Ser (Bz 1)-0H, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Gly€H, 10 H-Pyr-OH in deze volgorde) werd gedurende 1 uur bij 0°C gesuspendeerd 3 in 10 cm watervrij (gedestilleerd over 500 mg kobalttrifluoride) waterstoffluoride met daarin 1 cm^ anisool. Het water stof fluoride werd vervolgens onder verminderde druk verwijderd en het anisool verwijderd door wassen met driemaal 10 cm^ diisopropylethër. Het onzuivere pep- 3 15 tide werd van de hars geëxtraheerd met driemaal 10 cm dimethylforma-mide en gezuiverd door een gelfiltratie door Sephadex LH-20 onder toepassing van dimethylformamide als elueermiddel en door een uitwisse-lingschromatografie over DEAE-Sephadex A-25 onder toepassing van een amoniumacetaatbuffer met pH 6 als loopmiddel. Het produkt werd ver-20 volgens in het natriumzout omgezet met een overmaat natriumbicarbonaat, over Sephadex G-15 ontzout en gelyofiliseerd. 0,120 g peptide (1) werd aldus verkregen.

Rf 0,17; Rf 0,44; E_ Q 0,60 Glu; R. (HPLC) ca. 15' 5 f o t 25 Aminozuurverhouding:

Asp 0,99; Ser 1,94; Gly 1,96; Pro 1,98; Gly 1,01; Leu 2,96; Ile 1,97. VOORBEELD II

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH^ natriumzout (2) 1 g peptidehars verkregen volgens procedure C met de benodigde 30 volgorde aan amino zuurst likken (ingevoerd als Boc-Leu-OH, Boc-Glu (OBz l)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser-(Bz l)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OB l)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bz l)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Gly-OH, H-Pyr-OH in deze volgorde) werd 1 uur in 10 cm^ watervrij (gedestilleerd over 500 mg kobalttrifluoride) waterstoffluoride met 3 35 daarin 1 cm anisool gesuspendeerd. Het waterstoffluoride werd onder verminderde druk verwijderd en de anisool verdreven door te wassen 830 1 28 1 3 -18- met driemaal 10 cm diisopropylether. Het onzuivere peptide werd ver- 3 volgens van de hars geëxtraheerd met driemaal 10 cm dimethylformamide en gezuiverd door een gelfiltratie over Sephadex LH-20 onder toepassing van dimethylformamide als elueermiddel en door ixsi-uitwisselings-5 chromatografie over -DEAE-Sephadex A-25 onder toepassing van een amo-niumacetaatbuffer met pH 6 als elueermiddel. Het produkt werd ver-voglens in het natriumzout omgezet met een overmaat natriumbicarbonaat/ antzout over Sephadex G-15 en gelyofiliseerd. Aldus werd 0/130 g peptide (2) verkregen.

i 10 Eg g 0/30.

Aminozuurverhouding:'

Asp 0,98; Ser 1,95; Glu 1,97; Pro 1,96; Gly 1,00; Leu 2,94; Ile 1,98. VOORBEELD III

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH natriumzout (165) 15 1 g peptidehars verkregen volgens procedure B met de benodigde volgorde aan aminozuurstukken (ingevoerd als Boc-Leu-OH, Boc-Glu (OBz 1)-0H, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(Bz l)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBz l)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bz l)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, 3

Boc-Gly-OH in deze volgorde) werd gedurende 1 uur bij 0°C in 10 cm 20 watervrij (gedestilleerd over 500 mg kobalttrifluoride) waterstof- 3 fluoride met daarin 1 cm anisool gesuspendeerd. Het waterstoffluoride werd vervolgens onder verminderde druk verdreven en de anisool verwijderd door met driemaal 10 cm^ diisopropylether te wassen. Het onzuivere peptide werd vervolgens van de hars geëxtraheerd met driemaal 3 25 10 cm dimethylformamide en gezuiverd door een gelfiltratie over

Sephadex LH-20 onder toepassing van dimethylformamide als elueermiddel en door een ionen-uitwisselingschromatografie over CH-Sephadex C-25 onder toepassing van een ammoniumacetaatbuffer met pH 4 als elueermiddel. Het produkt werd vervolgens omgezet in zijn natriumzout met 30 behulp van een overmaat natriumbicarbonaat, cntzout over Sephadex C^-15 en gelyofiliseerd. Aldus werd 0,110 g peptide (165) verkregen.

