EP0122818B1 - Synthèse du hpGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires - Google Patents

Synthèse du hpGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires Download PDF

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EP0122818B1
EP0122818B1 EP84400343A EP84400343A EP0122818B1 EP 0122818 B1 EP0122818 B1 EP 0122818B1 EP 84400343 A EP84400343 A EP 84400343A EP 84400343 A EP84400343 A EP 84400343A EP 0122818 B1 EP0122818 B1 EP 0122818B1
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leu
ser
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    • Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

Definitions

  • hpGRF Human Pancreatic Growth Hormone releasing Factor
  • Somatocrinin is a peptide formed by the chain of 44 amino acids. Its sequence is as follows:
  • This peptide is particularly active in stimulating the release of growth hormone (GH) both in vitro and in vivo.
  • GH growth hormone
  • ED n / a 15 femtomoles / ml.
  • the therapeutic interest in human medicine of this substance will therefore be at the level of the treatment of dwarfism and delays in growth in pediatrics.
  • Other applications are possible in cases of protein anabolic deficiency (stress ulcers, repair of fractures or cartilage damage, extensive burns (during the anabolic phase), skin repairs, osteoporosis.
  • this compound is of obvious interest in terms of the weight growth of farm animals (cattle, sheep, pigs, chickens, etc.) and the increase in lactation (cattle, sheep, etc.). .
  • the process of the present invention can also be applied to the synthesis of hpGRF 1-40, a natural product also isolated by R. Guillemin, almost as active as hpGRF 1-44 and usable in the same therapeutic indications.
  • the elongation of the peptide from the synthesized fragments is carried out using as coupling agent benzotriazolyl-oxyphosphonium hexafluorophosphate (BOP), or dicyclohexylcarbodiimide in the presence of 1-hydroxy benzotriazole, or according to the carboxyazide method (Curtius) in a suitable solvent such as dimethylformamide or dimethylsulfoxide.
  • BOP benzotriazolyl-oxyphosphonium hexafluorophosphate
  • Curtius carboxyazide method
  • the product is isolated from the reaction medium by the introduction of a third insolubilizing solvent (ether, ethyl acetate, etc.) which precipitates the peptide.
  • the deprotections of the side chains at the end of elongation of the peptide can be carried out by hydrogenation in the presence of a catalyst (such as Pd / C) using hydrogen gas under slight pressure (1 to 5 kg) or else with a hydrogen generator such as formic acid or ammonium formate. It is also possible to eliminate this type of protective groups with a strong acid such as mixtures of methanesulfonic acid in trifluoroacetic acid (0.5 M) or else trifluoromethanesulfonic acid in trifluoroacetic acid (0.5 M ).
  • the product after the terminal deprotections, is purified by filtration on Sephadex G 50 gel using 30% acetic acid.
  • the fractions enriched in GRF 1-44 are combined and subjected to chromatography on ion exchangers (cations) of the carboxy type and using a gradient with increasing ionic strength adapted to the type of ion exchange resin used.
  • the higher purity fractions are combined and purified either by partition chromatography on an appropriate support of the Sephadex G 50 or Biogel P 10 type, or by countercurrent distribution.
  • a variant of the process consists in replacing the partition chromatography or the countercurrent distribution with the preparative HPLC.
  • the fragments used for the synthesis of hpGRF 1-44 are determined on the basis of chemical considerations, taking into account in particular the minimum risks of racemization during the coupling phases of the fragments.
  • Each of the fragments is then synthesized according to a strategy adapted to each case according to a "Step Wise" process in the liquid phase.
  • the following diagram 1 represents one of the synthesis strategies usable for the synthesis of hpGRF 1-44.
  • Peptide j and peptide K are in turn synthesized by a fragment process.
  • the peptide 5 ⁇ 19 is synthesized from 3 fragments and the peptide 20-44 from 7 fragments.
  • Schemes II and III below represent the strategies used to prepare peptides J and K, peptide I having already been prepared in scheme I.
  • Scheme IV represents the coupling of the 3 peptides I, J and K to result in hpGRF 1-44.
  • Tables X to XV represent the synthesis diagrams of the fragments not described by following diagram I.
  • H-Arg trifluoroacetate (NO 2 ) Leu-NH 2 are dissolved in 2 I of DMF. 200 g of Boc-Ala-OH are added and then 500 g of BOP. The pH is adjusted to 7 on pH paper (on small samples of the reaction medium) using NEM. The medium is stirred and the progress of the reaction is monitored by TLC. The reaction is finished after 4 h. The medium is evaporated to dryness under vacuum at 25 ° C. The residue is taken up in 2 of water and 2 1 of ethyl acetate. The organic phase is washed with a 5% aqueous NaHCO 3 solution, with water, dried and evaporated. The tripeptide is recrystallized from ethyl ether acetate, and finally dried under vacuum. It is controlled by CCM and RMN.
  • the previous dried product is treated with a 50-50 (volume) mixture of TFA-CH 2 Cl 2 under the conditions of the previous example (1-1). Isolation is also carried out under the same conditions.
  • the solid residue is purified by chromatography on silica gel using the butanol, pyridine, HO 2 CCH 3 , OH 2 mixture (50-12-12-25 by volume) as elution medium.
  • the resin is drained and the absence of ammonium chloride in the aqueous solution is checked by the Nesler test, then this solution is evaporated to dryness under reduced pressure (0.1 mm of mercury) at a temperature below 30 ° C. . A gummy residue is obtained which is dried overnight in a desiccator with phosphoric anhydride.
  • TLC ethyl acetate-pyridine-formic acid-water 40-21-10-6.
  • reaction mixture is stirred at RT and the reaction is followed by TLC (chloroform-methanol-acetic acid 95-5-9 and pyridine-ethyl acetate-formic acid-water 21-40-10-6).
  • H-Ser-Asn-Gln-OH is dissolved in a mixture of 100 ml of water and 600 ml of DMF.
  • the pH of the solution is brought to 7 by addition of NEM and a solution of 87.11 g of Boc-Glu (OBzl) -ONP (0.19 mole) in 600 ml of DMF and then 29.5 g of HOBT is added ( 0.19 mole).
  • the pH of the mixture is brought back to 7 by addition of NEM and the mixture is stirred at RT. After 1 hour of stirring, 2.7 g of Boc-Glu (OBzi) -ONP are added.
  • reaction is followed by TLC (tetrahydrofuran-pyridine-formic acid-water 60-20-10-6 and chloroform-methanol-acetic acid 95-5-3).
  • TLC tetrahydrofuran-pyridine-formic acid-water 60-20-10-6 and chloroform-methanol-acetic acid 95-5-3.
  • a slight insoluble material is filtered, then evaporated to dryness under reduced pressure (0.1 mm of mercury) at a temperature below 30 ° C.
  • the oil obtained is taken up in 800 ml of ethyl acetate, a slightly gelatinous precipitate is formed. It is drained and washed with ethyl acetate (2x400 ml), then with ether and dried.
  • AAA Ser: 0.86-Glu: 1.02-Ala: 0.99-Leu: 0.99-.
  • the impure product is chromatographed on a column of silica gel (5 cm ⁇ 150 cm). It is eluted with the 80/20 chloroform-ethyl acetate mixture (flow rate 600 ml / h). The good fractions determined in TLC are combined, evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is taken up in ether, triturated and the solid obtained drained.
  • AAA AC Gly 1.00-Val 0.96-Leu 1.06-Lys 0.98.
  • the reaction is finished.
  • the reaction mixture is evaporated to dryness under reduced pressure (0.1 mm of mercury) and at a temperature below 30 ° C.
  • the oil obtained is taken up in 300 ml of ethyl acetate.
  • the solid formed is drained and lifted with ether (1st jet).
  • Ether is added to the preceding filtrate; a solid precipitate which is wrung (2nd jet): the 2 jets are identical in TLC. They are washed in the solid state by stirring for 1 h with a mixture of 200 ml of water saturated with ethyl acetate and 60 ml of water.
  • the solid is drained and then washed with 60 ml of water and 300 ml of ether and dried.
  • the reaction mixture is evaporated to dryness under reduced pressure (0.1 mm of mercury) and at a temperature below 30 ° C.
  • the residual oil is taken up in ethyl acetate (300 ml).
  • the gelatinous solid formed is drained, washed with ethyl acetate (100 ml), with ethyl acetate-ether (1/1; 100 ml), then with ether (100 ml), finally with hexane (100 ml).
  • the product is dried under reduced pressure to constant weight.
  • AAA Ac: Gly: 1.00-Val: 0.97-Leu: 1.04-Tyr: 0.95.
  • the crude oil obtained above is dissolved in 50 ml ice-cold TFA and stirred for 1 h 30 min at RT.
  • the TFA is evaporated to the maximum and the residual oil is taken up 3 times in anhydrous ether and decanted. It is then dried in a desiccator under vacuum in the presence of pentane. A solid foam is formed which is crushed and put back to dry.
  • the above TFA salt is dissolved in a mixture of 20 ml DMF and 18 ml of distilled water.
  • the NEM is added up to pH 7 (use of the pH meter).
  • 4 g (0.014 mole) of Boc-Ala-ONSu dissolved in 16 ml of DMF are introduced.
  • the pH is maintained at 6.5-7 by addition of NEM.
  • the reaction is complete (CCM control).
  • the solvent is evaporated to the maximum and the residue is taken up in a mixture of water and ethyl acetate.
  • the organic phase is washed with a NaHCO 3 solution, with salt water, dried over NA 2 SO 4 and evaporated to dryness.
  • the residue is dissolved in ether and precipitated with hexane to give a gum which crystallizes after crushing.
  • the solid is drained and air dried.
  • Example XI synthesis of: H-Arg-Lys (Z) -Leu-Leu-Gln-Asp (Bzl) -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu (OBzI) -Ser-Asn-Gln -Glu (OBzI) -Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH 2 (peptide K)
  • Boc-Glu (OBzI) -Ser-Asn-Gln-Glu (OBzI) -Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH 2 , HCI
  • the previous TFA salt is dissolved in 300 ml of DMF and neutralized by NEM. 14.8 g of BOP (33 mM) are added then in small portions over 1 hour 21.4 g (30 mM) of Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH. The pH of the reaction medium is maintained around 6 by the NEM. A After 7 hours, the medium is poured onto 2 1 of ACOEt. The precipitate obtained is filtered, washed with ethyl acetate, then with ether and finally dried under vacuum.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • a TLC control shows a complete reaction after 24 h, however the reaction is only stopped after 40 hours by pouring the solution onto 750 ml of ice-cold ethyl acetate, stirred. The precipitate thus formed is filtered and washed abundantly with the same solvent and dried under vacuum in the presence of phosphoric anhydride. 14.35 g are thus obtained, used as such in the next step.
  • Boc-Gln-Asp (OBzI) -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu (OBzI) -Ser-Asn-Gln-Glu- (OBz) -Arg-Gly-Ala-Arg -Ala-Arg-Leu-NH 2 , HCI
  • Boc-Arg-Lys Z) -Leu-Leu-Gln-Asp (OBzI) -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu (OBzI) -Ser-Asn-Gln-Glu ( OBzI) -Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH 2 , HCI
  • Example XII Synthesis of: Boc-lie-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys (Z) -Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCI (peptide J)
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • Example XIII Synthesis of: Z-Tyr-Ala-Asp-OBzl) -Ala-lie-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys (Z) -Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys (Z) -Leu-Leu-Gln-Asp (OBzl) -lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly (OBzl) -Ser-Asn-Gin-Glu (OBzl) -Arg- Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH 2 , HCI
  • Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys Z) -Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys (Z) -Leu-Leu-Gln -Asp (OBzl) -lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu (OBzl) -Ser-Asn-Gln-Glu (OBzl) -Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu- NH 2 , HCI
  • NMR and CMM control AAA: Asp: 4.2-Thr: 0.92-Ser: 4.02-Glu: 7.37 (for 7) -Gly: 3.14 (for 3) -Ala: 5.11 -Val: 1.01-Met: 0.61-Ile: 1.84-Leu: 4.98-Tyr: 1.87-Phe: 0.95-Arg: 5.90.
  • the deprotected peptide obtained in the previous example (XIV) is subjected to chromatography on Sephadex G 50 gel (fine) using 30% acetic acid as eluent.
  • the fractions containing the expected peptide are combined, evaporated and lyophilized.
  • the lyophilisate thus obtained is in turn purified by chromatography on a cation exchanger of the CM-32 carboxymethylcellulose (Whatman) type using a linear gradient of ammonium acetate of between 0.1 M (pH 4.5) and 0.4 M (pH 6.5).
  • a chromatography column will be used having a bed volume of approximately 50 ml for a height of 20 cm.
  • 353 g of glycine tosylate benzyl ester (H-Gly-OBzl, tosylate) are dissolved in 2 l of DMF, 115 g of NEM are added, then 353 g of Z-Arg (NO 2 ) -OH and finally 500 g of BOP .
  • the pH of the medium is adjusted to 7 using NEM and using pH indicator paper on samples of the reaction medium diluted with water.
  • the reaction medium is stirred and the state of progress of the reaction monitored by TLC After 4 h, the reaction is complete and the medium is evaporated to dryness under vacuum at 35 °. The evaporation residue is taken up in 2 ethyl acetate and 2 1 water.
  • the product is air dried and checked by R.M.N. and C.C.M.
  • the medium is stirred for 4 h at room temperature. It is ensured that the reaction is complete and the solvent is evaporated in vacuo at a temperature of 35 °.
  • the evaporation residue is taken up in ethyl acetate. Under these conditions, the product is organized as a solid. It is drained and chromatographed on silica gel using chloroform-methanol (70-30 by volume) as eluent. Evaporation of the chromatography fractions containing the pure product leads to 412 g (75%) of a white powdery compound after lyophilization. It is controlled by C.C.M. and R.M.N.
  • the previous product is dissolved at room temperature in 3 l of a mixture (50/50) of TFA and CH 2 Cl 2 .
  • the medium is maintained for 15 min at room temperature, and it is evaporated to dryness under vacuum, while maintaining the temperature at 20 °.
  • the residue is taken up in ethyl ether and the solid obtained is drained and dried.
  • the yield is 423 g (100%) in the form of trifluoroacetate.
  • H-Glu trifluoroacetate (OBzl) -Arg-Gly-OH are dissolved in 3 I of dimethylformamide.
  • the pH is adjusted to 7 by adding NEM to samples diluted with water and using pH indicator paper.
  • Example 11-2 Using rigorously the conditions of Example 11-2 and starting from H-Gln-Glu (OBzl) -Arg-Gly-OH, trifluoroacetate (691 g) and 393 g of Boc-Asn-ONb, 685 g are obtained (85%) of a white solid product controlled by NMR and C.C.M.
  • Example 11-2 Also under the conditions of Example 11-2 and from 806 g of H-Asn-Gln-Glu (OBzl) -Arg-Gly-OH and from 366 g of Boc-Ser-ONb, the controlled product is obtained by NMR and C.C.M. with a yield of 688 g (77%) and in trifluoroacetate form.
  • fragment A hydrochloride 69.2 g of fragment A hydrochloride are dissolved in 500 ml of DMF. The pH is adjusted to 7 on samples diluted with water and using pH indicator paper and NEM. 117 g of fragment B are then added, 55 g of BOP, the pH is again adjusted to 7 using NEM and the medium is stirred for 14 h at room temperature. After checking the end of the reaction by TLC, 2 l of ethyl ether are added to the reaction medium. A white powdery precipitate is deposited under these conditions. It is purified by recrystallization from DMF-ethyl acetate. The drained product is then washed with ethyl acetate in the solid phase and dried.
  • Example XVII The following compounds can be obtained according to the techniques of Example XVII and representing the different stages of the elongation of the peptide.
  • fragment D is introduced using azide activation
  • a "scavenger" sweeper will be used during the various treatments with TFA-CH 2 CI 2 during the selective deprotection phases (elimination of the Boc).
  • thioanisole as a protection agent for methionine against oxidation in the proportion of 5% in the TFA-CH Z CI 2 medium.

