KR910006284B1 - hpGRF(소마토크리닌)의 합성 방법 - Google Patents
hpGRF(소마토크리닌)의 합성 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR910006284B1 KR910006284B1 KR1019840000837A KR840000837A KR910006284B1 KR 910006284 B1 KR910006284 B1 KR 910006284B1 KR 1019840000837 A KR1019840000837 A KR 1019840000837A KR 840000837 A KR840000837 A KR 840000837A KR 910006284 B1 KR910006284 B1 KR 910006284B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- arg
- gln
- boc
- leu
- ala
- Prior art date
Links
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 title description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 123
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 123
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 91
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 62
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 24
- -1 Boc group Chemical group 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 14
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 9
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 6
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 claims description 4
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- ZOQXJXMDCXGURL-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-yloxyphosphane Chemical compound POC1=CC=CC2=NNN=C12 ZOQXJXMDCXGURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N L-alaninamide Chemical compound C[C@H](N)C(N)=O HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- JRZBPELLUMBLQU-UHFFFAOYSA-N carbonazidic acid Chemical compound OC(=O)N=[N+]=[N-] JRZBPELLUMBLQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims 3
- QGHDLJAZIIFENW-UHFFFAOYSA-N 4-[1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(4-hydroxy-3-prop-2-enylphenyl)propan-2-yl]-2-prop-2-enylphenol Chemical group C1=C(CC=C)C(O)=CC=C1C(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C1=CC=C(O)C(CC=C)=C1 QGHDLJAZIIFENW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims 1
- 238000004185 countercurrent chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 186
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 158
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 110
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 91
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 79
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 48
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 47
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 37
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 36
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 32
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 27
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 24
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- VXDSLUMUNWTSDB-UHFFFAOYSA-N acetic acid;chloroform;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O.ClC(Cl)Cl VXDSLUMUNWTSDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 13
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 11
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 description 10
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 10
- 101800000736 Growth hormone-releasing factor Proteins 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxo-4-phenylmethoxybutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 8
- FWDKXKMKRUDOMG-IBGZPJMESA-N 5-o-benzyl 1-o-(4-nitrophenyl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanedioate Chemical compound C([C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)OC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 FWDKXKMKRUDOMG-IBGZPJMESA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- HJMMCTZLXOVMFB-LBPRGKRZSA-N (4-nitrophenyl) (2s)-5-amino-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-oxopentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 HJMMCTZLXOVMFB-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- YDADNAKYCYWNTD-UHFFFAOYSA-N O.C1CCOC1.OC(=O)C1=CC=CC=N1 Chemical compound O.C1CCOC1.OC(=O)C1=CC=CC=N1 YDADNAKYCYWNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus decaoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OZSSOVRIEPAIMP-ZETCQYMHSA-N (2s)-5-[amino(nitramido)methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N[N+]([O-])=O OZSSOVRIEPAIMP-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RXEUJZIXFKSROC-UHFFFAOYSA-N O.OC=O.CCOC(C)=O.C1=CC=NC=C1 Chemical compound O.OC=O.CCOC(C)=O.C1=CC=NC=C1 RXEUJZIXFKSROC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- KJOZJSGOIJQCGA-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound ClCCl.OC(=O)C(F)(F)F KJOZJSGOIJQCGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FATJLEZSGFVHQA-CABZTGNLSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s,3s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O FATJLEZSGFVHQA-CABZTGNLSA-N 0.000 description 2
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JXYACYYPACQCDM-UHFFFAOYSA-N Benzyl glycinate Chemical compound NCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 JXYACYYPACQCDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JQJPBYFTQAANLE-UHFFFAOYSA-N Butyl nitrite Chemical compound CCCCON=O JQJPBYFTQAANLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N Fluoroform Chemical compound FC(F)F XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- RWRIWBAIICGTTQ-UHFFFAOYSA-N difluoromethane Chemical compound FCF RWRIWBAIICGTTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N fluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)CF QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- LFRFWMCLWQNBFR-KBPBESRZSA-N methyl (2s)-4-methyl-2-[[(2s)-4-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoyl]amino]pentanoate Chemical compound COC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)OC(C)(C)C LFRFWMCLWQNBFR-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- BFGNHBBJJWESFT-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;ethoxyethane Chemical compound CCOCC.CN(C)C=O BFGNHBBJJWESFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 2
- SRRKNRDXURUMPP-UHFFFAOYSA-N sodium disulfide Chemical compound [Na+].[Na+].[S-][S-] SRRKNRDXURUMPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZPCSFNCKORLQG-NSHDSACASA-N z-arg(no2)-oh Chemical compound [O-][N+](=O)NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 BZPCSFNCKORLQG-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- IMUSLIHRIYOHEV-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C IMUSLIHRIYOHEV-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)OC(C)(C)C QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N (2s)-3-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N (2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- HSQIYOPBCOPMSS-ZETCQYMHSA-N (2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HSQIYOPBCOPMSS-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- JIMLDJNLXLMGLX-JTQLQIEISA-N (2s)-5-amino-5-oxo-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 JIMLDJNLXLMGLX-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- QZIWWFMMLBBICG-KRWDZBQOSA-N (4-nitrophenyl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoate Chemical compound C([C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)OC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QZIWWFMMLBBICG-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDCPFAYURAQKDZ-UHFFFAOYSA-N 1-nitroguanidine Chemical compound NC(=N)N[N+]([O-])=O IDCPFAYURAQKDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- LJCZNYWLQZZIOS-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trichlorethoxycarbonyl chloride Chemical compound ClC(=O)OCC(Cl)(Cl)Cl LJCZNYWLQZZIOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WWGQHTJIFOQAOC-UHFFFAOYSA-N 2,3,5-trichlorophenol Chemical compound OC1=CC(Cl)=CC(Cl)=C1Cl WWGQHTJIFOQAOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FORGMRSGVSYZQR-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-methylpentanamide Chemical compound CC(C)CC(N)C(N)=O FORGMRSGVSYZQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEULITJLZYZYPU-AWEZNQCLSA-N 4-o-benzyl 1-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanedioate Chemical compound C([C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)ON1C(CCC1=O)=O)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 KEULITJLZYZYPU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- WDYVUKGVKRZQNM-UHFFFAOYSA-N 6-phosphonohexylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCCCCP(O)(O)=O WDYVUKGVKRZQNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAIOZXJXGSOKFN-UHFFFAOYSA-N Aceric acid Natural products CC1OC(O)C(O)C1(O)C(O)=O PAIOZXJXGSOKFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N L-leucinamide Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(N)=O FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USPFMEKVPDBMCG-LBPRGKRZSA-N N-benzyloxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 USPFMEKVPDBMCG-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- PZFKRSRMVWJOLN-UHFFFAOYSA-N O.CCOC(C)=O.OC(=O)C1=CC=CC=N1 Chemical compound O.CCOC(C)=O.OC(=O)C1=CC=CC=N1 PZFKRSRMVWJOLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000008425 Protein deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 208000013201 Stress fracture Diseases 0.000 description 1
- 206010042220 Stress ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- LTJSXGVQCAVSJW-UHFFFAOYSA-N [K+].[K+].[S-][S-] Chemical class [K+].[K+].[S-][S-] LTJSXGVQCAVSJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVUDRSZQKGTCPH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;n,n-dimethylformamide Chemical compound CC(O)=O.CN(C)C=O XVUDRSZQKGTCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- QVQLCTNNEUAWMS-UHFFFAOYSA-N barium oxide Chemical compound [Ba]=O QVQLCTNNEUAWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001864 baryta Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- IQMUMKJNLGYVNS-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.CCCCO IQMUMKJNLGYVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- SKCNIGRBPJIUBQ-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethyl acetate Chemical compound ClC(Cl)Cl.CCOC(C)=O SKCNIGRBPJIUBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAIVIYSBZFEOIU-UHFFFAOYSA-N chloroform;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.ClC(Cl)Cl OAIVIYSBZFEOIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- WUESWDIHTKHGQA-UHFFFAOYSA-N cyclohexylurea Chemical compound NC(=O)NC1CCCCC1 WUESWDIHTKHGQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- GJYVZUKSNFSLCL-UHFFFAOYSA-N dichloromethanol Chemical compound OC(Cl)Cl GJYVZUKSNFSLCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;ethyl acetate Chemical compound CCOCC.CCOC(C)=O SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKQFHRVKCYFVCN-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;hexane Chemical compound CCOCC.CCCCCC ZKQFHRVKCYFVCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHYCRLGKOZWVEF-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hydrate Chemical compound O.CCOC(C)=O MHYCRLGKOZWVEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N hydron;methanol;chloride Chemical compound Cl.OC FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWKPPFQULDPWHX-VKHMYHEASA-N l-alanyl ester Chemical compound COC(=O)[C@H](C)N DWKPPFQULDPWHX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANSUDRATXSJBLY-VKHMYHEASA-N methyl (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CO ANSUDRATXSJBLY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QWZYDRRCPIDYNS-ZETCQYMHSA-N methyl 2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetate Chemical compound COC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(C)C QWZYDRRCPIDYNS-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- KQSSATDQUYCRGS-UHFFFAOYSA-N methyl glycinate Chemical compound COC(=O)CN KQSSATDQUYCRGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- XGZVNVFLUGNOJQ-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;ethyl acetate Chemical compound CN(C)C=O.CCOC(C)=O XGZVNVFLUGNOJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYRGLVWXHJRKMT-QMMMGPOBSA-N n-benzyloxycarbonyl-l-serine-betalactone Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 TYRGLVWXHJRKMT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C.CCN(C(C)C)C(C)C WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical compound [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- CBXWGGFGZDVPNV-UHFFFAOYSA-N so4-so4 Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O CBXWGGFGZDVPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008259 solid foam Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- GMFOMTHMMJGZDI-UHFFFAOYSA-N sulfo hydrogen sulfate;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(=O)(=O)OS(O)(=O)=O GMFOMTHMMJGZDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06043—Leu-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
- C07K5/06069—Ser-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
- C07K5/06095—Arg-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
내용 없음.
Description
본 발명은 액상에서의 hpGRF(소마토크리닌) 및 펩티드 중간체의 합성에 관한 것이다.
hpGRF(human Pancreatic Growth Hormone releasing Factor, ＂인체 췌장 성장 호르몬 방출인자＂) 또는 소마토크리닌은 44 아미노산의 쇄 형성에 의해 구성된 펩티드이다. 그 서열은 다음과 같다 :
이 서열은 최근에 인체 췌장 종양의 추출액으로부터 에이.길레민(A.GUILLEMIN)등 [Science, 218, 585-587(1982)]에 의해 발견되었다.
이 펩티드는 생체내 및 시험관내에서 성장 호르몬(GH)의 방출을 자극하는 활성이 있다. 특히, 시험관 내에서는 이러한 효과가 몇 펜토 몰/㎖의 투여량(ED50=15펜토 몰/㎖)에 의해 나타난다. 그러므로 인체 의학에서의 이러한 물질의 치료학적 관심은 소아과의 왜소발육증 및 지연발육의 치료에 모아지고 있다. 동화 단백질 결핍의 경우에도 응용이 가능하다.(스트레스와 관련된 궤양, 연골의 골절 또는 상처의 치료, 넓은 화상(동화기 도중), 피부치료, 골다공증).
수의학 분야에서, 농가 사육동물(육우, 양, 돼지, 닭 등)의 체중 증가 및 젖분비(젖소, 암양)의 증가에서 화합물의 중요성이 명확해진다.
폴리펩티드 화합물의 산업적인 개발은 이 물질의 대량 합성을 필요하게 한다. 고상에서 합성하는 종래의 방법은 단시간내에 소량의 유효성분을 제조할 수 있게 하나 [Science, 218, 585-187(1982)] 가격이 매우 높아 대규모 제약 생산에 적합하지 않다.
본 발명은 우수한 수율과 순도로 유효성분을 얻을 수 있으며 공업적인 규모로 행할 수 있는 액상에서의 합성의 방법을 제시하고 있다. 이러한 방법은 단편에 의한 합성 원리에 기초를 두고 있다.
본 발명의 방법은 다음의 서열 순서에 따라 비양성자성 극성 용매중에서 단편을 차례대로 커플링시키고, 서열 마지막에 트리플루오로아세트산에 용해시킨 메탄술폰산 또는 트리플루오로메탄산의 0.1 내지 1M 용액을 이용하여 모든 보호기를 제거함을 특징으로 한다 :
a) 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄산 작용 및 리신의 측쇄 아민 작용을 Boc기(페르티오부톡시 카르보닐)의 탈보호 조건에서 안정한 보호기에 의해 보호하고, b) 아르기닌의 구아니딘 작용을 양성자 첨가에 의해 보호하고, c) N-말단 아미노산을 Boc기에 의해 아민 위치에서 보호하고, d) 신장 단계에서 트리플루오로아세트산을 이용한 가수분해에 의해 펩티드의 N-말단 아민으로부터 Boc기를 선택적으로 제거한다.
본 발명의 방법은 또한 hpGRF-1-44와 거의 같은 활성을 갖고 동일한 치료 분야에 사용할 수 있는, 알.길레민(R.GUILLEMIN)에 의해 분리된 천연물, hpGRF-1-40의 합성에도 적용할 수 있다.
GRF의 합성방법은 다음의 특성을 더 갖는다 :
-작용을 갖는 측쇄에 대해 최소 보호의 원리를 적용.
-니트로기에 의한 아르기닌의 측쇄 구아니딘 작용의 일시적인 보호, 아르기닌은 니트로 구아니딘 형태로 서열속에 유일된다. 니트로 작용은 팔라듐/목탄의 도움으로 촉매 수소화에 의해 또는 포름산 또는 포름산 암모늄과 같은 수소 발생 화합물을 수소 기체 대신에 사용하여 가능한한 곧 제거된다.
이러한 방법으로, 합성의 마지막에 그들의 서열내에 아르기닌을 소유하는 모든 합성 단편은 강산(예, 염산)을 이용하는 양성자 첨가 반응에 의해 단순히 보호된 구아니딘 작용을 갖는다.
-글루탐산 및 아스파르트산의 측쇄의 카르복실산 작용이 촉매 수소화(H2/Pd/목탄)에 의해 또는 메탄술폰산(0.5M)-트리플루오로아세트산, 또는 트리플루오로메탄술폰산(0.5M)-트리플루오로아세트산 혼합물과 같은 강산 매질내에서 분해되는 기에 의해 보호된다. 본 발명은 보호기로서 벤질(OBzl) 또는 2,6-디클로로벤질 에스테르를 추천하고 있다. 이러한 보호기들은 알파 위치의 아민의 간헐적인 탈보호 [트리플루오로아세트산에 의한 3차-부틸옥시카르보닐(Boc)기의 제거] 조건에서 안정하다.
-리신의 측쇄의 아민 작용이 상기와 같은 조건하에서 분해되는 기에 의해 보호된다. 본 발명은 트리플루오로산에 의한 간헐적인 탈보호의 조건에서 안정한 벤질옥시카르보닐(Z), 2-클로로 또는 2-브로모 벤질옥시카르보닐(2-Cl 또는 2-BrZ)기를 추천한다.
