KR840000054B1 - 티모신 α₁의 제조방법 - Google Patents

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KR840000054B1 KR7801178A KR780001178A KR840000054B1 KR 840000054 B1 KR840000054 B1 KR 840000054B1 KR 7801178 A KR7801178 A KR 7801178A KR 780001178 A KR780001178 A KR 780001178A KR 840000054 B1 KR840000054 B1 KR 840000054B1
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쿠르트 네셀보슈
에프. 호프만-라롯슈 앤드 캄파니
볼프강 메쯔거
에프.호프만-라롯슈 앤드 캄파니
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Abstract

내용 없음.

Description

티모신 α1의 제조방법
본 발명은 면역항진제로 유용한 다음 구조식(Ⅰ)의 티모신 α1및 그의 염의 제조방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
티모신 α1은 열에 대하여 안정하고 강산성이며 28개의 아미노잔기를 함유하는 폴리펩타이드로서 이온교환크로마토그라피와 겔여과법을 조합하여 티모신 획분 5로부터 분리하였다[참조 : Gold Stein 등의 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 725-729(1977)].
본 발명의 구조식(Ⅰ)의 화합물은 다음과 같이 제조한다. 즉, 다음 일반식(Ⅱ)의 보호된 테트라데카펩타이드를 다음 일반식(Ⅲ)의 보호된 테트라데카펩타이드와 축합시킨 후 보호그룹을 제거하여 제조한다.
H3C-CO-Ser(R1)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr-(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-OR7(Ⅱ)
H-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6(Ⅲ)
상기 일반식에서
R1은 세린잔기의 하이드록실기를 위한 통상의 보호그룹이고,
R2,R4및 R6는 통상의 카복실기보호기이고,
R3는 트레오닌의 하이드록실기를 위한 통상의 보호기이고,
R5는 리신잔기의 ω-아미노기를 위한 통상의 보호그룹이고,
R7은 수소 또는 활성화기이다.
상기 커플링반응은 용액상 펩타이드 합성법에서 널리 알려진 방법으로 수행한다. 예를 들어, 아미노-말단테트라데카펩타이드를 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT) 및 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)와 반응시켜 활성화된 에스테르를 얻고, 이 물질을 카복실-말단테트라데카펩타이드와 반응시켜 다음 일반식(Ⅰ')를 갖는 보호된 형태의 티모신 α1을 얻는다.
H3C-CO-Ser(R1)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4) Val-Val-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6(Ⅰ')
상기 일반식에서
R1,R2,R3,R4,R5및 R6는 전술한 바와 같다.
상기 화합물(Ⅰ')로부터 보호그룹을 제거하는 것은 공지의 방법, 예를 들어, 바람직하게는 아니솔 존재하에 불화수소 같은 무수산(HF)으로 처리하여 수행한다.
상기기의 정의에서 R1으로는 벤질, 아세틸, 벤조일, 3급-부틸, 트리틸, 4-브로모벤질, 2,6-디클로로벤질 및 벤질옥시카보닐이 있으며 특히 벤질이 바람직하다.
R2,R4및 R6로는 아릴기, 특히 페닐 또는 저급알킬, 할로, 니트로, 메르캅토 또는 치환된 메르캅토(예 : 메틸티오)로 치환된 페닐 ; 벤질, 또는 메톡시, 할로 또는 니트로로 치환된 벤질 같은 아르알킬기 ; 메틸, 에틸, 3급-부틸 및 3급-아민 같은 저급알킬기 ; 2-할로에틸, β,β-디메틸아미노에틸 및 시아노메틸 같은 치환된 저급알킬기 ; 벤즈히드릴 및 펜아실이 있으며 특히 벤질이 바람직하다.
R3로는 벤질, 아세틸, 벤조일, 3급-부틸, 트리틸, 2,6-디클로로벤질, 4-브로모벤질, 및 벤질옥시카보닐이 있으며 특히 벤질이 바람직하다.
R5로는 4-클로로, 2-브로모, 4-브로모, 2,4-디클로로, 4-니트로, 4-메톡시, 3,5-디메톡시, 4-메틸, 2,4,6-트리메틸, 4-페닐아조, 4-(4-메톡시페닐아조), 2-(N,N-디메틸카브아미도) 및 2-니트로-4,5-디메톡시 등으로 방향족환이 임의로 치환된 벤질옥시카보닐 ; 4-톨루엔설포닐에틸옥시카보닐, 9-플루오레닐-메틸옥시카보닐 및 관련된 염기제거기, 5-벤즈이속사졸릴메틸렌옥시카보닐, 메틸티오- 및 메틸설포닐에틸옥시카보닐, 이소니코닐옥시카보닐, 할로에틸옥시카보닐, 디이소프로필메틸옥시카보닐, 벤즈히드릴옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, 디니트로디페닐메틸옥시카보닐, 3급-부틸옥시카보닐, 3급-아밀옥시카보닐, 아다만틸옥시카보틸, 사이클로펜틸옥시카보닐, 메틸사이클로부틸옥시카보닐, 메틸사이클로헥실옥시카보닐, 2-(p-비페닐일)-이소프로필옥시카보닐, 2-(4-피리딜)-이소프로필옥시카보닐 같은 2-아릴이소프로필옥시카보닐 및 유사한 질소함유 우레탄기 같은 우레탄형 보호기 ; 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 벤젠설포닐, 이세토아세틸, 클로로아세틸, 2-니트로벤조일, 4-톨루엔설포닐, 벤젠설페닐, 0-니트로페닐설페닐 및 이와 유사한 설페닐 등의 설페닐기 같은 아실기 ; 및 디페닐메틸 및 트리페닐메틸 등의 아릴-저급알킬기가 있으며 특히 벤질옥시카보닐기가 바람직하다.
보호된 카복실-말단테트라데카펩타이드(Ⅲ)의 화학적 합성법은 다음과 같다 :
먼저 H-Glu(OBzl)-OH를 Boc-Ala-Osu와 커플링시켜 보호된 디펩타이드 프래그먼트 Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH를 얻고 이를 DCC/HOSu공정[참조 : 뷘쉬 및 드레스, Chem.Ber. 99,110(1966)]에 따라 HCl·H-Asn-OBzl과 축합시킨다. 아스파라긴 벤질에스테의 염산염은, 아미노산의 세슘염을 사용하여 시판용 Boc-Asn-OH와 벤질브로마이드로부터 합성한 Boc-Asn-OBzl로부터 제조한다. 무수 THF중에서 4NHCl로 30분간 처리하여 Boc-보호기를 제거한다. H-Glu(OBzl)-OH와 Boc-Glu(OBzl)-Osu로 반응시키면 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH가 무색투명한 오일로 얻어진다. 이를 Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 4N HCl/THF상에서 처리하여 얻은 HCl·H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl과 함께 DCC/HOSu프래그먼트 축합법으로, 보호된 펜타펩타이드 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 합성하는 데 이용한다. 전술한 보호된 펜타펩타이드가 좋은 수율로 순수한 결정상 물질로 얻어진다.
보호된 옥타펩타이드 Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 제조하기 위하여, 보호된 트리펩타이드 Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH를 먼저 제조한다. 즉, Boc-Val-OSu를 유리발린과 반응시켜 Boc-Val-Val-OH를 얻고, 이를 THF중의 4N HCl로써 탈차단시킨 후 Boc-Glu(OBzl)-OSu와 반응시켜 사이클로헥실아민염으로 결정화되는 트리펩타이드 Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH·CHA를 얻는다. 사이클로헥실아민염을 유리산으로 전환시키고 이어서 HOSu 존재하의 DCC방법으로, Boc-Gul(OBzl)-Gul(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 THF중에서 HCl로 처리하여 수득되는 HCl·H-Gul(OBzl)-Gul(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl과 커플링시켜 보호된 옥타펩타이드 Boc-Gul(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Gul(OBzl)-Ala-Gul(OBzl)-Asn-OBzl을 정제된 형태의 무정형 고체로 얻는다. 이 물질을 가수소분해로 탈보호시키고 통상의 방법으로 트리플루오로아세트산으로 처리하여 유리옥타펩타이드 Gul-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn을 얻는다. 이 생성물을 이온교환컬럼크로마토그라피로 정제하고 박층크로마토그라피와 페이퍼 전기영동법으로 균질한 물질을 수득한다.
보호된 운데카펩타이드 Boc-Gul(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Vla-Vla-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Gul(OBzl)-Asn-OBzl을 합성하기 위하여, 필요한 트리펩타이드를 Boc-Lys(Z)-OSu와 H-Lys(Z)-OH로부터 합성한다. 이로부터 얻어진 디펩타이드 Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH를 THF중에서 4N HCl로 처리하고 이어서 수득된 염 HCl·H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH를 Boc-Glu(OBzl)-OSu와 반응시켜 원하는 트리펩타이드 Boc-Glu(Bzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH를 얻는다. 이어서 이 트리펩타이드를 다음 문헌 [참조 : Weygand et.al.,Z.Naturforsch 21 b, 426(1966)]의 방법에 따라 DCC 및 HOSu를 사용하여 활성화시키고, 자체내 생성된 활성트리펩타이드 에스테르 Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu의 용액을, 상응하는 차단된 옥타펩타이드를 THF와 30분간 처리하여 제조된 H-Glu(OBzl)-Val-Val-Gul(OBzl)-Gul(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl의 트리플루오로아세테이트염과 혼합시킨다. 소량의 염기를 가하면 곧 원하는 보호된 운데카펩타이드 Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl이 얻어진다.
보호된 운데카펩타이드 Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 무수 불화수소산으로 탈보호시켜 유리운데카펩타이드 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn을 생성하여 이는 이온교환 컬럼크로마토그라피 분리후에 페이퍼 전기영동으로 균질하게 얻어진다.
보호된 테트라데카펩타이드의 합법성도 유사한 방식으로 수행한다. Boc-Leu-Osu를 H-Lys(Z)-OH와 커플링시켜 Boc-Leu-Lys(Z)-OH를 얻고, Nα-Boc-그룹을THF중에서 4N HCl 처리로 제거한 다음, Boc-Asp(OBzl)-Osu와 반응시켜 보호된 트리펩타이드 Boc-Asp(Bzl)-Leu-Lys(Z)-OH를 순수한 결정성 고체로 얻는다. 이를 활성에스테르 Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Osu로 전환시키고, 상응하는 보호된 운데카펩타이드를 THF로 처리하여 얻어진 H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl의 트리플루오로 아세테이트염과 축합시켜 원하는 Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 좋은 수율로 얻는다. 박층크로마토그라피를 실시하여 보면 생성물이 단일물질임을 알 수 있다. 보호된 화합물을 무수 불화수소산으로 처리하고 이온교환 컬럼상에서 정제시켜 유리테트라데카펩타이드 Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn을 얻는다.