Rf. 0,16, Rf 0,44; E_ _ 0,34; R. (HPLC)Ca. 17' A S O f o t

Amino zuurverhouding:

Asp 0,98; Ser 1,97; Glu 1,00; Pro 1,99; Gly 0,99; Leu 2,97; Ile 1,98.

8301281 » -19-

VOORBEELD IV

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH., natriumzout (166) 1 g peptidehars verkregen volgens procedure B met de gewenste volgorde aan aminozuurgroepen (ingevoerd als Boc-Leu-OH, Boc-Glu 5 (OBz l)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(Bz 1)-0H, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBz D-OH,

Boc-Ile-OH, Boc-Ser(Bz 1)-0H, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Pro-OH, 3

Boc-Gly-OH in deze volgorde) werd 1 uur bij 0°C in 10 cm watervrij (gedestilleerd over 500 mg kobalttrifluoride) waterstoffluoride met daarin 1 cm"* anisool gesuspendeerd. Het waterstoffluoride werd onder 10 verminderde druk verdreven en de anisool verwijderd door te wassen met diisopropylether. Het onzuivere peptide werd van de hars geëxtraheerd met driemaal 10 cm^ dimethylformamide en gezuiverd door een gel-filtratie over Sephadex LH-20 onder toepassing van dimethylformamide als elueermiddel en door een ionen-uitwisselingschromatografie over 15 CH-Sephadex C-25 onder toepassing van ammoniumacetaatbuffer met pH 4 als elueermiddel. Het produkt werd vervolgens in het natriumzout omgezet met een overmaat natriumbicarbonaat,oritzout over Sephadex G-15 en gelyofiliseerd. Aldus werd 0,110 g peptide (166) verkregen.

E5,8 ^°· 20 Aminozuurverhouding:

Asp 0,98; Ser 1,97; Glu 0,99; Pro 1,97; Gly 1,00; Leu 2,96; Ile 1,96. VOORBEELD V

H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-OH natriumzout (89) 1 g peptidehars verkregen volgens procedure B met de gewenste 25 volgorde aan aminozuurgroepen Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bz l)-OH,

Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBz l)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(Bz l)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Pro-OH-Boc-Pro-OH, Boc-Glu(OBz l)-OH, Boc-Gln-OH in deze volgorde) werd 1 uur bij 0°C in 10 cm^ watervrij (gedestilleerd over 500 mg kobalttrifluoride) waterstoffluoride met daarin 1 cm anisool 30 gesuspendeerd. Het waterstoffluoride werd onder verminderde druk ver- 3 dreven en de anisool verwijderd door te wassen met driemaal 10 cm diisopropylether. Het onzuivere peptide werd van de hars geëxtraheerd met driemaal 10 cm^ dimethylformamide en gezuiverd door een gelfil-tratie over Sephadex LH-20 onder toepassing van dimethylformamide als 35 elueermiddel en door een ionen-uitwisselingschromatografie over CE-Sephadex C-25 onder toepassing van ammoniumacetaat met een pH 4 830 1 28 1 -20- als elueermiddel. Het produkt werd vervolgens in het natriumzout omgezet met een overmaat natriumbicarbonaat, ontzout over Sephadex G-15 en gelyofiliseerd. 0,130 g peptide (89) werd aldus verkregen.

Rf_ 0,22; Rf 0,45; E_ . 0,75; R. (HPLC)Ca 12' n O O f O u 5 Aminozuurverhouding:

Asp 0,99; Thr 0,88; Ser 0,96; Glu 1,98; Pro 1,98; Leu 2,00;

Ile 0,98; Phe 0,99.

Op overeenkomstige wijze werden de volgende stoffen bereid:

VI

10 Pyr-Glv-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH natriumzout(45) E5,8 0,63

Aminozuurverhouding:

Asp 0,98; Ser 1,96; Glu 1,98; Pro 1,99; Gly 1,00; Leu 1,97; Ile 1,98.

VII

15 Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH„ natriumzout (46) E5,8 0,3°*

Aminozuurverhouding:

Asp 0,99; Ser 1,95; Glu 1,97; Pro 1,98; Gly 1,00; Leu 1,98; Ile 1,97. 20 VIII

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH natriumzout (69)

Vs °-32·

Aminozuurverhouding:

Asp 0,98; Ser 1,97; Glu 0,98; Pro 1,98, Gly 1,00; Leu 1,99.

25 IX

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH,, natriumzout (70)·

Vs °'15·

Aminozuurverhouding:

Asp 0,99; Ser 1,98; Glu 0,99; Pro 1,97; Gly 1,00; Leu 1,99; Ile 1,99. 30 X

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OB natriumzout (91)

Vs °'35·

Aminozuurverhouding:

Asp 0,97; Ser 1,96; Glu 0,97; Pro 1,96; Gly 0,99; Leu 1,00; He 1,98.