트레오닌, 세린 및 티로신에 있는 히드록실 작용기는 보호되지 않는다. 합성된 단편으로부터 펩티드를 신장하는 것은, 디메틸 포름아미드 또는 디메틸술폭사이드와 같은 적당한 용매에서 카르복시아지드를 사용하는 방법(Curtius)에 따라, 또는 1-히드록시벤조트리아졸의 존재하에 벤조트리아졸릴 옥시포스포늄(BOP)의 헥사 플루오로포스페이트 또는 디시클로헥실 카르보디이미드를 커플링제로 사용하여 실시한다. 반응 매질로부터 생성물의 분리는 펩티드를 불용성인 채로 침전시키는 제3용매(에테르, 초산에틸…)을 유입시켜 실시한다.
커플링 단계중에는, 커플링제에 의해 야기되는 불순물 뿐만 아니라 최종적으로 커플링된 단편의 여분의 량을 제거하기 위해 적당한 용매의 도움에 의한 고체상 세척 형태의 간단한 정제에 국한된다.
각 단편 커플링 조작후에는 다음 커플링이 행해지는 아민의 수준에서, Boc(테르티오-부틸옥시카르보닐) 보호기의 간헌걱인 탈보호의 단계가 뒤따른다. 이러한 탈보호는 염화 메틸렌에 용해시킨 트리플루오로아세트산(50/50 부피비)에 의해 확실해진다.
펩티드 신장 마지막의 측쇄의 탈보호는 약간이 압력(1∼5㎏)하에 기체 수소의 도움을 받아 촉매(예, Pd/C)의 존재하에 수소화에 의해 행하거나 또는 포름산 또는 포름산 암모늄과 같은 수소 발생 화합물에 의해 행한다. 또한 이러한 형태의 보호기는 트리플루오로아세트산(0.5M)중의 메탄술폰산 또는 트리플루오로아세트산(0.5M)중의 트리플루오로 메탄술폰산의 혼합물과 같은 강산에 의해 제거될 수도 있다.
말단 탈보호후, 생성물은 30% 아세트산의 도움으로 세파덱스 겔 G 50 상 위에서 여과에 의해 정제된다.
GRF-1-44가 많은 분획을 함께 모으고, 카르복시 형태의 이온 교환기(양이온)상에서 사용된 이온 교환수지의 형태에 맞추어 이온 능력을 증가시키는 구배의 도움을 받아 크로마토그래피한다. 높은 순도의 분획들은 함께 모으고, 세파덱스 G 50 또는 바이오겔 P 10형의 적당한 지지체상의 분배 크로마토그래피, 또는 역류 분포에 의해 정제한다.
정제의 역가가 분석 HPLC에 의해 만족할만하게 판단되는 분액을 함께 모은다. 다른 것들은 재순환시킨다. 본 방법의 변형은 분배 크로마토그래피 또는 역류 분포를 조제용 HPLC로 바꾸는 것이다.
hpGRF-1-44의 합성에 사용되는 단편은 단편 커플링 단계 동안의 라세미화의 최소 위험을 고려하여 화학적 고찰에 기초를 두고 결정한다.
단편의 각각은 액상에서의 단계적인 방법에 따라 각 경우마다 적합하게 만든 방법에 따라 합성한다.
도표 1은 hpGRF-1-44의 합성을 위해 사용할 수 있는 합성 전략중의 하나를 나타낸다. 수직 화살표는 합성에 사용된 단편의 한 개를 나타내고, 이들 각각은 문자로 지정하였다.
A : 단편 40∼44
B : 단편 33∼39
C : 단편 28∼32
D : 단편 25∼27
E : 단편 21∼24
F : 단편 16∼20
G : 단편 12∼15
H : 단편 5∼11
I : 단편 1∼4
부가해서, 측쇄의 보호는 다음과 같이 기호화하였다.
X1=벤질형의 에스테르(OBzl)
X2=벤질옥시카르보닐(Z)형의 카르바메이트 보호.
표1∼9는 각 단편 A∼Ⅰ에 사용된 합성 방법을 나타낸다.
[도표 1]
GRF-합성의 전략
[표 1]
[표 1]
[표 3]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
[표 7]
[표 8]
[표 9]
hpGRF-1-44는 다음 단편을 사용하는 방법에 따라 제조될 수도 있다 :
20-44 펩티드 K
5-19 펩티드 J
1-4 펩티드 I
이들은 다음의 순서에 따라 커플링시킨다 :
5-19+20-44 5-44
1-4+5+44 1-44
펩티드 J 및 펩티드 K는 단편에 의한 방법에 의해 차례차례 합성된다. 펩티드 5-19는 3단편들로부터 펩티드 20-44는 7단편들로부터 합성된다.
도표 2 및 3은 펩티드 J 및 K, 도표 1에서 이미 제조된 펩티드 I의 제조를 위해 사용된 전략들을 나타낸다.
도표 4는 hpGRF-1-44에 도달하기 위한 펩티드 I, J 및 K의 3펩티드들의 커플링을 나타낸다.
표 10∼14는 다음 도표 1에서 제시되지 않은 단편의 합성 도표를 보여준다. 끝으로, 모든 경우에 있어서, hpGRF-1-40을 얻기 위해서는 단편 A를 알라닌아미드로 축소하는 것으로 충분하다.
[도표 2]
단편 20-44(25aa) : 펩티드 K의 합성
[도표 3]
단편 5-19(15α 아미노산) : 펩티드 J의 합성
[도표 4]
GRF 1-44의 서열의 통과
[표 10]
부-단편 B1
[표 11]
부-단편 B2
[표 12]
단편 E1
[표 13]
단편 F1
[표 14]
단편 G1
[표 15]
단편 H1
다음 실시예는 본 발명의 범위를 보다 더 쉽게 설명할 것이다.
다음 약어들이 사용될 것이다.
아미노산들은 IUPAC-IVB, 생화학 부분의 명명법 위원회에 의해 추천된 기호들에 의해 나타내었다.
Ala : 알라닌
Arg : 아르기닌
Asn : 아스파라긴
Gsp : 아스파르트산
Gln : 글루타민
Glu : 글루탐산
Gly : 글리신
Ile : 이소루이신
Leu : 루이신
Lys : 리신
Met : 메티오닌
Phe : 페닐 알라닌
Ser : 세린
Thr : 트레오닌
Tyr : 티로신
Val : 발린
글리신을 제외하고, 모두 L-배위를 갖는다.
TLC : 얇은 막 크로마토그래피
OBzl 벤질릭 에스테르
Z 벤질옥시 카르보닐(카르바메이트)
Boc 테르티오부틸옥시 카르보닐(카르바메이트)
DMF 디메틸 포름아미드
NEM N-에틸 모르폴린
TFA 트리플루오로아세트산
MA 혼합 무수물을 이용한 커플링 방법
ONSU N-히드록시 숙신이미드에 의해 활성화된 에스테르
ONp 오르토 니트로 페놀에 의해 활성화된 에스테르
Troc 트리클로로 에톡시 카르보닐(카르바메이트)
OBuｔ테르티오부틸에 의한 에스테르
OTcp 2,3,5 트리클로로페놀에 의해 활성화된 에스테르
OHBT N-히도록시벤조트리아졸
ONb N-히드록시 5-노르보르넨 2,3-디카르복시이미드에 의해 활성화된 에스테르
BOP 벤조트리아졸릴 옥시포스포늄의 헥사플루오로포스페이트
DCHa 디시클로헥실아민
DCU 시클로헥실우레아
DCC DCCI 또는 디시클로헥실카르보디이미드
TA 주변 온도
DIPEA 디이소프로필에틸아민
EPP 폴리펩티드 순도
TFMSA 트리플루오로 메탄술폰산
AAA 아미노산의 분석
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
부피로 표시된 크로마토그래피의 매질 :
BEW1부탄올, AcOH, H2O 72/7/21
BEW2부탄올, AcOH, H2O 67/10/23
BPEW1부탄올, 피리딘, AcOH, H2O 50/12/12/25
EPAW 부탄올, AcOEt, 피리딘, HCO2H, H2O 63/21/10/6
BPEW2부탄올, 피리딘, AcOH, H2O 42/24/4/30
[실시예 1]
H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2(단편 A)의 합성.
1.
130g의 루이신 아미드(H-Leu-NH2)를 1.5ℓ의 DMF에 주변 온도에서 용해시키고 333g의 Boc-Arg(NO2)-OH 및 500g의 BOP를 차례대로 가한다. pH 페이퍼(이때는 물론 희석한 소량의 샘플에 시험한다) 및 N-에틸모르폴린(NEM)을 이용해서 pH를 7로 조정한다.
매질을 교반하고 반응의 전계를 TLC로 검사한다. 4시간 후 반응을 완료하고 매질을 진공하에 25℃에서 증발건조 시킨다. 잔류물을 1ℓ의 물에 용해시키고 고체를 수거해서 물, 물과 NaHCO3의 5% 수용액 및 에틸 아세테이트로 차례로 세척하고 최종적으로 고체를 공기중에서 건조시킨 다음 TLC로 검사한다.
상기 고체를 2ℓ의 트리플루오로아세트산/염화 메틸렌 혼합물(50/50, 부피/부피)에 가하고 매질을 10분간 주변 온도에서 교반한 후, 진공하에 주변 온도에서 증발 건조시킨다. 증발 잔류물을 에테르에 용해시키고 배수 건조시킨 다음 TLC 및 NMR로 검사한다.
수율 : 339g(90% 백색 고체의 트리플루오로아세테이트)
2. H-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2
443g의 H-Arg(NO2)Leu-NH2의 트리플루오로아세테이트를 2ℓ의 DMF에 용해시키고 200g의 Boc-Ala-OH 및 500g의 BOP를 차례대로 가한다. pH 페이퍼(이때는 물로 희석한 소량의 샘플에 시험한다) 및 NEM을 사용해서 pH를 7로 조정한다. 매질을 교반하고 반응의 전개를 TLC로 검사한다. 4시간 후 반응을 완료하고 매질을 진공하에 25℃에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 2ℓ의 물 및 2ℓ의 에틸 아세테이트에 용해시킨다. 유기층을 5% NaHCO3수용액, 및 물로 세척하고 건조 및 증발시킨다. 트리펩티드를 에틸 아세테이트/에테르로 재결정하고, 최종적으로 진공하에 건조시킨다. TLC 및 NMR로 검사한다.
건조된 상기 생성물을 상기 실시예Ⅰ-1의 조건하에 TFA-CH2Cl2혼합물(50/50, 부피/부피)로 처리한 다음 역시 동일한 조건하에 분리시킨다.
수율 : 412g(80%, TLC 및 NMR로 검사, 백색 분말 생성물의 트리플루오로아세테이트)
3. Arg(NO2)-Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2
2.5ℓ의 DMF에 용해시킨 515g의 H-Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2, 333g의 Boc-Arg(NO2)-OH 및 500g의 BOP를 실시예Ⅰ-1과 같은 조건하에 조작하고 TFA-CH2Cl2혼합물로 처리하여 TLC 및 NMR로 검사된 607g(85%)의 백색 고체를 수득한다.
4. Z-Ala-Arg(NO2)-Ala-Arg-Leu-NH2.
4ℓ의 DMF에 용해시킨 715g의 E-Arg(NO2)Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2트리플루오로아세테이트, 233g의 Z-Ala-OH 및 500g의 BOP를 실시예Ⅰ-2와 같은 방법(TFA-CH2Cl2에 의한 처리는 제외)으로 처리한 후 DMF-에테르 혼합물로 재결정해서 TLC 및 NMR로 검사된 백색 분말 고체 형태의 Z-Ala-Arg(NO2)-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2612g(76%)을 수득한다.
5. Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 3HCl.
200g의 Z-Ala-Arg(NO2)Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2(0.25몰)을0.8몰의 HCl을 함유하는 2ℓ의 메탄올에 현탁시킨다. 40g의 Pd/C 및 10% Pd를 가하고 매질을 1.2바아의 압력하에 수소 기체 내에서 24시간 동안 교반한 후 반응 완료를 TLC로 검사한다. 촉매를 여과 제거하고 용매를 진공하에 주변 온도에서 증발시킨다.
용리 매질로서 부탄올-피리딘-HO2CCH3-OH2혼합물(50-12-12-25부피비)을 사용해서 고체 잔류물을 실리카겐 크로마토그래피하여 정제한다.
순수한 생성물을 함유한 분획을 수거하고 증발시킨 다음 냉동 건조시킨다.
수율 : 119g(69%, NMR 및 TLC로 검사된 백색 분말 고체)
아미노산 분석 : Leu 1.03(1) Arg 1.92(2) Ala 1.95(2)
[실시예 2]
Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH, HCl(단편 B1)의 합성.
1. Z-Arg-(NO2)-Gly-OBzl
3.37g(0.01몰)의 H-Gly-OBzl의 토실레이트를 5㎖의 DMF에 용해시키고 1당량의 NEM(1.3㎖)를 가한다. 상기 용액을 1당량의 NEM(1.3㎖)를 함유하는 15㎖의 DMF에 용해시킨 3.53g(0.01몰)의 Z-Arg(NO2)-OH 용액에 가한다. 그 다음 상기 반응 혼합물에 4.5g(0.01M)의 BOP를 가하고, NEM을 가해서 pH를 7로 조정하고 주변 온도에서 2시간 30분 동안 교반한다.
반응의 완료를 TLC : 클로로포름-메탄올(3/1)로 확인한다.
반응 혼합물을 감압하에(0.01mmHg) 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 100㎖의 에틸 아세테이트에 녹이고 이 용액을 강하게 교반한 빙수 120㎖에 붓는다. 몇차례 교반한 후 침전이 생성되면 이를 냉장고에 밤새 방치한다.
고체를 배수시키고 고체 상태에서 하기 물질 :
-2×100㎖의 중탄산나트륨 수용액.
-2×100㎖의 5% SO4HK-SO4K2수용액.
-2×100㎖의 물.
-2×100㎖의 에테르.
로 계속해서 세척한 다음 진공하에서(0.1mmHg) 일정한 중량이 될때까지 건조시킨다.
수율 : 4g(80%)
코플러 융점 : 149℃
TLC : 클로로포름-메탄올(3/1) Rf : 0.73
NMR 검사.
2. HCl-H-Arg-Gly-OH
100g(0.2몰)의 Z-Arg(NO2)-Gly-OBzl을 600㎖의 몰, 600㎖의 N염산 및 100㎖의 테트라히드로푸란의 혼합물에 현탁시킨다. 습도가 50%인 60g의 10% Pd/C를 가한다. 혼합물을 15mmHg 압력하에 주변 온도에서 48시간 동안 수소화시킨다. 촉매를 여과하고, 앰버라이트 IR 45수지(OH형)를 가함으로써 수용액의 pH를 6.5로 조정한다. 수지를 배수시킨 다음 또다시 새로운 수지를 가함으로써 용액의 pH를 8.5로 조정하고 진공(25mmHg)하에 회전식 증발기 내에서 20분간 교반한다.
수지를 배수시키고 네슬레 시험으로 수용액내의 염화 암모늄 부재를 확인한 다음 이 용액을 감압(0.1mmHg)하에 30℃ 미만의 온도에서 증발 건조시킨다. 고무성 잔류물을 수득하고 무수 인산을 사용하여 건조기 내에서 밤새 건조시킨다.
수율 : 45.19g (80.6%)
TLC : 에틸 아세테이트-피리딘-포름산-물(40-21-10-6)
Rf : 0.1 사카구찌 시험 양성(홍반)
NMR 검사.
