FI96115B - Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on T-soluavustaja-aktiivisuutta - Google Patents

Description

96115

Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on T-soluavus-ta ja-aktii visuutta

Jakamalla erotettu hakemuksesta FI 900267 5

Kyseinen keksintö koskee menetelmää synteettisten peptidien valmistamiseksi, jotka kykenevät stimuloimaan avustaja-T-soluaktiivisuutta. Tarkemmin ottaen kyseisen keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit ovat pentapep-10 tidejä, joiden perustana on tyspleniinimolekyyli.

Keksinnön tausta

Immuunisäätelijäproteiinit, tymopoietiini ja tys-pleniini (jota aiemmin kutsuttiin "speliiniksi"), on eristetty naudan ja ihmisen kateenkorvasta ja vastaavasti 15 pernasta. Lisäksi kemiallisesti on syntetisoitu pieniä peptidejä, jotka jäljittelevät tymopoietiinin biologista aktiivisuutta, ja niitä on edelleen modifioitu lisäominaisuuksien kuten vastustuskyvyn entsymaattiselle vaikutukselle saamiseksi. Katso esim. US-patenttijulkaisu 20 4 505 853.

Nyttemmin on julkistettu suuri määrä tällaisia proteiineja ja syntetisoituja peptidejä koskevia artikkeleita ja patentteja. US-patenttijulkaisussa nro 4 190 646 julkistetaan pentapeptidi tymopentiini, joka on tymopoietii-25 nin aktiivinen keskus ja jonka sekvenssi on Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, sekä peptidikoostumuksia, joissa tämän pentapep-tidin amino- ja/tai karboksyylipäätyyn on substituoitu erilaisia ryhmiä. Sekä tymopoietiini että tymopentiini indusoivat biologisia muutoksia kahdessa humaani-T-solu-30 linjassa, CEMissä ja M0LT-4:ssä, antaen täten osoituksen roolistaan biologisten aktiivisuuksien stimuloinnissa T-soluissa. Minkään pentapeptidejä (sekvenssissä 5 aminohappoa) lyhyempien tymopentiinianalogien ei todettu olevan aktiivisia CEM-soluissa.

96115 2 US-patentissa 4 923 964 julkistetaan ihmisen pernasta eristetty 48 aminohapon immuunisäätelijäproteiini, spleniini (johon viitataan tästä eteenpäin "tyspleniini-nä") . Nautatyspleniini stimuloi avustaja-T-soluaktiivi-5 suutta in vivo hiirissä. Humaanityspleniinin odotetaan täten osoittavan analogista biologista aktiivisuutta ihmisissä. Humaanityspleniinin kuvattiin edellä identifioidussa hakemusjulkaisussa indusoivan solunsisäisen cGMPrn kohoamista humaani-T-solulinjassa MOLT-4. Nautatysplenii-10 nin, jota kutsutaan SP-5:ksi, aktiivinen keskus kattaa sen aminohappojäännökset 32 - 36, ja sen sekvenssi on Arg-Lys-Glu-Val-Tyr. US-patentissa 4 923 964 humaanisekvenssin aktiiviseksi keskukseksi julkistettiin Arg-Lys-Ala-Val-Tyr.

15 Tyspleniini, päinvastoin kuin tymopoietiini, ei aiheuta muutoksia CEM-solujen biologisessa aktiivisuudessa. Täten tyspleniini vaikuttaa osallistuvan T-soluavus-taja-aktiivisuuden, eikä T-solusupressoriaktiivisuuden, stimulointiin. Katso myös esimerkiksi Goldstein, G., Na-20 ture (Lontoo) 247 (1974) 11-14; Basch, R.S., ja Goldstein, G., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 71 (1974) 1474-1478; Scheid, M.P., et ai.. J.Exp.Med. 147 (1978) 1727-1743; Scheid, M.P., et ai. . Science 190 (1975) 1211-1213; Ranges, G.E., et ai. . J. Exp. Med. 156 (1982) 1057-1064; T.

li 25 Audhya et ai.. Biochem. 20 (1981) 6195-6200; Venkatasub- ramanian, K. , et ai. . Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83 (1986) 3171-3174; Malaise, M.G., et ai.. kirjassa "Immuno-regulatory UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology", toim. Goldstein, G., et ai.. Liss, New York, 1986; 30 Sunshine, G.H., et ai.. J. Immunol. 120 (1978) 1594-1599, “ ja E. Rentz et ai. . Arch. Geschwulstforsch.. 54:2 (1948) 113-118. Katso myös US-patenttijulkaisut 4 190 646; 4 261 886; 4 361 673; 4 420 424; ja 4 629 723. Kyseiseen keksintöön liittyvää muuta tausta-aineistoa ja liittyviä 35 biologisia menetelmiä koskevan keskustelun osalta viita- li 3 9Ö115 taan edellä kuvattuihin patenttijulkaisuihin, hakemusjulkaisuihin sekä artikkeleihin.