Description

  • Le hpGRF (Human Pancreatic Growth Hormone releasing Factor) ou Somatocrinine est un peptide constitué par l'enchaînement de 44 amino acides. Sa séquence est la suivante:
    Figure imgb0001
  • Il a été récemment découvert par A. Guillemin et coll. (Science, 218, 585-587 (1982)) à partir d'extraits d'une tumeur pancréatique humaine.
  • Ce peptide est particulièrement actif sur la stimulation de la libération de l'hormone de croissance (GH) aussi bien in vitro qu'in vivo. In vitro, en particulier son efficacité se manifeste à des doses de quelques femtomoles/ml. (EDso=15 femtomoles/ml). L'intérêt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique protéique (ulcères de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brûlures étendues (pendant la phase anabolique), réparations cutanées, ostéoporoses.
  • Dans le domaine vétérinaire, ce composé présente un intérêt évident au niveau de la croissance pondérale des animaux d'élevage (bovins, ovins, porcins, poulets, etc.) et de l'augmentation de la lactation (bovins, ovins, etc.).
  • Le-développement industriel de ce composé polypeptidique nécessite la synthèse de quantités importantes de cette substance. Les procédés classiques de la synthèse en phase solide permettent la préparation en des temps courts de faibles quantités de ce principe actif (Science, 218, 585­ 587 (1982)) à des coûts très élevés et incompatibles avec un développement pharmaceutique à grande échelle.
  • On a maintenant trouvé un procédé de synthèse en phase liquide pouvant être transposé à l'échelle industrielle permettant un accès au principe actif avec un rendement et un taux de pureté excellents. Ce procédé est basé sur le principe d'une synthèse par fragments.
  • Le procédé de la présente invention est caractérisé en outre en ce que l'on couple, l'un après l'autre et dans l'ordre de la séquence, les fragments dans lesquels:
    • a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc (tertiobutoxycarbonyle),
    • b) la fonction guanidine de l'arginine est protégée par protonation, et
    • c) l'acide aminé N-terminal est protégé sur l'amine par le groupement Boc en éliminant sélectivement le groupement Boc de l'amine N-terminale du peptide en phase d'élongation par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant polaire aprotique, et on élimine en fin de séquence tous les groupes protecteurs par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique.
  • Le procédé de la présente invention peut aussi s'appliquer à la synthèse du hpGRF 1-40, produit naturel isolé également par R. Guillemin, presque aussi actif que le hpGRF 1-44 et utilisable dans les mêmes indications thérapeutiques.
  • Le procédé de synthèse du GRF se caractérise en outre par les aspects suivants:
    • - application du principe de la protection minimale au niveau des chaînes latérales fonctionnalisées
    • - protection temporaire de la fonction guanidine latérale de l'arginine par le groupement nitro. L'arginine est introduite en séquence sous forme nitro guanidine. La fonction nitro est ensuite éliminée le plus tôt possible par hydrogénation catalytique à l'aide de Pd/charbon, ou bien en utilisant à la place de l'hydrogène gaz un générateur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Ainsi, tous les fragments synthétisés possédant de l'arginine dans leur séquence ont en fin de synthèse les fonctions guanidine, simplement protégées par protonation à l'aide d'un acide fort (acide chlorhydrique par exemple)
    • - les fonctions acides carboxyliques des chaînes latérales des acides glutamique et aspartique sont . protégées par des groupements clivables par hydrogénation catalytique (H2/Pd/charbon) ou bien en milieu acide fort comme les mélanges acide méthanesulfonique (0,5 M)-acide trifluoroacétique, ou acide trifluorométhanesulfonique (0,5 M)-acide trifluoroacétique. Nous préconisons comme protecteurs l'ester benzylique (0 Bzl) ou 2,6-dichlorobenzylique. Ces groupements protecteurs sont stables dans les conditions des déprotections intermittentes des amines en a (élimination des groupements t-butyloxy-carbonyle:Boc par l'acide trifluoroacétique)
    • - les fonctions amines des chaînes latérales des lysines sont protégées par des groupements clivables dans les mêmes conditions que précédemment. Nous préconisons les groupments benzyloxycarbonyle (Z), 2-chloro ou 2-bromo-benzyloxycarbonyle (2-CI ou 2-Br Z) stables dans les conditions de déprotection intermittente par l'acide trifluoroacétique.
  • Les fonctions hydroxyle présentes dans la thréonine, la sérine et la tyrosine ne sont pas protégées.
  • L'élongation du peptide à partir des fragments synthétisés est réalisée en utilisant comme agent de couplage l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl-oxyphosphonium (BOP), ou la dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxy-1 benzotriazole, ou selon la méthode aux carboxyazides (Curtius) dans un solvant approprié comme le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. L'isolement du produit du milieu réactionnel est effectué par introduction d'un tiers solvant insolubilisant (éther, acétate d'éthyle ... ) qui précipite le peptide.
  • On se limite pendant les étapes de couplage à des purifications sommaires du type lavages en phase solide à l'aide de solvants appropriés afin d'éliminer le léger excès du dernier fragment couplé, ainsi que les impuretés apportées par les agents de couplage.
  • Chaque opération de couplage d'un fragment est suivie d'une phase de déprotection intermittente du groupement protecteur Boc (tertio-butyloxycarbonyle) au niveau de l'amine sur laquelle va être effectué le couplage suivant. Cette déprotection est assurée par l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène (50/50 en volume).
  • Les déprotections des chaînes latérales en fin d'élongation du peptide peuvent être effectuées par hydrogénation en présence d'un catalyseur (comme le Pd/C) à l'aide d'hydrogène gazeux sous légère pression (1 à 5 kg) ou bien avec un générateur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Il est également possible d'éliminer ce type de groupements protecteurs par un acide fort comme les mélanges d'acide méthanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M) ou bien d'acide trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M).
  • Le produit, après les déprotections terminales, est purifié par filtration sur gel de Sephadex G 50 à l'aide de l'acide acétique à 30%. Les fractions enrichies en GRF 1-44 sont réunies et soumises à une chromatographie sur échangeurs d'ions (cations) du type carboxy et à l'aide d'un gradient à force ionique croissante adapté au type de résine échangeuse d'ions utilisée. Les fractions de plus haute pureté sont réunies et purifiées soit par chromatographie cie partition sur un support approprié du type Sephadex G 50 ou Biogel P 10, soit par la distribution à contre-courant.
  • Les fractions dont le titre de pureté est jugé satisfaisant par HPLC analytique sont réunies. Les autres sont recyclées.
  • Une variante du procédé consiste à remplacer la chromatographie de partition ou la distribution à contre-courant par la HPLC préparative.
  • Les fragments utilisés pour la synthèse de hpGRF 1-44 sont déterminés sur la base de considérations chimiques en tenant compte en particulier des risques minimaux de racémisation pendant les phases de couplage des fragments.
  • Chacun des fragments est alors synthétisé selon une stratégie adaptée à chaque cas selon un procédé "Step Wise" en phase liquide.
  • Le schéma 1 suivant représente l'une des stratégies de synthèse utilisable pour la synthèse de hpGRF 1-44.
  • Les flèches verticales délimitent les fragments utilisés dans la synthèse et chacun d'eux est désigné par une lettre:
    Figure imgb0002
  • En outre, les protections des chaînes latérales ont été symbolisées par:
    • X1=ester de type benzyle (O Bzl)
    • X2=protection carbamate du type benzyloxycarbonyle (Z)
  • Un trouvera ensuite dans les tableaux I à IX le procédé de synthèse utilisé pour chacun des fragments A à I.
    Figure imgb0003
    Figure imgb0004
    Figure imgb0005
    Figure imgb0006
    Figure imgb0007
    Figure imgb0008
    Figure imgb0009
    Figure imgb0010
    Figure imgb0011
    Figure imgb0012
  • On peut également préparer le hpGRF 1-44 selon un procédé faisant intervenir les fragments:
    Figure imgb0013
    que l'on couple dans l'ordre:
    Figure imgb0014
  • Le peptide j et le peptide K sont à leur tour synthétisés par un procédé par fragments.
  • Le peptide 5―19 est synthétisé à partir de 3 fragments et le peptide 20-44 à partir de 7 fragments.
  • Les schémas Il et III ci-après représentent les stratégies utilisées pour préparer les peptides J et K, le peptide I ayant déjà été préparé dans le schéma I.
  • Le schéma IV représente le couplage des 3 peptides I, J et K pour aboutir au hpGRF 1-44.
  • Les tableaux X à XV représentent les schémas de synthèse des fragments non décrits en suivant le schéma I.
  • Enfin, dans tous les cas, pour obtenir hpGRF 1-40, il suffit de réduire le fragment A à l'alaninamide.
    Figure imgb0015
    Figure imgb0016
    Figure imgb0017
    Figure imgb0018
    Figure imgb0019
    Figure imgb0020
    Figure imgb0021
    Figure imgb0022
    Figure imgb0023
  • Les exemples suivants permettront de mieux comprendre la portée de l'invention.
  • Les abréviations suivantes seront utilisées.
  • Les acides aminés sont représentés par les symboles recommandés par la commission de nomenclature de l'IUPAC-IUB section biochimie.
    • Ala: Alanine
    • Arg: Arginine
    • Asn: Asparagine
    • Asp: Acide aspartique
    • Gin: Glutamine
    • Glu: Acide glutamique
    • Gly: Glycine
    • IIe: Isoleucine
    • Leu: Leucine
    • Lys: Lysine
    • Met: Méthionine
    • Phe: Phénylalanine
    • Ser: Sérine
    • Thr: Thréonine
    • Tyr: Tyrosine
    • Val: Valine
    • A l'exception de la glycine, ils ont tous la configuration L.
    • HPLC: chromatographie liquide haute performance
    • CCM: chromatographie sur couches minces
    • OBzI: ester benzylique
      Figure imgb0024
    • Z: benzyloxycarbonyle (carbamate)
      Figure imgb0025
    • Boc: tertiobutyloxycarbonyl (carbamate)
      Figure imgb0026
    • DMF: diméthylformamide
    • NEM: N-éthylmorpholine
    • TFA: acide trifluoroacétique
    • MA: méthode de couplage aux anhydrides mixtes
    • ONSu: ester activé avec la N-hydroxysuccinimide
      Figure imgb0027
    • ONp: ester activé avec l'ortho nitrophénol
      Figure imgb0028
    • Troc: trichloroéthoxycarbonyle (carbamate)
      Figure imgb0029
    • OBut: ester avec le tertiobutanol
      Figure imgb0030
    • OTcp: ester activé avec le 2,3,5-trichlorophénol
    • OHBT: N-hydroxybenzotriazole
    • ONb: ester activé avec le N-hydroxy norbornène-5 dicarboximide-2,3
      Figure imgb0031
    • BOP: hexafluorophosphate de benzotriazolyloxyphosphonium
      Figure imgb0032
    • DCHa: dicyclohexylamine
    • DCU: dicyclohexylurée
    • DCC ou DCCI: dicyclohexylcarbodiimide
    • TA: température ambiante
    • DIPEA: diisopropyléthylamine
    • EPP: pureté polypeptidique
    • TFMSA: acide trifluorométhane sulfonique
    • AAA: analyse d'amino acides
    • Milieux de chromatographie exprimés en volumes:
    • BEW1: butanol, AcOH, H20 72/7/21
    • BEW2: butanol, AcOH, H20 67/10/23
    • BPEW1: butanol, pyridine, AcOH, H20 50/12/12/25
    • EPAW: AcOEt, pyridine, HCO2H, H20 63/21/10/6
    • BPEW2: butanol, pyridine, AcOH, H20 42/24/4/30
    • Exemple 1
    • Synthèse de H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (fragment A)
    • NO2 1. H-Arg-Leu-NH2
  • Dissoudre à la température ambiante 130 g de leucine amide (H-Leu-NH2) dans 1,5 I de DMF. Ajouter 333 g de Boc-Arg (NO2)―OH puis 500 g de BOP. Ajuster le pH à 7 au papier pH (sur de petits prélèvements dilués à l'eau) et à l'aide de N-éthylmorpholine (NEM). Le milieu est agité et on suit l'évolution de la réaction par CCM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé à sec sous vide à 25°C. Le résidu est repris par 1 litre d'eau et on obtient un solide qui est lavé à l'eau, puis avec une solution aqueuse de NaHCO3 à 5% à l'eau, à l'acétate d'éthyle et, finalement, on sèche le solide à l'air. On contrôle par CCM.
  • Le solide précédent est introduit dans 2 I d'un mélange 50-50 en volume d'acide trifluoroacétique- chlorure de méthylène. Le milieu est agité 10 min à la température ambiante et évaporé à sec sous vide à la température ambiante. Le résidu d'évaporation est repris dans l'éther, essoré, séché et contrôlé par CCM et RMN. Rendement: 339 g (90%) en trifluoroacétate d'un solide blanc.
  • 2. H-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2
  • 443 g de trifluoroacétate de H-Arg(NO2)Leu-NH2 sont dissous dans 2 I de DMF. On ajoute 200 g de Boc-Ala-OH et ensuite 500 g de BOP. On ajuste le pH à 7 au papier pH (sur de petits prélèvements du milieu réactionnel) à l'aide de NEM. Le milieu est agité et l'évolution de la réaction est suivie par CCM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé à sec sous vide à 25°C. Le résidu est repris par 2 d'eau et 2 1 d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution aqueuse de NaHC03 à 5%, à l'eau, séchée et évaporée. Le tripeptide est recristallisé dans l'acétate d'éthyléther, et finalement séché sous vide. Il est contrôlé par CCM et RMN.
  • Le précédent produit séché est traité par un mélange 50-50 (volume) de TFA-CH2Cl2 dans les conditions de l'exemple précédent (1-1). L'isolement est effectué également dans les mêmes conditions.
  • Rendement: 412 g (80%) exprimé en trifluoroacétate d'un produit pulvérulent blanc (contrôlé en CCM et RMN).
    • 3. Arg(N02)-Ala-Arg(N02)-Leu-NH2
  • A partir de 515 g de H-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2 dans 2,5 de DMF et 333 g de Boc-Arg(NO2)-OH et 500 g de BOP, on obtient en utilisant les conditions opératoires décrites dans l'exemple 1,1, après traitement au mélange TFA-CH2Cl2, 607 g (85%) d'un solide blanc contrôlé par CCM et RMN.
    • 4. Z-Ala-Arg(N02)-Ala-Arg-Leu-NH2
  • A partir de 715 g de trifluoroacétate de H-Arg(NO2)Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2 en solution dans 4 I de DMF et 233 g de Z-Ala-OH et 500 g de BOP en utilisant la même technique que celle décrite en 1-2 (et sans traitement dans ce cas par TFA-CH2Cl2), on obtient après recristallisation dans le mélange DMF-éther, 612 g de Z-Ala-Arg(N02)-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2 (76%) sous forme d'un solide pulvérulent blanc, contrôlé par CCM et RMN.
    • 5. Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 3HCI
  • 200 g de Z-Ala-Arg(NO2)Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2 (0,25 mole) sont mis en suspension dans 2 1 de méthanol contenant 0,8 mole de HCI. On ajoute 40 g de Pd/C à 10% de Pd, et le milieu est agité sous atmosphère d'hydrogène sous 1,2 bar de pression, pendant 24 h. Après cet intervalle de temps, on contrôle la fin de la réaction par CCM. Le catalyseur est éliminé par filtration et le solvant évaporé sous vide à la température ambiante.
  • Le résidu solide est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme milieu d'élution le mélange butanol, pyridine, HO2CCH3,OH2 (50-12-12-25 en volume).
  • Les fractions contenant le produit pur sont réunies, évaporées et lyophilisées.
  • Rendement: 119 g (69%) d'un solide pulvérulent blanc.
  • Contrôles: RMN, CCM.
  • Analyse d'aminoacides: Leu 1,03 (1)
    • Arg 1,92 (2)
    • Ala 1,95 (2).
    Exemple Il: synthèse de Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH, HCI (fragment B1) 1°) Z-Arg(N02)-Gly-OBzl
  • On dissout 3,37 g (0,01 mole) de tosylate de H-Gly-OBzl dans 15 ml de DMF, puis on ajoute 1 équivalent de NEM (1,3 ml). Cette solution est ajoutée à une solution de 3,53 g (0,01 mole) de Z-Arg(NO2)-OH dans 15 ml de DMF contenant un équivalent de NEM (1,3 ml). On ajoute alors 4,5 g (0,01 mole) de BOP au mélange réactionnel dont le pH est ensuite amené à 7 par addition de NEM et qui est agité à TA pendant 2 h 30 (la fin de la réaction est déterminée par CCM:chloroforme-méthanol (3/1). Le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 30°C. Le résidu est repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle. Cette solution est versée dans 120 ml d'eau glacée viroureusement agitée. Après quelques instants d'agitation, un précipité se forme qui est abandonné une nuit au réfrigérateur. Le solide est essoré et lavé successivement à l'état solide avec:-
    • 2x100 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de soude
    • 2x100 ml d'une solution aqueuse de S04HK-S04K2 à 5%
    • 2x100 ml d'eau
    • 2x100 ml d'éther