3. Boc-Glu(OBzl)-Arg(HCl)-Gly-OH.
41.5g의 HCl-H-Arg-Gly-OH(0.155M)을 400㎖의 DMF 및 130㎖의 물의 혼합물에 용해시킨다. N 염산을 가해서 pH를 7로 조정한다.
상기 용액에 하기 물질 :
-100㎖의 DFM와 40㎖의 물과의 혼합물에 68.8g의 Boc-Glu(OBzl)-ONP(0.150M)을 용해시킨 용액.
-100㎖의 DFM와 40㎖의 물과의 혼합물에 22.7g의 히드록시벤조트리아졸(0.150M)을 용해시킨 용액.
-100㎖의 DFM에 37.8㎖의 NEM(2×0.150M)을 용해시킨 용액을 동시에 가한다.
반응 혼합물을 주변 온도에서 교반하고 반응을 TLC [클로로포름-메탄올-아세트산(95-5-9) 및 피리딘-에틸아세테이트-포름산-물(21-40-10-6)]에서 행한다.
반응 1시간 후, 13.76g의 Boc-Glu(OBzl)-ONP를 가한다.
반응 2시간 후, 13.76g의 Boc-Glu(OBzl)-ONP를 가한다.
반응 3시간 후, 7g의 Boc-Glu(OBzl)-ONP를 가한 다음 1시간 다음 반응을 계속시킨다.
반응 혼합물을 감압(0.1mmHg)하에 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 진한 오일을 수득하고, 이를 500㎖의 에틸 아세테이트에 용해시킨다. 1ℓ의 에테르를 가해서 진한 오일을 형성시킨다. 이를 냉장고에 24시간 동안 방치시킨 다음 액체상을 경사 분리시킨다.
잔류 오일을 500㎖의 메탄올에 용해시키고, 500g의 실리카(70-230메시)를 가한다음 회전식 증발기를 사용해서 용매를 증발시킨다. 수득된 분말을 클로로포름-메탄올(80-20) 혼합물과 혼합하고, 생성된 겔을 클로로포름-메탄올(80-20) 혼합물로 채워진 실리카겔 컬럼(높이 : 200㎝, 직경 : 85㎜)의 상부로 주입한다.
생성물을 하기 물질 :
-클로로포름-메탄올(80-20) 혼합물 : 25ℓ
-클로로포름-메탄올(50-50) 혼합물 : 10ℓ
-메탄올 : 30ℓ
로 용출시킨다.
TLC(피리딘-에틸 아세테이트-포름산-물, 21-40-10-6)으로 정제한다.
2분획을 수거한다 :
-분획 A, 29.80g
TLC : 피리딘-에틸 아세테이트-포름산-물, 21-40-10-6 ; Rf : 0.75
NMR 검사
HPLC-EPP : 96.98%
AAA : Glu 1.01-Gly 1.01-Arg 0.98
-분획 B, 36.82g
TLC : 피리딘-에틸 아세테이트-포름산-물, 21-40-10-6 ; Rf : 0.75
1H NMR 스펙트럼, 일치
HPLC-EPP : 99.61%
AAA : Glu 0.93-Gly 0.99-Arg 1.08
[실시예 3]
Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH(단편 B2)의 합성
1. Boc-Asn-Gln-OBzl
TFA, H-Gln-OBzl(0.445M)을 500㎖의 DMF에 용해시킨다. 이 용액에 하기 물질 :
-103.3g의 Boc-Asn-OH(0.445M)
-62.3㎖의 NEM
-217.8g의 BOP(0.5M)
을 계속해서 가한 다음 NEM을 가해서 용액의 pH를 7로 조정한다.
혼합물을 주변 온도에서 교반하고, 필요시 NEM을 가함으로써 pH를 7로 유지한다. 반응을 TLC(클로로포름-메탄올, 3-1)로 검사한다. 1시간후, 반응을 완료하고 1.5ℓ의 에틸 아세테이트를 가해서 생성물을 침전시킨다. 1시간 동안 교반한 다음 냉장고에 밤새 방치한다.
고체를 배수시키고, 에틸 아세테이트(3×500㎖), 에테르(1ℓ)로 세척한 다음 건조시킨다.
수율 : 108.13g(53.9%)
TLC : 클로로포름-메탄올(3-1) ; Rf : 0.63
2. TFA, H-Asn-Gln-OBzl
102g의 Boc-Asn-Gln-OBzl(0.226M)을 빙조에서 냉각시킨 500㎖의 TFA에 용해시킨다. 빙조를 제거하고 주변 온도에서 15분간 교반을 계속한다. 약간 불용성인 물질을 배수시키고 15분간 교반을 계속한다. 반응 매질을 감압(25mmHg)하에 1/4로 농축시켜서 300㎖의 에테르에 용해시킨다. 상기 조작을 두번 계속하고(2×300㎖의 에테르) 잔재 용매를 진공(25mmHg)하에 제거한다. 흡습성 백색 고체를 수득한다.
수율 : 107g
TLC : 클로로포름-메탄올(3-1) ; Rf : 0.08
3. Boc-Ser-Asn-Gln-OBzl
0.226몰의 TFA, H-Asn-Gln-OBzl을 1.5ℓ의 DMF에 용해시킨다. 이 용액에 하기 물질 :
-48.4g의 Boc-Ser-OH, 1/2H2O(0.226M)
-34.8㎖의 NEM(0.27M)
-111g의 BOP(0.25M)
을 계속해서 가한 다음 NEM을 가함으로써 용액의 pH를 7로 조정한다.
혼합물을 주변 온도에서 교반하고, 필요시 NEM을 가함으로써 pH를 7로 유지한다. 반응의 전개를 TLC(클로로포름-메탄올-아세트산, 9-2-0.5)로 검사한다. 2시간 후, 반응을 완료한다. 약간 불용성인 물질을 여과하고 반응매질을 감압(0.1mmHg)하에 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다.
잔류 오일을 800㎖의 에틸 아세테이트에 용해시키고 1시간 동안 교반한 다음 냉장고에 밤새 방치한다.
고체를 배수시키고, 에틸 아세테이트(2×200㎖) 및 에테르(200㎖)로 차례대로 세척하고 진공하에 건조시킨다.
수율 : 108.32g(89%)
TLC : 클로로포름-메탄올-아세트산, 9-2-0.5 ; Rf : 0.42
4. TFA, H-Ser-Asn-Gln-OBzl
108g의 Boc-Ser-Asn-Gln-OBzl(0.2M)을 빙조에서 냉각시킨 520㎖의 TFA에 용해시킨다. 빙조를 제거하고 주변 온도에서 30분간 교반한다. 약간 불용성인 물질을 여과한 다음 감압하에 30℃ 미만의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 에테르에 용해시키고, 고체를 배수시킨 다음 에테르로 여러번 세척하고 건조시킨다.
수율 : 139g
TLC : 테트라히드로푸란-피리딘-포름산-물, 60-20-10-6 ; Rf : 0.81
5. TFA, H-Ser-Asn-Gln-OH
0.2몰의 TFA, H-Ser-Asn-Gln-OBzl을 1ℓ의 물에 용해시킨다. 습도가 50%인 22.4g의 10% Pd/C를 가한다. 혼합물을 15mmHg 압력하에 주변 온도에서 24시간 동안 교반하면서 수소화한다. 촉매를 여과한 다음 감압(0.1mmHg)하에 30℃ 미만의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 무수 인산을 사용해서 건조기내에서 밤새 건조시킨다.
수율 : 93.66g
TLC : 테트라히드로푸란-피리딘-포름산-물, 60-20-10-6 ; Rf : 0.45
6. Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH.
0.2몰의 TFA, H-Ser-Asn-Gln-OH를 100㎖의 물과 600㎖의 DMF와의 혼합물에 용해시킨다. NEM을 가해서 용액의 pH를 7로 조정하고, 600㎖의 DMF에 87.11g의 Boc-Glu(OBzl)-ONP (0.19M)을 용해시킨 용액을 가하고 29.5g의 HOBT(0.19몰)을 가한다. NEM을 가해서 혼합물의 pH를 7로 조정하고 주변 온도에서 교반한다. 1시간 교반후, 2.7g의 Boc-Glu(OBzl)-ONP를 가한다.
반응을 TLC(테트라히드로푸란-피리딘-포름산-물, 60-20-10-6 및 클로로포름-메탄올-아세트산, 95-5-3)로 검사한다.
최종 첨가 30분후, 약간 불용성인 물질을 여과한 다음 감압(0.1mmHg)하에 30℃ 미만의 온도에서 증발 건조시킨다. 수득한 오일을 800㎖의 에틸 아세테이트에 용해시켜서 약간 젤라틴성인 침전물을 형성시킨다. 이를 배수시키고, 에틸 아세테이트(2×400㎖) 및 에테르로 차례대로 세척시키고 건조시킨다.
수율 : 114.3g(90%)
상기 생성물을 주변 온도에서 4시간 동안 교반하면서 에틸 아세테이트(1.2ℓ)로 다시 세척해야 한다. 고체를 배수시키고, 에테르로 세척한 다음 건조시킨다.
수율 : 95.85g(71.9%)
TLC : 테트라히드로푸란-피리딘-포름산-물, 60-20-10-6 ; Rf : 0.62.
노르말부탄올-피리딘-아세트산-물, 50-12-10-25 ; Rf : 0.46
1H NMR, 일치
HPLC-EPP 87.81
AAA : Asn(asp) : 1.01-Ser : 0.89-Glu(gln) : 2.05.
융점(코플러) : 134℃(분해)
[실시예 4]
Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl(단편 C)의 합성
1. Z-Gln-Gly-OMe
1ℓ의 DMF에 75.36g의 HCl, H-Gly-OMe(0.6M)을 현탁시키고 빙조에서 냉각시킨다. 이 현탁액에 168.2g의 Z-Gln-OH(0.6M), 256.41g의 BOP(0.7M) 및 165.4㎖의 N-에틸 모르폴린(1.3M)을 가한다.
주변 온도에서 20시간 동안 반응시킨 후, 용액을 감압하에 농축시켜서 에틸 아세테이트에 용해시킨다. 이 유기 용액을 하기 물질 :
-중탄산나트륨 용액
-염화나트륨 용액
-KHSO4/K2SO4용액
-염화나트륨 용액
으로 세척한다.
유기 용액을 MgSO4를 사용해서 건조시키고 여과한다. 20시간 경과후 각 용액에서 결정이 형성된다. 수성 매질 내에서 결정화된 분획들을 여과해해서 함께 수거하고 물-포화 AcOEt로 세척한 다음 여과, 진공 건조시켜서 7.78g의 생성물(m.p. 158∼159℃)를 수득한다.
AcOEt내에서 결정화된 분획을 물-포화 AcOEt로 세척하고 여과, 진공 건조시켜서 61.8g의 생성물(m.p. 150∼154℃)를 수득한다.
수성층 및 유기층으로부터 부수적인 결정화가 일어난다. 이들 두 생성물을 함께 수거하고 상술한 바와 같이 세척해서 상기 생성물들 외에 38.05g의 생성물을 수득한다.
총 수율 : 107.63g-NMR 및 TLC 검사
2. HCl, H-Gln-Gly-OMe
704㎖의 DMF에 61.8g의 Z-Gln-Gly-OMe(175.9mM)을 용해시키고 880㎖의 메탄올을 가한다. 이 용액을 빙조내에서 냉각시키면서 176㎖의 N HCl 용액에 가하고 3.1g의 10% Pd/C를 가한다. 350mHg의 고압하에서 3시간 30분간 수소화시킨 후 촉매를 셀라이트로 여과하고 감압하에 용액을 농축시킨다. 잔류물을 그대로 하기 반응에 사용한다.
3. Boc-Gln-Gln-Gly-OMe
상기 반응에서 수득된 잔류물(이론치 175.9mM)을 500㎖의 DMF에 용해시킨 용액을 빙조에서 냉각시키고 77.6g의 Boc-Gln-ONp(211.1mM), 26.4g의 히드록시 벤조트리아졸(211.1mM)을 가하고 pH 7이 될 때까지 N-에틸 모르폴린을 가한다. 주변 온도에서 20시간 동안 반응시킨 후 방지한다. 에틸 아세테이트를 가함으로써 침전물을 수득하고, 이를 배수시키고 AcOEt로 세척한 후 진공하에 건조시킨다. 64.27g의 생성물을 수득한다. 수율은 82%이다. NMR 및 TLC로 검사한다.
4. TFA, H-Gln-Gln-Gly-OMe
300㎖의 디클로로메탄에 98.83g의 Boc-Gln-Gln-Gly-OMe(221.8mM)을 현탁시킨 현탁액을 빙조에서 냉각시키고 거기에 400㎖의 TFA를 가한다. 빙조내에서 30분간 반응시키고 주변온도에서 1시간 동안 반응시킨 후, 감압하에 처음 부피의 1/2까지 농축시켜서 교반된 에테르에 붓는다. 여과후, 진공하에 세척, 건조시켜서 119g의 생성물을 수득한다.
5. Boc-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe
1190㎖의 DMF에 119g의 상기 생성물을 용해시키고 빙조에서 냉각시킨다. 77.91g의 Boc-Arg (NO2)-OH(244mM), 97.51g의 BOP(266.2mM) 및 N-에틸 모르폴린을 pH 7l 될 때가지 가한다. 주변 온도에서 20시간 동안 반응시킨 후, 용액을 8ι의 에틸 아세테이트에 붓는다. 수득된 침전물을 여과하고 AcOEt로 세척한 다음 진공하에 건조시킨다. 153.7g의 생성물을 수득한다. NMR 및 TLC로 검사한다.
6. TFA, H-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe
600㎖의 디클로로메탄에 153.7g의 Boc-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe(이론치 221.8밀리몰)을 현탁시키고 빙조에서 냉각시킨 다음 거기에 750㎖의 TFA를 가한다. 주변온도에서 1시간 동안 반응시킨 후 250㎖의 TFA를 가하고 30분후 250㎖의 TFA를 더 가한다. 1시간 동안 더 반응시킨 후 용액을 처음 부피의 1/3로 농축시키고 잔류물을 교반하면서 3ι의 에테르에 붓는다. 생성된 침전물을 배수시키고, 에테르로 세척하고 진공하에 건조시킨다. 167g의 생성물을 수득한다.
7. Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe
1.5ι의 DMF에 167g의 TFA, H-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe(이론치 221.8mM)을 용해시키고 빙조에서 냉각시킨다. 97.52g의 Boc-Ser-ONb(266.2mM), 33.31g의 히드록시 벤조트리아졸(266.2mM) 및 N-에틸 모르폴린을 pH 7이 될때가지 가한다. 주변 온도에서 3시간 동안 반응시킨 후 DMF를 증발시키고 잔류 용액을 에틸 아세테이트에 교반하면서 붓는다. 침전물을 여과하고 에틸 아세테이트로 세척한 다음 진공하에 건조시킨다. 153.3g의 생성물을 수득한다. 4단계에 걸친 수율은 94.2%이다. NMR 및 TLC로 검사한다.
8. Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OMe, AcOH
1ℓ의 메탄올에 153.3g의 Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe(208.9mM)을 용해시키고, 1ℓ의 물 및 500㎖의 아세르산을 가한다. 이 용액을 10g의 10% Pd/C 존재하에 20시간 동안 수소화시킨다. 촉매를 여과하고 용액을 농축시킨 후, 동결 건조시킨다. 153g의 생성물을 수득한다. 수율은 97.8%이다.
9. Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl
2ℓ의 DMF에 104.4g의 Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OMe(139.4mM)을 용해시키고 27.88g의 NaOH(697mM) 및 50㎖의 물을 빙조에서 냉각시키면서 가한다. 15℃ 근처 온도에서 15분간 반응시킨 후, 생성물을 Ph 6.5가 될 때까지 N 염산용액으로 중화시킨다. 증발시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트 내에서 연마한다. 생성된 침전물을 배수시키고, AcOEt로 세척한 다음 진공하에서 및 공기로 차례로 건조시킨다. 132.7g의 생성물을 수득한다.
정제 : 109g의 Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl을 n-부탄올-메탄올-물(4-1-5) 혼합물내에서 역류 분포함으로써 정제한다. 700회 전이시킨 후 생성물을 3파트로 분류시키고 증발 및 동결 건조시킨다 : 한분획 ; 27.5g 및 재정제할 두분획 ; 23.79g 및 16.90g NMR 및 TLC로 검사.
AAA : Ser : 0.91-Arg : 0.97-Gln(Glu) : 2.05
-Gly : 1.01
[실시예 5]
Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2(단편 D)의 합성
1. Boc-Met-NH-NH Troc
50㎖의 에틸 아세테이트에 4.31g(10mM)의 Boc-Met-OH, DCHa를 용해시킨다. 이 용액을 20㎖의 물 존재하에 이황산 칼륨 포화 용액과 반응시켜 pH를 3으로 조정한다.
수성층을 에틸 아세테이트로 몇차례 추출시키고 추출물을 황산 마그네슘으로 건조시킨다. 상기 용액에 2.28g(11mM)의 H2N-NH-Troc [Troc=2,2,2-트리클로로 에톡시카르보닐, 야지마(YAJIMA)에 의해 제조, Chem.Pharm.Bull.1971, 19,420]를 가한다.
빙조에서 냉각시킨 후, 10㎖의 에틸 아세테이트에 2.37g(11mM)의 97% DCC를 용해시킨 용액을 가한다. 생성물이 점차 주변 온도가 되도록 하루밤을 방치한 후, 디시클로헥실우레아를 여과하고 건조시킨다(2.04g). 유기 용액을 하기 수용액으로 계속 세척한다 : 5% 황산염- 이황산염으로 2회, ClNa2M2X 5% 중 탄산나트륨으로 2회, ClNa 3M로 2회 및 물로 2회. 황산 마그네슘으로 건조시키고 용매를 건조 농축시킨 후, 용액이 탁해지기 시작할때까지 헥산을 가한다. +40℃에서 밤새 방치한 후 생성된 침전물을 여과하고 헥산과 에틸 아세테이트(4/1) 혼합물로 세척하고 진공하에서 건조시킨다. 3.46g(79%)의 생성물을 수득한다.
m.p.=92∼94℃, αＤ25°=-32°, C=1, 디옥산.
TLC(클로로포름-메탄올-AcOH, 95-5-3) ; Rf=0.45
2. TFA, H-Met-NH-NH Troc
200㎖의 디클로로메탄 및 20㎖의 에탄 디티올에 43.9g(0.1M)의 Boc-Met-NH-NH-Troc를 용해시키고, 이용액을 질소 대기하에 빙조내에서 교반하면서 200㎖의 트리플루오로아세트산과 반응시킨다. 빙조를 제거하고, 생성물을 1시간 동안 교반 방치한다. 먼저 20mmHg, 다음에는 0.1mmHg 압력하에서 휘발성 물질을 제거함으로써 생성물을 분리시킨다. 잔류 오일을 진공하에 증발시킴으로써 75㎖의 이소프로판올에 2회 용해시킨 다음 경사분리로 75㎖이 헥산으로 2회 세척하고 수산화 칼륨 존재하에 밤새 진공에서 건조시킨다. 고체화 하기 시작하면 이를 다음 조작에 그대로 사용한다.
3. Boc-Ile-Met-NH-NH-Troc
6500㎖의 에틸 아세테이트에 상기 오일 TFA, H-Met-NH-NH Troc(약 0.1M)을 용해시키고 빙조에서 냉각시킨다. 12.7㎖(0.1M)의 N-에틸 모르폴린, 14.85g(0.1M)의 HOBT, 1H2O, 34.35g(0.08M)의 Boc-Ile-OSu 및 12.7㎖(0.1M)의 N-에틸 모르폴린(NEM)을 차례대로 가한다. 30분후 빙조를 제거하고 NEM을 주기적으로 계속 가함으로써 pH를 7 이상으로 유지한다.
20시간 후 반응을 완결하고 하기 수용액 : 5% 황산염-이황산칼륨 : 3회, 물: 3회, 5% 탄사나트륨 : 3회 및 물로 중성에 이를때까지 연속적으로 세척해서 분리시킨다.
황산 마그네슘으로 건조시키고 전공하에 용매를 증발시킨 후 64g의 고무를 수득하고 0 내지 1.5%의 메탄올을 함유하는 디클로메탄을 이용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피한다. 98.9%의 HPLC 순도 및 기대한 구조의 NMR스펙트럼을 갖는 생성물 30g(68%)를 수득한다.
m.p. : 88∼92℃
4. TFA, H-Ile-Net-NH-NH-Troc
140㎖의 디클로로메탄 및 14㎖의 에탄디티올 27.6g(50mM)의 Boc-Ile-Met-NH-NH-Troc를 용해시키고 빙조에서 냉각시킨다. 질소 대기에서 교반한 다음 140㎖의 트리플루오로아세트산을 5-6분내에 가한다.
빙조를 제거하고, 45분후 시약을 최대로 증발시키고, 잔류오일을 2×60㎖의 이소프로판올에 용해시키고 증발시킨 다음 60㎖의 펜탄으로 2회 세척함으로써 생성물을 분리시킨다. 수산화 칼륨을 사용해서 진공하에 하룻밤 동안 건조시켜서 유리같은 외관의 오일을 수득한다(30g). 이를 다음 조작에 사용한다.
5. Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc
250㎖의 THF에 30g의 상기 오일을 용해시키고 6.4㎖(50mM)의 NEM 및 18.9g(45mM)의 Boc- Asp(OBzl)O Su를 가한다. NEM을 계속 가해서 pH를 6 내지 7로 조정한다. 4시간 후 THF를 증발시킨 다음 400㎖의 에틸 아세테이트에 용해시키고 상기 (3)과 같이 세척함으로써 생성물을 분리시킨다. 건조 및 증발시킨 후 잔류물(36.5g)을 용매로서 0 내지 1.5%의 메탄올을 함유하는 디클로로메탄올을 사용해서 실리카 컬럼 크로마토그래피함으로써 정재한다. 원하는 구조의 NMR 스펙트럼을 나타내는 생성물 25g(66%)를 수득한다.
m.p.=96∼100℃
6. Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2
80㎖의 DMF-AcOH(80-20) 혼합물에 7.57g(10mM)의 Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc를 용해시키고 주변 온도에서 교반하면서 6.54g의 분말아연과 30분간 반응시킨다. 아연을 여과하고, 여과액을 800g의 얼음과 반응시킨 다음 얼음이 녹은 후 물로 반복 세척함으로써 생성물을 분리한다. 백색 고체를 처음에는 공기중에서, 다음에는 수산화 칼륨 및 무수 인산 존재하에 고도의 진공하에서 건조시킨다. TLC 및 NMR 검사에 따르면 약 95%의 순도를 갖는 5.60g(96%)의 생성물을 수득한다.
m.p.=180∼185℃
TLC 및 HPLC 검사.
[실시예 6]
Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH(단편 E1)
1. Boc-Leu-Leu-OMe
18.4g의 NEM(0.16M)이 함유되어 있는 디옥산 500㎖에 9.05g의 H Leu OMe, HCl(0.05M), 7.4g의 HOBt(0.055M) 및 18g의 Boc-Leu-ONSu(0.055M)을 계속 가한다. 생성물을 주변 온도에서 18시간 동안 계속 교반하고 필요할 경우 반응도중에 NEM을 이용하고 pH 페이퍼를 사용하여 pH를 6-7로 조절한다. 용매를 증발시키고 잔류물을 AcOEt에 용해시킨 다음 유기 용액을 5%-KHSO4-K2SO4, ClNa/물, 5% NaHCO3, ClNa/물로 계속해서 2회 세정한다. 생성물을 MgSO4로 건조시키고 용매를 증발시킨다. 잔류물을 에테르에 용해시키고 생성물을 펜탄으로 침전시킨 다음, 배수, 건조시킨다.
수율 : 15g(83%)
TLC : 클로로포름-메탄올-아세트산, 95-5-3
AcOEt-헥산 25/75, m.p. : 131-136
실리카겔 60Merck(70-230메쉬)를 클로로포름 용매에 넣고 상기 혼합용매로 용출시켜 정제할 수 있다.
2. H-Leu-Leu-OMe, TFA
Boc-Leu-Leu-OMe(0.076M) 27.5g을 주변온도에서 TFA 180㎖로 덮는다(이때 가벼운 열이 발생). 30분 후 용매를 증발시키고, 잔류오일을 에테르에 용해시킨 다음 생성물을 모은다(이때 백색 침전물이 형성). 펜탄을 가하고 생성물을 배수, 건조시킨다.
수율 : 28.2g(100%)
TLC : 클로로포름-메탄올-아세트산 95/5/3
클로로포름-메탄올-아세트산 80/15/5
3. Boc-Lys(Z)-Leu-Leu-OMe
빙조에서 냉각된 AcOEt 600㎖에 다음 물질을 계속 가한다 :
-H-Leu-Leu-OMe, TFA(0.076M) 28.2g
-NEM(0.0228M) 26.22g
-HOBt(0.083M) 11.23g
-Boc-Lys(Z) OTcP(0.083M) 46.4g
생성물을 교반하고 냉각된 욕조를 제거한다. pH를 필요할 경우 NEM으로 6-7로 조절한다. 18시간 후 유기용액을 5% KHSO4-K2SO4, ClNa/물, 5% NaHCO3, ClNa/물로 계속 세정한다. 생성물을 MgSO4로 건조시킨다. 용매를 증발시키고 잔류오일을 클로로포름에 용해시킨 다음 클로로포름에 실리카겔 60Merck(70-230메쉬)를 가한 컬럼(길이 : 90㎝, 직경 5㎝)의 상부에 넣는다. 생성물을 클로로포름으로 용출시키고, 분류한다. 순수한 생성물이 함유된 분획을 증발시키고, 얻은 거품을 에테르에 재용해시킨 다음 증발 건조시킨다. 잔류물을 펜탄내에서 가루로 만들어 배수시키고 이어 건조시킨다.
수율 : 42.4g(91%)
TLC : AcOEt/헥산 1/2
클로로포름-MeOH-AcOH 95/5/3
NMR-HPLC-EPP로 검사 : 98.7%
4. Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OMe
Boc-lys(Z)-Leu-Leu-OMe(0.025M) 15.5g을 주변온도에서 TFA 100㎖로 덮는다. 30분 후, 때때로 교반하면서 용매를 완전히 증발시킨다. 잔류오일을 디옥산 150㎖에 용해시키고 pH를 DIPEA 및 pH 페이퍼를 사용하여 6-7까지 올린다. 생성물을 빙조에 넣어 냉각시키고, 7.21g의 Boc-Arg-OH, H2O, HCl(0.025M), BOP(0.03M) 13.44g 및 DIPEA(0.08M) 10.32g을 가한다. 생성물을 교반하고, 냉각된 욕조를 제거한 다음 필요할 경우 pH를 DIPEA를 이용하여 6-7로 조절한다. 18시간 후 디옥산을 증발시키고, 잔류오일을 AcOEt에 용해시킨 후 5% NaHCO3, ClNa/물로 계속 세정한다. 생성물을 MgSO4로 건조시키고, 용매를 증발시킨 다음 오일을 물로 포화된 5-9 5MeOH-클로로포름에 용해시킨 후 위의 용해 혼합물에 실리카겔 60Merck(70-230메쉬)를 가한 컬럼(길이 85㎝-직경 4㎝)의 상부에 넣는다. 생성물을 다음 물질로 용출시킨다 :
-물로 포화된 MeOH-클로로포름(5-95) 1.5리터
-물로 포화된 MeOH-클로로포름(7.5-92.5) 1.1리터
-MeOH-클로로포름 2.5리터
생성물을 분류하고 순수한 분획을 증발시킨 다음, 에테르에 용해시키고, 증발시킨 후 진공 중에서 완전히 추출한다.
수율 : 16.8g(87%)
TLC : 클로로포름-MeOH-AcOH 95-5-3
클로로포름-MeOH-AcOH 80-15-3
NMR-HPLC-EPP로 검사 91.8%
5. Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH
Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OMe(0.018M) 13.98g을 MeOH 250㎖에 용해시키고, 물 40㎖를 가한다음, 주변온도에서 세분된 바리타(baryta)(0.018M) 5.67g을 가한다. 그리고 주변온도에서 생성물을 2시간 30분간 교반한다. 반응의 종료를 TLC로 관찰한다. CO2를 버블링시켜 pH를 6으로 한 다음, 생성물을 여과한다. 여액을 증발시키고, 잔류물을 이소프로필 알코올에 용해시킨 후 여과한다. 알코올을 농축시키고 생성물을 에테르로 침전시킨다.
수율 : 12.31(89%)
TLC : 클로로포름-MeOH-AcOH 90/15/5
2-부탄올-AcOH-물 72/7/21
NMR-HPLC-EPP로 검사 95.88
[실시예 7]
Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe(단편 F1)
1. Boc-Ser-Ala-OMe
DMF 500㎖에 H-Ala-OMe 25g, HCl 및 Boc-Ser-ONb 66g을 용해시킨다. 생성물을 빙조에서 냉각시키고 자석 막대로 교반시키면서 NEM 25㎖, N-히드록시 벤조트리아졸 24g을 가하고 NEM을 가하여 pH를 6.5 또는 7로 유지시킨다. 생성물을 주변온도에서 18시간 동안 교반한다. TLC 확인 후, 매질을 90%까지 증발시킨다(0.1mmHg-35℃). 수득한 오일을 클로로포름 1500㎖에 용해시키고, 생성물을 포화염화나트륨 용액(2회), 5% 황산염/이황산나트륨 용액(3회), 포화중탄산나트륨(5회)으로 세정한다. 용액을 Na2SO4로 건조시키고 증발 건조시킨다. 수득한 오일을 일정한 중량이 될때까지 건조시킨다(30°, 0.1mmHg).
수율 : 53.78g, TLC로 검사
2. H-Ser-Ala OMe, TFA
염화메틸렌 100㎖에 Boc-Ser-Ala-OMe 52.8g을 자석 막대로 교반하면서 가한다. 냉각된 TFA 250㎖를 가하고 생성물을 주변온도에서 20분간 교반하고 여과한다. 여액을 증발 건조시킨다(35°, 물-제트 펌프). 에테르 2리터를 가하여 백색 고체를 침전시킨다. 그리고 탈수 및 에테르로 세정(3회)하고 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다(30°, 0.1mmhg).