US-patenttijulkaisussa 4 428 938, jonka omistavat Kisfaludy et ai. ja joka julkaistiin 31. tammikuuta 1984, 5 julkistetaan tiettyjä immuunisäätelyyn vaikuttavia peptidejä. Näiden peptidien joukossa ovat seuraavat tetrapepti-dit:

Arg-Lys-Asp-Val Arg-Lys-Asn-Val 10 Arg-Lys-Ala-Val

Arg-Lys-Asp-Ala Arg-Lys-Asp-Ile Arg-Lys-Glu-Val Glp-Arg-Lys-Asp.

15 Patenttijulkaisu '938 sisältää yleisesti näiden sekvenssien suoloja, amideja, (alempi alkyyli)-estereitä sekä suojattuja johdannaisia, sekä menetelmiä näiden sekvenssien käyttämiseksi kateenkorvapuutoksista johtuvien immunologisten häiriöiden hoitamiseksi. Tässä patentissa 20 kyseisten peptidien aktiivisuutta testattiin in vitro E-ruusukemäärityksellä.

Samat tutkijat ilmoittivat tällaisista tetrapepti-deistä julkaisusssa Kisfaludy et ai. . Hoppe-Sevler's Z. Phvsiol. Chem. 364 (1983) 933-940. Tässä artikkelissa il-’· 25 moitettiin, että sekvenssi Arg-Lys-Glu-Val oli erittäin aktiivinen analogi in vitro -E-ruusukekokeessa, ja että sekvenssit Arg-Ala-Asp-Val ja Arg-Lys-Ala-Val omaavat erittäin voimakkaasti alentuneen aktiivisuuden.

Alalla on edelleen tarve saada muita peptidejä, 30 jotka olisivat hyödyllisiä ihmisten immuunijärjestelmän stimuloinnissa erilaisissa T-solupuutostiloissa.

FI-patentit 86 860, 70 905 ja 79 329 koskevat kaikki pentapeptidejä, joiden aminohapposekvenssien asemassa 3 on Asp.

96115 4 EP-25 897 kohdistuu pentapeptideihin, joilla on kaava

G-K-Q-X-M

jossa kaavasssa G voi olla Arg, K voi olla Lys, Q voi olla 5 Glu, Asp tai 2-aminoadipiinihappo; X voi olla Vai tai Ile ja M on hydrofobinen aminohappo tai sen esteri tai amidi.

Mainituissa viitejulkaisuissa ei ole mitään kuvausta tai ehdotusta pentapeptidistä, jossa Ala on aminohappo-asemassa 3. Vaikka sekä asparagiini että alaniini ovat 10 hydrofiilisiä, nämä kaksi aminohappoa eroavat toisistaan happamuutensa suhteen. Asp on emäksinen aminohappo. Sen sijaan Ala on neutraali aminohappo.

Pienen peptidin, kuten esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavan peptidin aktiivisuus on hyvin al-15 tis aminohappomuutoksille. Tietyn aminohapon valinta voi muuttaa liitettyjen aminohappojen suhteellisen happamuuden tai emäksisyyden. Olivat aminohapot sitten hydrofiilisia tai hydrofobisia, niin aminohappoja ei voida vaihtaa keskenään. Aminohappojen suhteellisen koon ja suhteellisen 20 happamuuden vuoksi tällaiset aminohappokorvaukset voivat aiheuttaa merkittävät aktiivisuusmuutokset tai jopa aktiivisuuden menettämisen. Tästä syystä ei ollut ennustettavissa, että aminohappojen korvaaminen kooltaan ja happamuudeltaan erilaisilla aminohapoilla johtaisi peptidiin, !· 25 jolla on esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetta vien peptidien biologinen aktiivisuus.