    puis séché sous vide (0,1 mm de mercure) jusqu'à poids constant.
  • Rendement: 4 g (80%).
    • Point de fusion Koffler: 149°C.
    • CCM: chloroforme-méthanol (3/1)
    • Rf: 0,73
    • Contrôle: RMN.
    2°) HCI-H-Arg-Gly-OH
  • On met en suspension 100 g (0,2 mole) de Z-Arg(N02)-Gly-OBzl dans un mélange de 600 ml d'eau, 600 ml d'acide chlorhydrique N et 100 ml de tétrahydrofuranne. On ajoute 60 g de Pd/C à 10% contenant 50% d'humidité. Ce mélange est hydrogéné pendant 48 h à température ambiante et sous une pression de 15 mm de mercure. Le catalyseur est ensuite filtré et la solution aqueuse est amenée à pH 6,5 par addition de résine Amberlite IR 45 (forme OH). La résine est essorée. La solution est ensuite amenée à pH 8,5 par addition d'une nouvelle quantité de résine et l'ensemble est agité pendant 20 min au rotavapor sous vide (25 mm de mercure). On essore la résine et on vérifie l'absence de chlorure d'ammonium dans la solution aqueuse par le test de Nesler, puis on évapore à sec cette solution sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 30°C. On obtient un résidue gommeux qui est séché une nuit dans un dessiccateur avec de l'anhydride phosphorique.
  • Rendement: 43,19 g (80,6%).
  • CCM: acétate d'éthyle-pyridine-acide formique-eau 40-21-10-6.
  • Rf: 0,1 test de SaKaguchi positif (spot rouge).
  • Contrôle RMN.
    • 3°) Boc-Glu(OBzi)-Arg(HCI)-Gly-OH
  • On dissout 41,5 g de HCI-H-Arg-Gly-OH (0,155 mole) dans un mélange de 400 ml de DMF et de 130 ml d'eau. Le pH est ajusté à 7 par addition d'acide chlohydrique N. A cette solution, on ajoute simultanément:
    • - une solution de 68,8 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP (0,150 ml) dans un mélange de 100 ml de DMF et de 40 ml d'eau
    • - une solution de 22,7 g d'hydroxybenzothiazole (0,150 mole) dans un mélange de 100 ml de DMF et de 40 ml d'eau
    • - une solution de 37,8 ml de NEM (2x0,150 mole) dans 100 ml de DMF.
  • Le mélange réactionnel est agité à TA et la réaction est suivie en CCM (chloroforme-méthanol-acide acétique 95-5-9 et pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6).
  • Au bout de 1 h de réaction, on rajoute 13,76 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP.
  • Au bout de 2 h de réaction, on rajoute 13,76 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP.
  • Au bout de 3 h de réaction, on rajoute 7 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP et ou poursuit la réaction pendant 1 h.
  • Le mélange réactionnel est alors évaporé à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) et à température inférieure à 30°C. On obtient une huile épaisse qui est dissoute dans 500 ml d'acétate d'éthyle. Par addition de 1 litre d'éther, une huile épaisse se forme. On abandonne au repos 24 h au réfrigérateur, puis on décante la phase liquide. L'huile résiduelle est reprise dans 500 ml de méthanol. A cette solution on ajoute 500 g de silice (70-230 mesh) et on évapore le solvant au rotavapor. La poudre obtenue est mélangée avec un mélange chloroforme-méthanol 80-20 et le gel formé est introduit au sommet d'une colonne de gel de silice (hauteur 200 cm, diamètre 85 mm) montée dans le mélange chloroforme-méthanol 80-20. Le produit est élué avec:
    • - mélange de chloroforme-méthanol 80-20: 25 litres
    • - mélange de chloroforme-méthanol (50-50): 10 litres
    • - méthanol: 30 litres.
  • La purification est suivie par CCM (pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6). On recueille 2 fractions:
    • - fraction A 29,80 g.
      • CCM: pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6
      • Rf: 0,75
      • Contrôle: RMN
      • HPLC-EPP: 96,98%
      • AAA: Glu 1,01-Gly 1,01-Arg 0,98
    • - fraction B 36,82 g
      • CCM: pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6
      • Rf: 0,75
      • -1H RMN spectre conforme
      • Contrôle: HPLC-EPP: 99,61%
      • AAA: Glu 0,93-Gly 0,99-Arg 1,08.
    Exemple III: synthèse de Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH (fragment B2) 1°) Boc-Asn-Gln-OBzl
  • On dissout TFA, H-Gln-OBzI (0,445 mole) dans 500 ml de DMF. A cette solution, on ajoute successivement:
    • - 103,3 g de Boc-Asn-OH (0,445 mole)
    • - 62,3 ml de NEM
    • - 217,8 g de BOP (0,5 mole)

    puis le pH de la solution est ramené à 7 par addition de NEM. Le mélange est agité à TA, on maintient le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM (chloroforme-méthanol 3-1). Au bout de 1 h, la réaction est terminée et on fait précipiter le produit par addition de 1,5 1 d'acétate d'éthyle. On laisse 1 h sous agitation puis on abandonne une nuit au réfrigérateur. Le solide est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle (3x500 ml), à l'éther (1 litre), puis séche.
    • Rendement: 108,13 g (53,9%)
    • CCM: chloroforme-méthanol 3-1
    • Rf: 0,63.
    2°) TFA, H-Asn-Gln-OBzI
  • On dissout 102 g de Boc-Asn-Gln-OBzI (0,226 mole) dans 500 ml de TFA refroidis dans un bain de glace. On enlève le bain de glace et on poursuit l'agitation à TA pendant 15 min. On essore un léger insoluble et on poursuit l'agitation pendant 15 min. Le milieu réactionnel est concentré au 1,4 sous pression réduite (25 mm de mercure) et on reprend dans 300 ml d'éther. Cette opération est répétée 2 fois (2×300 ml d'éther) et le solvant restant éliminé sous vide 25 mm de mercure). On obtient un solide blanc hydroscopique.
    • Rendement: 107 g
    • CCM: chloroforme-méthanol 3-1
    • Rf: 0,08.
    3°) Boc-Ser-Asn-Gln-OBzl
  • On dissout 0,226 mole de TFA, H-Asn-Gln-OBzl dans 1,5 1 de DMF. A cette solution on ajoute successivement:
    • - 48,4 g de Boc-Ser-OH, 1/2 H20 (0,226 mole)
    • - 34,8 ml de NEM (0,27 mole)
    • - 111 g de BOP (0,25 mole)