유사한 방법으로 아세틸테트라펩타이드, 헥사펩타이드 및 다른 테트라펩타이드를 사용하여 공지의 펩타이드 합성법에 따라 보호된 아미노말단 테트라테카펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Blz)-Ser(Blz)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(z)-OH를 제조한다. 아미노-말단 아세틸테트라펩타이드를 합성하기 위하여, H3C-CO-Ser(Bzl)-OH 및 벤질 브로마이드로부터 아미노산의 세슘엽을 거쳐 H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl을 제조한다. H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl을 가하이드라진 분해시켜 H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2의 순수결정성 고체를 좋은 수율로 얻는다. Boc-Ala-Ala-OH를 탈보호시켜 디펩타이드 염산염 HCl·H-Ala-Ala-OH를 얻고 이 디펩타이드를 Boc-Asp(OBzl)-Osu와 커플링시켜 보호된 트리펩타이드 Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH를 얻는데, 이는 디사이클로헥실아민염으로 분리된다. 아미노보호기를 제거하고 H3O-CO-Ser(Bzl)-HNNH2와 아자이드공정[참조 : Honzl and Rudinger, Collection Czech. Chem. Commun. 26,233(1961)]에 따라 축합시켜 부분적으로 보호된 테트라펩타이드 H3C-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH를 얻은 후 이를 HOBT존재하에서 DCC를 사용하여 량의 하이드라진과 반응시켜 원하는 중간생성물인 H3O-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2를 생성한다.
보호된 헥사펩타이드 Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glb(OBzl)-HNNH2를 합성하기 위하여, C-말단으로부터 펩타이드 체인을 연장시키는 방법을 채택한다. 따라서 H-Glu(OBzl)-OH를 Boc-Ser(Bzl)-Osu와 커플링시켜 보호된 디펩타이드 Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH를 얻고, Boc-기를 제거한 후 계속 Boc-Ser(Bzl)-Osu와 반응시키면 트리펩타이드 Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH를 얻는다. 아미노기를 탈보호시키고 생성된 트리-펩타이드염 HCl·H-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH를 Boc-Thr-(Bzl)-Osu와 축합시켜 보호된 테트라펩타이드 Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH를 얻은 후 이를 THF중에서 HCl로 처리하여 Boc-기를 제거하고, 이어서 Boc-Asp(OBzl)-과 반응시켜 보호된 펜타펩타이드 Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH를 얻는다. 이 화합물의 Boc-기를 HCl로 처리하여 제거하고 이어서 생성물 HCl·H-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH를 Boc-Val-Osu와 커플링시켜 Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(OBzl)-Glu(OBzl)-OH를 순수결정으로 얻는다.
전술한 헥사펩타이드의 말단글루탐산 잔기상의 α-카복실기를 HOBT 존재하에서 커플링제로 DCC를 사용하여 등량의 하이드라진과 반응시켜 하이드라진 작용기로 전환시켜 원하는 보호된 헥사펩타이드 하이드라지드 Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2를 좋은 수율로 순수결정성 고체형태로 분리시킨다.
보호된 테트라펩타이드 Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 합성하기 위하여 N-하이드록시석신이미드 활성에스테르공정[참조 : Anderson 등의 J.Amer. Chem. Soc. 86,1839(1964)]을 사용한다. Boc-Thr(Bzl)-Osu와 H-Lys(Z)-OH를 반응시켜 오일상의 디펩타이드 Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 얻고 이의 α-아미노말단기를 탈보호시킨 후 Boc-Thr(Bzl)-Osu와 반응시켜 트리펩타이드 Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 결정성 고체로 얻는다. Boc-기를 제거하고 생성물 HCl·H-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 Boc-Ile-Osu와 반응시킨 후 실리카겔컬럼상에서 크로마토그라피시켜 원하는 보호된 테트라펩타이드 Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 순수결정으로 얻는다. 이 테트라펩타이드프래그먼트의 아미노말단기를 탈보호시키고 보호된 헥사펩타이드 Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2와 아자이드법을 이용하여 축합시켜 보호된 데카펩타이드 Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 좋은 수율로 얻는다.
데카펩타이드 화합물의 Boc-기를 TFA로 제거하고 이어서 N-말단테트리펩타이드 Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2와 아자이드공정에 따라 커플링시켜 원하는 보호된 테트라데카펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(Bzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(Bzl)-Ile-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 얻는다. 최종 커플링시키기 위하여, 이 아세틸테트라데카펩타이드를 DCC 및 HOBT로 활성화시키고 이어서 수득된 활성에스테르를 상응하는 차단된 화합물을 TFA로 처리하여 얻어진 TFA-H-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl과 반응시켜 보호된 아세틸옥타코사펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 얻는다. 이를 무수 HF로 처리하여 모든 보호기를 제거한 후 이온교환 크로마토그라피로 정제시켜 티모신 α1을 얻는다.
동일한 방법으로, 보호된 테트라데카펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH로부터 유리테트라데카펩타이드 H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH를 얻는다.
또한 본 발명에 따라 [Asn2]-티모신 α1을 티모신 α1의 합성법과 동일한 방법으로 합성할 수 있다. N-말단아세틸테트라펩타이드하이드라지드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2외의 모든 중간물질은 동일하다. 이 화합물을 합성하기 위하여, Boc-Ala-Ala-OH를 먼저 Boc-Ala-Ala-OBzl로 전환시키고 Boc-기를 HCl로 처리하여 선택적으로 제거하여 디펩타이드에스테르염 HCl·H-Ala-Ala-OBzl을 얻는다. 이 디펩타이드를 Boc-Asn-OH와 DCC/HOBT공정 [참조 :
Figure kpo00002
및 Geiger, Chem. Ber. 103,788(1970)]에 따라 커플링시키고 생성된 보호된 트리펩타이드에스테르 Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl을 THF중에서 HCl로 처리하여 Boc-기를 제거한다. 이어서 생성된 HCl.H-Asn-Ala-Ala-OBzl을 H3C-CO-Ser(Bzl)-OH·DCHA와 축합시켜(DCC/HOBT공정) 원하는 보호된 테트라펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Bzl을 얻는다.
이 화합물을 가하이드라진 분해시켜 상응하는 하이드라지드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2를 좋은 수율로 얻고 이 하이드라지드를 데카펩타이드 TFA·H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH와 축합시켜 보호된 테트라데카펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 생성한다. 이어서 이 화합물을 탈차단된 C-말단테트라데카펩타이드 TFA염과 커플링시켜 상응하는 보호된 [Asn2]-티모신 α1을 얻는다. 이를 무수 HF로 처리하여 모든 보호기를 제거하고 컬럼이온-교환 크로마토그라피로 정제시켜 원하는 [Asn2]-티모신 α1을 얻는다. 반면에 보호된 테트라데카펩타이드 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 사용하여 동일한 방법으로 처리하여 아세틸화된 테트라데카펩타이드 H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH를 얻는다.
본 발명의 다른 면에서, 상기 티모신 α1및 [Asn2]-티모신 α1의 합성에 사용된 상기의 여러 중간생성물은 T-세포의 조절, 분화 및 작용에 대해 효과를 나타냄을 발견하였다. 즉, 그 중간생성물은 다음과 같다.
Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn ; Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn ; Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn ; H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys ; 및 H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys.
티모신 α1,[Asn2]-티모신 α1, 또는 전술한 신규의 옥타-, 운데카-, 테트라데카펩타이드 및 그들의 약학적으로 무독한 염류들은, 온혈동물에게 정맥내 피하, 근육주사 등의 비경구 경로로 투여한다. 이 화합물들은 강력한 면역항진제로 1일 용량은 정맥내 투여시 1 내지 100㎎/㎏이다. 그러나 용량은 치료하는 상태, 상태의 경, 중 및 치료지속시간에 따라 다르다. 약제학적 용도에 적절한 제형은 티모신 α1,[Asn2]-티모신 α1또는 전술한 펩타이드 동결건조물 1㎎이며 이는 사용시에 무균수 또는 식염수를 가하여 재구성해야 한다.
본 발명에서는 티모신 α1,[Asn2]-티모신 α1및 전술한 펩타이드 프래그먼트들의 약학적으로 무독한염도 포함되며 적당한 염으로는 나트륨염, 칼륨염 또는 구아니딘 같은 강유기염기와의 염이 포함된다. 또한 이들 양이온의 짝이온, 즉 클로라이드, 설페이트, 포스페이트, 말레에이트, 아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 석시네이트, 말레리트, 아스콜베이트도 포함된다.
본문에서 사용되는 약자는 다음의 의미를 지닌다. Boc=3급-부틸옥시카보닐 ; Bzl=벤질 ; DCC=디사이클로헥실카보디이미드 ; DMF=디메틸포름아미드 ; THF=테트라하이드로푸란 ; HOSu=N=-하이드록시석신이미드 ; 트리톤 B=트리메틸벤질암모늄 하이드록사이드의 40% 메탄올용액 ; NMM=N-메틸모르폴린 ; CHA=사이클로헥실아민 ; DCHA=디사이클로헥실아민 ; Z=벤질옥시카보닐 ; DMSO=디메틸설폭사이드 ; TFA=트리플루오로아세트산 ; TLC=박층크로마토그라피 ; Et3N=트리에틸아민 ; HOBT=1-하이드록시-벤조트리아졸.
다음 실시예는 티모신 α1및 [Asn2]-티모신 α1의 합성법을 상세히 설명한 것이다.
[실시예 1]
Boc-Asn-OBzl
Boc-Asn-OH(11.0g, 47.5밀리몰)을 200ml의 메탄올에 용해시키고 20ml의 물을 가한다. 이 용액에 20% Cs2CO3(~55ml) 수용액을 가하여 pH 7.0으로 조정한다. 혼합물을 증발 건조시키고, 잔유물을 DMF(매회 120ml, 45℃)로 2회 재증발시킨다. 수득된 백색고체를 120ml의 DMF중에서 8.9g의 벤질브로마이드(52밀리몰)와 함께 6시간동안 교반시킨다. 증발건조시키고 다량의 물로 처리하면 생성물이 곧 고체화된다. 이를 여과하여 모으고 에틸아세테이트에 용해시키고 물로 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수, 증발시켜 고체를 얻고 에틸아세테이트로부터 석유에테르로 결정화시킨다.