8301281 -21- a %

XI

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NH natriumzout (92) E5,8 °'16·

Aminozuurverhouding: 5 Asp 0,98? Ser 1,97? Glu 1,01? Pro 1,97; Gly 1,00; Leu 1,00; He 1,97.

XII

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-OH natriumzout (111) E5,8 °'18·

Aminozuurverhouding: 10 Asp 0,99; Ser 1,98? Pro 1,99; Gly 1,01? Leu 1,00; lie 1,99.

XIII

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-NB,, natriumzout (112) E5,8 Ca* °*

Aminozuurverhouding: 15 Asp 0,98; Ser 1,98; Pro 1,98; Gly 0,99; Leu 1,00, lie 1,98.

XIV

5-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-OH natriumzout (127) E5,8 °'15·

Aminozuurverhouding: 20 Asp 0,99; Ser 1,97; Pro 1,99? Gly 1,0; Leu 1,99; He 1,98.

XV

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-NH^ natriumzout (128) E ca. 0.

5,8

Aminozuurverho tiding: 25 Asp 0,98? Ser 1,97? Pro 1,97; Gly 1,00; Leu 2,00? He 1,99.

XVI

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-OH natriumzout (145) E5,8 °'32- 30 Aminozuurverhouding:

Asp 0,99; Ser 1,98; Glu 0,97; Pro 1,98? Gly 1,00; Leu 2,01? He 1,99.

XVII

H-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-NH^ natriumzout (146) E5,8 °'16- 35 Aminozuurverhouding:

Asp 0,98; Ser 1,98; Glu 0,98; Pro 1,99; Gly 1,00; Leu 1,98? lie 1,98.

830 1 28 1 η -22-

XVIII

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH natriumzout (13) E5,8 °'28·

Aminozuurverhouding: 5 Asp 0,99; Ser 1,99; Glu 1,99; Pro 1,98; Gly 1,00; Leu 2,97; Ile 1,97.

XIX

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asn-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-NH^ natriumzout (11) E5,8 0,14‘

Aminozuurverhouding: 10 Asp 0,99; Ser 1,97; Glu 1,97; Pro 1,99; Gly 1,00; Leu 2,98; He 1,99.

XX

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Gln-Leu-OH natriumzout (5) E5,8 °'28*

Aminozuurverhouding: 15 Asp 0,97; Ser 1,98; Glu 1,96; Pro 1,97; Gly 1,00; Leu 2,97; Ile 1,97.

XXI

Pyr-Gly-Pro-Pro-I le- Ser-I le-Asp-Leu-Ser-Leu-Gln-Leu-Nï^ natriumzout (6) ES,8 °'14·

Aminozuurverhouding: 20 Aps 0,98; Ser 1,97; Glu 1,97; Pro 1,99; Gly 1,00; Leu 3,01; Ile 1,99.

XXII

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-OH natriumzout (3) RfA 0,16; RfB 0,42; E^g 0,60.

Aminozuurverhouding: 25 Asp 0,99; Ser 1,95; Glu 1,99; Pro 1,98; Gly 1,00; Leu 1,97; Ile 1,98; Phe 1,00.

XXIII

Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Phe-NH» natriumzout (4) E5,8 °'30· 30 Aminozuurverhouding:

Asp 0,98; Ser 1,98; Glu 1,96; Pro 1,98; Gly 1,01; Leu 1,99; Ile 1,98; Phe 1,00.

VOORBEELDEN XXIV-CLXXXVI

Onder toepassing van passende uitgangsmaterialen en via pas-35 sende tussenprodukten werden de peptiden met de nummers 7-12, 15-44, 47-68, 71-90, 93-110, 113-126, 129-144 en 147-186 op een analoge wijze als beschreven in de voorgaande voorbeelden bereid.