수율 : 40.82g
3. Boc-Leu-Ser-Ala-OMe
H-Ser-Ala-OMe, TFA 40g 및 Boc-Leu-OH, H2O 32.9g을 DMF 400㎖에 용해시킨다. 생성물을 자석 막대로 교반하면서 빙조에 넣어 냉각시키고 NEM 14.4㎖를 가한 후 BOP 65.8g을 가하고 NEM을 충분히 가하여 pH를 6.5-7로 유지한다. 생성물을 2시간 동안 주변온도에서 교반한다. TLC로 확인한 후 생성물을 증발 건조시키고(0.1m, 35°) 수득한 오일을 클로로포름 1500㎖에 용해시킨 다음, 포화 NaCl 용액으로 2회, 5% 황산염/이황산나트륨으로 3회, 포화중탄산나트륨으로 3회 세정하고 Na2SO4로 건조시킨 후 증발 건조시킨다(30°, 물-제트 펌프). 수득한 오일 에테르내에서 고체화시킨다 : 분획 A=29g. 헥산을 가하여 2번째 제트 B를 수득한다(TLC가 동일) : B=13.7g.
수율 : 42.7g
NMR 및 TLC로 검사
4. H-Leu-Ser-Ala-OMe, TFA
메틸렌클로라이드 50㎖에 Boc-Leu-Ser-Ala-OMe 29g을 자석 막대로 교반하면서 현탁시키고 빙조에 넣어 냉각시킨다. 냉각된 TFA 100㎖를 가하고 용해시킨 후 생성물을 30분간 주변온도에서 교반한 다음 여과한다. 여액을 증발 건조시킨다(35°, 물-제트 펌프). 수득한 오일을 에테르 내에서 고체화시킨다(용매를 수회 바꾼다). 생성물을 중량이 일정하게 될때까지 건조한다(30°, 0.1mmHg).
수율 : 30.2g
5. Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe
DMF 300㎖에 H-Leu-Ser-Ala-OMe, TFA 30g 및 Boc-Gln-ONp 25.5g을 자석 막대로 교반하면서 용해시킨다. 생성물을 NEM 9.7㎖로 중화시킨다. OHBt 10g을 가하고 생성물을 주변온도에서 2시간 교반하고, NEM을 가하여 pH를 6.5 내지 7로 유지시킨다. TLC 확인 후, 매질을 90%까지 농축시키고(0.1mmHg, 35°), 클로로포름 1000㎖에 용해시킨다(이때 생성물이 겔로 침전된다). 생성물을 탈수하고, 클로로포름 500㎖로 2회 및 에테르(3회)로 세정한다. 생성물을 중량이 일정해질때까지 건조시킨다(0.1mmHg, 30°).
수율 : 32.1g
TLC : 클로로포름/MeOH/AcOH : 9/2/0.5, Rf=0.81
HPLC : EPP=91%
AAA : Ser : 0.86-Glu : 1.02-Ala : 0.9-Leu : 0.99.
[실시예 8]
Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HCl(단편 G1)
1. Z-Leu-Gly-OCH3
Z-Leu-OH 0.22몰을 DMF 500㎖에 용해시키고, 여기에 HCl H-Gly-OCH3(0.2몰) 25.11g, NEM 28㎖ 및 BOP(0.22몰) 96g을 연속해서 가한다. 그리고는 NEM을 가하여 pH를 7로 조절한다.
필요할 경우 NEM을 가하여 pH를 7로 유지하면서 반응 혼합물을 주변 온도하에 교반한다. TLC(클로로포름-메탄올-아세트산 96-5-9)에서 반응시킨다. 2시간 후 반응이 완결되면 반응 혼합물을 감압하에(0.2mmHg) 그리고 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 에틸아세테이트(1리터)에 용해시킨다.
용액을 중탄산수용액(4×200㎖), SO4HK-SO4K2수용액(4×200㎖) 및 포화 NaCl수용액(2×200㎖)으로 연속 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하에 증발 건조시킨다. 잔류물을 에테르(500㎖)에 용해시키고, 분쇄, 탈수, 건조시킨다.
수율 : 56.7g(84.28%)
TLC :클로로포름-메탄올-아세트산 95-5-3 Rf : 0.44
2. HCl-H-Leu-Gly-OCH3
0.23N 염산성 메탄올 900㎖에 Z-Leu-Gly-OCH356g(0.166몰)을 용해시킨다. 그리고 여기에 습도50%인 10% Pd/C 6g을 가한다. 주변온도 및 감압하에 24시간동안 수소화반응을 수행한다. 촉매를 여과하고 용액을 감압 및 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 에테르(2×50㎖)에 용해시키고 경사 분리한 후, 생성물을 인산 무수물의 존재하에 건조기 내에서 건조시켜, 백색 분말을 얻었다.
수율 : 33.53g(84.4%)
TLC : 클로로포름-메탄올-아세트산 90-20-9 Rf : 0.15
NMR로 검사
3. Boc-Val-Leu-Gly-OCH3
-10℃로 냉각된 THF 400㎖에 Boc-Val-OH(0.13몰) 28.24g을 용해시키고, 이소부틸클로로포르메이트 14.45㎖(0.13몰)을 가한다. 혼합물을 -10℃에서 15분간 강력히 교반한다. 여기에 앞에서 14.45㎖의 N 메틸 모르폴린으로 중화시킨 HCl H-Leu-Gly-OCH3(0.13몰) 31.5g이 함유되어 있으며 -10℃로 냉각된 THF 용액을 가한다. 반응 혼합물을 빙조내에서 2시간 그리고 주변온도에서 2시간 냉각시키면서 교반을 계속한다.
반응 혼합물을 감압하 그리고 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 에틸아세테이트-물(500㎖-500㎖)에 용해시킨다. 수성층을 경사 분리시키고 유기층을 중탄산나트륨 수용액(2×50㎖), SO4HK-SO4K2(pH 2) 수용액(2×50㎖) 및 NaCl 수용액(50㎖)로 연속해서 세정한 후 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하 및 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 펜탄(50㎖)에 용해시키고 탈수 및 진공 건조시킨다(0.1mmHg).
수율 : 39.7g(76%)
TLC : 클로로포름-아세톤 75-25 Rf : 0.46
NMR로 검사
4. TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3
빙조에서 냉각된 TFA 190㎖에 Boc-Val-Leu-Gly-OCH3(0.097몰) 39g을 용해시킨 다음, 빙조를 분리시키고 주변온도에서 혼합물을 30분간 교반한다. 생성물을 감압하에 증발 건조시키고 잔류물을 에테르(100㎖)에 용해시킨 후, 분쇄하고 에테르를 경사 분리시킨다. 위의 조작을 2회 반복하고 마지막 남은 용매를 감압하에 제거한다(0.1mmHg).
수율 : 44.8g
TLC : 클로로포름-메탄올-아세트산 90-20-3 Rf : 0.36
5. Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
DMF 200㎖에 TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3(0.0615몰) 22.55g을 용해시킨다. NEM을 가하여 용액을 pH를 7로 한다. 여기에 Boc-Lys(Z)-OTCP(0.058몰) 32.47g 및 HOBT(0.059몰) 9g을 가한다. 반응 혼합물이 pH를 NEM을 가하여 7로 되돌린다. 생성물을 필요할 경우 NEM을 가하여 pH를 7로 유지하면서 주변온도하에 교반한다. 다음에는 TLC에서 반응을 실시한다 : 클로로포름-메탄올, 90-10 ; 클로로포름-메탄올-아세트산, 90-20-3(2매질).
1시간 후 Boc-Lys(Z)-OTCP(0.0035몰) 1.96g 및 HOBT 0.61g을 가한다. 그리고는 NEM을 가하여 용액의 pH를 7로 되돌린다.
2시간 후 반응을 TLC상에서 완결 짓는다. 다음에는 혼합물을 감압 (0.1mmHg)하 및 30℃ 이하의 온도하에 증발 건조시킨다. 잔류물을 물 500㎖에 용해시키고 분쇄한다. 형성된 고체를 탈수시키고 HKSO4-K2SO4(pH 2) 수용액 500㎖, 포화 중탄산나트륨 수용액 500㎖ 및 물 200㎖로 세정한 다음 에테르(200㎖×2)로 다시한번 세정한 후 건조시킨다.
순수하지 않은 생성물은 실리카겔 컬럼(5㎝×150㎝) 상에서 크로마토그래피 시킨다. 그리고는 클로로포름-에틸아세테이트의 80-20 혼합물로 용출시킨다(속도 600㎖/hr).
TLC로 확인된 약질의 분획을 함께 수거해 감압하에 증발 건조시킨다. 잔류물을 에테르에 용해시키고 분쇄한 다음 수득한 고체를 탈수시킨다.
백색분말, 35.14g(86%)
TLC : 클로로포름-메탄올 90-10 Rf : 0.62
클로로포름-메탄올-아세트산, 87.7-9.4-2.8 Rf : 0.52
NMR로 검사
AAA : AC : Gly 1.00-Val : 0.96-Leu : 1.06-Lys : 0.98
6. TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
TFA-염화메틸렌(75㎖/75㎖) 혼합물에 Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3(22.6mM) 15g을 용해시킨다. 생성물을 주변온도에서 40분간 교반하고, 감압하 및 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 20% 헥산(100㎖)이 함유된 에테르에 용해시킨다. 형성된 고체를 탈수 및 건조시킨다. 백색고체 14.51g을 얻었다.
수율 : 94.7%
TLC : 클로로포름/메탄올/아세트산(95/5/3) Rf : 0.12
7. Boc-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3(21mM) 14.1g을 DMF 50㎖에 용해시킨다. NEM을 가하여 용액의 pH를 6∼7로 한다. 그리고 여기에 Boc-Arg(HCl)-OH. 1H2O(20mM) 6.57g 및 BOP(24mM) 10.6g을 가한다. 필요할 경우 NEM을 가하여 pH를 6∼7로 유지하면서 생성물을 주변온도에서 교반한다. 다음에는 TLC상에서 반응을 행한다 : 클로로포름/메탄올(80/20).
5시간 후 반응이 안결되면, 반응 혼합물을 감압하(0.1mmHg) 및 30℃ 이하에서 증발 건조시킨다. 수득한 오일을 에틸아세테이트 300㎖에 용해시킨다. 형성된 고체를 탈수하고 에테르로 세정한다(첫번째 제트). 앞의 여과액에 에테르를 가한다 : 고체가 침전되면 이를 탈수시킨다(두번째 제트) : 위의 두 제트는 TLC에서 동일하다. 이들을 1시간동안 교반하면서 물로 포화된 에틸아세테이트 200㎖ 및 물 60㎖와의 혼합물로 세정한다. 고체를 탈수시키고 물 60㎖ 및 에테르 300㎖로 세정한 다음 건조시킨다.
수율 : 78.7%(13.49g)
TLC : 클로로포름/메탄올(20/20), Rf : 0.32
NMR로 검사
8. TFA H-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
TFA-염화메틸렌(60㎖/60㎖) 혼합물에 Boc-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3(15.5mM)13.3g을 용해시킨다. 생성물을 주변온도에서 40분간 교반하고 감압하 그리고 30℃ 이하에서 증발 건조시킨다. 형성된 고체를 탈수시키고 헥산으로 세정한 다음 건조시킨다(무게 15.13g)
TLC :클로로포름/메탄올(3/1) Rf : 0.35
9. Boc-Ytr-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
DMF 50㎖에 TFA H-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH315.5㎖를 용해시킨다. NEM을 가하여 용액의 pH를 6으로 한다. 그리고 여기에 Boc-Tyr-OTCP(15.5×10Mm) 8.20g 및 HOBT(15.5×10mM) 2.41g을 가한다. NEM을 가하여 pH를 6으로 되돌린다. 반응 혼합물을 필요할 경우 NEM을 가하여 pH를 6으로 조절하면서 주변온도에서 교반한다. 그리고는 TLC 상에서 반응을 수행한다 : 클로로포름/메탄올(3/1).
3시간 후 반응이 완결되면, 반응 혼합물을 감압하(0.1mmHg) 및 30℃ 이하의 온도에서 증발 건조시킨다. 잔류오일을 에틸아세테이트(300㎖)에 용해시킨다. 형성된 고체를 탈수시키고, 에틸아세테이트(100㎖), 에틸아세테이트-에테르(1/1 : 100㎖), 에테르(100㎖) 및 헥산(100㎖)의 순으로 세정한다. 생성물을 감압하에 중량이 일정해질때까지 건조시킨다.
수율 : 96%(15.14g)
TLC : 클로로포름/메탄올(3/1) Rf : 0.47
NMR로 검사
AAA : AC : Gly : 0.95-Val : 0.98-Leu : 1.02-Lys : 1.01-Arg : 1.01-Tyr : 1.05, HPLC : 93.81% EPP
10. Boc-Tyr-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH
Boc-Tyr-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3(6.86mM) 7g을 디옥산 70㎖-물 35㎖ 혼합물에 용해시킨다. 4N NaOH(25.6mM) 6.4㎖(3.7당량)을 위의 용액에 가하고 생성물을 주변온도에서 30분간 교반한다. 그리고는 물 200㎖ 및 에틸아세테이트 800㎖로 희석시킨다. 혼합물을 HCl로 산성화시켜 pH를 3으로 한다. 에틸아세테이트를 경사 분리시키고 고체를 탈수시킨다(첫번째 제트). 에틸아세테이트를 증발 건조시킨다 : 두번째 제트를 수득한다. 위의 두 제트는 TLC에서 동일한데 함께 수거해 에테르로 세정하고 건조시킨다.
수율 : 74.7%(5.16g)
TLC : 클로로포름/메탄올(2/1) Rf : 0.45
1H NMR로 검사
AAA : AC : Gly : 1.00-Val : 0.97-Leu : 1.04-Tyr : 0.95-Lys : 0.99-Arg : 1.05.
HPLC-EPP 91.52%
[실시예 9]
Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2(단편 H1)
1. Boc-Asn-Ser-OMe
DMF 250㎖에 Boc-Asn-OH(0.1M) 23.32g 및 NaOH(0.11M) 19.7g을 용해시키고, 빙조내에서 냉각시킨 다음 DCCI 22.69g을 가한다. 주변온도에서 3시간 동안 반응시킨 후, DCU를 여과하고 빙조에서 냉각한 후 HCl H-Ser-OMe 15.56g을 가한다. NEM을 가하여 pH를 7로 유지한다. 주변온도에서 4시간 및 4℃에서 20시간 후에 용액을 감압 농축시킨다. 잔류물을 AcOEt/n-부탄올(50/50) 혼합물에 용해시킨다.
유기 용액을 중탄산나트륨 포화용액, NaCl 포화용액, 5% KHSO4/K2SO4용액 및 NaCl 포화용액으로 계속해서 세정한다.
MgSO4로 건조시킨 후 감압하에 증발시키고 잔류물을 에테르-헥산 혼합물에서 결정화시킨다. 생성물을 여과하고 에테르/헥산으로 세정하고 진공 건조시킨다.
수율 : 26.9g(80.8%)
NMR 및 TLC로 검사
2. TFA, H-Asn-Ser-OMe
디클로로메탄 54㎖에 용해시킨 Boc-Asn-Ser-OMe(40.5mM) 13.5g의 용액을 빙조에서 냉각시키고 TFA 81㎖를 가한다. 주변온도에서의 반응 1시간 후, 용액을 감압 농축시키고 잔류물을 에테르에 용해시킨다. 진한 오일을 수득하는데 이를 다음 반응에 사용한다.