수율 : 13.8g(90.3%)
융점 : 120 내지 122℃ ;
Figure kpo00003
=-17.29°(C=1,DMF)
[실시예 2]
Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH
H-Glu(OBzl)-OH(7.0g, 29.5밀리몰)을 유발 및 유봉을 사용하여 곱게 마쇄하고 8.88g(32.3밀리몰)의 Boc-Ala-OSu와 함께 6ml의 NMM존재하, 250ml의 DMF중에서 48시간동안 교반시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 소량의 NMM을 더 가한다. 용매를 증발시키고, 잔유물을 30ml의 에틸아세테이트 및 500ml의 물(2ml의 10% H2SO4를 함유)중에 분배한다. 유기층을 물로 3회 세척하고 Na2SO4상에서 탈수시킨 후 증발 건조시킨다. 생성물을 소량의 에테르중에 가하고 다량의 석유에테르로 처리하여 백색무정형 고체를 얻는데 이는 TLC 결과 균질함을 알 수 있다.
수율 : 11.0g(91.5%)
융점 : 84 내지 88℃ ;
Figure kpo00004
=-8.08°(C=1, DMF)
[실시예 3]
Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
Boc-Asn-OBzl(13.7g, 42.4밀리몰)을 80ml의 THF중에 용해시키고, THF중에서 500ml의 4N HCl로 처리한다. 이 혼합물을 45분간 정치시키면 약간의 생성물이 침전하기 시작한다. 100ml의 에테르로 처리하면 곧 백색고체가 형성된다. 이를 여과하고 에테르로 세척한 후 진공하 NaOH상에서 건조시키면 HCl-H-Asn-OBzl이 생성된다.
수율 : 10.3g(94%)
융점 : 122내지 126℃ ;
Figure kpo00005
=+6.82°; TLC, 균질
Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH(10.4g, 25.4밀리몰), HCl·H-Asn-OBzl(6.56g, 25.4밀리몰) 및 HOSu(5.9g, 50.8밀리몰)을 DMF(250ml, 0℃)중에 용해시키고, DCC(5.7g, 27.6밀리몰)을 가한 후 곧 Et3N(3.5ml)을 가한다. 혼합물을 0℃에서 2시간, 25℃에서 40시간 교반시키며, 이때 반응을 약염기성으로 유지하지 위하여 때때로 약간의 Et3N을 가한다. 생성된 불용성 부산물을 여과하고 여액을 증발 건조시킨다. 유상의 잔유물을 물로 처리하여 고체화시킨다. 조생성물을 CHCl3중에 가하고, 물로 3회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 소량으로 만든다. 형성된 소량의 고체(디사이클로헥실우레아로 심하게 오염되어 있다)를 여과하고 여액을 석유에테르로 처리하여 결정성 물질을 얻는다.
수율 : 8.0g(51.4%)
융점 : 102 내지 105℃ ;
Figure kpo00006
=-12.05°(C=1,DMF)
[실시예 4]
Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH
H-Glu(OBzl)-OH(4.74g, 20밀리몰)을 유발 및 유봉을 사용하여 곱게 갈고, Boc-Glu(OBzl)-OSu(0.7g, 20밀리몰)과 함께 3.6ml의 NMM존재하에 DMF중에서 36시간동안 교반시킨다. 이어서, 용액을 증발시켜 시럽상으로 하고, 물로 처리한다. 유상의 침전을 에틸아세테이트중에 가하고, 5% HOAC 및 물(3회)로 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고, 증발건조시켜 14.03g의 투명한 오일을 얻는다. 이를 석유 에테르중에 액침시켜 10.2g(90.0%)의 유상 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH를 얻는다. TLC결과 생성물이 균일함을 알 수 있다.
Figure kpo00007
=-7.59°(C=1, DMF)
[실시예 5]
Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl(28.2g, 46밀리몰)을 THF중에서 1.1ℓ의 4N HCl로 1시간동안 처리하고, 용매 및 과잉의 산을 증발시키면 오일이 남는데 이를 새로운 THF와 함께 2번 더 증발시킨다. 이잔유오일을 다량의 에테르로 처리하여 고체화하고 이 고체 HCl·H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl을 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH(25.6g, 46밀리몰)를 HOSu(10.6g, 92밀리몰) 및 DCC(10.9g, 53밀리몰)과 함께 0℃, DMF중에서 1시간동안 교반하고, 다시 25℃에서 48시간동안 교반한다. 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 Et3N(총 Et3N 약 16ml)을 전반에 걸쳐 가하고, 불용성 부산물을 여과한 후, 여액을 증발 건조시킨다. 조생성물을 CHCl3중에 용해시키고, 물로 3회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고, 증발건조시킨다. 조생성물을 석유에테르로 처리하여 고체화시키고 이소프로판올로 재결정시킨다.
수율 : 28.9g(59.8%)
융점 : 169내지 175℃ ;
Figure kpo00008
=-11.78°(C=1, DMF)
[실시예 6]
Boc-Val-Val-OH
Boc-Val-OSu(12.6g, 40밀리몰)과 H-Val-OH(4.68g, 40밀리몰)을 2ml의 Et3N의 존재하에 DMF(250ml)중에서 96시간동안 축합시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 Et3N을 필요하면 더 가한다. 잔유불용성 물질을 여과하고 여액을 증발 건조시킨다(45℃). 잔유물을 에테르와 희황산(약 1%)에 분해하고 유기층을 물로 3회 세척한 다음, Na2SO4상에서 탈수시킨 후, 증발시켜 거품상 유리물질을 얻는다. 생성물을 에테르 및 석유에테르로 결정화시킨다.
수율 : 12.2g(96.4%)
융점 : 155 내지 158℃ ;
Figure kpo00009
=+1.10°(C1, DMF)
[실시예 7]
Boc-Glu(Bzl)-Val-Val-OH·CHA
Boc-Val-Val-OH(40.5g, 128밀리몰)을 THF중에서 1.8의 4N HCl로 60분간 처리하고, 증발시켜 과잉의 산 및 용매를 제거한 후, 에테르로 처리하면 34.5g의 HCl·H-Val-Val-OH를 백색무정형 분말로 얻는다. 이를 Boc-Glu(OBzl)-OSu-(55.6g, 128밀리몰)로 54ml의 Et3N 존재하 1ℓ의 DMF중에서 24시간동안 처리한다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 물질을 제거하고, 여액을 증발 건조시킨다. 유상의 잔유물을 EtOAc (1.5ℓ)중에 가하고, 5% HOAc로 2회, 이어서 물로 3회세척한다. 유기층을 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발 건조시켜 무색의 투명한 오일을 얻는데 이는 결정화되지 않는다. 이를 3.2ℓ의 에테르에 용해시키고, CHA(17ml)로 처리하여 혼합물의 pH(습윤 pH페이퍼)를 7.5로 조정한다. 수득된 고체염을 모아 메탄올 및 에테르로 재결정시킨다.
수율 : 58.9g(72.7%)
융점 : 158 내지 160℃ ;
Figure kpo00010
=-33.41°(C=1, MeOH)
[실시예 8]
HCl·H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (3.9g, 3.48밀리몰)을 TMF중에서 15ml의 4N HCl로 30분간 처리한다. 약간의 결정이 생성되기 시작하면 에테르 (210ml)를 가하고, 침전된 고체를 모아 에테르로 세척한다. 조물질을 메탄올 및 에테르로 결정화시킨다.
수율 : 2.58g(75.1%)
융점 : 148 내지 151℃ ;
Figure kpo00011
=-3.65°(C=1, DMF)
[실시예 9]
Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
분액여두를 이용하여 Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH·CHA 1.69g, 2.66밀리몰)을 물(40ml) 및 에틸아세테이트(40ml)중에 현탁시키고 4ml의 1M H2SO4를 가한다. 심하게 진탕시켜, 고체를 용해시키고, 유기층을 물로 수회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수키시고 증발시켜 1.45g의 오일을 얻는다.
수득된 유리 트리펩타이드를 HOSu (0.612g, 5.32밀리몰) , NMM (0.3ml, 2.66밀리몰) 및 DCC (0.63g, 3.06밀리몰) 존재하에 15ml의 DMF중에서 2.58g의 HCl·H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (2.61밀리몰)과 0℃에서 1시간, 25℃에서 60시간 축합시킨다. 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 필요하면 NMM을 더 가한다. 불용성 부산물을 여과하여 버리고, 여액을 증발 건조시킨다(45℃). 잔유 유상의 물질을 물로 처리하면 고체화된다. 조생성물을 DMF (50ml)중에 용해시킨 후, 메탄올(300ml)로 침전시킨다.
수율 : 2.25g (58.7%)
융점 : 277내지 280℃ :
Figure kpo00012
=-12.43°(C=1, DMF)
[실시예 10]
Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH·DCHA
Boc-Lys(Z)-OH (15g, 39.5밀리몰)을 HOSu (5.8g, 50.5밀리몰) 및 DCC (8.66g, 42밀리몰)와 함께 TMF (250ml)중에서 3시간동안 교반시킨다. 불용성 부산물을 여과하고, 여액을 증발 건조시킨다. 잔유의 시럽상 물질(24.2g)을 이소프로판올(150ml) 및 석유에테르 (150ml)로 처리하여 오일상 생성물(21g)을 얻는데, 이는 결정화되지 않는다. 조활성 에스테르 Boc-Lys(Z)-OSu를 사용하여 5.5ml의 Et3N존재하에 DMF (250ml)중에서 H-Lys(Z)-OH (10.6g, 38밀리몰)과 72시간동안 축합시킨다. 이때 반응혼합물을 약염기성으로 유지하기 위하여 때때로 소량의 Et3N을 더 가한다. 소량의 불용성물질을 여과하여 버리고, 여액을 증발 건조시킨다(45℃). 유상 잔유물을 1ℓ의 5% HOAc로 처리하고, 침전된 생성물을 에틸 아세테이트로 추출한 후, 유기층을 물로 세척하고 Na2SO4상에서 탈수시킨 다음 증발시켜 오일을 얻는다. 이를 DCHA (10ml)를 함유하는 에틸 아세테이트 (300ml)로 염의 형태로 결정화시키고 메탄올 및 에테르로 재결정화시킨다.
수율 : 22.7g (72.5%)
융점 : 160 내지 162℃ ;
Figure kpo00013
=-2.21°(C=1, MeOH)
[실시예 11]
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH
Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH·DCHA (10g, 12. 14밀리몰)을 EtOAc(1ℓ) 및 0.1N 황산 (1ℓ)에 분배한다. 유기층을 물로 3회 세척하고, Na2SO4상에서 탈수시킨후, 증발 건조시킨다(7.9g). 수득된 유리산 Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH를 새로 제조된 4N HCl로 TMF중에서 30분간 처리하고 용매 및 과잉의 산을 증발시킨 후(30℃) 잔유물을 TMF로 2회 재증발시킨다. 잔유물을 에테르로 처리하면 고체로 변한다. 염HCl·H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH를 여과하여 모은 후 에테르로 수회 세척하여 6.7g의 백색 분말을 얻는다. 이를 DMF (70ml)중에 용해시키고, 빙욕중에서 냉각시킨 다음 Et3N (1.63ml) 로 처리한 후 Boc-Glu(OBzl)-OSu(5.54g, 12.76밀리몰)로 처리한다. 혼합물을 0℃에서 1시간, 25℃에서 24시간 동안 교반하는데 이때 반응의 pH를 7.5로 유지하기 위하여 EtSN을 더 가한다. 수 ml의 아세트산을 가하여 반응액을 산성(pH 3.5)으로 하고 용매를 증발 제거한다.