Keksinnön yhteenveto

Kyseinen keksintö kuvaa sarjaa tyspleniinipeptidi-analogeja, jotka kykenevät indusoimaan biologista aktiivi-30 suutta MOLT-4-T-solulinjassa. Päinvastoin kuin tymopentii- » » .. nianalogit, joista on ilmoitettu aiemmin, pienemmät kuin pituudeltaan viiden aminohapon ja tyspleniinille sukua olevat peptidit ovat aktiivisia T-soluavustaja-aktiivisuu-den indusoinnissa MOLT-4-soluissa, kuten tässä kuvatut 35 tyspleniinipentapeptidianalogit.

Il 96115 5

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on aminohapposekvenssi, jolla on kaava R2-Arg-X' -Ala-Y' -Z' -R3 5 jossa kaavassa R2 on H, alempi alkyyli, asetyyli, formyyli, alempi alkanoyyli tai des-amino; X' on Pro, dehydro-Pro, hydroksi-Pro, D-Lys, Aib tai Lys; Y' on D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valo Iitaan seuraavista: Vai, Ile, Leu, Ala, Asp, Glu, Gin, Lys; Z' on D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valitaan seuraavista: Tyr, Vai, Leu, His, Ala ja Trp; R3 on OH tai NR4RS, jossa R4 ja R5 ovat vetyjä tai 15 suoraketjuisia tai haarautuneita alkyylejä tai alkenyyle- jä, jotka käsittävät 1-6 hiiliatomia, tai R4 ja R5 muodostavat yhdessä 3-7 hiiliatomin syklisen metyleeniryh-män.

Näille uusille pentapeptideille on ominaista kyky 20 nostaa cGMP-aktiivisuutta humaani-T-solulinjassa MOLT-4.

Näillä peptideillä ja näitä peptidejä sisältävillä koostumuksilla on yllättävästi tallella humaanitysplenii-nin biologinen aktiivisuus. Suurelle määrälle näitä peptidejä on niinikään tunnusomainen parantunut vastustuskyky 25 hyökkäyksille endo- ja eksopeptidaasien sekä trypsiinin kaltaisten entsyymien toimesta ruoansulatuskanavassa ja seerumissa. Täten nämä peptidit tarjoavat merkittäviä etuja immuunipuutosten hoidossa. Erityisesti kyseiset penta-peptidit, joissa X' on Pro tai Aib, omaavat yllättävää 30 vastustuskykyä hajoamista vastaan entsyymien kuten seeru- ♦ · mipeptidaasien toimesta.

Kyseisen keksinnön muita näkökohtia ja etuja julkistetaan seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa, joka sisältää esimerkkejä tämänhetkisistä edullisista suo-35 ritusmuodoista.

96115 6

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 on graafinen esitys MOLT-4-cGMP-määrityk-sestä, jossa esitetään peptidipitoisuuden (mikrogrammaa/ ml) funktiona cGMP-tasot (pikogrammaa/ml), ja verrataan 5 tymopentiinin (TP-5:n) ja tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien aktiivisuutta verrokkeihin.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö tarjoaa sarjan pentapeptidejä, joille on ominaista kyky indusoida aktiivisuutta M0LT-4-soluissa, 10 ja joiden kaava on R2-Arg-X' -Ala-Y' -Z' -R3 tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävän happo- tai emäs-additiosuolan, jolloin kaavassa R2, X', Y', Z' ja R3 ovat kuten edellä määritelty.

15 Tässä käytettynä ilmaisu "alempi alkyyli" kattaa haarautuneet ja suoraketjuiset tyydytetyt hiilivedyt, jotka omaavat 1-6 hiiliatomia, kuten metyyli, etyyli, pro-pyyli, isopropyyli, pentyyli, heksyyli ja muut samankaltaiset, kun puolestaan ilmaisulla "alempi alkanoyyli" tar-

20 koitetaan ryhmää O

n (alempi alkyyli)-C-,

Kautta tämän hakemusjulkaisun peptidien aminohap-porakenneosat ja tietyt niiden valmistuksessa käytetyt materiaalit identifioidaan kätevyyden vuoksi lyhenteillä.

» 9 25 Useimmat aminohapoista käytetyt kolmen kirjaimet lyhenteet ovat varsin tunnettuja. Muita vähemmän tunnettuja lyhenteitä ovat Asu, aminosukkiini-imidyylistä, ja Glp, pyro-glutamyylistä (myös p-Glu). Ellei toisin mainittu kaikki aminohapot ovat L-isomeerikonf iguraatiossa. Tarkoitettaes-30 sa D-isomeerikonfiguraatiota se on merkitty.