    puis le pH de la solution est ramené à 7 par addition de NEM. Le mélange est agité à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. L'évolution de la réaction est suivie en CCM (chloroforme-méthanol-acide acétique 9-2-0,5). Au bout de 2 h, la réaction est terminée. On filtre un léger insoluble et le milieu réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure ou égale à 30°C. L'huile résiduelle est reprise dans 800 ml d'acétate d'éthyle. On laisse 1 h sous agitation puis on abandonne une nuit au repos au réfrigérateur. Le solide est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle (2x200 ml) puis à l'éther (200 ml) et séché sous vide.
    • Rendement: 108,32 g (89%)
    • CCM: chloroforme-méthanol-acide acétique 9-2-0,5
    • Rf: 0,42.
    4°) TFA, H-Ser-Asn-Gln-OBzl
  • On dissout 108 g de Boc-Ser-Asn-Gln-OBzl (0,2 mole) dans 520 ml de TFA refroidis dans un bain de glace. On enlève le bain de glace et on agite 30 min à TA. On filtre un léger insoluble, puis on évapore à sec sous pression réduite à température inférieure à 30°C. Le résidu est repris dans l'éther, le solide essoré, lavé plusieurs fois à l'éther et séché.
    • Rendement: 139 g
    • CCM: tétrahydrofuranne-pyridine-acide formique-eau 60-20-10-6
    • Rf: 0,81.
    5°) TFA, H-Ser-Asn-Gln-OH
  • On dissout 0,2 mole de TFA, H-Ser-Asn-Gln-OBzl dans 1 litre d'eau. On ajoute à la solution 22,4 g de Pd/C à 10% contenant 50% d'humidité. Le mélange est hydrogéné à TA et sous pression de 15 mm de mercure pendant 24 h sous agitation. On filtre le catalyseur puis on évapore à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) et à température inférieure à 30°C. Le résidu est mis à sécher une nuit dans un dessiccateur avec de l'anhydride phosphorique.
    • Rendement: 93,66 g
    • CCM: tétrahydrofuranne-pyridine-acide formique-eau 60-20-10-6
    • Rf: 0,45.
    6°) Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH
  • On dissout 0,2 mole de TFA, H-Ser-Asn-Gln-OH dans un mélange de 100 ml d'eau et de 600 ml de DMF. On amène le pH de la solution à 7 par addition de NEM et ajoute une solution de 87,11 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP (0,19 mole) dans 600 ml de DMF puis 29,5 g de HOBT (0,19 mole). Le pH du mélange est ramené à 7 par addition de NEM et on agite à TA. Au bout de 1 h d'agitation on rajoute 2,7 g de Boc-Glu(OBzi)-ONP. La réaction est suivie en CCM (tétrahydrofuranne-pyridine-acide formique-eau 60-20-10-6 et chloroforme-méthanol-acide acétique 95-5-3). Une 1/2 h après la dernière addition, on filtre un léger insoluble, puis on évapore à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 30°C. L'huile obtenue est reprise dans 800 ml d'acétate d'éthyle, un précipité légèrement gélatineux se forme. Il est essoré et lavé à l'acétate d'éthyle (2x400 ml), puis à l'éther et séché.
  • Rendement: 114,3 g (90%).
  • Ce produite doit être relavé par de l'acétate d'éthyle (1,2 1) sous agitation pendant 4 h à TA. Le solide est essoré, lavé à l'éther, séché.
    • Rendement: 95,85 g (71,9%)
    • CCM: tétrahydrofuranne-pyridine-acide formique-eau 60-20-10-6
    • Rf: 0,62
      • : n-butanol-pyridine-acide acétique-eau 50-12-12-25
    • Rf: 0,46
    • 1H RMN conforme
    • HPLC-EPP 87,81
    • AAA: Asn(asp): 1,01-Ser: 0,89-Glu(gln): 2,05
    • Point de fusion Koffler: 134°C (décomposition).
    Exemple IV: synthèse de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCI (fragment C) 1°) Z-Gln-Gly-OMe
  • Une suspension refroidie sur bain de glace de 75,36 g de HCI, H-Gly-OMe (0,6 M) dans 1 litre de DMF est additionnée de 168,2 g de Z-Gln-OH (0,6 M), de 256,41 g de BOP (0,7 M) et de 165,4 ml de N-éthylmorpholine (1,3 M). Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu repris avec de l'acétate d'éthyle, La solution organique est lavée par:
    • - une solution de bicarbonate de sodium
    • - une solution de chlorure de sodium
    • - une solution de KHS04/KZS04
    • - une solution de chlorure de sodium.
  • La solution organique est séchée sur MgS04 et filtrée. Après 20 h de repos, il y a cristallisation dans chacune des solutions. Après filtration, les fractions provenant d'une cristallisation en milieu aqueux sont regroupées et lavées dans AcOEt saturé en eau pour donner après filtration et séchage sous vide 7,78 g de produit (F. 158-159°C). La fraction provenant de la cristallisation dans AcOEt est lavée dans AcOEt saturé en eau pour donner, après filtration et séchage sous vide 61,8 g de produit (F. 150-154°C). La phase aqueuse et la phase organique donnent une cristallisation supplémentaire. Ces deux derniers produits sont regroupés et lavés comme précédemment pour fournir 38,05 g supplémentaires de qualité comparable.
    • Rendement global: 107,63 g
    • Contrôles RMN et CCM.
    2°) HCI, H-Gln-Gly-OMe
  • Une solution de 61,8 g de Z-Gln-Gly-OMe (175,9 mM) dans 704 ml de DMF, 880 ml de méthanol est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 176 ml d'une solution d'HCI N, puis de 3,1 g de Pd/C à 10%. Après 3 h 30 d'hydrogénation sous surpression de 35 cm de mercure, le catalyseur est filtré sur célite et la solution est concentrée sous pression réduite. Le résidue est utilisé directement dans l'étape suivante.
    • 3°) Boc-Gln-Gln-Gly-OMe
  • Une solution du résidu obtenu à l'étape précédente (théoriquement 175,9 mM) dans 500 ml de DMF, refroidie sur bain de glace est additionnée de 77,6 g de Boc-Gln-ONp (211,1 mM), 26,4 g d'hydroxybenzotiazole (211,1 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est prise en masse. Par addition d'acétate d'éthyle, on obtient un précipité qui est essoré, lavé à AcOEt et séché sous vide. On obtient 64,27 g de produit, soit un rendement de 82%.
  • Contrôles RMN et CCM.
    • 4°) TFA, H-Gln-Gln-Gly-OMe
  • Une suspension refroidie sur bain de glace de 98,83 g de Boc-Gln-Gln-Gly-OMe (221,8 mM) dans 300 ml de dichlorométhane est additionnée de 400 ml de TFA. Après 30 min de réaction sur bain de glace et 1 h à TA, la solution est concentrée sous pression réduite jusqu'à la moitié de son volume initial et le résidu est versé sur de l'éther en agitation. Après filtration, lavage et séchage sous vide, on obtient 119 g de produit.
    • 5°) Boc-Arg(N02)-Gln-Gln-Gly-OMe
  • Une solution des 119 g du produit précédent dans 1190 ml de DMF refroidie sur bain de glace est additionnée de 77,91 g de Boc-Arg(N02)-OH (244 mM), de 97,51 g de BOP (266,2 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtention de pH 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est versée sur 8 1 d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé à AcOEt, puis séché sous vide.
  • On obtient 153,7 g de produit.
  • Contrôles RMN et CCM.
    • 6°) TFA, H-Arg(NO,)-Gln-Gln-Gly-OMe
  • Une suspension refroidie sur bain de glace de 153,7 g de Boc-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe (théoriquement 221,8 mM) dans 600 ml de dichlorométhane est additionnée de 750 ml de TFA. Après 1 h à TA, on ajoute encore 250 ml de TFA et, 30 min plus tard, 250 ml de TFA. Après 1 h supplémentaire de réaction, on concentre la solution jusqu'au tiers du volume initial et verse le résidu sur 3 1 d'éther en agitation. Le précipité formé est essoré, lavé à l'éther et séché sous vide. On obtient 167 g de produit.
    • 7°) Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe
  • Une solution refroidie sur bain de glace de 167 g de TFA, H-Arg(N02)-Gln-Gln-Gly-OMe (théoriquement 221,8 mM) dans 1,5 I de DMF est additionnée de 97,52 g de Boc-Ser-ONb (266,2 mM), 33,31 g d'hydroxybenzotriazole (266,2 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 3 h de réaction à TA, on évapore une partie du DMF et l'on verse la solution résiduelle sur de l'acétate d'éthyle sous agitation. Le précipité est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle et séché sous vide.
  • On obtient 153,3 g de produit, soit un rendement de 94,2% sur 4 étapes.
  • Contrôles RMN et CCM.
    • 8°) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OMe, AcOH
  • Une solution de 153,3 g de Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe (208,9 mM) dans 1 litre de méthanol, 1 litre d'eau et 500 ml d'acide acétique est hydrogénée pendant 20 h en présence de 10 g de Pd/C à 10%. Après filtration du catalyseur et concentration de la solution, le résidu repris à l'eau est lyophilisé.
  • On obtient 153 g de produit, soit 97,8% de rendement.
    • 9°) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCI
  • Une solution de 104,4 g de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OMe (139,4 mM) dans 2 de DMF est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 1 litre d'eau, puis de 27,88 g de NaOH (697 mM) dans 50 ml d'eau. Après 15 min de réaction à température voisine de 15°C, on neutralise par une solution d'acide chlorhydrique N jusqu'à obtenir un Ph de 6,5. Après évaporation, on triture le résidu dans le l'acétate d'éthyle, Le précipité formé est essoré, lavé à AcOEt et sèche sous vide, puis à l'air.
  • On obtient 132,7 g de produit.
  • Purification: 109 g de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCI sont purifiés par distribution à contre-courant dans le mélange n-butanol-méthanol-eau (4-1-5).
  • Après 700 transferts, on fractionne en trois parties qui, après évaporation et lyophilisation, donnent:
    • - une fraction de 27,5 g et
    • - deux fractions à repurifier de 23,79 g et 16,90 g
  • Contrôles RMN et CCM
    Figure imgb0033
    • Exemple V: Synthèse de Boc-Asp (OBzl)-lIe-Met-NH-NH2 (fragment D) 1°) Boc-Met-NH-NH-Troc
  • 4,31 g (10 mM) de Boc-Met-OH, DCHa en solution dans 50 ml acétate d'éthyle sont traités en présence de 20 ml d'eau par une solution saturée de bisulfate de potassium jusqu'à pH=3; la phase aqueuse est extraite plusieurs fois à l'acétate d'éthyle et les extraits séchés sur sulfate de magnésium. A cette solution, on ajoute 2,28 g (11 mM) de H2N-NH-Troc (Troc=trichloro-2,2,2, éthoxycarbonyle, ce réactif étant préparé selon YAJIMA, Chem. Pharm. Bull. 1971, 19, 420).
  • Après refroidissement au bain de glace, on ajoute 2,37 g (11 mM) de DCC à 97% en solution dans 10 ml d'acétate d'éthyle. Après une nuit pendant laquelle le produit revient progressivement à TA, la dicyclohexylurée est filtrée et séchée (2,04 g) et la solution organique est lavée successivement par les solutions aqueuses suivantes: sulfate-bisulfate 5% 2 fois CINa 2 M 2xbicarbonate de sodium 5%, 2 fois CINa M 2 fois et enfin à l'eau 2 fois. Après séchage sur sulfate de magnésium et concentration du solvant presque à sec, on ajoute de l'hexane jusqu'à début de trouble et garde à +4° une nuit après quoi le précipité forme est filtre, lavé par un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle 4/1 et séché sou svide, on obtient ainsi 3,46 g (79%) Fc=92-4° alpha D 25°=-32°-C=1, dioxane.
    • CCM dans chloroforme-méthanol-AcOH 95/5/3-Rf=0,45
    2°) TFA, H-Met-NH-NH-Troc
  • 43,9 g (0,1 M) de Boc-Met-NH-NH-Troc en solution dans 200 ml de dichlorométhane et 20 ml d'éthanedithiol sont traités au bain de glace sous azote et avec agitation par 200 ml d'acide trifiuoroacétique,on ôte le bain froid et laisse sous agitation pendant une heure. Le produit est isolé par élimination des réactifs volatils d'abord sous 20 mm puis 0,1 mm de pression, l'huile résiduelle est reprise 2 fois par 75 ml d'isopropanol en évaporant sous vide puis lavée 2 fois par 75 ml d'hexane par décantation après quoi elle est séchée sous vide en présence de potasse une nuit, après quoi elle commence à se solidifier et est utilisée telle quelle dans l'opération suivante.
    • 3°) Boc-lle-Met-NH-NH-Troc
  • L'huile ci-dessus (environ 0,1 M) de TFA, H-Met-NH-NH-Troc en solution dans 6500 ml d'acétate d'éthyle et refroidie au bain de glace est traitée par 12,7 ml (0,1 M) de N-éthylmorpholine puis 14,85 g (0,1 M) d'HOBt, 1 h 20 puis par 34,35 g (0,08 M) de Boc-lie-OSu suivis de 12,7 ml (0,1 M) de N-éthylmorpholine (NEM). Après 1/2 h, le bain froid est ôté et par la suite de la NEM est ajoutée périodiquement de manière à maintenir le pH apparent vers 7.
  • Après 20 h, la réaction est complète et l'isolement se fait par lavages successifs par les solutions aqueuses suivantes: sulfate-bisulfate de potassium 5% 3 fois, de l'eau 3 fois, du bicarbonate de sodium 5% 3 fois et enfin, à l'eau jusqu'à neutralité.
  • Après séchage sur sulfate de magnésium et évaporation du solvant sous vide, on obtient 64 g de gomme qui est chromatographiée sur une colonne de silice avec du dichlorométhane contenant de 0 à 1,5% de méthanol. On obtient ainsi 30 g (68%) de produit ayant une pureté HPLC de 98,9% et un spectre RMN en accord avec la structure attendue. Fc: 88-92°.
    • 4°) TFA, H-Ile-Met-NH-NH-Troc
  • 27,6 g (50 mM) de Boc-lle-Met-NH-NH-Troc en solution dans 140 ml de dichlorométhane et 14 ml d'éthanedithiol sont refroidis au-bain de glace et agités sous azote puis on leur ajoute en 5-6 min, 140 ml d'acide trifluoroacétique. Le bain froid est ôté et, après 45 min, le produit est isolé par évaporation au maximum des réactifs, reprise de l'huile résiduelle par 2x60 ml d'isopropanol suivie d'évaporation et enfin par 2 lavages par 60 ml de pentane. Après séchage une nuit sur potasse sous vide, on obtient une huile d'aspect vitreux qui est utilisée dans l'opération suivante (30 g).
    • 5°) Boc-Asp(OBzI)-Ile-Met-NH-NH-Troc
  • Les 30 g d'huile précédente en solution dans 250 ml de THF sont traités par 6,4 ml (50 mM) de NEM et 18,9 (45 mM) de Boc-Asp (OBzI)O Su. Le pH apparent est ajusté entre 6 et 7 par additions successives de NEM. Après 4 h, le produit est isolé par évaporation du THF, reprise dans 400 ml d'acétate d'éthyle, suivie des mêmes lavages que l'homologue précédent (3). Le résidu, après séchage et évaporation (36,5 g), est purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec du dichlorométhane comme solvant contenant de 0 à 1,5% de méthanol. On obtient ainsi 25 g (66%) de produit présentant un spectre RMN conforme à la structure attendue. Fc=96-1000.
    • 6°) Boc-Asp(OBzI)-IIe-Met-NH-NH2
  • 7,57 g (10 mM) de Boc-Asp(OBzI)-Ile-Met-NH-NH-Troc en solution dans 80 ml du mélange DMF-AcOH 80/20 sont traités à TA par 6,54 g de zinc en poudre fine sous agitation pendant 30 min. Le produit est isolé par filtration du zinc, traitement du filtrat par 800 g de glace, puis filtration après fusion de la glace suivie de lavages à l'eau répétés. Le solide blanc est d'abord séché à l'air puis sous vide poussé en présence de potasse et d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 5,60 g (96%) de produit à environ 95% de pureté d'après la CCM et la RMN. Fc=180-185°.-Contrôles CCM et HPLC-
    • Exemple VI: Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH (fragment E,) 1°) Boc-Leu-Leu-OMe
  • Dans 500 ml de dioxane contenant 18,4 g de NEM (0,16 M), on ajoute successivement 9,05 g de H-Leu-OMe, HCI (0,05 M), 7,4 g de HOBt (0,055 M) et 18 g de Boc-Leu-ONSu (0,055 M). Agiter à TA durant 18 h et ajuster le pH à 6-7 par NEM, au papier pH, si nécessaire en cours de la réaction. Evaporer le solvant, dissoudre le résidu dans AcOEt et laver la solution organique successivement 2 fois par KHSO4 K4SO4 5%, CINa/eau, NaHC03 5%, CINa/eau. Sécher sur MgS04 et évaporer le solvant. Dissoudre le résidue dans le minimum d'éther et précipiter le produit par le pentane. Essorer. Sécher.
    • Rendement: 15 g (83%)
    • CCM chloroforme-méthanol-acide acétique 95-5-3
    • AcOET-hexane 25/75 -Fc: 131-136.
  • Possibilité de purification sur gel de silice 60 Merck (70-230 mesh) dans le chloroforme, avec élution par le même solvant.
    • 2°) H-Leu-Leu-OMe, TFA
  • 27,5 g de Boc-Leu-Leu-OMe (0,076 M) sont recouverts de 180 ml de TFA à TA: un léger échauffement se produit. Après 30 min, évaporer le solvant, reprendre l'huile résiduelle dans l'éther et gratter: un précipité blanc se forme; ajouter de pentane, essorer, sécher.
    • Rendement: 28,2 g (100%)
    • CCM: chloroforme-méthanol-acide acétique 95/5/3
      • chloroforme-méthanol-acide acétique 80/15/3.
    3°) Boc-Lys(Z)-Leu-Leu-OMe
  • Dans 600 ml AcOEt refroidis au bain de glace, on ajoute successivement:
    • - 28,2 g de H-Leu-Leu-OMe, TFA (0,076 M)
    • - 26,22 g de NEM (0,0228 M)
    • - 11,23 g HOBt (0,083 M)
    • - 46,4 g de Boc-Lys(Z)OTcp (0,083 M).
  • Agiter, puis retirer le bain froid. Ajuster le pH à 6-7 par NEM si nécessaire. Après 18 h, laver la solution organique successivement par KHS04-MgS04 5%, CINa/eau, NaH CO3, 5%, CINa/eau. Sécher sur MgS04. Evaporer le solvant. Dissoudre l'huile résiduelle dans le chloroforme et déposer en tête d'une colonne (L: 90 cm-diamètre 5 cm) de gel de silice 60 Merck (70-230 mesh) dans le chloroforme. Eluer avec du chloroforme, fractionner. Evaporer les fractions contenant le produit pur; redissoudre dans l'éther la mousse obtenue et évaporer à sec. Triturer le résidu dans le pentane, essorer et sécher.
    • Rendement: 42,2 g (91%)
    • CCM AcOEt/hexane 1/1
      • chloroforme-MeOH-AcOH 95/5/3
    • Contrôle RMN-HPLC-EPP: 98,7%.
    4°) Boc-Arg-Lys(Z)Leu-Leu-OMe
  • 15,5 g de Boc-Lys(Z)Leu-Leu-OMe (0,025 M) sont recouverts de 100 ml de TFA à TA. Après 30 min avec agitation occasionnelle, évaporer le solvant à fond. Dissoudre l'huile résiduelle dans 150 ml de dioxane et amener à pH 6-7 par DIPEA, au papier pH. Refroidir au bain de glace et ajouter 7,21 g de Boc-Arg-OH, H2O, HCI (0,025 M), 13,44 g de BOP (0,03 M) et 10,32 g de DIPEA (0,08 M). Agiter, puis retirer le bain froid et ajuster le pH à 6-7 par DIPEA si nécessaire. Après 18 h, évaporer le dioxane, dissoudre l'huile résiduelle dans AcOEt et laver successivement par NaHC03 5%, CINa/eau. Sécher sur MgS04. Evaporer le solvant et dissoudre l'huile dans MeOH-chloroforme 5-95, saturé d'eau, puis déposer en tête d'une colonne (L: 85 cm-diamètre: 4 cm) de gel de silice 60 Merck (70-230 mesh) dans le même mélange. Eluer avec:
    • - 1,5 1 de MeOH-chloroforme 5-95 saturé d'eau
    • - 1 I de MeOH-chloroforme 7,5-92,5 saturé d'eau
    • - 2,5 1 de MeOH-chloroforme.
  • Fractionner et évaporer les fractions pures. Reprendre dans l'éther, évaporer et tirer à fond sous vide.
    • Rendement: 16,8 g (87%)
    • CCM chloroforme-MeOH-AcOH 95/5/3
      • chloroforme-MeOH-AcOH 80/15/5
    • Contrôle RMN-HPLC-EPP 91,8%.
    5°) Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH
  • 13,98 g de Boc-Arg-Lys(Z)Leu-Leu-OMe (0,018 M sont solubilisés dans 250 ml de MeOH; ajouter 40 ml d'eau, puis à TA 5,67 g de baryte (0,018 M), finement pulvérisée. Agiter 2h30 à TA. On contrôle la fin de la réaction par CCM. Faire barboter CO2 jusqu'à pH 6, filtrer. Evaporer le filtrat, le résidu est solubilisé dans l'alcool isopropylique et filtré. Concentrer l'alcool et précipiter le produit par l'éther.
    • Rendement: 12,31 g (98%)
    • CCM chloroforme-MeOH-AcOH 90/15/5
      • 2-butanol-AcOH-eau 72/7/21
    • Contrôle RMN-HPLC-EPP 95,88.
    Exemple VII: Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe (fragment Fi) 1°) Boc-Ser-Ala-OMe
  • Dissoudre 25 g de H-Ala-OMe, HCI et 66 g de Boc-Ser-ONb dans 500 ml de DMF. Refroidir au bain de glace et ajouter sous agitation magnétique 25 ml de NEM, 24 g de N-hydroxybenzotriazole et maintenir le pH à 6,5 ou 7 par addition de NEM. Agiter 18 h à TA. Après contrôle CCM, évaporer le milieu à 90% (0,1 mm Hg-35°C). L'huile obtenue est dissoute dans 1 500 ml de chloroforme. Laver avec une solution de chlorure de sodium saturée (2 fois), solution sulfate/bisulfate de potassium 5% 3 fois, bicarbonate de sodium saturée 5 fois. La solution est séchée sur Na2SO4 et évaporée à sec. On obtient une huile qui est séchée à poids constant (30°-0,1 mm/Hg).
  • Rendement: 53,78 g-Contrôle CCM-.
    • 2°) H-Ser-Ala-OMe, TFA
  • Dissoudre 52,8 g de Boc-Ser-Ala-OMe dans 100 ml de chlorure de méthylène sous agitation magnétique en refroidissant au bain de glace. Ajouter 250 ml de TFA refroidi et agiter 20 min à TA. Filtrer. Evaporer le filtrat à sec (35° trompe à eau). Par addition de 2 1 d'éther, un solide blanc précipite. Il est essoré, lavé à l'éther 3 fois. Sécher à poids constant (30°―0,1 mm Hg).
  • Rendement: 40,82 g.
    • 3°) Boc-Leu-Ser-Ala-OMe
  • Dissoudre 40 g de H-Ser-Ala-OMe, TFA et 32,9 g de Boc-Leu-OH, H2O dans 400 ml de DMF. Refroidir au bain de glace sous agitation magnétique et ajouter 14,4 ml de NEM puis 65,8 g de BOP et assez de NEM pour maintenir le pH à 6,5-7. Agiter 2h à TA. Après contrôle CCM, évaporer à sec (0,1 mm-35°) et dissoudre l'huile obtenue dans 1 500 ml de chloroforme. Laver 2 fois avec une solution NaCI saturée, 3 fois avec sulfate/bisulfate de potassium 5%, 3 fois au bicarbonate de sodium saturé. Sécher/Na2S04. Evaporer à sec (30°-trompe à eau). L'huile obtenue est solidifiée dans l'éther: Fraction A=29 g. Un deuxième jet B est obtenu par addition d'hexane, identique en CCM: B=13,7 g.
  • Rendement: 42,7 g-Contrôles RMN et CCM.
    • 4°) H-Leu-Ser-Ala-OMe, TFA
  • Mettre en suspension 29 g de Boc-Leu-Ser-Ala-OMe dans 50 ml de chlorure de méthylène sous agitation magnétique en refroidissant au bain de glace. Ajouter 100 ml de TFA refroidi et, après dissolution, agiter 30 min à TA. Filtrer. Evaporer le filtrat à sec (35°-trompe à eau). L'huile obtenue est solidifiée dans l'éther (changer le solvant plusieurs fois). Sécher à poids constant (30°-0,1 mm Hg).
  • Rendement: 30,2 g.
    • 5°) Boc-Gin-Leu-Ser-Ala-OMe
  • Dissoudre sous agitation magnétique 30 g de H-Leu-Ser-Ala-OMe, TFA et 25,5 g de Boc-Gln-ONp dans 300 ml de DMF. Neutraliser par 9,7 ml de NEM. Ajouter 10 g d'OHBt et agiter 2 h à TA en maintenant le pH à 6,5-7 par addition de NEM. Après contrôle CCM, le milieu est concentré à 90% (0,1 mm Hg-35°), repris dans 1 000 ml de chloroforme: un produit précipité en gel. Essorer, Laver en reprenant dans 500 ml de chloroforme 2 fois, puis dans l'éther 3 fois. Sécher à poids constant (0,1 mm Hg-30°).
  • Rendement: 32,1 g.
  • CCM: chloroforme/MeOH/AcOH: 9/2/0,5―Rf=0,81―HPLC―EPP=91%.
  • AAA: Ser: 0,86-Glu: 1,02-Ala: 0,99-Leu: 0,99-.
    • Exemple VIII: Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HCI (fragment Gi) 1°) Z-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 0,22 mole de Z-Leu-OH dans 500 ml de DMF. A cette solution, on ajoute successivement:
    • - 25,11 g de HCI-H-Gly-OCH3 (0,2 mole)
    • - 28 ml de NEM
    • - 96 g de Bop (0,22 mole)