이어서 잔유물을 EtOAc중에 가하고 물로 3회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고, 증발 건조시켜 고체로 얻는다. 이를 에테르로 처리하고 에틸아세테이트로 재결정시킨다.
수율 : 7.26g (69.5%)
융점 : 153 내지 155℃ ;
Figure kpo00014
=-2.71 ° (C=1, THF)
[실시예 12]
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (1.7g, 1.16밀리몰)을 TFA (24ml)로 30분간 처리한다. 과량의 산을 증발시키고 (30℃), 잔유물을 에테르로 처리한다. 수득된 분말을 에테르 및 석유에테르로 완전히 세척한 후 진공하 NaOH상에서 탈수시켜 옥타펩타이드의 트리플루오로 아세테이트염을 얻는다(1.71g). 활성에스테르 Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH (0.998g, 1.16밀리몰), HOSu (0.16g, 1.4밀리몰) 및 DCC (0.274g, 1.33밀리몰)을 0℃, 15ml의 DMF중에서 3시간 동안 교반시켜 Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu를 자체내에서 생성시키고 트리펩타이드 활성 에스테르를 함유하는 상기용액에 옥타펩타이트염 CF3COOH·H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (1.71g)을 0.2ml의 Et3N과 함께 가한다. Et3N 몇방울 및 DMF(15ml)를 가하고 혼합물을 25℃에서 3일간 교반시킨다. 젤라틴상의 반고형의 물질이 형성된다. 이를 아세트산으로 산성화시키고 물로 처리한다. 백색 침전을 모아 세척하여 (H2O, MeOH, 에테르) 융점이 310내지 313℃인 조생성물을 2.25g 얻는다. 이를 DMF중에 용해시키고 MeOH로 침전시킨다.
수율 : 1.75g (68.3%)
융점 : 314 내지 316℃ ;
Figure kpo00015
=-13.68°(C=1, DMSO)
TLC 결과 균질함을 확인.
[실시예 13]
Boc-Leu-Lys(Z)-OH·DCHA
Boc-Leu-OSU(4.0g, 12.2밀리몰)과 H-Lys(Z)-OH (3.42g, 12.2밀리몰)을 Et3N (1.7ml) 존재하에 DMF (75ml)중에서 48시간 동안 축합시킨다. 이때 Et3N 을 조금씩 가하여 pH를 7.5로 유지시킨다. 불용성물질을 여과하고 여액을 증발 건조시킨다. 수득된 거품상 유리를 에테르 (200ml)에 용해시키고, 3ml의 DCHA로 처리하여 결정성 물질을 얻고 이를 모아 에테르로 세척한 후 메탄올 및 에테르로 재결정화시킨다.
수율 : 5.7g (69.5%)
융점 : 140 내지 142℃ ;
Figure kpo00016
=-7.20°(C=1, MeOH)
[실시예 14]
Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH
Boc-Leu-Lys(Z)-OH·DCHA (2.97g, 4.4밀리몰)을 유리산으로 전환시키고(EtOAC와 0.1N NH2SO4에 분배함) 수득된 무색오일(2.2g)을 4N HCl로 TFA(40ml)중에서 30분간 처리한다. 과잉의 산과 용매를 증발시키고(30℃), 잔유물을 에테르로 처리한다. 잔유 오일을 에테르중에 용해시키고, 새로운 에테르로 2회 더 증발시킨다. 잔유물을 Et3N(1.85ml) 존재하에 Boc-Asp(OBzl)-OSu(1.85g, 4.4밀리몰)과 철야 교반시킨다.
반응혼합물을 증발 건조시켜 오일상 물질을 얻고, 이를 에틸 아세테이트를 가한 후 물로 3회 세척하고 Na2SO4상에서 탈수시킨 다음, 다시 증발 건조시킨다. 조생성물을 에틸 아세테이트 및 석유 에테르로 결정화시킨다.
수율 : 1.52g (49.6%)
융점 : 109 내지 111℃ ;
Figure kpo00017
=-16.14°(C=1, DMF)
[실시예 15]
Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl(1.2g, 0.545밀리몰)을 35ml TFA와 30분간 처리한다. 과잉의 산을 급히 증발시키고, 잔유물을 에테르로 수회 처리하여 1.2g의 운데카펩타이드 TFA-염을 백색 분말상태로 얻는다. 이를 DMF(5ml)및 DMSO(2ml)의 혼합물중에 용해키고, Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH(0.381g, 0.545밀리몰)을 HOSu(0.126g, 1.1밀리몰) 및 DCC(0.124g, 0.599밀리몰)과 함께 0℃, 3ml의 DMF 중에서 3시간 교반함으로써 자체내에서 생성된 Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Osu로 처리한다. 트리펩타이드 활성 에스테르 및 운데카펩타이드를 함유하는 혼합물을 0℃에서 2시간, 25℃에서 3일간 교반시키며 이때 반응의 pH를 약염기성으로 유지시키기 위하여 Et3N을 반응도중 조금씩 가한다. 젤라틴상의 물질이 얻어진다. 이를 5% HOAc로 처리하고 얻어진 백색 고체를 여과한 후, 물, 메탄올 및 에테르로 세척하여 융점이 325 내지 326℃ 인 조생성물 1.28g을 얻은 다음 DMF/DMSO(10ml/5ml )및 메탄올(230ml)로 재침전시킨다.
수율 : 1.22g(80.2%)
융점 : 326 내지 327℃ ;
Figure kpo00018
=-15.71°(C=1, DMF/DMSO)
[실시예 16]
Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn
Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl(0.721g, 0.49밀리몰)을 DMF-MeOH-H2O(40ml-30ml-2ml) 중에서 5% Pd/BaSO4(0.5g)상에서 3시간동안 3.4atm으로 수소첨가 반응시킨다. 이 혼합물을 여과하고 여액을 증발 건조시킨다. 이를 5ml의 TFA로 30분간 처리하고 산을 증발시켜 얻은 잔유물을 에테르로 수회 처리한다. 이어서 수득된 백색고체를 물(20ml) 중에 가하고 동결건조시켜 0.47g의 조생성물을 얻는다. 이 화합물을 pH 8.1 암모늄 아세테이트 완충액(NH3로 처리하여 pH 8.1로 한 2% HOAc)으로 평형화시킨 강염기성 폴리스티렌수지(Bic-Rad AGl-X2, 3×32㎝) 컬럼상에 옮기고 컬럼을 각각 200ml의 0.025M, pH 5.5 NH4OAc, 0.025M HOAc, 0.05M HOAc, 0.1M HOAc, 0.25M HOAc, 0.5M HOAc, 0.75M HOAc, 1M HOAc로 차례로 용출시킨다. 12ml의 획분을 모으고 각각의 튜브에서 얻어진 용출물을 TLC로 확인한다. 원하는 물질(튜브 225 내지 229)을 함유하는 획분을 합하고 2회 동결건조시켜 0.223g(48.1%)의 생성물을 얻는데 이는 TLC 및 페이퍼 전기영동 결과 균질화됐음을 알 수 있다.
[실시예 17]
Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl(0.5g, 0.226밀리몰)을 2ml의 TFA 중에 용해시키고 0℃에서 15분간 15ml의 HF와 교반반시킨다. 과잉의 산(0℃)을 증발시키고, 잔유물을 5% 수성 HOAc 중에 용해한 다음 에테르로 3회 세척하고 증발시킨 후 동결 건조시켜 0.34g의 조생성물을 얻는다. 이를 전술한 바와 같이 (실시예 16) 이온 교환컬럼상에서 크로마토그라피시켜 0.13g(42.1%)의 순수한 표제 생성물을 얻는다.
Figure kpo00019
=-85.65°(C=1, H2O)
[실시예 18]
Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn
Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Gul(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl(1.128g, 0.404밀리몰)을 7ml의 아니솔과 혼합하고 0℃에서 25ml 무수 HF로 15분간 처리한다. 과잉의 산을 증발시키고 (0℃) 잔유물을 에테르와 물중에 분배한다. 수층을 에테르로 2회 세척하고, 용량이 처음의 반정도로 될 때까지 증발시킨 후 동결 건조시켜 0.69g의 조생성물을 얻은 다음 이를 실시예 16 및 17과 같이 크로마토그라피시킨다. 튜브 101 내지 120에서 용출된 물질을 모아 동결건조시켜 0.25g의 물질(소량의 불순물을 포함함)을 얻고, 이를 동일한 컬럼상에서 재 크로마토그라피시켜 0.155g(22%)의 순수한 생성물을 얻는다. 페이퍼 전기영동에 의해 생성물이 균일화되어 있음을 알 수 있다.
Figure kpo00020
=-86.27°(C=1, 0.1N HCl)
[실시예 19]
Ac-Ser(Bzl)-OH·DCHA
H-Ser(Bzl)-OH(18.6g, 95.4밀리몰)을 45ml의 트리톤 B (트리메틸벤질암모늄 하이드록사이드의 40%메탄올 용액)에 용해시키고 증발 건조시킨후, 잔유물을 DMF(매회 250ml)로 2회 재증발시킨다. 오일상 잔유물을 DMF(250ml)중에 가하고 Ac-Osu(16.5g, 95.4 밀리몰)과 함께 5시간 교반한다. 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 약간(~5ml)의 NMM을 가한다. 이어서 산(~5ml)을 가하고 , 용매를 증발 제거한 후 오일상 잔유물을 5% HOAc 및 EtOAc에 분배한다. 수성층을 EtOAc로 2회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 약 300ml(원래 부피의 1/3)로 만든다. DCHA를 약염기성 용액중에 가하면 (~35ml) 곧 결정성 생성물이 형성된다.
조생성물(32.5g, 융점 : 135 내지 145℃)을 EtOH(150ml) 및 에테르(900ml)로 재결정시킨다.