8301281

Claims

1. Peptide met de formule: X-A-Pro-Pro-Ile-Ser-B-C-Leu-D-E-F-G-W waarin X waterstof, een terminale stikstofschermgroep in de vorm van acyl, 5 aromatisch urethan, alkyl, aralkyl of alifatisch urethan of een groep van een neutraal L-aminozuur, waarvan de vrije aminogroep al of niet door een boven weergegeven schermgroep is beschermd, A een L-aminozuurrest of een glycinerest, B een neutrale L-aminozuurgroep, 10. een neutrale L-aminozuurgroep of een zuur reagerende L-aminozuurgroep, D een L-aminozuurgroep met in de zijketen een alcoholische hydroxyl-groep, welke laatste vrij kan zijn of kan zijn beschermd door een gebruikelijke schermgroep voor een hydroxylfunctie, 15. een valentiebinding of een neutrale L-aminozuurgroep, F een valentiebinding of een L-aminozuurgroep, G een valentiebinding of een neutrale L-aminozuurgroep, en W een hydroxylgroep, een aminogroep of een groep met de formule OR, NHR, NR2 of NH-NH-R' voorstellen, waarbij R een rechte, vertakte 20 of cyclische (met inbegrip van geaneHeerde of brugringen) alkyl-groep met 1-11 koolstofatomen, die al of niet is gesubstitueerd, een fenyl- of aralkylgroep met 6-8 koolstofatomen; en R' een waterstofatoom, één van de groepen die door R worden weergegeven, een alkenylgroep met 3-8 koolstofatomen, een rechte, vertakte of cycly-25 sche alifatische acylgroep met 1-11 koolstofatomen, die al of niet is gesubstitueerd door een hydroxy lgroep, een aminogroep of een halogeenatoom, een aromatische acylgroep, die al of niet is gesubstitueerd door een hydroxylgroep, een aminogroep of een halogeenatoom, een rechte, vertakte of cyclisch alifatische urethangroep 30 met 3-11 koolstofatomen of een aromatische urethangroep voorstellen; alsmede de farmaceutisch geschikte zouten daarvan.

2. Peptide volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat X waterstof, formyl, acetyl, trifluoracetyl, propionyl of benzoyl, danwel benzyloxycarbonyl (Z), 4-nitrobenzyloxycarbonyl, 4-methoxy-35 benzyloxycarbonyl, 2,4-dichloorbenzyloxycarbonyl, 2-broombenzyloxy- 830 1 28 1 4 -24- carbonyl , 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 3,5-dimethoxy-α, a' -dimethylbenzyloxycarbonyl (Ddz), t-butyloxycarbonyl (Boc), 1-methyl— cyclobutyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, isobomyloxycarbonyl, trityl, benzyl (Bzl), methyl, isopropyl, Pyr, Gin, Pro of 2-oxo-5 L-pipecolinezuur, A Glu, Gin of Gly, B lie, Leu, Nle, Val of Phe, C Asn, Gin, Asp of Glu, D Ser, Hse of Thr en, indien de hydroxylgroep van het stuk D is be-10 schermd, deze beschermd is door t-butyl, trityl, benzyl, 2,4-dichloor-benzyl, benzyloxycarbonyl, 2-broombenzyloxycarbonyl, tetrahydropyra-nyl, t-butyloxycarbonyl of acyl, zoals formul, acetyl, trifluorace-, tyl, propionyl of benzoyl is beschermd, E phe, Leu of Nle, danwel een valentiebinding,

15. Glu, Gin, His of een valentiebinding, G Leu of Phe danwel een valentiebinding, en W een hydroxylgroep, een aminogroep of een groep met de formules OR, NHR, NR of NH-NH-R’ voorstellen, waarbij R methyl, ethyl, n-propyl, « * isopropyl, n-butyl, s-butylfi isobutyl, t-butyl, 2,2,2-trifluorethyl, 20 cyclohexyl, adamantyl, fenyl, benzyl of fenethyl, R’waterstof, allyl, pentenyl of één van de onder R genoemde groepen, danwel formyl, acetyl, trifluoracetyl, propionyl, butyryl, adamantyloxycarbonyl, benzoyl, fenylacetyl, cinnamyl, benzyloxycarbonyl (Z), 4-nitrobenzyloxycarbony1, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-dichloor-25 benzyloxycarbonyl, 2-broombenzyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxy carbonyl (Fmoc), 3,5-dimethoxy-a,a'-dimethylbenzyloxycarbonyl (Ddz), t-butyloxycarbonyl (Boc), 1-methy1-cyclobutyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl of isobomyloxycarbonyl voorstellen, alsmede de farmaceutisch geschikte zouten daarvan.

3. Peptide volgens conclusie 1, te weten H-Pyr-Gly-Pro-Pro-Ile- Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-OH.

4. Farmaceutisch preparaat met daarin een peptide volgens één van de voorgaande conclusies danwel een farmaceutisch geschikt zout daarvan, gemengd met een farmaceutisch geschikt verdunningsmiddel of 35 drager. 83 0 1 28 1