    puis on ajuste le pH à 7 par addition de NEM.
  • On agite le mélange réactionnel à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM (chloroforme-methanol-acide acétique 95/5/9). Au bout de 2 h, la réaction est terminée. Le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (0,2 mm de mercure) et à température inférieure à 30°C. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle (1 litre). La solution est lavée successivement avec:
    • - solution aqueuse de bicarbonate (4x200 ml)
    • - solution aqueuse de SO4HK-SO4K2 (4x200 ml)
    • - solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (2x200 ml)

    puis, elle est séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu est repris dans de l'éther (500 ml), titure, éssoré, séché.
  • Rendement: 56,7 g (84,28%).
  • CCM chloroforme-méthanol-acide acétique 95/5/3-Rf: 0,44-.
    • 2°) HCI-H-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 56 g (0,166 mole) de Z-Leu-Gly-OCH3 dans 900 ml de méthanol chlorhydrique 0,23 N. A cette solution, on ajoute 6 g de Pd/C à 10% contenant 50% d'humidité. On hydrogène pendant 24 h, à TA et sous pression atmosphérique. On filtre le catalyseur et la solution est évaporée à sec sous pression résuite à température inférieure à 30°C. On reprend le résidue par de l'éther (2x50 ml), on décante et on sèche le produit au dessiccateur en présence d'anhydride phosphorique. On obtient une poudre blanche.
  • Rendement: 33,53 g (84,4%).
  • CCM chloroforme-méthanol-acide acétique 90/20/9-Rf: 0,15.
  • Contrôle RMN.
    • 3°) Boc-Val-Leu-Gly-OCH3
  • 28,24 g de Boc-Val-OH (0,13 mole) sont dissous dans 400 ml de tétrahydrofuranne refroidi à -10°C. On ajoute ensuite 14,45 ml (0,13 mole) de chloroformiate d'isobutyle. Le mélange est vigoureusement agité à -10°C pendant 15 min. A ce mélange, on ajoute une solution tétrahydrofurannique refroidie à -10°C contenant 31,5 g du chlorhydrate de H-Leu-Gly-OCH3 (0,13 mole) préalablement neutralisé par 14,45 ml de N-méthylmorpholine. On poursuit l'agitation en refroidissant le mélange réactionnel dans un bain de glace (2 h) puis à TA pendant 2 h. Le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite température inférieure à 30°C. Le résidu est repris dans un mélange acétate d'éthyle-eau (500 ml-500 ml). La phase aqueuse est décantée et la phase organique lavée successivement avec:
    • - une solution aqueuse de bicarbonate de soude (2x50 ml)
    • - une solution aqueuse de SO4HK-SO4K2 (pH 2) (2x50 ml)
    • - une solution aqueuse de chlorure de sodium (50 ml),

    puis séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec sous pression réduite à température inférieure à 30°C. Le résidu est repris avec le péntane (50 ml), essoré et séché sous vide (0,1 mm de mercure).
  • Rendement: 39,7 g (76%).
  • CCM chloroforme-acétone 75/25-Rf: 0,46.
  • Contrôle RMN.
    • 4°) TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 39 g de Boc-Val-Leu-Gly-OCH3 (0,097 mole) dans 190 ml de TFA refroidi dans un bain de glace. Après dissolution, on enlève le bain de glace et on agite le mélange pendant 30 min à TA. On évapore à sec sous pression réduite et le résidu est repris dans l'éther (100 ml), trituré et l'éther décante. Cette opération est répétée 2 fois et les dernières traces de solvants sont éliminées sous pression réduite (0,1 mm de mercure).
  • Rendement: 44,8 g.
  • CCM chloroforme-méthanol-acide acétique 90/20/3-Rf: 0,36.
    • 5°) Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 25,55 g de TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3 (0,0615 mole) dans 200 ml de DMF. La solution est amenée à pH 7 par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 32,47 g de Boc-Lys(Z)-OTCP (0,058 mole) et 9 g de HOBT (0,059 mole). Le pH du mélange réactionnel est ramené à 7 part addition de NEM. On agite à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM: chloroforme-méthanol 90/10; chloroforme-méthanol-acide acétique (90/20/3 (2 milieux).
  • Au bout de 1 heure, on rajoute, 1,96 g de Boc-Lys(Z) OTCP (0,0035 mole) et 0,61 g de HOBT. Le pH de la solution est ramené à 7 par addition de NEM.
  • 2 h après, la réaction est terminée en CCM. Le mélange réactionnel est alors évaporé à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 30°C. Le résidu est repris avec 500 ml d'eau, trituré. Le solide formé est essoré puis lavé avec:
    • - 500 ml de solution aqueuse de KHS04 KzS04 (pH 2)
    • - 500 ml d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de soude
    • - 200 ml d'eau