수율 : 17.8g(44.7%)
융점 : 166 내지 168℃ ;
Figure kpo00021
=+34.18°(C=1, MeOH)
[실시예 20]
HCl·H-Ser(Bzl)-OBzl
Boc-Ser(Bzl)-OH(6.3g, 21.4밀리몰)을 MeOH(75ml) 및 H20(7.5ml) 중에 용해시키고 20% CS2CO3(28ml)를 중성 (pH 7.0)이 될 때까지 상기 용액을 가한다. 용매를 증발 제거시키고, 잔유물을 DMF(50ml)로 2회 재증발시킨후, 이 염을 25ml의 DMF 중에서 벤질브로마이드(4.28g, 25 밀리몰)와 함께 교반시킨다.
용매를 증발시키고, 오일상 잔유물을 EtOAc로 추출한 후, H2O로 3회 세척하고, Na2SO4상에서 탈수시킨 다음, 증발 건조시켜 무색투명한 오일(8.9g)을 얻는다. 이 단계에서 화합물은 결정화되지 않는다. 이를 통상의 방법(THF 내에서 4N HCl로 30분간 처리)으로 Boc-기를 제거하여 HCl 염으로 전환시키고, 끝처리하여 백색 고체를 얻고 이를 재결정시켜 4.99g(72.8%)의 표제화합물을 얻는다.
융점 :138 내지 140℃ ;
Figure kpo00022
=-23.86°(C=1, MeOH)
[실시예 21]
H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl
HCl·H-Ser(Bzl)-OBzl(3.38g, 10.5밀리몰)을 50ml의 DMF 중에 용해시키고, AC-OSu(1.73g, 11밀리몰)로 처리한후 3ml의 Et3N으로 처리한다. 이 혼합물을 18시간 동안 교반하고, 이어서 소량의 HOAc로 산성화시킨다. 용매를 증발시키고 오일상 잔유물을 EtOAc 및 5% HOAc에 분배한다. 유기층을 물로 3회 세척하고, Na2SO4상에서 탈수시킨 후, 증발시켜 투명한 오일을 얻고 이를 석유에테르로 처리하면 즉시 고체화된다(3.2g). 생성물을 EtOAc 및 석유에테르로 재결정시켜 2.7g(78.6%)의 생성물을 얻는다.
융점 : 89 내지 91℃ ;
Figure kpo00023
=-14.91°(C=1, MeOH)
또 다른 방법으로 동일한 화합물을 제조할 수 있다 : H-Ser(Bzl)-OH(18.6g, 95.4밀리몰)을 45ml의 트리톤 B중에 용해시키고, 증발 건조시킨 후 잔유물을 (100ml)로 2회 재증발시킨다. 잔유물을 150ml의 DMF 중에서 AcOsu(16.9g, 95.4밀리몰) 과 함께 20시간 교반시키고, N-메틸-모르폴린을 때때로 가하여 반응을 악염기성으로 유지시킨다. 용매를 제거하고, 생성물을 EtOAc로 추출한 후, 소량의 10% HOAc로 세척한 다음 H2O로 세척하고(이때 생성물은 수용성이므로, 소량의 물을 사용한다), Na2SO4상에서 탈수시킨 다음, 증발 건조시켜 투명한 오일(14.5g, Ac-Ser(Bzl)-OH)을 얻는다. 이 화합물은 결정화되지 않는다. 이를 MeOH(30ml)와 H2O(30ml)의 혼합물중에 용해시키고, 20% Cs2CO3로 pH 7.0으로 조정한 다음, 증발시켜 고체를 얻는다. 염을 DMF로 2회 이상 재증발시키고, 250ml의 DMF 중에서 18시간동안 벤질브로마이드(15.4g, 91밀리몰)와 함께 교반한다. 용매를 증발시키고 잔유물을 600ml의 물에 가한 다음 형성된 오일상 생성물을 EtOAc로 추출한다. 물로 세척하고, Na2SO4상에서 탈수시킨후, 증발시켜 시럽상 물질을 얻고 여기에 결정핵을 넣어 결정화시킨 다음 석유에테르 및 EtOAc로 재결정화시켜 10.42g(합계32.2%)의 생성물을 얻는다.
융점 : 89 내지 91℃
[실시예 22]
H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2
H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl(2.2g, 6.73밀리몰)을 75ml의 에탄올중에 용해시키고 5ml의 H2NNH2와 함께 철야 교반시킨다. 침전된 불용성 물질을 여과하고 여액을 증발시켜 오일을 얻고, 이를 에테르로 처리하여 고체화시킨 다음 소량의 에탄올 및 에테르로 재결정화시킨다.
수율 : 1.40g(82.8%)
융점 : 128 내지 130℃ ;
Figure kpo00024
=+5.80°(C=1, MeOH)
[실시예 23]
Boc-Ala-Ala-OH
L-알라닌(3.57g, 40밀리몰)을 18.8ml의 트리톤 B(40밀리몰)중에 용해하고 증발 건조시킨후, 얻어진 오일상 잔유물을 매회 30ml의 DMF로 2회 재증발시킨다. 생성된 염을 11.45g의 Boc-Ala-Osu(40밀리몰)와 40ml의 DMF 중에서 4ml의 NMM을 가하면서 20시간 교반시킨다. 용매를 제거하고 잔유물을 10% HOAc(100ml)중에 가한다. 생성물을 EtOAc(4×100ml)로 추출하고, 소량의 H2O로 2회 세척한 후, Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 소량의 용적으로 만들고, 뿌옇게 변할 때까지 석유에테르로 처리한다. 형성된 결정을 냉동기중에서 철야 저장한다.
수율 : 8.2g(76.3%)
융점 : 115 내지 118℃
[실시예 24]
HCl·H-Ala-Ala-OH
Boc-Ala-Ala-OH(32.6g, 139밀리몰)을 3ℓ의 4N HCl로 THF중에서 30분간 처리한다. 증발시키고 통상의 방법으로 끝처리하여 오일을 얻고 이를 에테르로 처리하여 고체화시킨다. 생성물을 메탄올 및 에테르로 재결정시켜 융점 209 내지 211℃인 표제화합물 9.1g(33.3%)을 얻는다.
[실시예 25]
Boc-Ala-Ala-OBzl
Boc-Ala-Ala-OH(7.23g, 27.8밀리몰)을 200ml의 메탄올 및 20ml의 물의 혼합물중에 용해시키고, Cs2CO3용액(20% 수용액)을, pH가 7.0에 도달할 때까지 가한다. 생성된 중성용액을 증발 건조시키고 잔유물을 DMF(150ml)로 2회 증발시킨 후, 얻어진 젤라틴성 고체를 120ml의 DMF 중에서 벤질브로마이드(7.2g, 42밀리몰)와 함께 15시간 교반시킨다. 용매를 증발 제거시키고 500ml의 물로 처리한다. 오일상으로서 침전된 생성물을 정치시키면 점차로 고체화된다. 이를 EtOAc(400ml)중에 가하고, 물로 3회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시킨 다음 증발시켜 시럽상 물질을 얻고 이를 석유에테르로 처리하면 결정화되기 시작한다. 이 생성물을 석유에테르 및 EtOAc로 재결정시켜 7.2g(73.8%)의 표제화합물을 얻는다.
융점 : 71 내지 73℃
[실시예 26]
HCl·H-Ala-Ala-OBzl
Boc-Ala-Ala-OBzl(6.0g, 17.51밀리몰)을 THF 중에서 380ml의 새로 제조된 4N HCl로 30분간 처리한다. 과잉의 산 및 용매를 증발 제거시키고, 잔유의 시럽상 물질을 새로운 THF로 2회 재증발시킨다. 생성물은 에테르로 처리하면 곧 고체화한다. 이를 MeOH및 에테르로 재결정시켜 4.30g(87.4%)의 표제생성물을 얻는다.
융점 : 154 내지 156℃ ;
Figure kpo00025
=-38.86°(C=1, MeOH)
[실시예 27]
Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH·DCHA
HCl·H-Ala-Ala-OH(2.36g, 12밀리몰)을 20ml의 DMF 중에 용해시키고, 빙욕중에서 냉각시킨 후 1.68ml의 Et3N(12밀리몰)에 이어서 Boc-Asp(OBzl)-Osu(12밀리몰)을 처리한다. 혼합물을 0℃에서 서서히 2시간, 25℃에서 철야 교반시키는데, 이때 반응의 pH를 8.0으로 유지하기 위하여 Et3N 1당량(12밀리몰)을 소량씩 가한다. 수 ml의 HOAc를 가하고, 산성화된 혼합물을 증발 건조시킨다. 생성물을 EtOAc로 추출하고 H2O로 3회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 오일상 잔유물(6g)을 얻는다. 이를 EtOAc중에 용해시키고, DCHA를 사용하여 pH 8.0으로 조정한다. 침전된 결정성염을 이소프로판올 및 석유 에테르로 재결정시킨다.
수율 : 5.1g(65.7%).
융점 : 138 내지 141℃ ;
Figure kpo00026
=-13.33°(C=1, MeOH)
[실시예 28]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH
Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH·DCHA(3.5g, 5.4밀리몰)을 500ml의 EtOAc및 10ml의 10% 황산을 함유하는 350ml의 물중에 분배한다. 수층을 EtOAc(250ml)로 다시 1회 추출하고 EtOAc층을 모아 H2O로 2회 세척한후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발 건조시키면 유리상 고체 Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH(2.5g)을 얻는다. 이 물질을 200ml의 새로 제조된 4N HCl로 TMF중에서 30분간 처리하고, 32℃에서 증발시켜 시럽상의 물질을 얻고 THF로 2회 더 재증발시킨다. 유상잔유물을 에테르로 처리하여 고체화시킨다. 이 HCl·H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH(1.93g, 4.83밀리몰)은 H3C-CO-Ser(Bzl)-N3와 아자이드 커플링시키는 데 이용한다. 그런데 이 물질은 1.24g의 H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2(4.9밀리몰)을 25ml의 DMF(-25℃) 중에서 7.42ml의 3.3N HCl 및 0.99ml의 N-아밀나이트리트(7.35밀리몰)와 -30℃에서 30분간 교반시켜 제조한다. 제조된 아자이드 용액을 -35℃로 냉각시키고, 4.1ml의 Et3N과 혼합한후 HCl·H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH(1.93g)의 백색분말로 처리한다. 혼합물을 -20℃에서 30분간, 4℃에서 2일간 교반시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 소량의 Et3OH을 더 가한다. 통상적인 방법으로 완결지어 결정성과를 얻고 이를 THF 및 석유에테르로 재결정시킨다.