3. Boc-Thr-Asn-Ser-OMe
DMF 300㎖에 용해시킨 위에서 얻은 조 생성물의 용액을 빙조에서 냉각시키고 여기에 Boc-Thr- ONSu(44.44mM) 14.09g, HOBt(41.3mM) 5.58g 및 NEM을 pH가 7이 될때까지 가한다. 주변온도에서 20시간 반응시킨 후, 용액을 감압하에 농축시키고 잔류물을 AcOEt/n 부탄올 혼합물에 용해시킨다. 유기용액을 중탄산나트륨 포화용액, 염화나트륨 포화용액, 5% KHSO4/K2SO4용액 및 염화나트륨 포화용액으로 계속해서 세정한다.
MgSO4로 건조시킨 후, 용액을 감압하에 농축시키고 잔류물을 에테르/헥산 혼합물에서 결정화시킨 결과 8.28g의 생성물을 얻었다.
수율 : 47%, NMR 및 TLC로 검사.
4. TFA, H-Thr-Asn-Ser-OMe
디클로로메탄 32㎖에 용해시킨 Boc-Thr-Asn-Ser-OMe 8g의 용액을 빙조에서 냉각시키고 여기에 TFA 54㎖를 가한다. 주위온도에서 1시간 반응시킨 후, 용액을 감압하에 농축시키고 잔류물을 에테르로 침전시킨다. 이를 여과하고, 있는 그대로 다음 반응에 사용한다.
5. Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe
DMF 100㎖에 용해시킨 위에서 얻은 침전물의 용액을 빙조에서 냉각시키면서 pH가 7이 될 때까지 Boc-Phe-ONp(20.24mM) 7.82g, HOBt(18.71mM) 2.53g 및 N-에틸 모르폴린을 가한다. 4시간 후, 용액을 감압하에 농축시키고 잔류물을 AcOEt에 용해시킨다. 유기용액을 중탄산나트륨 포화용액, 염화나트륨 포화용액, 5% KHSO4/K2SO4용액 및 염화나트륨 포화용액으로 연속해서 세정한다.
MgSO4로 건조시킨 후, 유기상을 농축시키고, 잔류물을 에테르에서 결정화시킨 결과 10g의 생성물을 얻었다.
수율 : 93.5%, TLC 및 NMR로 검사
6. TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe
디클로로메탄 40㎖에 용해시킨 Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe(17.19mM) 10g의 용액에 빙조에서 냉각시키면서 TFA 60㎖를 가한다. 주변온도에서 1시간 반응시킨 후, 에테르로 생성물을 침전시킨다. 건조 후 고무 생성물 5.14g을 얻었다.
수율 : 48.5%.
7. Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe
DMF 100㎖에 용해시킨 TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe(8.78mM) 5.14g의 용액을 빙조에서 냉각시키고, 여기에 Boc-Ile-OSu(9.66mM) 3.17g, HOBt(9.62mM) 1.30g 및 N-에틸 모르폴린을 pH가 7이 될때까지 가한다. 주변온도에서 20시간 반응시킨 후, 용액을 감압하에 농축시키고 잔류물을 에테르에 용해시켜 얻은 생성물을 여과, 진공 건조시킨다. 결과 5.24g의 생성물을 얻었다.
수율 : 85.9%, NMR 및 TLC로 검사
8. Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2.
메탄올 200㎖-DMF 40㎖에 용해시킨 Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe(7.2mM) 5g의 용액을 빙조에서 냉각시키고 여기에 80% 히드라진 히드레이트 용액 3.6㎖를 가한다. 주변온도에서 21시간 반응시킨 후 위와 동일한 히드라진 용액 0.9㎖를 가한다. 3시간 후, 얻는 겔을 여과하고, 메탄올로 세정 및 진공 건조시킨 결과 3.94g의 생성물을 얻었다.
수율 : 78.8%, NMR 및 TLC로 검사
[실시예 10]
Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH(단편 1)
1. Boc-Asp(OBzl)-Ala-OBut
테르티오 부틸 알라니네이트의 히드로클로라이드 3.62g(0.02몰)을 30㎖의 아세토니트릴에 현탁시킨다. 2.52㎖의 NEM을 가한 후, 8.4g(0.02몰)의 Boc-Asp(OBzl)ONsu를 더 가한다. NEM을 가하여 pH를 6-6.5로 유지시키면서 18시간 동안 교반을 계속한다. TLC로 검사한 후, 매질을 증발 건조시키고, 오일을 50㎖의 AcOEt에 용해시킨 다음, 용액을 KHSO4/K2SO4용액을 두 번 세척하고, 염수로 세척한 후 Na2SO4로 건조시키고 증발 건조시킨다. 수득된 오일을 헥산에 용해시키고, 소량의 고체를 여과한 후, 여액을 증발 건조시킨다. 수득된 오일은 있는 그대로 사용된다.
TLC : CHCl3/아세톤/AcOH 80/15/5-Rf=0.8
2. Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
상기에 수득된 조 오일을 50㎖의 냉 TFA에 용해시키고, 주변온도에서 1시간 30분 동안 교반한다. TFA를 최대로 증발시키고, 잔류오일을 3배의 무수 에테르에 용해시키고 경사 분리한 후, 펜탄 존재하에 진공 건조기에서 건조시킨다. 고체 거품이 생성되면 그를 파쇄하고 건조시킨다.
9.4g의 조 생성물을 수득하고, 커플링을 위해 있는 그대로 사용한다.
상기 TFA염을 20㎖의 DMF 및 18㎖의 증류수 혼합물에 용해시킨다. pH 7이하가 되도록 pH미터를 사용하여 NEM을 가한다. 16㎖의 DMF에 녹인 4g(0.014몰)의 Boc-Ala-ONsu 용액을 도입한다. NEM을 가하고 pH를 6.5-7로 유지시킨다. 5시간 30분 후 반응을 종결시킨다(TLC로 검사). 용매를 최대로 증발시키고, 잔류물을 물과 에틸아세테이트의 혼합물에 용해시킨다. 유기상을 NaHCO3용액 및 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조시킨 후 증발 건조시킨다. 잔류물을 에테르에 용해시키고 헥산으로 침전시켜 고무를 수득하고, 분쇄한 후 결정화한다. 고체를 배수시키고, 공기중에서 건조시킨다.
수율 : 5.05g
TLC : CHCl3-아세톤-AcOH 80-15-5, Rf=0.28
3. Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
1g(2밀리몰)의 Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH를 10㎖의 교반된 냉 TFA에 도입시킨다.
주변온도에서 30분간 교반한 후, TFA를 최대로 증발시키고, 잔류물을 두배의 무수 에테르에 용해시킨 후, 경사 분리하고, 수산화칼륨 존재하에 진공 중에서 건조기에서 건조시킨다. 고체 거품을 형성한다.
조 생성물을 4㎖의 DMF 및 2㎖의 증류수의 혼합물에 용해시킨다. pH 7-7.5가 되도록 NEM을 가한다. 1g(2.4밀리몰)의 1-Tyr-ONsu를 가하고, pH를 NEM(pH-미터)에 의해 7-7.5로 유지시킨다. 2시간 30분후 TLC로 검사하고, 40℃에서 용매를 최대로 증발시킨다. 잔류물을 에틸아세테이트에 용해시키고, 물로 세척한 후, 소량의 고체를 제거하고, 에틸아세테이트를 황산염 중황산염과 염수의 혼합물로 세척한다. 생성물을 수시간 방치한 후, 생성된 침전물을 배수시키고 에테르로 세척한 다음 공기 중에서 건조시킨다.
500㎎의 생성물을 수득한다. 에틸아세테이트를 더 농축하여 덜 정제된 제2생성물 350㎎을 수득한다.
TLC 클로로포름-AcOH 3-1 Rf : 0.4
부탄올-AcOH-H2O 72-7-2 Rf : 0.85
클로로포름-아세톤-AcOH 80-15-5 Rf : 0.1
HPLC 90.9% 폴리펩티드 순도
NMR로 검사
[실시예 11]
H-Arg-Lys(Z)-Leu-Gln-Asp(Bzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Leu-NH2(펩티드 K)의 합성
1. Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 3HCl
34.47g의 H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 3HCl(57mM)을 230㎖의 DMF에 용해시킨다. 28g의 BOP(63mM)을 가하고, 1시간 후 190㎖의 DMF에 녹인 33.5g(57mM)의 Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH 용액을 가한다. 반응 매질의 pH를 NEM을 가하여 약 6으로 유지시킨다. 4시간 후, 반응매질을 진공 농축하여 약 반으로 줄이고 잔류물을 800㎖의 에틸아세테이트에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에틸아세테이트 및 에테르로 세척한 후 진공 건조시킨다. 56.8g의 새성물을 수율 80%로 수득한다.
확인 : 1H NMR 및 AAA : Glu : 0.98-Gly : 1.01-Ala : 1.97-Leu : 1.05-Arg : 2.97
HPLC 역상 EPP 95%, TLC in EPAW 40/20/10/6, Rf=0.55
2. H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl
55.3g의 상기 생성물을 250㎖의 CH2Cl2+250㎖의 TFA에서 30분간 교반한다. 반응 매질을 진공 농축하여 반으로 줄이고 1200㎖의 냉 에테르에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에테르로 세척한 후 수산화칼륨으로 진공 건조시킨다.
수율 : 100%
3. Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl 상기 TFA염(45mM)을 400㎖의 DMF에 용해시키고, NEM으로 중화시킨 후, 22.2g의 BOP(50mM)을 가하고, 1시간 내에 300㎖의 DMF에 용해된 30g(45mM)의 Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH 용액을 가한다. 반응 매질의 pH를 6으로 유지시킨다. 6시간 후, 매질을 30℃에서 반으로 진공 농축시키고, 1200㎖의 에틸아세테이트에 붓는다. 생성된 침전을 여고하고, 에틸아세테이트 및 에테르로 세척하고, 최종적으로 진공 건조시킨다.
수율 : 60.5g(75%)
NMR 및 AAA에 의해 확인된 생성물 : Asp : 1.00-Ser : 0.81-Glu : 2.71-Gly : 0.89-Ala : 1.82-Leu : 0.96-Arg : 3.02, HPLC 역상 EPP 70%, TLC : EPAW 30/20/10/6 : Rf : 0.35
4. H-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl
53.3g(30mM)의 상기 생성물을 250㎖의 디클로로메탄+250㎖의 TFA에서 35분간 교반한다. 절반으로 진공 농축한 후, 잔류물을 1300㎖의 빙 에테르에 붓고, 생성된 침전을 여과한 다음, 에테르로 세척하고, 수산화칼륨으로 진공 건조시킨다.
5. Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl
상기의 TFA염을 300㎖의 DMF에 용해시키고, NEM으로 중화시킨다. 14.8g의 BOP(33mM)을 가하고, 1시간 내에 21.4g(30mM)의 Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH를 가한다. 반응 매질의 pH를 NEM에 의해 약 6에서 유지시킨다. 7시간 후, 매질을 2ℓ의 AcOEt에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에틸아세테이트 및 에테르로 세척한 후, 최종적으로 진공 건조시킨다.
수율 : 57g(80%)
NMR, AAA에 의해 확인된 생성물 : Ser : 1.7-Arg : 4.1-Glu : 4.7-Gly : 2.05-Asp : 1.00-Ala : 1.91-Leu : 0.97, TLC BPEWI Rf : 0.35
6. H-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl
14.21g(6mM)의 상기 생성물을 80㎖의 디클로로메탄에 현탁시키고, 질소 대기에서 120㎖의 트리플루오로 아세트산으로 10분간 처리한다. 주변온도에서 45분간 교반한 후, 생성물을 진공 농축하여 최초 부피의 1/3로 줄이고, 750㎖의 교반 냉 에테르(+4℃)에 붓는다. 침전을 여과하고, 에테르로 세척한 후, 수산화칼륨으로 진공 건조시키고, 무수 인산으로 더 건조시킨다. 13.9g(97%)의 생성물을 수득한다. 있는 그대로 다음 반응에 사용한다.
7. Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2,HCl
5.82(10mM)의 Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2를 76.6㎖의 DMF에 용해시키고, -20℃∼-25℃에서 6.66㎖(40mM)의 기체 6.0NHCl/디옥산으로 처리한 후, 5㎖의 DMF에 녹인 1.45㎖(12mM)의 테르티오 부틸나이트라이트로 처리한다. -20∼-25℃에서 1시간 후, 생성물에 약 8㎖의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 가하여 pH 6-7로 중화하고, 약간의 DMF을 가하여 총 부피를 100㎖로 맞춘 후, 0.1몰의 아지드 용액이 되게 한다(항상 약 -20℃에서 보존).
상기의 TFA염 13.84g(약 5.8mM)을 58㎖의 DMSO 및 87㎖의 DMF에 용해시키고, 1㎖의 DIPEA에 의해 pH 6.7로 중화시킨 후, 수득된 용액에 72.5㎖(약 1.25당량)의 상기 아지드 용액을 약 10분동안 -20∼-25℃에서 가한다. 소량의 DIPEA로 pH 6-7를 로 맞추고, 용액을 -15℃에서 보존한다. 16시간 후, 14.5㎖(0.25당량)의 아지드 용액을 더 가한다. TLC로 검사하면 24시간 후에 반응이 완결되는 것으로 나타나나, 40시간 후 750㎖의 교반된 냉 에틸아세테이트 용액을 부어서 반응을 중단시킨다.
생성된 침전을 여과하고, 같은 용매로 충분히 세척한 후, 인산 무수물 존재하에 진공 건조시킨다.
14.35g을 수득하고, 이것을 있는 그대로 다음 반응에 사용한다.
8. H-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2,
14g의 상기 생성물을 80㎖의 CH2Cl+120㎖의 TFA+10㎖의 HS(CH2)2SH에서 35분간 교반한다. 절반으로 진공 농축한 후, 반응 매질을 800㎖의 냉 에테르에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에트르로 세척한 후, 수산화칼륨으로 진공 건조시킨다.
수율 : 100%
9. Boc-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-
Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA,
Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl
상기에 수득된 TFA염(4.9mM)을 120㎖의 DMF+30㎖의 DMSO에 용해시키고 NEM으로 중화시킨 후, 740㎎의 HOBt(5.5mM)을 가하고, 2.02g의 Boc-Gln-ONp(5.5mM)을 가한다. NEM을 가하여 반응 매질의 pH를 약 6으로 유지시킨다. 6시간 후, 반응 매질을 800㎖의 AcOEt에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에틸아세테이트로 세척한 후, 에테르로 세척하고, 진공 건조시킨다.
중량 : 14.8g, 수율 :100%
NMR 및 AAA에 의해 확인된 생성물 : Asp : 1.97-Ser : 2.0-Glu : 6.12-Gly : 2.06-Ala : 2.06-Met : 0.55-Ile : 0.93-Leu : 0.99-Arg : 3.81, TLC : Rf 0.45-BPEWI
10. H-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl
14.7g의 상기 생성물을 80㎖의 CH2Cl2+10㎖의 HS(CH2)2SH+120㎖의 TFA에서 35분간 교반한다. 절반으로 진공 농축한 후 반응 매질을 600㎖의 냉 에테르에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에테르로 세척한 후, 수산화칼륨으로 진공 건조시킨다.