    puis à l'éther (200 mlx2) et séché.
  • Le produit impur est chromatographié sur une colonne de gel de silice (5 cmx150 cm). Il est élué avec le mélange chloroforme-acétate d'éthyle 80/20 (débit 600 ml/h). Les bonnes fractions déterminées en CCM sont réunies, évaporées à sec sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'éther, trituré et le solide obtenu essoré.
  • Poudre blanche 35,14 g (86%).
  • CCM chloroforme-méthanol 90/10-Rf: 0,62.
  • Chloroforme-méthanol-acide acétique 87, 7-9,4-2,8Rf: 0,52.
  • Contrôle RMN.
  • AAA: AC Gly 1,00-Val 0,96-Leu 1,06-Lys 0,98.
    • 6°) TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 15 g de Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (22,6 mM) dans un mélange de TFA-chlorure de methylène (75 ml/75 ml). On agite 40 min à TA, puis on évapore à sec sous pression réduite à température inférieure à 30°C. Le résidu est repris par de l'éther contenant 20% d'hexane (100 ml). Le solide formé est essoré et séché. On obtient un solide blanc de 14,51 g.
  • Rendement: 94,7%.
  • CCM chloroforme/méthanol/acide acétique 95/5/3-Rf: 0,12.
    • 7°) Boc-Arg(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 14,1 g de TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (21 mM) dans 50 ml de DMF. La solution est amenée à pH par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 6,57 g de Boc-Arg (HCI)-OH . 1 H20 (20 mM) et 10,6 g de BOP (24 mM). Le pH du mélange réactionnel est ramené à 6-7 par addition de NEM. On agite à TA en maintenant le pH à 6-7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM: chloroforme/méthanol (80/20).
  • Au bout de 5 h, la réaction est terminée. On évapore à sec le mélange réactionnel sous pression réduite (0,1 mm de mercure) et à température inférieure à 30°C. L'huile obtenue est reprise dans 300 ml d'acétate d'éthyle. Le solide formé est essoré et lévé à l'éther (ler jet). On rajoute de l'éther au filtrat précédent; un solide précipite qui est essoré (2ème jet): les 2 jets sont indentiques en CCM. Ils sont lavés à l'état solide par agitation pendant 1 h avec un mélange de 200 ml d'eau saturée en acétate d'éthyle et 60 ml d'eau. Le solide est essoré puis lavé avec 60 ml d'eau et 300 ml d'éther et séché.
  • Rendement: 78,7% (13,49 g).
  • CCM chloroforme/méthanol 20/20-Rf=0,32.
  • Contrôle RMN.
    • 8°) TFA H-Arg(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
  • 13,3 g de Boc-Arg(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (15,5 mM) sont dissous dans un mélange TFA-chlorure de méthylène (60 ml/60 ml). On agite 40 min à TA, puis on évapore à sec sous pression réduite à température inférieure à 30°C. Le residu est repris par un mélange éther-hexane (80/20:100 ml). Le solide formé est essoré, lavé à l'hexane et séché (poids: 15,13 g).
  • CCM: chloroforme/méthanol (3/1)­Rf: 0,35.
    • 9°) Boc-Tyr-Arg(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3
  • On dissout 15,5 mM de TFA H-Arg(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 dans 50 ml de DMF. La solution est amenée à pH 6 par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 8,20 g de Boc-Tyr-OTCP (15,5x10 mM) et 2,41 g de HOBT (15,5x10 mM). On ramène le pH à 6 par addition de NEM. Le mélange réactionnel est agité à TA en maintenant le pH à 6 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM: chloroforme/méthanol (3/1). Au bout de 3 h, la réaction est terminée. On évapore à sec le mélange réactionnel sous pression réduite (0,1 mm de mercure) et à température inférieure à 30°C. L'huile résiduelle est reprise dans de l'acétate d'éthyle (300 ml). Le solide gélatineux formé est essoré, lavé avec de l'acétate d'éthyle (100 ml), avec de l'acétate d'éthyle-éther (1/1; 100 ml), puis à l'éther (100 ml), enfine à l'hexane (100 ml). Le produit est séché sous pression réduite jusqu'à poids constant.
  • Rendement: 96% (15,14 g).
  • CCM chloroforme/méthanol (3/1)-Rf: 0,47.
  • Contrôle RMN.
  • AA: AC: Gly: 0,95-Val: 0,98-Leu: 1,02-Lys, 1,01.
  • Arg: 1,01-Tyr: 1,05.
  • HPLC: 93,81% EPP.
    • 10°) Boc-Tyr-Arg(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH
  • 7 g de Boc-Tyr-Art(HCI)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (6,86 mM) sont dissous dans un mélange de 70 ml de dioxane et 35 ml d'eau. On ajoute à cette solution 6,4 ml de soude 4N (25,6 mM): 3,7 équivalents) et on agite pendant 30 min à TA. On dilue avec 200 ml d'eau et 800 ml d'acétate d'éthyle. Le mélange est alors acidifié à pH 3 par addition de HCI (N). On décante l'acétate d'éthyle et on essore le solide (ler jet). L'acétate d'éthyle est évaporé à sec: on obtient un 2ème jet. Les 2 jets identiques en CCM sont réunis, lavés à l'éther et séchés.
  • Rendement: 74,7% (5,16 g).
  • CCM: chloroforme/méthanol (2/1)-Rf: 0,45.
  • 1H Contrôle RMN.
  • AAA: Ac: Gly: 1,00-Val: 0,97-Leu: 1,04-Tyr: 0,95.
  • Lys: 0,99-Arg: 1,05.
  • HPLC-EPP 91,52%.
    • Exemple IX: Boc-lie-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 (fragment H1) 1°) Boc-Asn-Ser-OMe
  • Une solution de 23,32 g de Boc-Asn-OH (0,1 M) et 19,7 g de NbOH (0,11 M) dans 250 ml de DMF, refroidie sur bain de glace est additionnée de 22,69 g de DCC. Après 3 h de réaction à TA, on filtre la DCU, on refroidit sur bain de glace et ajoute 15,56 g de HCI, H-Ser-OMe (chlorhydrate de H-Ser-OMe). Le pH est amené, puis maintenu à 7 par addition de NEM. Après 4 h TA et 20 h à +4°, la solution est concentrée sous pression réduite. La résidu est repris par le mélange AcOEt/n-butanol (50/50). La solution organique est lavée successivement par:
    • - une solution saturée de bicarbonate de sodium
    • - une solution saturée de chlorure de sodium
    • - une solution de KHSOQ/KZS04 à 5%
    • - une solution saturée de chlorure de sodium.
  • Après séchage sur MgS04 et évaporation sous pression réduite, le résidu est cristallisé dans le mélange éther-hexane. Filtration, lavage à éther/hexane et séchage sous vide donnent 26,9 g de produit.
  • Rendement: 80,8%.
  • Contrôles RMN et CCM.
    • 2°) TFA, H-Asn-Ser-OMe
  • Une solution refroidie sur bain de glace de 13,5 g de Boc-Asn-Ser-OMe (40,5 mM) dans 54 ml de dichlorométhane est additionnée de 81 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite, le résidu est repris à l'éther. On obtient une huile épaisse qui est utilisée dans la réaction suivante.
    • 3°) Boc-Thr-Asn-Ser-OMe
  • Une solution refroidie sur bain de glace du produit brut précédemment obtenu dans 300 ml de DMF est additionnée de 14,09 g de Boc-Thr-ONSu (44,55 mM) 5,58 g d'HOBt (41,3 mM) et de NEM jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu est repris dans le mélange AcOEt/n butanol. La solution organique est lavée successivement par:
    • - une solution saturée de bicarbonate de sodium
    • - une solution saturée de chlorure de sodium
    • - une solution de KHS04/K2S04 à 5%
    • - une solution saturée de chlorure de sodium.
  • Après séchage sur MgS04, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu cristallisé dans le mélange éther/hexane. On obtient 8,28 g de produit.
  • Rendement: 47%.
  • Contrôles RMN et CCM.
    • 4°) TFA, H-Thr-Asn-Ser-OMe
  • Une solution refroidie sur bain de glace 8 g de Boc-Thr-Asn-Ser-OMe dans 32 ml de dichlorométhane est additionnée de 54 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu précipité à l'éther. Après filtration, il est utilisé tel quel dans la réaction suivante.
    • 5°) Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe
  • Une solution du précipité obtenu a l'étape précédente dans 100 ml de DMF est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 7,82 g de Boc-Phe-ONp (20,24 mM), 2,53 g d'HOBt (18,71 mM) et de la N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 4 h, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu est repris dans AcOEt. La solution organique est lavée par:
    • - une solution saturée de bicarbonate de sodium
    • - une solution saturée de chlorure de sodium
    • - une solution de KHSO4/K2SO4 à 5%
    • - une solution saturée de chlorure de sodium.
  • Après séchage sur MgS04, concentration de la phase organique le résidu est cristallisé dans l'éther. On obtient 10 g de produit.
  • Rendement: 93,5%.
  • Contrôles CCM et RMN.
    • 6°) TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe
  • Une solution de 10 g de Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe (17,19 mM) dans 40 ml de dichlorométhane est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 60 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, le produit est précipité à l'éther. La gomme obtenue après séchage s'organise pour donner 5,14 g de produit.
  • Rendement: 48,5%.
    • 7°) Boc-ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe
  • Une solution refroidie sur bain de glace de 5,14 g de TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe (8,78 mM) dans 100 ml de DMF est additionnée de 3,17 g de Boc-ile-OSu (9,66 mM), 1,30 g d'HOBt (9,62 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu repris à l'éther donne un précipité qui est filtré et séché sous vide. On obtient 5,24 g de produit.
  • Rendement: 85,9%.
  • Contrôles RMN et HPLC.
    • 8°) Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2
  • Une solution de 5 g de Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe (7,2 mM) dans 40 ml de DMF et 200 ml de méthanol refroidie sur bain de glace est additionnée de 3,6 ml d'une solution à 80% d'hydrate d'hydrazine. Après 21 h de réaction à TA, on ajoute 0,9 ml de la même solution d'hydrate d'hydrazine. Après 3 h supplémentaires, le gel obtenu est filtré, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient 3,94 g de produit.
  • Rendement: 78,8%.
  • Contrôles RMN et CCM.
    • Exemple X: Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (fragment I) 1°) Boc-Asp(OBzl)-Ala-OBut
  • 3,62 g (0,02 mole) de chlorhydrate d'alaninate de tertiobutyle sont mis en suspension dans 30 ml d'acétonitrile. 2,52 ml de NEM sont ajoutés puis 8,4 g (0,02 mole) de Boc-Asp(OBzl) ONSU. Le pH est maintenu à 6-6,5 par addition de NEM. L'agitation est poursuivie 18 h. Après contrôle CCM le milieu est évapore à sec, l'huile est reprise dans 50 ml AcOET, la solution lavée 2 fois par une solution KHS04/KpS04, puis à l'eau salée, séchée sur Na2S04 et évaporée à sec. L'huile obtenue est dissoute dans l'hexane, un peu de solide est filtré et le filtrat est évaporé à sec. L'huile obtenue est utilisée telle quelle.
  • CCM: CHCI3/Acétone/ACOH 80/15/5-Rf=0,8.
    • 2°) Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
  • L'huile brute obtenue précédemment est dissoute dans 50 ml TFA glacé et agitée 1h30 à TA. Le TFA est évaporé au maximum et l'huile résiduelle est reprise 3 fois dans l'éther anhydre et décantée. Elle est ensuite séchée au dessiccateur sous vide en présence de pentane. Il se forme une mousse solide qui est écrassée et remise à sécher.
  • On obtient 9,4 g de produit brut utilisé tel quel pour le couplage.
  • Le sel de TFA ci-dessus est dissous dans un mélange de 20 ml DMF et 18 ml d'eau distillée. Le NEM est ajoutée jusqu'à pH 7 (utilisation du pH métre). 4 g (0,014 mole) de Boc-Ala-ONSu en solution dans 16 ml de DMF sont introduits. Le pH est maintenu à 6,5-7 par addition de NEM. Après 5h30, la réaction est terminée (contrôle CCM). Le solvant est évaporé au maximum et le résidu est repris dans un mélange d'eau et d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution de NaHCO3, à l'eau salée, séchée sur NA2SO4 et évaporée à sec. Le résidu est dissous dans l'éther et précipité par l'hexane pour donner une gomme qui cristallise après triturage. Le solide est essoré et séché à l'air.
  • Rendement: 5,05 g.
  • CCM CHCI3-acétone-ACOH 80/15/5-Rf=0,28.
    • 3°) Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
  • 1 g (2 mmoles) de Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH est introduit dans 10 ml TFA glacé agité. Après 30 min d'agitation à TA, le TFA est évaporé au maximum, le résidu repris 2 fois dans l'éther anhydre et décanté, puis séché au dessiccateur sous vide en présence de potasse. Il se forme une mousse solide. Le produit brut est mis en solution dans un mélange de 4 ml DMF et 2 ml d'eau distillée. NEM est ajouté jusqu'à pH 7-7,5. 1 g (2,4 mmoles) de Z-Tyr-ONSu est alors ajouté et le pH est maintenu à 7-7,5 par NEM (pH mètre). Au bout de 2h30, après contrôle CCM, le solvant est évaporé au maximum à 40°C. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle et lavé à l'eau, un peu de solide est éliminé et l'acétate d'éthyle est lavé au mélange sulfate/bisulfate et à l'eau salée. Après abandon quelques heures, il se forme un précipité qui est essoré, lavé à l'éther et séché à l'air. 500 mg sont ainsi obtenus. Un 2ème jet de 350 mg légérement moins pur est obtenu par concentration de l'acétate d'éthyle.
  • CCM chloroforme-ACOH 3/1 Rf: 0,4.
    • butanol-ACOH-H20 72/7/2 Rf: 0,85.
    • chloroforme-acétone-ACOH 80/15/5 Rf: 0,1.
  • HPLC 90,9% pureté polypeptidique.
  • Contrôle RMN.
    • Exemple XI: synthèse de: H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(Bzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (peptide K) 1°) Boc-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 3 HCI
  • 34,47 g de H-Ala-Arg-Àla-Arg-Leu-NH2, HCI (57 mM) sont dissous dans 230 ml de DMF. On ajoute 28 g de BOP (63 mM), puis en 1 h 33,5 g (57 mM) de Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH en solution dans 190 ml de DMF. Le pH du milieu réactionnel est maintenu autour de 6 par addition de NEM. Après 4 h, le milieu réactionnel est concentré sous vide de moitié et le résidu versé sur 800 ml d'acétate d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, à l'éther et séché sous vide. On obtient 56,8 g de produit avec un rendement de 80%.
  • Identification: 1H RMN et AAA: Glu: 0,98-Gly: 1,01-Ala: 1,97 Leu: 1,05-Arg: 2,97.
  • HPLC phase reverse EPP 95%.
  • CCM dans EPAW 40/20/10/6 Rf=0,55.
    • 2°) H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCI
  • 55,3 g du produit ci-dessus sont agités 30 min dans 250 ml de CH2CI2+250 ml de TFA. Puis le milieu réactionnel est concentré sous vide de moitié et versé sur 1200 ml d'éther glacé. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'éther, séché sous vide sur potasse.
  • Rendement: 100%.
    • 3°) Boc-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI
  • Au précédent sel de TFA (45 mM) dissous dans 400 ml de DMF et neutralisé par de la NEM, on ajoute 22,2 g de BOP (50 mM) puis, en 1 h, 30 g (45 mM) de Boc-Glu(OBzi)Ser-Asn-Gln-OH en solution dans 300 ml de DMF. Le pH du milieu réactionnel est maintenu à 6. Après 6 h, le milieu est concentré de moitié sous vide à 30°C puis versé sur 1 200 ml d'acétate d'éthyle. Le précipité formé est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther et finalement séché sous vide.
  • Rendement: 60,5 g (75%).
  • Produit identifié par RMN et AA: Asp: 1,00-Ser: 0,81-Glu: 2,71-Gly: 0,89-Ala: 1,82-Leu: 0,96-Arg: 3,02-HPLC phase réverse.
  • EPP 70%.
  • CCM: EPAW 30/20/10/6 Rf=0,35.
    • 4°) H-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCI
  • 53,3 g (30 mM) du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 250 ml de dichlorométhane plus 250 ml de TFA. Après concentration sous vide de moitié, le résidu est versé sur 1 300 ml d'éther glacé; le précipité formé est filtré, lavé à l'éther, puis séché sous vide sur potasse.
    • 5°) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI
  • Le précédent sel de TFA est dissous dans 300 ml de DMF et neutralisé par la NEM. On ajoute 14,8 g de BOP (33 mM) puis par petites portions en 1 h 21,4 g (30 mM) de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH. Le pH du milieu réactionnel est maintenu autour de 6 par la NEM. A Après 7 heures, le milieu est versé sur 2 1 d'ACOEt. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther et enfin séché sous vide.
  • Rendement 57 g (80%).
  • Produit identifié par RMN, AAA-Ser: 1,7-Arg: 4,1-Glu: 4,7-Gly: 2,05-Asp: 1,00-Ala: 1,91-Leu: 0,97-CCM BPWI-Rf: 0,35.
    • 6°) H-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCI
  • 14,21 g (6 mM) du produit précédent en suspension dans 80 ml de dichlorométhane sont traités en 10 min sous azote par 120 ml d'acide trifluoroacétique. Après 45 min à TA sous agitation, on concentre sous vide au 1/3 du volume initial et coule sur 750 ml d'éther froid (+4°) agité. Le précipité est filtré et lavé à l'éther puis séché sous vide sur potasse puis anhydride phosphorique. On obtient ainsi 13,9 g (97%) de produit utilisé tel quel dans la réaction suivante.
    • 7°) Boc-Asp-(OBzI)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI
  • 5,82 g (10 mM) de Boc-Asp(OBzl)-lie-Met-NH-NH2 en solution dans 76,6 ml de DMF sont traités entre -20° et -25° par 6,66 ml (40 mM) d'HCI gaz 6,0 N/dioxane, puis par 1,45 ml (12 mM) de nitrite de tertiobutyle en solution dans 5 ml de DMF. Après 1 h entre -20 et -25° on neutralise à pH apparent de 6-7 par addition d'environ 8 ml de diisopropyléthylamine (DIPEA) et ajuste le volume total à 100 ml par un peu de DMF, ce qui conduit à une solution d'azide à 0,1 molaire (qui est toujours conservée vers -20°). 13,84 g (environ 5,8 mM) du sel de TFA précédent dissous dans 58 ml de DMSO et 87 ml de DMF sont neutralisés à pH apparent de 6,7 par 1 ml de DIPEA et la solution ainsi obtenue est additionnée en 10 min environ à 72,5 ml (soit environ 1,25 équivalent) de la solution d'azide ci-dessus à température comprise entre -20 et -25°. Le pH est ajusté à 6-7 par un peu de DIPEA et la solution conservée à -15°. Après 16 h, 14,5 ml (0,25 équivalent) supplémentaires de la solution d'azide sont ajoutés. Un contrôle en CCM montre une réaction complète après 24 h, cependant la réaction n'est stoppée qu-après 40 heures par coulée de la solution sur 750 ml d'acétate d'éthyle glacé, agité. Le précipité ainsi formé est filtré et lavé abondamment par le même solvant et séché sous vide en présence d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 14,35 g utilisés tels quels dans l'étape suivante.
    • 8°) H-Asp-(OBzI)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCI
  • 14 g du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 80 ml de CH2Cl2+120 ml de TFA+10 ml HS(CH2)2SH. Après concentration sous vide de moitié, le milieu réactionnel est versé sur 800 ml d'éther glacé. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'éther,'puis séché sous vide sur potasse.
  • Rendement: 100%.
    • 9°) Boc-Gln-Asp(OBzI)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu-(OBz)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI
  • Au sel de TFA obtenu ci-dessus (4,9 mM) dissous dans 120 ml de DMF plus 30 ml de DMSO et neutralisé par de la NEM, on ajoute 740 mg d'HOBt (5,5 mM) puis par petites portions 2,02 g de Boc-Gln-ONp (5,5 mM), le pH du milieu réactionnel est maintenu vers 6 par addition de NEM. Après 6 h, le milieu réactionnel est versé dans 800 ml d'AcOEt. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther, puis séché sous vide.
  • Poids: 14,8 g.
  • Rendement: 100%.
  • Le produit est identifié par RMN et AAA: Asp: 1,97-Ser: 2,0-Glu: 6,12-Gly: 2,06-Ala: 2,06-Met: 0,55-IIe: 0,93-Leu: 0,99-Arg: 3,81-CCM: Rf 0,45-BPEW,.
    • 10°) H-Gln-Asp(OBzI)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCI
  • 14,7 g du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 80 ml de CH2Cl2+10 ml HS(CH2)2SH+120 ml de TFA. Après concentration sous vide de moitié, le milieu réactionnel est versé sur 600 ml d'éther glacé. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'éther puis séché sous vide sur potasse.
  • Poids: 14,5 g.
    • 11°) Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzI)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzI)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzI)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI
  • Au sel de TFA obtenu ci-dessus (4,9 mM) dissous dans 120 ml de DMF+40 ml de DMSO et neutralisé par de la NEM, on ajoute 2,44 g de BOP (5,5 mM) et 4,2 g de Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH, HCI (5,5 mM) par petites portions en 30 min. Le pH du milieu réactionnel est maintenu vers 6 par addition de NEM. Après 23 h, le milieu réactionnel est versé sur 1 litre d'AcOEt. Le précipité formé est filtré, lavé par AcOEt puis Et20, puis séché sous vide.
  • M: 16,5g-Rendement: .93%-Produit identifié par RMN et AAA: Asp: 2,10-Ser: 1,86-Glu: 6,2-Gly: 2,00-Ala: 2,00-Mét: 0,55-Ile: 0,80-Leu; 2,89-Lys: 0,87-Arg: 4,67-CCM Rf: 0,40 (BPEWi).
    • Exemple XII: Synthèse de: Boc-lie-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCI (peptide J) 1°) H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3
  • 10,3 g (18,8 mM) de Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 sont agités 35 min dans 100 ml de dichlorométhane contenant 100 ml de TFA. Le milieu réactionnel est concentré sous vide à environ 50 ml et versé sur 300 ml d'éther. Le précipité est essoré, lavé à l'éther et séché sous vide.
    • 2°) Boc-Tyr-Arg(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCI
  • Au sel de TFA obtenu ci-dessus, dissous dans 200 ml de diméthylformamide et neutralisé par de la N-éthylmorpholine, on ajoute 18,9 g (18,8 mM) de Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HCI puis 9,2 g de BOP (21 mM) puis de la NEM pour amener le pH du milieu réactionnel vers 6. Après 4 h d'agitation, le milieu réactionnel est versé sur 1 1 d'AcOEt. Le précipité obtenu est filtré, lavé 3 fois par 100 ml d'AcOEt, puis 3 fois par 100 ml d'Et2O puis il est séché sous vide.
  • On obtient 24,16 g de produit.
  • Rendement: 90%.
  • CCM Rf: 0,20 (BEW,)-alpha D: -17,6°-(CC: 1-DMF à 5% d'AcOH).
  • Produit identifié par 1H RMN et AAA: Ser: 1,01-Glu: 0,99-Gly: 1,06-Ala: 1,01-Val: 0,98-Leu: 1,97-Tyr: 1,00-Lys: 0,98-Arg: 0,99-HPLC en phase reverse (EPP: 92%).
    • 3°) H-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Arg-OCH3, HCI, TFA
  • 8,66 g (6,1 mM) du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 37 ml de dichlorométhane+3,5 ml d'anisole+40 ml de TFA. Après concentration sous vide de moitié, le résidu est versé sur 300 ml d'éther glacé; le précipité blanc obtenu est filtré, lavé à l'éther puis séché sous vide sur potasse.
  • Poids: 8,68 g.
  • Rendement: 100%.
    • 4°) Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-N3
  • 5,94 g (8,55 mM) de Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 sont dissous dans 27 ml de DMSO+37 ml de DMF. Après refroidissement à -25°C, on ajoute 6,1 ml d'une solution HCI/dioxanne 5,6 N puis 1,23 ml de nitrite de tertiobutyl (1,2 équivalent) prédilué dans 5 ml de DMF prérefroidi à -20°C. Après 1h15 min d'agitation entre -20° et -25°C, on ajoute 6,1 ml de diisopropyléthylamine (DIPEA) pour amener le pH vers 6, puis on ajoute 3 ml de DMF pour amener le volume à 85 ml et on conserve cette solution à -25°C.
    • 5°) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCI
  • Le sel de TFA obtenu à l'exemple XI-3°), dissous dans 70 ml de DMF, est neutralisé par de la DIPEA puis ajouté en 15 min à 70 ml de la solution d'azide obtenue ci-dessus à -20°C. Puis on ajoute de la DIPEA pour amener le pH vers 7, on agite 1 h à -20°C, puis on conserve le milieu à -12°C. Après 22 h, on ajoute 5 ml de la solution d'azide et remonte le pH vers 7 par DIPEA. Après 45 h, on rajoute le restant de la solution d'azide et remonte le pH vers 7 par DIPEA. Après 74 h, le milieu réactionnel est versé sur 1 200 ml d'acétate d'éthyle. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle puis à l'éther, puis séché sous vide.
  • Poids: 10,46 g.
  • Rendement: 86%.
  • Par concentration des eaux mères et reprécipitation par un mélange acétate d'éthyle-éther, on obtient un 2e jet qui permet d'avoir un rendement global de 95%. Le produit de couplage est identifié par 1 H RMN et AAA: Asp: 1,02-Thr: 1,03-Ser: 1,91-Glu: 0,97-Gly: 1,06-Ala: 1,06-Val: 1,00-lle: 0,94-Leu: 1,98-Tyr: 1,04-Phe: 1,02-Lys: 0,94-Arg: 1,02-CCM Rf: 0,20 (BEW,)-HPLC en phase reverse (EPP: 90%).
    • 6°) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Gly-Gln-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCI
  • 5,3 g (2,7 mM) du produit obtenu ci-dessus sont dissous dans 40 ml de DMSO+6 ml d'eau; on ajoute goutte à goutte 10 ml de soude 1 N, on agite 30 min puis neutralise par 10 ml d'acide chlorhydrique 1 N. Le milieu réactionnel est versé sur un litre d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé 4 fois à l'acétate d'éthyle puis 2 fois à l'eau, puis 4 fois à l'éther, puis il est séché sous vide sur P2O5.
  • Poids: 4,56 g.
  • Rendement: 86%-Produit identifié par 1H RMN et AAA-CCM: Rf: 0,5 BEW,.
    • Exemple XIII: Synthèse de: Z-Tyr-Ala-Asp-OBzl)-Ala-lie-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly(OBzl)-Ser-Asn-Gin-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI (GRF 1-44 protégé) 1°) H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI, TFA
  • 1,4 g du produit de l'exemple XI-11°) sont agités 35 min dans 60 ml de CH2CI2, +70 ml de TFA+7 ml d'éthanedithiol. Après concentration sous vide de moitié, le résidu est versé sur 500 ml d'éther glace. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'éther, puis séché sous vide sur potasse.
    • Poids: 7,44 g.
    2°) Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI
  • A 6,6 g de sel de TFA ci-dessus (1,9 mM) dissous dans 36 ml de DMSO+90 ml de DMF et neutralisé par de la NEM, on ajoute 1,0 g de BOP (2,3 mM), puis 3,8 g du peptide de l'exemple XI-6°) (1,9 mM), le pH du milieu réactionnel est amené à 6 par de la NEM. Après 19 h, on ajoute 1,15 mM de BOP. Après 26 h, le milieu réactionnel est versé sur 600 ml d'AcOEt. Le précipité obtenu est filtré, lavé par AcOEt, puis filtré et séché sous vide.
  • Rendement: 88% (9,2 g).
  • Produit identifié par RMN et AAA.
    • 3°) H-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCI, TFA
  • 9,1 g du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 100 ml de TFA+5 ml d'éthanedithiol. Puis le milieu réactionnel est versé sur 500 ml d'éther glacé. Le précipité obtenu est filtré, lavé par Et20, puis séché sous vide sur potasse.
  • Rendement: 100%.
    • 4°) GRF-1-44 protégé
  • A 9,10 g du précédent sel de TFA (1,66 mM) en solution dans 50 ml de DMF et 50 ml de DMSO et neutralisé par la NEM, on ajoute 1,18 g du peptide décrit dans l'exemple X-3°) (1,78 mM) et 0,79 g de BOP (1,78 mM); le pH est maintenu vers 6 par de la NEM. Après 23 h, à TA, le milieu réactionnel est versé sur 600 ml d'AcOET. Le précipité formé est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther et finalement séché sous vide.
  • Rendement: 8,54 g (84%).
  • Contrôle RMN et CMM: AAA: Asp: 4,2-Thr: 0,92-Ser: 4,02-Glu: 7,37 (pour 7)-Gly: 3,14 (pour 3)-Ala: 5,11-Val: 1,01-Met: 0,61-Ile: 1,84-Leu: 4,98-Tyr: 1,87-Phe: 0,95-Arg: 5,90.
    • Exemple XIV: Déprotection de GRF-1-44:
  • 4,5 g du produit obtenu selon l'exemple XIII-4°) sont agités 1 h à 0° dans 180 ml de TFA contenant 19,8 ml de TFMSA, 27 ml de thioanisole et 11 ml de métacrésol. On ajoute ensuite 1 1 d'éther. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'éther puis séché 1 h sous vide en présence de potasse. Le produit est redissous dans 200 ml d'eau et on ajoute de la résine échangeuse d'ions Amberlite IR 45 (sous forme acétate) afin de ramener le pH à 4,5. On agite le milieu 30 min à TA. La résine est filtrée, lavée à l'eau et les filtrats concentrés à 50 ml puis lyophilisés.
  • Rendement: 3,85 g.
  • Contrôle par RMN de la disparition des groupements protecteurs Z et OBzl. CCM (BEPW1): tache majoritaire Rf 0,38.
    • Exemple XV: Purification du GRF-1-44
  • La peptide déprotégé obtenu dans l'exemple précédent (XIV) est soumis à une chromatographie sur gel de Séphadex G 50 (fine) en utilisant l'acide acétique à 30% comme éluant. Les fractions contenant le peptide attendu sont réunies, évaporées et lyophilisées. Le lyophilisat ainsi obtenu est purifié à son tour par une chromatographie sur un échangeur de cations du type CM-32 carboxyméthylcellulose (Whatman) en utilisant un gradient linéaire d'acétate d'ammonium compris entre 0,1 M (pH 4,5) et 0,4 M (pH 6,5). Par exemple, pour 1 charge de 1 g de peptides à purifier, on utilisera une colonne à chromatographie ayant un volume de lit de 50 ml environ pour une hauteur de 20 cm. Les fractions contenant le peptide avec un degré de pureté ;à 80% (HPLC) sont réunies et lyophilisées juqu'à poids constant (afin d'éliminer le tampon CH3CO2NH4). Enfine, le précédent lyophilisat est soumis à une chromatographie de partition en utilisant comme support de la phase liquide stationaire le Séphadex G 50 fine et à l'aide du système de solvants suivant: n-butanol/éthanol/pyridine/acide acétique 0,2 N dans la proportion de: 4/1/1/7 (en volumes). Les fractions de chromatographie sont contrôlées par HPLC et celles dont le titre de pureté est ≥à 95% sont réunies et lyophilisées.
  • Le produit est finalement contrôlé par analyse des amino-acides:
    Figure imgb0034
    • Exemple XVI-Synthèse de Boc-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly (fragment B) 1°) Z-Arg(N02)-Glu-OBzl
  • 353 g de tosylate de glycine benzyl ester (H-Gly-OBzl, tosylate) sont dissous dans 2 l de DMF, on ajoute 115 g de NEM puis 353 g de Z-Arg(NO2)-OH et enfin 500 g de BOP. Le pH du milieu est ajusté à 7 à l'aide de NEM et en utilisant du papier indicateur de pH sur des prélèvements du milieu réactionnel dilués à l'eau. Le milieu réactionnel est agité et l'état d'avancement de la réaction suivi par C.C.M. Au bout de 4 h, la réaction est complète et Is milieu évaporé à sec sous vide à 35°. Le résidu d'évaporation est repris par 2 d'acétate d'éthyle et 2 1 d'eau. On obtient dans ces conditions un solide qui est essoré et lavé successivement en phase solide avec une solution aqueuse à 5% de KHSO4+K2SO4, à l'eau pure, avec une solution aqueuse à 5% de NaHC03 et finalement à l'eau.
  • Le produit est séché à l'air et contrôle par R.M.N. et C.C.M.
  • Rendement: 410 g (82%).
    • 2°) H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH
  • 500 g du précédent produit en solution dans 3 de HCIN dans le DMF et en présence de 100 g de Pd/C à 10% en Pd sont hydrogénés sous une pression de 1,5 bar d'hydrogène. Après 24 h, la réaction est terminée (contrôle par C.C.M.). Le catalyseur est filtré et le pH du milieu ajusté à 7 par addition de N-éthyl morpholine et en utilisant du papier indicateur de pH sur des prélèvements dilués à l'eau. On introduit 458 g de Boc-Glu(OBzl)-ONp en solution dans 1 litre de DMF. Le milieu réactionnel est dilué par addition de 1 litre d'eau et on ajoute progressivement 135 g d'OHBT et de la NEM en quantités suffisantes pour maintenir le pH à 7.
  • Le milieu est agité 4 h à la température ambiante. On s'assure que la réaction est complète et le solvant est évaporé sous vide à la température de 35°. Le résidu d'évaporation est repris dans l'acétate d'éthyle. Dans ces conditions, le produit s'organise en solide. Il est essoré et chromatographié sur gel de silice en utilisant comme éluant le chloroforme-méthanol (70-30 en volume). L'évaporation des fractions de chromatographie contenant le produit pur conduit à 412 g (75%) d'un composé pulvérulent blanc après lyophilisation. Il est contrôlé par C.C.M. et R.M.N.
  • Le précédent produit est dissous à la température ambiante dans 3 l d'un mélange (50/50) de TFA et de CH2Cl2. On maintient le milieu 15 min à la température ambiante, et on évapore à sec sous vide, en maintenant la température à 20°. Le résidu est repris dans l'éther éthylique et le solide obtenu est essoré et séché. Le rendement est de 423 g (100%) sous forme de trifluoroacétate.
    • 3°) H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH .
  • 564 g de trifluoroacétate de H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH sont dissous dans 3 I de diméthylformamide. Le pH est ajusté à 7 par addition de NEM sur des prélèvement dilués à l'eau et à l'aide de papier indicateur de pH.
  • On introduit ensuite 367 g de Boc-Gln-ONp en solution dans 1 litre de DMF. Le milieu réactionnel est dilué par addition de 1 litre d'eau. On ajoute progressivement 135 g d'OHBT et la quantité suffisante de NEM pour que le pH se maintienne à 7.
  • Le mélange est agité 4 h à la température ambiante. On contrôle la fin de la réaction par C.C.M. et le solvant est évaporé sous vide poussé à 35°. Le résidu d'évaporation est trituré dans l'acétate d'éthyle. On obtient dans ces conditions un solide hygroscopique qui est utilisé tel quel pour le traitement à l'acide trifluoroacétique-CH2Cl2 (2 I du mélange 50-50 en volume).
  • Le milieu est conservé 10 min à la température ambiante et enfin évaporé sous vide à 20°. Le résidu d'évaporation est trituré dans l'éther éthylique pour donner 525 g (76%) de H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH. (Contrôlé par R.M.N. et C.C.M.).
    • 4°) H-Asn-Gln-Glu(OBz)-Arg-Gly-OH
  • En utilisant rigoureusement les conditions de l'exemple 11-2 et à partir de H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH, trifluoroacétate (691 g) et 393 g de Boc-Asn-ONb, on obtient 685 g (85%) d'un produit solide blanc contrôlé par R.M.N. et C.C.M.
    • 5°) H-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH
  • Egalement dans les conditions de l'exemple 11-2 et à partir de 806 g de H-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH et de 366 g de Boc-Ser-ONb, on obtient le produit contrôlé par R.M.N. et C.C.M. avec un rendement de 688 g (77%) et sous forme trifluoroacétate.
    • 6°) Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH (fragment B)
  • A partir de 894 g de H-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH trifluoroacétate et 458 g de Boc-Glu(OBzl)-ONp, on obtient 824 g (80%) du produit attendu après purification par cristallisation dans le milieu DMF-éther (50-50 en volume).
  • Le produit est contrôlé par R.M.N., C.C.M. et analyse d'amino acides:
    Figure imgb0035
  • En suivant les stratégies présentées dans les tableaux V, VI, VII et VIII et les techniques décrites dans les exemples 1 à IX et XVI, les composés suivants peuvent être obtenus:
    Figure imgb0036
    • Exemple XVII: Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (fragment B-A)
  • 69,2 g du fragment A chlorhydrate sont dissous dans 500 ml de DMF. On ajuste le pH à 7 sur des prélèvements dilués à l'eau et à l'aide de papier indicateur de pH et de NEM. On ajoute ensuite 117 g du fragment B, 55 g de BOP, on ajuste à nouveau le pH à 7 à l'aide de NEM et le milieu est agité pendant 14 h à la température ambiante. Après contrôle de fin de réaction par C.C.M., on ajoute au milieu réactionnel 2 1 d'éther éthylique. Un précipité pulvérulent blanc se dépose dans ces conditions. Il est purifié par recristallisation dans le DMF-acétate d'éthyle. Le produit essoré est ensuite lavé à l'acétate d'éthyle en phase solide et séché.
  • On obtient 149 g (81%) d'un produit blanc contrôlé par C.C.M. et R.M.N.
  • Analvse d'amino acides:
    Figure imgb0037
    • Déprotection de l'azote N-terminal
  • Le produit décrit dans le précédent exemple (184 g) est introduit dans un mélange constitué par 750 ml de TFA et 750 ml de CH2Cl2 sous agitation et à la température ambiante. Après dissolution, le mélange est conservé 15 min à la même température et évaporé sous vide en maintenant le milieu d'évaporation à 25°. Le résidu d'évaporation est trituré dans l'éther et l'on obtient dans ces conditions un solide pulvérulent blanc qui est sèche sous vide et contrôlé par C.C.M. et R.M.N.
  • Les composés suivants pouvant être obtenus selon les techniques de l'exemple XVII et représentant les différents stades de l'élongation du peptide.
    Figure imgb0038
    Figure imgb0039
  • (H) Dans ce cas particulier, le fragment D est introduit en utilisant l'activation aux azides
    Figure imgb0040
  • Dès que la méthionine est en séquence, un balayeur "scavenger" sera utilisé au cours des différents traitements par le TFA-CH2CI2 pendant les phases de déprotection sélective (élimination du Boc). Nous préconisons le thioanisole comme agent de protection de la méthionine à l'oxydation dans la proportion de 5% dans le milieu TFA-CHZCI2.
    Figure imgb0041
    Figure imgb0042
    Figure imgb0043
    Figure imgb0044
    Figure imgb0045
  • La déprotection et la purification du hpGRF 1-44 sont ensuite effectuées comme indiqué dans les exemples XIV et XV.