수율 : 1.85g(65.6%)
융점 : 167 내지 170℃ ;
Figure kpo00027
=-18.91° (C=1, DMSO)
[실시예 29]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH(0.825g, 1.41밀리몰)을 4ml의 DMF 중에 용해시키고 빙욕중에서 0℃로 냉각시킨다. 이 용액에 H2NNH2(54.3㎎ ; 1.69밀리몰)을 가하고 이어서 HOBT·H2O(0.475g, 3.10밀리몰) 및 DCC(0.32g, 1.55밀리몰)을 가한다. 혼합물을 NMM으로 pH 7.5로 조정하고, 0℃에서 2시간, 25℃에서 17시간동안 교반시킨다. 이때 반응물이 겔상태로 변한다. 이를 메탄올로 희석시키고, 잔유고체물질을 흡인여과시킨후 메탄올, 에테르 및 석유에테르로 충분히 세척하여 융점이 229 내지 232℃인 물질을 얻는다. 이어서 생성물을 DMF 및 MeOH 로 침전시킨다.
수율 : 0.5g(61.0%)
융점 : 230 내지 232℃ ;
Figure kpo00028
=-17.94°(C=1, DMSO)
[실시예 30]
Boc-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2
DMF(4ml)중에 용해되어 있는 Boc-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH(0.55g, 0.86밀리몰)을 0℃에서 H2NNH2(32.9g, 1.03밀리몰), HOBT·H2O(288.2㎎, 1.88밀리몰) 및 DCC(193.9㎎, 0.941밀리몰)로 처리한다. 수적의 NMM을 가하여 혼합물의 pH를 7.5로 조정하고, 0℃에서 2시간, 이어서 25℃에서 17시간 교반시킨다. 생성된 부산물인 고체를 여과하고 여액을 증발 건조시킨다. 오일상 잔유물을 이소-프로판올을 2회 결정화시킨다.
수율 : 0.13g(23.1%)
융점 : 184 내지 187℃ ;
Figure kpo00029
=-14.22°(C=1, DMSO)
[실시예 31]
Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl
HCl·H-Ala-Ala-OBzl(4.25g, 14.83밀리몰)을 DMF(60ml) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각한 후 Boc-Asn-OH(3.45g, 14.83밀리몰), HOBT(4.02g, 29.6밀리몰) NMM(2ml) 및 DCC(3.37g, 16.35밀리몰)와 함께 0℃에서 2시간, 이어서 25℃에서 20시간 교반시킨다. NMM을 반응도중에 때때로 가하여 반응을 약염기성으로 유지시킨다. 불융성 부산물을 여과하고 여액을 증발 건조시킨다. 오일상 잔유물을 물로 처리하면 곧 고체화된다. 이를 EtOAc중에 가하고, H2O로 3회 세척한후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 소량의 용적으로 만들면 결정이 석출되기 시작한다. 동용량의 석유 에테르를 가하고 혼합물을 철야정치시킨 다음 조생성물을 석유에테르 및 THF로 재결정시킨다.
수율 :5.2g(75.6%)
융점 :153 내지 155℃ ;
Figure kpo00030
=-55.61(C=1, MeOH)
[실시예 32]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl
Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl(2.2g 4.75밀리몰)을 THF 중에서 220ml의 4.0N HCl로 30분간 처리한다. 과잉의 산 및 용매를 증발 제거시키고 잔유물을 새로운 THF로 2회 재증발시킨다. 오일살 잔유물을 에테르로 처리하여 고체화시킨다. 이를 새로운 에테르로 처리하고 모아 백색분말(1.85g)을 얻는다. 수득된 염산염을 40ml의 DMF 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키면서 H3C-CO-Ser(Bzl)-OH·DCHA(1.97g, 4.75 밀리몰)을 가한다. 0℃에서 30분간 교반시키고, DCHA·HCl의 침전이 관찰되면 HOBT(1.19g)을 가하고, 이어서 DCC(1.08g, 5.23밀리몰)을 가한다. 수적의 NMM를 가하여 반응의 pH를 7.5로 유지하면서 0℃에서 2시간 25℃에서 철야 교반시킨다. 불용성 부산물을 여과하여 제거하고 여액을 증발시켜 담색의 고체괴를 얻는다. 이를 EtOAc 및 H2O로 충분히 세척하여 담황색 분말을 얻고 이를 DMF(40ml) 및 이소-프로판올(500ml)로 결정화시킨다.
수율 : 1.57g(56.9%)
융점 : 213 내지 215℃ ;
Figure kpo00031
=-23.11°(C=1, DMSO)
[실시예 33]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl(1.57g, 2.69밀리몰)을 20ml의 DMF중에 용해시키고, 2ml의 H2NNH2와 함께 18시간 교반시킨다. 수득된 고체 생성물을 모아 DMF, EtOH 및 에테르로 충분히 세척한다.
수율 : 1.22g(89.6%)
융점 : 262 내지 264℃ ;
Figure kpo00032
=-26.7°(C=1, DMSO)
[실시예 34]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OBzl
HCl·H-Ala-Ala-OBzl(1.68g, 5.83 밀리몰)을 DMF(8ml)와 CH2Cl2(20ml)의 혼합물중에 용해시키고 빙욕중에서 냉각시킨다. NMM(0.6ml), Boc-Asp(OBzl)-OH(1.88g, 5.83밀리몰) 및 DCC(1.27g, 6.14밀리몰)을 가하고, 이 혼합물을 0℃에서 2시간, 25℃에서 15시간 교반시키고, 이때 수적의 NMM을 더 가하여 반응을 약염기성으로 유지시킨다. 불융성 부산물을 여과한후 여액을 증발 건조시킨다. 잔유물을 EtOAc로 추출하고, H2O로 3회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시킨 다음 증발시켜 오일상 물질을 얻는다. 이를 THF(55ml)중에 가하고 여과하여 잔유의 디사이클로헥실 우레아를 제거하고, 증발시켜 투명한 오일(3.3g)을 얻는다. 생성물 Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OBzl은 결정화되지 않는다. 이 물질을 200ml의 새로 제조된 4.0N HCl로 THF중에서 30분간 처리하고 통상의 방법으로 완결지어 HCl·H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OBzl(1.89g, 3.85밀리몰)을 무정형 분말로 얻는다. 이 트리펩타이드 에스테르 염산염을 DMF(22ml)중에 용해시키고 빙욕중에서 냉각시킨 후 Ac-Ser(Bzl)-OH·DCHA(1.61g, 3.85밀리몰)과 함께 30분간 교반시킨다. 이어서 HOBT(1.04g, 7.7밀리몰), NMM(0.4ml) 및 DCC(0.82g, 4.24밀리몰)을 가하고, 혼합물을 0℃에서 2시간, 25℃에서 17시간 교반시킨다. 불용성 부산물을 여과하고 여액을 증발, 건조시킨다. 고체괴를 EtOAc중에 용해시키고, H2O, 5% NaHCO3, 5% HOAc, H2O로 세척한후, Na2SO4상에서 탈수시킨다. 증발시키면 결정이 생성되기 시작한다. 용액을 EtOAC중 25% 석유에테르 동 용량으로 처리한 후, 정치시키면 결정화가 완결된다. 생성물을 이소프로판올과 펜탄으로 재결정시킨다.
수율 : 0.91g(23.2%)
융점 : 154 내지 158℃ ;
Figure kpo00033
=-35.95°(C=1, MeOH)
[실시예 35]
H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-OH.
Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OBzl(0.6g, 0.888밀리몰)을 파르 장치중에서 0.62g 촉매 (5%Pd/BaSO4) 존재하에 50psi에서 35ml의 MeOH, 15ml의 H2O, 1ml의 HOAc의 용매혼합물중에서 4시간 동안 수소첨가 반응시키고, 촉매를 여과 제거한 후 여액을 농축시키고 동결건조시켜 0.38g의 조생성물을 얻는다. TLC를 실시하여 보면 주생성물외에 소량의 불순물 두 가지가 존재함을 알 수 있다. 이 화합물을 Bio-Rad AG1-X2 컬럼(3×24㎝)(이는 0.2M NaOH, H2O, 0.2M HOAc로 세척하고, 0.025M의 아세트산 암모늄 완충용액과 평형화시켰다)상에서 정제한다. 이 pH에서 시료를 적용하고 다음 농도의 아세트산 용액을 순서대로 사용하여 용출시킨다 ; 0.25M, O.5M , 1.0M , 1.5M , 2.0M , 2.5M, 3.0M, 3.5M, 4.0M, 4.5M, 용출속도는 약 50ml/hr로 조절하고 각각 10ml 획분을 LKB 획분수집기중에 모은다. 각 튜브로부터 화합물 5㎕씩을 실리카겔 TLC판(Merck 60, F-254)상에 스폿팅하고 n-BuOH ; HOAc : EtOAc : H2O(1 : 1 : 1 : 1)로 전개시킨다. 주성분을 함유하는 획분을 합하고 2회 동결 건조시켜 310㎎(86.3%)의 원하는 생성물을 얻는다 ;
Figure kpo00034
=-77.01°(C 1, 10% HOAc)
[실시예 36]
H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-OH.
Ac-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl(0.58g, 0.992밀리몰)을 MeOH(35ml), DMF(5ml), H2O(15ml) 및 HOAc(1.5ml)의 혼합물 중에 용해시키고 1.5g의 촉매존재하에 50psi에서 5시간 수소첨가시킨다. 촉매를 여과하고 여액을 증발시킨후 동결 건조시켜 0.411g의 조생성물을 얻는다. 이를 실시예 35의 같은 컬럼상에서 정제시킨 다음 주획분을 모아 동결 건조시킨다.
수율 : 288㎎(72.2%).
Figure kpo00035
=-83.61°(C=1,10% HOAc)
[실시예 37]
Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH·CHA.
H-Glu(OBzl)-OH(39.4g, 166밀리몰)을 Et3N(2.3ml, 165밀리몰) 존재하에 900ml의 DMF중에서 Boc-Ser(Bzl)-OSu(65.0g, 166밀리몰)과 함께 교반시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 소량의 Et3N을 더 가한다. 투명한 용액을 증발, 건조시키고 오일상 잔유물을 Et3N(1.5ℓ)와 5% HOAc(2ℓ)중에 분배시킨다. 유기층을 물로 2회 세척하고 Na2SO4상에서 탈수시킨 후 농축시켜 맑은 오일(90.0g)을 얻고 이를 3ℓ의 에테르중에 가하고 25ml의 사이클로헥실아민으로 처리한 후 수득된 고체를 메탄올 및 에테르로 재결정시킨다.