중량 : 14.5g
11. Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl
상기에 수득된 TFA염(4.9mM)을 120㎖의 DMF+40㎖의 DMSO에 용해시키고 NEM으로 중화한 후, 2.44g의 BOP(5.5mM) 및 4.2g의 Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH, HCl(5.5mM)을 30분내에 소량씩 가한다. 반응 매질을 pH를 NEM을 가하여 약 6에서 유지시킨다. 23시간 후, 반응매질을 1ℓ의 AcOEt에 붓는다. 생성된 침전을 여과하고, AcOEt 및 Et2O으로 세척한 후 진공 건조시킨다.
M : 16.5g, 수율 : 93%
NMR 및 AAA에 의해 확인된 생성물 : Asp : 2.10-Ser : 1.86-Glu : 6.2-Gly : 2.00-Ala : 2.00-Met : 0.55-Ile : 0.80-Leu : 2.89-Lys : 0.87-Arg : 4.67, TLC Rf : 0.40(BPEWI)
[실시예 12]
Boc-Ile-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCl(펩티드 J)의 합성
1. H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3
10.3g(18.8mM)의 Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3를 100㎖의 TFA를 함유하는 100㎖의 디클로로메탄에서 35분간 교반한다. 반응 매질을 약 50㎖로 진공 농축시키고, 300㎖의 에테르에 붓는다. 침전을 배수시키고, 에테르로 세척한 후 진공 건조시킨다.
2. Boc-Tyr-Arg(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCl
상기에 수득된 TFA염을 200㎖의 디메틸포름아미드에 용해시키고, N-에틸 모르폴린으로 중화시킨 후, 18.9g(18.8mM)의 Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, 9.2g BOP(21mM) 및 NEM을 차례로 가하여 pH가 약 6인 반응 매질을 수득한다. 4시간 동안 교반한 후, 반응 매질을 1ℓ의 AcOEt에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 100㎖의 AcOEt로 3번 및 100㎖의 Et2O으로 3번 세척한 후, 진공 건조시킨다.
24.16g의 생성물을 수득한다. 수율 : 90%
TLC Rf : 0.20(BEWl), αＤ: 17.6°-(Cc : 1, 5%, AcOH-함유 DMF)
1H NMR 및 AAA에 의해 확인된 생성물 : Ser : 1.01-Glu : 0.99-Gly : 1.06-Ala : 1.01-Val : 0.98-Leu : 1.97-Tyr : 1.00-Lys : 0.98-Arg : 0.99 역상 HPLC(EPP :92%)
3. H-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Arg-OCH2, HCl, TFA
8.66g(6.1mM)의 상기 생성물을 37㎖의 디클로로메탄+3.5㎖의 아니솔+40㎖의 TFA에서 35분간 교반한다. 절반으로 진공 농축한 후, 잔류물을 300㎖의 냉 에테르에 붓고, 수득한 백색 침전을 여과한 다음 에테르로 세척하고, 수산화칼륨으로 진공 건조시킨다.
중량 : 8.68g, 수율 : 100%
4. Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-N3
5.94g(8.55mM)의 Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2를 27㎖의 DMSO+37㎖의 DMF에 용해시킨다. -25℃로 냉각시킨 후, -20℃로 미리 냉각되고 5㎖의 DMF에 의해 미리 희석된 6.1㎖의 5.6N HCl/디옥산 용액 및 1.23㎖의 테르티오 부틸나이트라이트(1.2당량)을 차례로 가한다. -20℃∼-25℃에서 1시간 15분 동안 교반한 후, 6.1㎖의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)를 가하여 pH 6으로 맞추고, 3㎖의 DMF를 가하여 부피가 85㎖가 되게한 후, 용액을 -25℃에서 보관한다.
5. Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCl
실시예11-3에서 수득된 TFA염을 70㎖의 DMF에 용해시키고, DIPEA로 중화한 후, 이것을 상기에서 수득된 70㎖의 아지드 용액에 -20℃에서 15분간 가한다. DIPEA를 가하여 pH 7로 맞추고, 생성물을 -20℃에서 1시간동안 교반한 후, 매질을 -12℃에서 보존한다. 22시간 후, 5㎖의 아지드 용액을 가하고, DIPEA에 의해 pH를 7로 상승시킨다. 45시간 후, 나머지 아지드 용액을 가하고, DIPEA에 의해 pH를 7로 상승시킨다. 74시간 후, 반응 매질을 1200㎖의 에틸아세테이트에 붓는다. 수득된 백색침전을 여과하고, 에틸아세테이트 및 에테르로 차례로 세척한 후 진공 건조시킨다.
중량 : 10.46g, 수율 : 86%
모액을 농축하고 에틸아세테이트/에테르 혼합물로 재침전시킴으로서 제2생성물을 수득한다. 전체수율 : 95%
1H NMR 및 AAA에 의해 확인된 커플링 생성물 : Asp : 1.02-Thr : 1.03-Ser : 1.91-Glu : 0.97-Gly : 1.06-Ala : 1.06-Vla : 1.00-Ile : 0.94-Leu : 1.98-Tyr : 1.04-Phe : 1.02-Lys : 0.94-Arg : 1. 02, TLC Rf : 0.20(BEWl), HPLC 역상(EPP : 90%)
rF : 0.20(BEWl), HPLC 역상(EPP : 905)
6. Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Gly-Gln-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCl
상기에서 수득된 생성물 5.3g(2.7mM)을 40㎖의 DMSO+6㎖의 몰에 용해시키고, 10㎖의 1N 수산화나트륨을 적가한 후, 생성물을 30분간 교반하고 10㎖의 1N염산으로 중화시킨다. 반응 매질을 1ℓ의 에틸아세테이트에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에틸 아세테이트로 4번, 물로 2번 및 에테르로 4번 세척한 후 P2O5로 진공 건조시킨다.
중량 : 4.56g, 수율 : 86%
1H NMR 및 AAA에 의해 확인된 생성물-TLC : Rf : 0.5BEWl
[실시예 13]
Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Try-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2,HCl(보호된 GRF 1-44)의 합성
1. H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Glu-Gln-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl, TFA
1.4g의 실시예 10-11의 생성물을 60㎖의 CH2Cl2+70㎖의 TFA+7㎖ 에탄디티올에서 35분간 교반한다. 절반으로 진공 농축한 후, 잔류물을 500㎖의 냉 에테르에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, 에테르로 세척한 후, 수산화칼륨으로 진공 건조시킨다(중량 : 7.44g)
2. Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-
Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl
6.6g의 상기 TFA염(1.9mM)을 36㎖의 DMSO+90㎖의 DMF에 용해시키고, NEM으로 중화한 후, 1.0g의 BOP(2.3mM) 및 3.8g의 실시예 11-6의 펩티드(1.9mM)을 차례로 가한 다음, 반응 매질의 pH를 NEM에 의해 6으로 맞춘다. 19시간 후, 1.15mM의 BOP를 가한다. 26시간 후, 반응 매질을 600㎖의 AcOEt에 붓는다. 수득된 침전을 여과하고, AcOEt로 세척한 후, 여과하고 진공건조시킨다.
수율 : 88%(9.2g)-NMR 및 AAA에 의해 확인된 생성물.
3. H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl, TFA
9.1g의 상기 생성물을 100㎖의 TFA+5㎖의 에탄디티올에서 35분간 교반시킨다. 반응 매질을 500㎖의 냉 에테르에붓는다. 수득된 침전을 여과하고, Et2O으로 세척한 후, 수산화 칼륨으로 진공 건조시킨다.
수율 : 100%
4. 보호된 GRF 1-44
9.10g의 상기 TFA염(1.66mM)을 50㎖의 DMF 및 50㎖의 DMSO에 용해시키고, NEM으로 중화시킨 후, 실시예 11-3에 기재된 펩티드 1.18g(1.78mM) 및 0.79g의 BOP(1.78mM)을 가하고, NEM에 의해 pH를 약 6으로 유지시킨다. 주변온도에서 23시간 후, 반응 매질을 600㎖의 AcOEt에 붓는다. 생성된 침전을 여과하고, 에틸아세테이트 및 에테르로 세척한 후, 최종적으로 진공 건조시킨다.
수율 : 8.54g(84%)
NMR 및 TLC에 의해 검사 : -AAA : Asp : 4.2-Thr : 0.92-Ser : 4.02-Glu : 7.37(7)-Gly : 3.14(3)-Ala : 5.11-Val : 1.01-Met : 0.61-Ile : 1.84-Leu : 4.98-Tyr : 1.87-Phe : 0.95-Arg : 5.90
[실시예 14]
GRF 1-44의 탈보호
실시예 7-4에 따라 수득된 생성물 4.5g을 19.8㎖의 TFMSA, 27㎖의 티오아니솔 및 11㎖의 메타크레솔을 함유하는 180㎖의 TFA에서 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 1ℓ의 에테르를 가한다. 수득된 침전을 여과하고, 에테르로 세척한 후, 수산화칼륨 존재하에 1시간동안 진공 건조시킨다. 생성물을 200㎖의 물에 재용해시키고, 이온교환수지 엠버라이트 IR 45(아세테이트형)를 가하여 pH 4.5로 맞춘다. 주변온도에서 매질을 30분간 교반한다. 수지를 여과하고, 물로 세척한 후, 여과액을 50㎖로 농축하고, 동결 건조시킨다.
수율 : 3.85g. 보호기 Z 및 OBzL의 소멸을 NMR로 검사한다.
TLC(BEPWI)-주 스포트 Rf 0.38
[실시예 15]
GRF 1-44의 정제
상기 실시예 13에서 수득된 탈보호 펩티드를 세파덱스 G50겔(미세)로 크로마토그래피하고 용리액으로 30% 아세트산을 사용한다.
원하는 펩티드를 함유하는 분획을 함께 수거하여 증발 및 동결건조시킨다. 수득된 동결 건조물을 양이온 교환 CM-32 카르복시메틸 셀룰로오즈(와트만)형의 양이온 교환 기상에서 0.1M(pH 4.5) 내지 0.4M(pH 6.5)의 암모늄 아세테이트를 사용하여 크로마토그래피한다. 예를들면 정제될 1g의 펩티드 1충전량 당 베드 부피 약 50㎖ 및 높이 20㎝인 크로마토그래피 컬럼을 사용한다.
순도≥80%(HPLC) 이상의 펩티드를 함유하는 분획을 함께 수거하고, CH3CO2NH4를 제거하기 위해 일정 중량이 될 때까지 동결 건조시킨다.
마지막으로, 상기 동결 건조물을 정지 액상의 지지체로써 미세 세파덱스 G 50 및 4/1/1/7(부피) 비율의 n-부판올/에탄올/피리딘/0.2N 아세트산 용매를 사용하여 분배 크로마토그래피한다. 크로마토그래피의 분획을 HPLC로 검사하고, 순도가
95％인 것은 함께 수거하여 동결 건조시킨다.
생성물을 최종적으로 검사하여 아미노산 분석한다.
Tyr : 1.91(2)-Ala : 4.88(5)-Asn,Asp : 3.86(4)-Ile : 1.96(2)-Phe : 0.93(1)-Thr : 1.02(1)-Ser : 3.88(4)-Arg : 5.89(6)-Lys : 1.98(2)-Val : 1.01(1)-Leu : 5.10(5)-Gly : 2.98(3)-Gln,Glu : 6.82(7)-Met : 0.91(1)
[실시예 16]
Boc-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly(단편 B)의 합성
1. Z-Arg(NO2)-Gly-OBzl
글리신 벤질 에스테르의 토실레이트(H-Gly-o-Bzl, 토실레이트) 353g을 2ℓ의 DMF에 용해시키고, 115g의 NEM, 353g의 Z-Arg(NO2)-OH 및 500g의 BOP를 차례로 가한다. NEM을 가하고 물로 희석된 반응 매질 시료에 pH지시 종이를 사용하여 매질의 pH를 7로 맞춘다. 반응 매질을 교반하고, 반응의 진전상태를 TLC로 검사한다. 4시간 후 반응을 완결하고, 매질을 35℃에서 진공 증발 건조시킨다. 증발 잔류물을 2ℓ의 에틸아세테이트 및 2ℓ의 물에 용해시킨다. 이런 조건하에 수득된 고체를 배수시키고, 고상에서 HKSO4+K2SO4의 5% 수용액, 정수, NaHCO35% 수용액 및 물로 연속 세척한다.
생성물을 공기 중에서 건조시키고, NMR 및 TLC에 의해 검사한다.
수율 : 410g(82%)
2. H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH
DMF에 녹인 3ℓ의 HCIN 용액에서 10% Pd의 100g Pd/C 존재하에 1.5바아의 수소 압력하 500g의 상기 생성물을 수소화한다. 24시간 후, 반응을 종결한다(TLC로 검사). 촉매를 여과한 다음, N-에틸 모르폴린을 가하고 물로 희석된 시료를 pH 지시 종이로 검사하여 매질의 pH를 7로 맞춘다. 458g의 Boc-Glu(OBzl)-ONp를 1ℓ의 DMF 용액에 도입한다. 반응 매질에 1ℓ의 물을 가하여 희석하고, 135g의 OHBT 및 충분량의 NEM을 점차 가하여 pH 7로 유지한다.
매질의 주변온도에서 4시간동안 교반한다. 반응이 완결되면 35℃에서 용매를 진공 증발시킨다. 증발 잔류물을 에틸아세테이트에 용해시킨다. 이 조건하에서 생성물은 고체가 된다. 고체를 배수시키고, 실리키겔로 크로마토그래피하며 용리액으로 클로로포름-메탄올(70-30부피)을 사용한다. 순수한 생성물을 함유하는 크로마토그래피 분획을 증발시켜 412g(75%)의 백색 분말상 화합물을 수득하고, 동결 건조시킨다. TLC 및 NMR로 검사한다.
상기 생성물을 주변온도에서 TFA 및 CH2Cl2의 50/50 혼합물 3ℓ에 용해시킨다. 매질을 주변온도에서 15분간 유지시키고, 20℃에서 유지시키면서 진공 증발 건조시킨다. 잔류물을 에틸에테르에 용해시키고, 수득된 고체를 배수 및 건조시킨다. 수율은 트리플루오로 아세테이트형으로 423g(100%)이다.
3. H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH
H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH의 트리플루오로 아세테이트 564g을 3ℓ의 디메틸포름아미드에 용해시킨다. 물로 희석된 시료에 NEM을 가하고 pH 지시 종이로 pH 7로 맞춘다.
367g의 Boc-Gln-ONp를 1ℓ의 DMF 용액에 도입한다. 반응 매질에 1ℓ의 물을 가하여 희석한다. 135g의 OHBT 및 충분량의 NEM을 점차 가하여 pH 7로 유지한다.
혼합물을 주변온도에서 4시간동안 교반한다. 반응말기에 TLC로 검사하고, 35℃의 고 진공에서 용매를 증발시킨다. 증발 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시킨다. 이 조건하, 습한 고체를 수득하고 이를 트리플루오로 아세트산 -CH2Cl2(2ℓ의 50/50부피 혼합물)로 처리한다.
매질을 주변온도에서 10분간 보존하고, 20℃, 진공중에서 증발시킨다. 증발 잔류물을 에틸에테르로 연마하여 525g(76%)의 H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH를 수득한다(NMR 및 TLC로 검사).