Claims (13)

1. Procédé de synthèse, en phase liquide et par fragments, des hpGRF 1-44 et hpGRF 1-40, caractérisé en ce que l'on couple, l'un après l'autre et dans l'ordre de la séquence du GRF, les fragments dans lesquels:
a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc, .
b) la fonction guanidine de l'arginine est protégée par protonation, et
c) l'acide aminé N-terminal est protégé sur l'amine par le groupement Boc, en ce qu'on élimine sélectivement le groupement Boc de l'amine N-terminale du peptide en phase d'élongation par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant polaire aprotique et en ce qu'on élimine en fin de séquence tous les groupes protecteurs par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhane-sulfonique dans l'acide trifluoroacétique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après chaque couplage le produit obtenu est isolé du milieu réactionnel par précipitation à l'aide d'un solvant apolaire.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit brut de réaction est purifié par la distribution à contre-courant et la chromatographie de perméation sur gel.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à coupler successivement et dans l'ordre de la séquence du GRF les neuf fragments peptidiques ci-après:
H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (40-44) dit fragment A,
Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH (33-39) dit fragment B,
Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH (28-32) dit fragment C,
Boc-Asp(OBzl)-lle-Met-NH-NH2 (25-27) dit fragment D,
Boc-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-OH (21-24) dit fragment E,
Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-OH (16-20) dit fragment F,
Boc-Lys(Z)-Vai-Leu-Gly-OH (12-15) dit fragment G,
Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-OH (5-11) dit fragment H,
Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (1-4) dit fragment I,

et en ce que le peptide obtenu est le hpGRF 1-44.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on utilise l'alaninamide à la place du fragment A et en ce que le peptide obtenu est le hpGRF 1-40.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on couple successivement et dans l'ordre de la séquence du GRF les 3 fragments peptidiques:
H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (séquence 20-44 du GRF dit peptide K),
Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH (séquence 5-19 du GRF dit peptide J),
Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (séquence 1-4 du GRF dit peptide I), ledit peptide obtenu étant le hpGRF 1-44.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu l'on utilise le fragment peptidique correspondant à la séquence 20-40 du GRF à la place du peptide K, ledit peptide obtenu étant le hpGRF 1-40.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le couplage est réalisé à l'aide de l'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxyphosphonium (BOP) ou la dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxy-1 benzotriazole (agent de couplage) ou par activation aux carboxyazides, dans un solvant approprié, tel que le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde.
9. A titre de produits nouveaux, les peptides intermédiaires ou fragments peptidiques A à K mis en oeuvre dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Peptides intermédiaires selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est le peptide K dont la séquence correspond à la séquence 20-44 du GRF et dont certains amino-acides sont bloqués, obtenu par couplage successif en phase liquide des sous-fragments ci-après dans l'ordre de la séquence du GRF:
H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (40-44) dit fragment A,
Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH (37-39) dit fragment B1,
Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH (33-36) dit fragment B2,
Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH (28-32) dit fragment C,
Boc-Asp(OBzl)-lle-Met-NH-NH2 (25-27) dit fragment D,
Boc-Gln-ONp,
Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH (20-23) dit fragment E1 dans lesquels:
a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc,
b) la fonction guanidine de l'arginine est protégée par la protonation, et
c) l'acide aminé N-terminal des fragments B1, B2, C, D, E1 est protégé sur l'amine par le groupement Boc éliminable sélectivement en phase d'élongation du peptide par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, les couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique.
11. Peptide intermédiaire selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est le fragment peptidique ayant la séquence 20-40 du GRF, obtenu par couplage successif en phase liquide des sous-fragments ci-après dans l'ordre de la séquence du GRF:
H-Ala-NH2,
Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH (37-39) dit fragment B1,
Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH (33-36) dit fragment B2,
Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH (28-32) dit fragment C,
Boc-Asp(OBzl)-lle-Met-NH-NH2 (25-27) dit fragment D,
Boc-GIn-ONp,
Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH (20-23) dit fragment E, dans lesquels:
a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont protegées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc,
b) la fonction guanidine de l'arginine est protégé par la protonation, et
c) l'acide aminé N-terminal des fragments Bi, B2, C, D, E est protégé sur l'amine par le groupement Boc éliminable sélectivement en phase d'élongation du peptide par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, les couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique.
12. Peptide intermédiaire selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est le peptide J obtenu par couplage successif en phase liquide des sous-fragments suivants dans l'ordre de la séquence du GRF,
H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 (16-19) dit fragment Fi,
Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gln-OH (10-15) dit fragment Gi,
Boc-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 (5-9) dit fragment H1,

dans lesquels:
a) la fonction amine latérale de la lysine du fragment G est protégée par un groupement protecteur stable dans les conditions de déprotection du groupement Boc,
b) la fonction guanidine du fragment 10-15 est protégé par protonation,
c) l'acide aminé N-terminal des fragments G et H est protégé sur l'amine par le groupement Boc, éliminable sélectivement en phase d'élongation du peptide par l'hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, les couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique.
13. Peptide intermédiaire selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est le peptide I obtenu par synthèse en phase liquide dans laquelle:
a) la fonction latérale acide de l'acide aspartique est protégée par un groupe protecteur stable dans les conditions de déprotection du groupement Boc,
b) l'acide alpha aminé N-terminal est protégé sur l'amine par un groupement clivable dans les conditions de déprotection des groupements protecteurs des chaînes latérales.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704450A (en) * 1983-02-21 1987-11-03 Sanofi Synthesis of hpGRF(Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides
DE3327007A1 (de) * 1983-07-27 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus
FR2567524B1 (fr) * 1984-07-10 1987-11-27 Sanofi Sa Procede de synthese de la somatocrinine en phase liquide et peptides intermediaires
EP0193910A3 (fr) * 1985-03-06 1988-11-23 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Synthèse d'un dérivé du "GRF" et peptides intermédiaires
FR2599038B1 (fr) * 1986-05-26 1990-06-29 Sanofi Sa Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires
US5565606A (en) * 1986-10-21 1996-10-15 Hoechst Aktiengesellschaft Synthesis of peptide aminoalkylamides and peptide hydrazides by the solid-phase method
US5200526A (en) * 1987-04-27 1993-04-06 The Governors Of The University Of Alberta Syntheses of optically pure α-amino acids from 3-amino-2-oxetanone salts
US4888385A (en) * 1987-04-30 1989-12-19 Millipore Corporation BOP reagent for solid phase peptide synthesis
IT1226552B (it) * 1988-07-29 1991-01-24 Ellem Ind Farmaceutica Peptidi immunostimolanti.
DK0490249T3 (da) * 1990-12-10 1995-05-29 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af GRF(1-44)-NH2
IE921942A1 (en) * 1992-06-16 1993-12-29 Gary A Siwruk John S Eynon Liquid phase synthesis of peptides and peptide derivatives
US5516891A (en) * 1992-06-16 1996-05-14 Kinerton, Ltd. Liquid phase synthesis of peptides and peptide derivatives
US6013764A (en) * 1996-07-17 2000-01-11 Ortho Pharmaceutical Corp. Liquid phase peptide synthesis of KL-4 pulmonary surfactant
KR200427009Y1 (ko) * 2006-07-06 2006-09-21 노승설 치약이 내장된 칫솔
JP6564539B1 (ja) * 2018-09-14 2019-08-21 長瀬産業株式会社 スルホン酸化合物によるペプチド精製方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU466760B2 (en) * 1972-03-14 1975-11-06 Takeda Chemical Industries Ltd. Process for producing peptide
JPS5726506B2 (fr) * 1974-03-08 1982-06-04
FR2451915A1 (fr) * 1979-03-23 1980-10-17 Clin Midy Nouveau procede de preparation de la somatostatine
DE2919592A1 (de) * 1979-05-15 1981-01-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von thymosin- alpha 1 und derivaten davon
NZ204456A (en) * 1982-06-16 1987-05-29 Salk Inst For Biological Studi Synthetic pancreatic growth-hormone releasing factor
US4563352A (en) * 1982-10-04 1986-01-07 The Salk Institute For Biological Studies Human pancreatic GRF
US4476116A (en) * 1982-12-10 1984-10-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Polypeptides/chelating agent nasal compositions having enhanced peptide absorption
AU3318184A (en) * 1984-08-10 1986-03-07 Immunetech Pharmaceuticals Immunotherapeutic polypeptide agents

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