수율 : 76.2g(74.8%)
융점 : 154 내지 156.5℃ ;
Figure kpo00036
=6.32°(C=1, MeOH)
[실시예 38]
Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH
Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH·CHA(76.2g, 124밀리몰)을 1.5ℓ의 물 및 1.5ℓ의 EtOAc로 된 혼합물에 현탁시키고, 이 혼합물에 10% 황산을 가하여 산성 (pH 약 2.5)으로 만들고 고체를 용해시킨다. 디펩타이드 유리산을 함유하는 유기층을 물로 2번 세척하고 건조시킨 후 증발 건조시켜 투명한 오일을 얻는다(68.5g). 이를 3ℓ의 새로 제조된 4.1N HCl로 THF중에서 45분간 처리하고 증발시켜 오일상 물질을 얻고 이를 THF로 2회 재증발시킨다. [잔유물 HCl·H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH]을 DMF(500ml)중에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨후 Boc-Ser(Bzl)-Osu(48.66g, 124밀리몰)로 처리하고 곧 27ml의 Et3N로 처리한다. 이 혼합물을 25℃에서 철야 교반한다. 이때 반응을 약염기성으로 유지시키기 위하여 때때로 약간의 Et3N을 가한다. 소량의 불용성 물질을 여과하여 제거하고 여액을 증발시켜 오일상 물질을 얻고 이를 EtOAc에 가한후 5% HOAc(필요하면 추가의 HOAc로 산성하한다) 및 H2O로 세척하고, Na2SO4상에서 탈수시킨 다음 다시 증발, 건조시킨다. 생성물을 석유에테르로 EtOAC부터 결정화시킨다.
수율 : 71.8g(83.7%)
융점 : 112 내지 113℃ ;
Figure kpo00037
=+17.91°(C=1, THF)
[실시예 39]
Boc-Thr(Bzl)-Osu
Boc-Thr(Bzl)-Osu(23.2g, 75밀리몰)을 HOSu(9.5g, 82.5밀리몰) 및 DCC(17.0g, 82.5밀리몰)과 함께 3시간동안 교반시킨다. 불용성 부산물을 여과하고 여액을 증발시켜 오일을 생성하고 이를 에테르(400ml)중에 가한다. 4℃에서 수시간동안 정치시키면 부산물(DCu)이 더 생성된다. 이를 다시 여과하고 여액을 증발시키면 반고형의 물질이 형성되는데 이를 이소-프로핀올로 결정화시켜 29.5g(융점 : 70내지 75°)의 조생성물을 얻은 다음 이 조물질을 EtOH로 재결정시킨다.
수율 : 21.2g(69.8%)
융점 : 104 내지 106℃ ;
Figure kpo00038
=+6.04°(C=1, CHCl3)
[실시예 40]
Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH
Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH(71.6g, 104밀리몰)을 2.7ℓ의 새로 제조된 3.9N HCl과 THF중에서 45분간 반응시키고 이 혼합물을 증발 건조시킨 후 잔유물을 THF로 다시 2회 증발시키면 고체를 얻는다(59.3g ; 융점 : 161 내지 165℃). 이를 모아 에테르로 세척하고 Et3N(25ml) 존재하에 500ml의 DMF중에서 Boc-Thr(Bzl)-Osu(38.2g, 94밀리몰)와 함께 0℃로 1시간동안 교반시킨 후 다시 25℃에서 15시간동안 교반시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 약간의 Et3N(14.5ml)를 수회로 나누어 가한다. 불용성 물질을 여과하고 여액을 증발시켜 오일상 물질을 얻은 후 이를 EtOAc(1.5ℓ)중에 용해하고, 5% HOAc로 1회, H2O로 2회 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 고체물질을 얻은 다음 생성물을 EtOAc 및 석유에테르로 재결정시킨다.
수율 : 64.8g(78.1%)
융점 : 115 내지 118℃ ;
Figure kpo00039
=+11.64(C=1, DMSO)
[실시예 41]
Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH
Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH(54.5g, 61.7밀리몰)을 THF 중에서 HCl(4.1N, 1.5ℓ)로 40분간 처리한 후 통상의 방법으로 완결지어 HCl·H-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH(46.3g, 56.6밀리몰)을 백색분말 형태로 얻는다. 이를 DMF(500ml)중에서 Boc-Asp(OBzl)-Osu(23.7g, 56밀리몰)과 함께 0℃에서, Et3N(16ml) 존재하에 2시간동안 교반시킨다. 혼합물을 25℃에서 15시간 더 교반시키고, 이때 7.4ml의 Et3N을 더 가한다. 생성물을 통상의 방법으로 완결지어 CH2Cl2및 석유에테르로 결정화시킨다.
수율 : 50.35g(82.7%)
융점 : 111 내지 113℃ ;
Figure kpo00040
=+7.21°(C=1, DMSO)
[실시예 42]
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH
Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH(50.0g, 46밀리몰)를 중에서 THF(4.15N)를 사용하여 탈보호시키고 통상의 방법으로 완결지어 45.4g의 백색고체를 얻는다. 이를 THF(1.5ℓ)중에 용해시키고, 에테르(7ℓ)로 처리한다. 0℃에서 철야 정치하여 백색분말을 얻는다(44.0g, 융점 : 179 내지 184℃). 이 물질 HCl·H-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH (43.7g, 42.7밀리몰)의 일부를 500ml의 DMF 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨 후 Boc-Val-Osu(15.4g, 49밀리몰) 및 Et3N(10ml)으로 처리한다. 혼합물을 15시간동안 교반시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 Et3N(7.9ml)를 수회로 나누어 가한다. 불용성 물질을 여과하여 제거하고 여액을 증발 건조시킨다. 오일상 잔유물을 CH2Cl2중에 용해시키고, 5% HOAc, H2O로 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발시켜 소량(0.5ℓ)으로 만들고 석유에테르로 처리한다. 철야 정치시 생성물이 결정화된다. 이를 THF 및 이소프로판올로 재결정시킨다.
수율 : 26.3g(51.4%)
융점 : 174 내지 177℃ ;
Figure kpo00041
=+0.84°(C=1, THF)
[실시예 43]
Boc-Val-Asp(Bzl)-Thr(Bzl)-Ser((Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2.
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH(13.0g, 10.94밀리몰)을 DMF(50ml)중에 용해시키고 0℃로 냉각한 후 H2NNN2(0.421g, 13.14밀리몰) HOBT(3.688g, 24.1밀리몰) 및 DCC(2.48g, 12.04밀리몰)로 처리한다. 반응의 pH가 7.5로 될 때까지 NMM을 가한후 반응혼합물을 18시간동안 교반시키고 여과하여 불용성 부산물을 제거한다. 여액을 증발, 건조시키고, 잔유물을 물로 처리한다. 형성된 고체를 모아 DMF 및 이소프로판올로 결정화 시킨다.
수율 : 8.7g(66.4%)
융점 : 215 내지 218℃ ;
Figure kpo00042
=+7.62°(C=1, DMSO)
[실시예 44]
Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH
Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH(14.0g, 24.5밀리몰)을 THF 중에서 500ml의 4.0N HCl로 30분간 처리하고, 증발 건조시킨후 새로운 THF로 2회 재증발시킨다. 오일상 잔유물을 에테르로 처리하여 고체화시킨다. 건조된 디펩타이드 염산염 분말(11.4g, 21.6밀리몰)을 140ml의 DMF중에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨후 Boc-Thr(Bzl)-Osu(8.8g, 21.6밀리몰)로 처리한 다음 곧 3.5ml의 Et3N으로 처리한다. 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 몇방울의 Et3N을 가하면서 혼합물을 25℃에서 24시간동안 교반시킨다. 이를 5ml의 HOAc로 처리하여 산성화시키고 다량의 물로 희석시킨다. 침전된 고형의 조생성물을 모아 EtOAc 중에 용해시키고, 물로 세척한 후 Na2SO4상에서 탈수시키고 증발건조시켜 유리상 고체를 얻고 EtOAc 및 석유에테르로 결정화시킨다.
수율 : 13.8g(83.7%)
융점 : 110 내지 112℃ ;
Figure kpo00043
=+19.45°(C=1, EtOAc)
[실시예 45]
Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH
Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(z)-OH(41.5g, 54밀리몰)을 THF중에서 500ml의 새로 조제한 3.55N HCl로 25분간 처리하고, 증발시켜 시럽상 물질을 얻은 후 새로운 THF로 2회 재증발시킨다, 오일상 잔유물을 에테르로 처리하여 고체화시킨다. 이 고체를 모아 에테르로 세척하여 트리펩타이드의 조염산염 37.4g을 수득하고 이를 500ml의 DMF 중에 용해시키고 0℃로 냉각시킨후 Boc-Ile-Osu(17.4g, 53밀리몰)로 처리하고 16ml의 Et3N으로 처리한다. 혼합물을 25°C에서 철야 교반시킨다. 이때 반응을 약염기성으로 유지하기 위하여 약간의 Et3N(총 6.2ml)를 더 가한다. 생성된 혼합물을 여과하고 여액을 증발시켜 오일을 얻은후 이를 EtOAc로 추출하고 5% HOAc, H2O로 세척하고 Na2SO4상에서 탈수시킨 후 증발시켜 황색 오일상 물질을 얻는다. 이를 EtCAc 및 석유에테르로 결정화시킨다. 수득된 조생성물(39.6g, 융점 140 내지 142℃)에는 몇종의 소량의 불순물이 포함되어 있다. 이 물질을 실리카겔 60(70 내지 230메쉬) 칼럼(4.7×67㎝)상에서 CHCl3/MeOH(95 : 5, V/V)를 용출제로 하여 크로마토그라피시키고, 원하는 생성물을 함유하는 획분을 모아 증발시켜 오일상 물질을 얻은 후 이를 CHCl3및 석유에테르로 결정화시킨다.
수율 : 19.1g(41.2%)
융점 : 144 내지 146℃ ;
Figure kpo00044
=+2.40°(C=1, CHCl3)
[실시예 46]
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH.
Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH(0.439g, 0.496밀리몰)을 THF중에서 4N HCl로 30분간 처리하고 통상의 방법으로 완결지어 0.39g의 HCl·H-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH를 얻는다. Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2(0.59g, 0.492밀리몰)를 6ml의 DMF 중에 용해시키고 -25℃로 냉각시킨후 THF(2.46밀리몰)중에서 0.57ml의 4.3N HCl로 처리하고 곧 0.1ml의 i-아밀나이트리트(0.74밀리몰)로 처리한다. -20° 내지 -25℃에서 30분간 교반시키고, 온도를 -35℃로 낮추면서 0.42ml의 Et3N및 HCl·H-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH(0.39g, 상기에서 제조됨)을 가한다. 이 혼합물을 -20℃에서 30분간, 이어서 4℃에서 48시간동안 교반시킨다. 이때 반응의 pH를 7.5로 유지하기 위하여 때때로 Et3N를 가한다. 혼합물을 250ml의 5% HOAc로 희석하고 형성된 고체를 모아 물, 메탄올, 에테르로 세척하고 진공하에 NaOH 펠렛상에서 건조시켜 0.82g의 조생성물(융점 244 내지 254℃)을 얻는다. 이를 DMSO중에 용해시키고 메탄올을 가하여 침전시킨다.