4. H-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH
실시예 2-2와 같은 조건에서 H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH, 트리플루오로 아세테이트(691g) 및 393g의 Boc-Asn-ONb로부터 685g(85%)의 백색고체 생성물을 수득하고 NMR 및 TLC로 검사한다.
5. H-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH
실시예 2-2와 같은 조건에서, 806g의 H-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH 및 366g의 Boc-Ser-ONb로부터 688g(77%)의 트리플루오로 아세테이트형 생성물을 얻는다(NMR 및 TLC로 검사).
6. Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln(OBzl)-Arg-Gly-OH(단편 B)
894g의 H-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH 트리플루오로 아세테이트 및 458g의 Boc-Glu (OBzl)-ONp로부터 반응시키고 DMF-에테르(50-50부피) 매질로 결정화 정제시켜 824g(80%)의 기대 생성물을 수득한다. 생성물을 NMR, TLC 및 아미노산 분석에 의해 검사한다.
Gln-Glu : 2.92(3)-Ser : 0.97(1)-Asn : 1.03(1)-Arg : 0.97(1)-Gly : 0.96(1)
표 5, 6, 7 및 8에 기재된 전략 및 실시예 1∼11 및 16의 기술에 의해, 하기의 화합물을 수득할 수 있다.
Boc-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-OH(단편 E)
Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-OH(단편 F)
Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH(단편 G)
Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-OH(단편 H)
[실시예 17]
Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2(단편 B-A)
69.2g의 단편 A 히드로클로라이드를 500㎖의 DMF에 용해시킨다. 물로 희석된 샘플을 pH 지시 종이와 NEM으로 pH 7로 맞춘다. 117g의 단편 B 및 55g의 BOP를 가하고, NEM에 의해 pH 7로 다시 맞추고, 매질을 주변온도에서 14시간 동안 교반한다. 생성물을 TLC로 검사한 후, 2ℓ의 에틸에테르를 반응 매질에 가한다. 백색분말상 침전을 이 조건에서 침적시킨다. DMF-에틸아세테이트로 재결정하여 정제한다. 배수된 생성물을 고상에서 에틸아세테이트로 세척하고 전조시킨다.
149g(81%)의 백색 생성물을 수득하고, TLC, NMR로 검사한다. 아미노산 분석 :
Gln-Glu : 2.92(3)-Ser : 1.02(1)-Asn : 0.97(1)-Arg : 2.89(3)-Gly : 1.01(1)-Ala : 1.98(2)-Leu : 0.93(1)
N-말단 질소의 탈보호
상기 실시예에 기재된 생성물(184g)을 750㎖의 TFA 및 750㎖의 CH2Cl2혼합물에 주변온도에서 교반하면서 도입한다. 용해시킨 후 혼합물을 같은 온도에서 15분간 보존하고, 증발 매질의 온도를 25℃에서 유지시키면서 진공 증발시킨다. 증발 잔류물을 에테르에 용해시키고, 이 조건하에서 백색 분말 고체를 수득한 후 진공 건조시키고 TLC 및 NMR에 의해 검사한다.
하기의 화합물은 실시예 17의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 펩티드 신장의 다른 단계를 나타낸다.
단편 : C-B-A
단편 : D-C-B-A
이런 특정 경우에, 아지드(
)의 활성화를 이용해서 단편 D를 도입한다.
메티오닌이 서열내에 생기자마자, 선택적 탈보호(Boc의 제거)동안 TFA-CH2Cl2에 의한 여러 처리 도중에 스카밴져를 사용할 수 있다. 본 발명에서는, TFA-CH2Cl2매질에서 메티오닌이 5% 산화하는 것을 보호하기 위해 티오아니솔을 사용한다.
단편 : E-D-C-B-A
단편 : F-E-D-C-B-A
단편 : G-F-E-D-C-B-A
단편 : H-G-F-E-D-C-B-A
Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-(H)-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Mer-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2
보호된 hPGRF
hpGRF 1-44의 탈보호 및 정제는 실시예 14 및 15에 따라 수행된다.
Claims (8)
- a) 리신의 측쇄 아민 작용 및 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄산 작용을 Boc기의 탈보호의 조건에서 안정한 보호기로 보호하고, b) 아르기닌의 구아니딘 작용을 양성자 첨가에 의해 보호하고, c) N-말단 아미노산을 Boc기에 의해 아민 위치에서 보호함으로써 단편들을 비양성자성 극성 용매 중에서 GRF의 서열 순서에 따라 차례대로 커플링시키고 ; -신장 단계에서 트리플루오로아세트산을 이용하는 가수분해에 의해 펩티드의 N-말단아민으로부터 Boc기를 선택적으로 제거하고, -서열의 끝에서, 트리플루오로아세트산에 용해시킨 메탄술폰산 또는 트리플루오로메탄술폰산의 0.1∼1M 용액을 이용하는 가수분해에 의해 모든 보호기들을 제거하는 단계들로 이루어짐을 특징으로 하는, 단편들에 의해, 액상에서 hpGRF 1-44 및 hpGRF 1-40임을 합성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 각 커플링 후, 얻어진 생성물을 비양자성 용매를 이용한 침전에 의해 반응 매질로부터 분리함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 반응의 조 생성물을 역류 및 겔투과 크로마토그래피에 의해 정제함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, GRF의 서열 순서에 따라 연속적으로 다음의 9개 펩티드 단편들을 커플링시키고, 얻어진 펩티드가 hpGRF 1-44임을 특징으로 하는 방법 :-H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2(40-44)(단편 A)-Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH(33-39)(단편 B)-Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH(28-32)(단편 C)-Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2(25-27)(단편 D)-Boc-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-OH(21-24)(단편 E)-Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-OH(16-20)(단편 F)-Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH(12-15)(단편 G)-Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-OH(5-11)(단편 H)-Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH(1-4)(단편 I)
- 제1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 알라닌아미드를 단편 A대신에 사용하고, 얻어진 펩티드가 hpGRF 1-40임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 다음의 3개의 펩티드 단편들을 GRF의 서열 순서에 따라 연속적으로 커플링시키고, 얻어진 펩티드가 hpGRF 1-44임을 특징으로 하는 방법 :1) H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Gln(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH1(GRF의 서열 20-44, 펩티드 K)2) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH(GRF의 서열 5-19, 펩티드 J)3) Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH(GRF의 서열 1-4, 팹티드 I)
- 제6항에 있어서, GRF의 서열 20-40에 해당하는 펩티드 단편을 펩티드 K 대신에 사용하고, 얻어진 펩티드가 hpGRF 1-40임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 커플링을 디메틸포름아미드 또는 디메틸술폭사이드와 같은 적절한 용매내에서, 1-히드록시벤조트리아졸(커플링제)의 존재하에 벤조트리아졸릴옥시포스포늄(BOP)의 헥사플루오로포스페이트 또는 디시클로헥실-카르보디이미드의 도움으로, 또는 카르복시아지드를 이용한 활성화에 의해 수행함을 특징으로 하는 방법.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8302781 | 1983-02-21 | ||
| FR8302781A FR2541271B1 (fr) | 1983-02-21 | 1983-02-21 | Nouvelle synthese du hpgrf en phase liquide |
| FR83/02781, | 1983-02-21 | ||
| FR83/19058 | 1983-11-29 | ||
| FR8319058A FR2555588B1 (fr) | 1983-11-29 | 1983-11-29 | Procede de synthese en phase liquide de la somatocrinine et peptides intermediaires |
| FR8319058 | 1983-11-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR850000469A KR850000469A (ko) | 1985-02-27 |
| KR910006284B1 true KR910006284B1 (ko) | 1991-08-19 |
Family
ID=26223300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019840000837A KR910006284B1 (ko) | 1983-02-21 | 1984-02-21 | hpGRF(소마토크리닌)의 합성 방법 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4581168A (ko) |
| EP (1) | EP0122818B1 (ko) |
| KR (1) | KR910006284B1 (ko) |
| AU (1) | AU574348B2 (ko) |
| CA (1) | CA1267998A (ko) |
| DE (1) | DE3466693D1 (ko) |
| DK (1) | DK79284A (ko) |
| IE (1) | IE56918B1 (ko) |
| IL (1) | IL71031A (ko) |
| NZ (1) | NZ207205A (ko) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4704450A (en) * | 1983-02-21 | 1987-11-03 | Sanofi | Synthesis of hpGRF(Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides |
| DE3327007A1 (de) * | 1983-07-27 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus |
| FR2567524B1 (fr) * | 1984-07-10 | 1987-11-27 | Sanofi Sa | Procede de synthese de la somatocrinine en phase liquide et peptides intermediaires |
| EP0193910A3 (en) * | 1985-03-06 | 1988-11-23 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Synthesis of a derivative of grf and intermediate peptides |
| FR2599038B1 (fr) * | 1986-05-26 | 1990-06-29 | Sanofi Sa | Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires |
| US5565606A (en) * | 1986-10-21 | 1996-10-15 | Hoechst Aktiengesellschaft | Synthesis of peptide aminoalkylamides and peptide hydrazides by the solid-phase method |
| US5200526A (en) * | 1987-04-27 | 1993-04-06 | The Governors Of The University Of Alberta | Syntheses of optically pure α-amino acids from 3-amino-2-oxetanone salts |
| US4888385A (en) * | 1987-04-30 | 1989-12-19 | Millipore Corporation | BOP reagent for solid phase peptide synthesis |
| IT1226552B (it) * | 1988-07-29 | 1991-01-24 | Ellem Ind Farmaceutica | Peptidi immunostimolanti. |
| EP0490249B1 (en) * | 1990-12-10 | 1995-03-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for the enzymatic preparation of GRF(1-44)NH2 |
| IE921942A1 (en) * | 1992-06-16 | 1993-12-29 | Gary A Siwruk John S Eynon | Liquid phase synthesis of peptides and peptide derivatives |
| US5516891A (en) * | 1992-06-16 | 1996-05-14 | Kinerton, Ltd. | Liquid phase synthesis of peptides and peptide derivatives |
| US6013764A (en) * | 1996-07-17 | 2000-01-11 | Ortho Pharmaceutical Corp. | Liquid phase peptide synthesis of KL-4 pulmonary surfactant |
| KR200427009Y1 (ko) * | 2006-07-06 | 2006-09-21 | 노승설 | 치약이 내장된 칫솔 |
| JP6564539B1 (ja) | 2018-09-14 | 2019-08-21 | 長瀬産業株式会社 | スルホン酸化合物によるペプチド精製方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU466760B2 (en) * | 1972-03-14 | 1975-11-06 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Process for producing peptide |
| JPS5726506B2 (ko) * | 1974-03-08 | 1982-06-04 | ||
| FR2451915A1 (fr) * | 1979-03-23 | 1980-10-17 | Clin Midy | Nouveau procede de preparation de la somatostatine |
| DE2919592A1 (de) * | 1979-05-15 | 1981-01-15 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur herstellung von thymosin- alpha 1 und derivaten davon |
| NZ204456A (en) * | 1982-06-16 | 1987-05-29 | Salk Inst For Biological Studi | Synthetic pancreatic growth-hormone releasing factor |
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| US4476116A (en) * | 1982-12-10 | 1984-10-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Polypeptides/chelating agent nasal compositions having enhanced peptide absorption |
| AU3318184A (en) * | 1984-08-10 | 1986-03-07 | Immunetech Pharmaceuticals | Immunotherapeutic polypeptide agents |
-
1984
- 1984-02-17 US US06/580,287 patent/US4581168A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-02-20 DK DK79284A patent/DK79284A/da unknown
- 1984-02-20 CA CA000447826A patent/CA1267998A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-02-20 DE DE8484400343T patent/DE3466693D1/de not_active Expired
- 1984-02-20 IE IE387/84A patent/IE56918B1/xx unknown
- 1984-02-20 EP EP84400343A patent/EP0122818B1/fr not_active Expired
- 1984-02-20 NZ NZ207205A patent/NZ207205A/en unknown
- 1984-02-21 AU AU24774/84A patent/AU574348B2/en not_active Ceased
- 1984-02-21 KR KR1019840000837A patent/KR910006284B1/ko active IP Right Grant
- 1984-02-21 IL IL71031A patent/IL71031A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0122818B1 (fr) | 1987-10-07 |
| IL71031A0 (en) | 1984-05-31 |
| IE56918B1 (en) | 1992-01-29 |
| AU574348B2 (en) | 1988-07-07 |
| KR850000469A (ko) | 1985-02-27 |
| CA1267998A (en) | 1990-04-17 |
| IE840387L (en) | 1984-08-21 |
| DK79284A (da) | 1984-08-22 |
| DE3466693D1 (en) | 1987-11-12 |
| US4581168A (en) | 1986-04-08 |
| IL71031A (en) | 1988-03-31 |
| EP0122818A1 (fr) | 1984-10-24 |
| AU2477484A (en) | 1984-08-30 |
| DK79284D0 (da) | 1984-02-20 |
| NZ207205A (en) | 1988-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR910006284B1 (ko) | hpGRF(소마토크리닌)의 합성 방법 | |
| US4148788A (en) | Synthesis of thymosin α1 | |
| EP3398960A1 (en) | Method for preparing sermaglutide | |
| EP0009010B1 (en) | Bradykinin inhibiting tripeptide derivatives, process for their preparation and pharmaceutical preparations containing them | |
| Blake et al. | THE SYNTHESIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF [165, 182, 189‐S‐CARBAMIDOMETHYLCYSTEINE]‐HUMAN GROWTH HORMONE‐(140–191) | |
| EP0123950A2 (en) | Intermediates for thymosin alpha 1 and desacetylthymosin alpha 1 | |
| EP0173557B1 (en) | Peptides | |
| US4797469A (en) | Synthesis of hGRF (Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides | |
| DK161835B (da) | Grf-analoge peptider og farmaceutisk acceptable salte deraf samt middel indeholdende disse | |
| KR920006564B1 (ko) | Grf유도체의 제조방법 | |
| EP0181121B1 (en) | Novel polypeptide and process for producing the same | |
| EP0413839A1 (en) | GHRH analogs | |
| FI56830C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av asparaginylgrupper innehaollande biologiskt aktiva polypeptider | |
| US4794169A (en) | Pentapeptides with cell growth regulatory effects and a process for the preparation thereof | |
| US6448031B1 (en) | Process for producing LH-RH derivatives | |
| US4704450A (en) | Synthesis of hpGRF(Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides | |
| US4474765A (en) | Biologically active peptides | |
| KR840000054B1 (ko) | 티모신 α₁의 제조방법 | |
| US4271152A (en) | Psycho-pharmacological peptides | |
| Fujii et al. | Total synthesis of bovine pancreatic ribonuclease A. Part 1. Synthesis of the protected pentadecapeptide ester (positions 110–124) | |
| DK148303B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af cysteinholdige peptider | |
| YAJIMA et al. | Studies on Peptides. XLIII. Synthesis of Two Protected Peptides Related to the C-Terminal Portion of the Basic Trypsin Inhibitor from Bovine Pancreas (Kunitz and Northrop) | |
| FR2541271A1 (fr) | Nouvelle synthese du hpgrf en phase liquide | |
| GB2118190A (en) | Peptides with sauvagine-like activity | |
| JPS59216859A (ja) | 液相中でのソマトクリニンの合成方法及び中間体ペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| G160 | Decision to publish patent application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| NORF | Unpaid initial registration fee |