수율 : 0.698g(81.7%)
융점 : 268 내지 271℃
[실시예 47]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH.
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(BZl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH(0.698g, 0.358밀리몰)을 10ml의 TFA로 30분간 처리하고, 펩타이드염을 에테르로 처리하여 침전시킨다. 이를 흡인 여과시키고, 에테르로 세척한후 건조시켜 0.652g의 물질(TFA 염으로서 0.333밀리몰)을 얻는다. 다른 별도의 플라스크중에서 H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2(0.17g, 0.335밀리몰)을 7ml의 DMF 중에 현탁시키고, 0.27ml의 6.18N HCl로 -20℃, THF 중에서 처리한다. 이 혼합물에 DMF 중에 용해시킨 0.68ml의 10% 이소-아밀나이트리트를 가하고, 이 용액을 같은 온도에서 30분간 교반시킨다. 온도를 -30℃로 낮추고 0.2344ml의 Et3N(1.675밀리몰)을 가하고 계속하여 위에서 제조한 데카펩타이드의 TFA 염(1.675밀리몰)을 가한다. 이 혼합물을 -20℃에서 3ml의 DMSO로 희석하고, Et3N 수적을 가하여 반응을 약염기성(pH 7.5)으로 조정한다. 이를 -20℃에서 30분간, 4℃에서 5일간 교반한다. 이동안 DMSO(5ml) 및 Et3N을 더 가하여 반응을 약염기성으로 유지하고 반응액이 겔화되는 것을 방지한다. 전체용액을 5% HOAc(250ml)에 부으면 백색침전이 얻어지는데, 이를 모아 H2O, MeOH, 에테르로 세척하고 건조시킨다. 조생성물(0.702g ; 융점 290 내지 291℃)을 DMSO 및 MeOH로 재침전시킨다.
수율 : 0.348g(42.0%)
융점 : 296 내지 298℃(분해) ;
Figure kpo00045
=+3.77°(C=1, DMSO)
[실시예 48]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2(0.408g, 0.68밀리몰)을 10ml의 DMF 중에 현탁 시킨후 -20℃로 냉각시키고 THF 중에서 새로 제조된 5.43N HCl(0.627ml, 3.4밀리몰)로 처리하고, 이어서 DMF 중에서 10% i-아밀나이트리트(1.39ml, 1.03밀리몰)로 처리한다. 30분간 교반시키고, Et3N(0.476ml, 3.4밀리몰)를 가하고 이어 데카펩타이드 H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(z)-OH(1.334g, 0.68밀리몰)의 TFA염을 가하면서 -30℃로 냉각시킨다.
이 혼합물을 -20℃에서 30분간, 이어서 4℃에서 5일간 교반시킨다. 이때 소량의 추가 Et3N 및 DMSO를 가하여 반응을 약염기성으로 유지하고 겔상태의 물질이 형성되는 것을 방지한다. 반응혼합물을 5% HOCA(300ml) 중에 가하고 형성된 고체침전을 모아 물, 메탄올, 에테르로 세척하고 건조시켜 융점이 296 내지 299℃인 1.49g의 물질이 얻어진다. 이 생성물을 DMSO 및 MeOH로 재침전시킨다.
수율 : 1.40g(85.37%) ; 융점 297 내지 299℃ ;
Figure kpo00046
=+6.37°(C=1, DMSO)
[실시예 49]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
실시예 48에서 수득된 테트라데카펩타이드(1.35g, 0.558밀리몰)을 HOBT·H2O(0.188g, 1.23밀리몰)과 함께 각각 15ml의 DMF 및 DMSO의 혼합물 중에서 수분동안 교반시킨다. 혼합물을 빙욕중에서 냉각시키면서 DCC(0.126g, 0.614밀리몰)을 가하고, 같은 온도에서 24시간 동안 계속 교반시킨다.
별도의 플라스크 중에서 Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (4.0g, 1.43밀리몰)을 40ml의 TFA로 25분간 처리시키고 다량의 에테르를 가하여 생성된 테트리-데카펩타이드의 TFA염을 급히 침전시킨다. 생성된 고체를 모아 에테르로 충분희 세척하여 3.74g의 백색분말(C-말단 테트라데카펩타이드의 TFA염)을 얻는다. 이 물질의 일부(1.567g, 0.5583밀리몰)를, DMF-DMSO 혼합물중에서 아미노말단 테트라-데카펩타이드로 부터 전술한 바와 같이 유도한 활성 에스테르에 가한다. 수적의 NMM을 가하여 pH를 7.5내지 8.0으로 조정하고 0℃에서 1시간, 이어서 25℃에서 5일간 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 1.5ℓ의 5% 아세트산 중에 도입한다. 침전된 생성물을 물, 메탄올, DMF, 메탄올 및 에테르로 충분히 세척하여 2.21g 표제생성물을 수득한다. 융점 : 300℃ 이상
[실시예 50]
H3C-CO-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [티모신 α1]
실시예 49에서 수득한 보호된 옥타코사펩타이드(2.21g, 0.435밀리몰)를 8ml의 TFA 중에 용해시키고, 4ml의 아니솔과 혼합한 후 0℃에서 무수 HF와 30분간 교반시킨다. 0℃에서 진공 증류시켜 산을 제거하고 고체 잔유물을 200ml의 물중에 용해시킨후 에테르로 2회 세척하고 용량이 반으로 될 때까지 증발시키고 동결 건조시켜 1.1g의 조생성물을 얻는다. 이를 세파텍스
Figure kpo00047
G-10칼럼(3×80㎝ ; 0.2M HOAc)에 이어서 DEAE-세파덱스
Figure kpo00048
칼럼(3×75㎝)에 통과시키고 암모늄 아세테이트(pH 7.0)의 농도를 증가시키면서 (0.025M, 0.25M), 이어서 희아세트산으로 용출시켜 정제한다, 원하는 물질을 함유한 분획을 모아 동결 건조시켜 0.281g의 표제화합물을 무정형 백색분말로서 수득한다.
아크릴아마이드 겔 등전성집중법에 의할 때, 본 발명의 합성물질은 소의 흉선에서 분리한 천연 티모신α1과 이동패턴이 동일한다[참조 : A.L. Goldstein et al., Proc.Natl. Acad. Sci. (USA) 74,725(1977)].
[실시예 51]
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
실시예 47의 생성물(0.866g, 0.373밀리몰)을 HOBT·H2O(0.12g, 0.82밀리몰)과 함께 DMSO(8ml) 및 DMF(6ml)의 혼합물중에서 교반하고, 빙욕중에서 냉각시킨다. 이 혼합물을 DCC(0.085g, 0.411밀리몰)로 처리한 후, 0℃에서 24시간동안 교반시킨다. 이를, 실시예 49에서 제조한 C-말단 테트라데카펩타이드의 TFA염(1.05g, 0.303밀리몰) 및 2ml DMSO와 함께 혼합한다. 수적의 NMM을 가하여 pH를 7.5내지 8.0으로 조정하고 0℃에서 1시간, 25℃에서 5일간 교반한다. 실시예 49에서 언급된 바에 따라 완결지어 1.5775g의 완전히 보호된 옥타코사펩타이드를 수득한다.
[실시예 52]
H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Asp-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [(Asn)2-티모신 α1]
실시예 51의 화합물(1.5775g, 0.3157밀리몰)을 3ml의 아니솔을 함유한 10ml의 TFA 중에 용해시킨다.
이 혼합물을 45ml의 HF와 함께 0℃에서 30분간 교반시키고, 이어서 실시예 50에서와 같이 완결짓는다.
상술한 바와 같이 세파덱스
Figure kpo00049
G-10 및 DEAE-세파덱스
Figure kpo00050
컬럼상에서 정제시켜 0.283g의 표제화합물을 백색 무정형 생성물을 얻는다. 이 화합물은 아크릴아마이드 겔 등전성집중법에서, 천연의 티모신 α1에 비하여 약간 산성이 약한 쪽으로 이동하는데 이는 구조차이와 일치한다.
[실시예 53]
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-HNNH2
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH(43.2g, 50밀리몰)을 0℃, DMF(280 ml)중에서 H2NNH2(1.76g, 55밀리몰) 및 HOBT·H2O(15.3g, 100밀리몰)로 처리하고 이어서 DCC(11.33g, 55밀리몰)로 처리한다.
이 혼합물을 0℃에서 2시간, 25℃에서 철야 교반시킨다. 이때 때때로 NMM을 가하여 반응을 약염기성으로 유지시킨다. 용매를 증발시키고, 오일상 잔유물을 다량의 물로 처리하면 조생성물이 고체화된다.
이를 모아 H2O, 이소프로판올 및 에테르로 세척하고, 수득한 분말을 이소-프로판올로 2회 결정화시킨다. 수율 : 31.93g(73.0%) ; 융점 164 내지 169℃ ;
Figure kpo00051
=1.37°(C=1, THF)
[실시예 54]
Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-HNNH2
Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH(14.8g, 21.0밀리몰)를 0℃, DMF(80ml) 중에서 H2NNH2(0.80ml, 25.0밀리몰), HOBT·H2O(7.1g, 46.2밀리몰) 및 DCC(4.7g, 23.0밀리몰)로 처리하고, 이 혼합물을 0℃에서 2시간, 25℃에서 17시간 교반한 다음 상기와 같이 완결지어 9.2g(61.5%)의 원하는 생성물을 얻는다.
용점 133내지 137℃ ;
Figure kpo00052
=-19.36°(C=1, THF)

Claims (1)

  1. 다음 일반식(Ⅱ)의 보호된 테트라데카펩타이드와 다음 일반식(Ⅲ)의 보호된 네트라펩타이드를 축합시켜 다음 일반식(Ⅰ)의 보호된 옥타코사펩타이드를 제조하고, 무수 불화수소를 사용하여 상기 옥타코사펩타이드로 부터 보호기를 제거함을 특징으로 하여 다음 구조식(Ⅰ)의 티모신 α1을 제조하는 방법.
    H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (Ⅰ)
    H3C-CO-Ser(R1)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6(Ⅰ')
    H3C-CO-Ser(R1)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-OR7(Ⅱ)
    H-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6(Ⅲ)
    상기 일반식에서
    R1은 세린잔기의 하이드록실기에 대한 통상의 보호기이고 ;
    R2, R4및 R6는 통상의 카복실보호기이며 ;
    R3는 트레오닌의 하이드록실기에 대한 통상의 보호기이고 ;
    R5는 리신잔기의 ω-아미노기에 대한 통상의 보호기이며 ;
    R7은 수소 또는 활성화기이다.
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