··· Tiettyjä kyseisen keksinnön mukaisesti valmistetta via edullisia pentapeptidejä ovat ne kaavan mukaiset pen-tapeptidit, joissa X' on Pro tai Aib. Edullisempia peptidejä ovat ne edeltävän kaavan mukaiset peptidit, joissa X' 35 on Pro, Y' on Vai ja Z' on Tyr. Edelleen edullisempia pentapeptidejä ovat seuraavat peptidit: li 96115 7

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2 asetyyli-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH2.

Näiden peptidien kanssa suoloja muodostamaan kyke-5 neviä happoja ovat kuitenkaan mainittuihin rajoittumatta epäorgaaniset hapot kuten kloor ivetyhappo, bromi vety happo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo ja vastaavat. Orgaanisia happoja voidaan niinikään käyttää keksinnön mukaisten suolojen muodostami-10 seksi, esim. muurahaishappoa, etikkahappoa, propionihap-poa, glykolihappoa, maitohappoa, palorypälehappoa, oksaalihappoa, malonihappoa, meripihkahappoa, maleiinihappoa, fumaarihappoa, antraniliinihappoa, kanelihappoa, naftalee-nisulfonihappoa, sulfaniliinihappoa ja muita vastaavia.

15 Ei-kattava luettelo emäksistä, jotka kykenevät muo dostamaan suoloja happamia osuuksia omaavien peptidien kanssa, ovat epäorgaaniset emäkset, kuten natriumhydroksi-di, ammoniumhydroksidi, kaliumhydroksidi ja muut vastaavat. Orgaanisia emäksiä tällaiseen käyttöön ovat mainit-20 tuihin rajoittumatta mono-, di- ja tri-alkyyli- ja aryyli-amiinit (esim. trietyyliamiini, di-isopropyyliamiini, me-tyyliamiini, dimetyyliamiini) ja mahdollisesti substituoi-dut etanoliamiinit (esim. etanoliamiini, dietanoliamiini).

Tässä kuvatut peptidit voidaan yleensä valmistaa 25 tunnettuja tekniikoita noudattaen. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Käytännöllisesti kuvatun polypeptidin synteettinen valmistus voi tapahtua kiinteäfaasisynteesi-menetelmän mukaan, jota on kuvannut Merrifield artikkelis-30 sa J.A.C.S. 85 (1963) 2149-2154. Tämä tekniikka ymmärretään hyvin ja se on tavallinen menetelmä peptidien valmistamiseksi. Kiinteäfaasisynteesimenetelmässä suojattuja aminohappoja lisätään vaihe kerrallaan kasvavaan peptidi-ketjuun, joka on sidottu kovalenttisilla sidoksilla kiin-35 teään hartsiosaseen. Tässä menettelyssä reagenssit ja si- 96115 8 vutuotteet poistetaan suodattamalla, jolloin vältytään välituotteiden puhdistamiselta. Tämän menetelmän yleisohje on riippuvainen ketjun ensimmäisen aminohapon kiinnittymisestä kiinteään polymeeriin kovalenttisella sidoksella.

5 Seuraavat suojatut aminohapot lisätään vaiheittain yksi kerrallaan, tai ryhminä, kunnes haluttu sekvenssi on koottu. Lopuksi suojattu peptidi poistetaan kiinteästä hartsikantajasta ja suojaryhmät pilkotaan pois.

Aminohapot voidaan kiinnittää mihin tahansa sopi-10 vaan, hartsina toimivaan polymeeriin. Hartsin tulee sisältää funktionaalinen ryhmä, johon ensimmäinen suojattu aminohappo voidaan tukevasti kytkeä kovalenttisella sidoksella. Tähän tarkoitukseen soveltuvat erilaiset polymeerit, kuten selluloosa, polyvinyylialkoholi, polymetyylimetakry-15 laatti ja polystyreeni. Tarkoituksenmukaisia tällaisessa synteesissä käytettäviksi soveltuvia suojaryhmiä ovat t-butyylioksikarbonyyli (BOC), bentsyyli (BZL), t-amyyliok-sikarbonyyli (AOC), tosyyli (TOS), o-bromifenyylimetoksi-karbonyyli (BrZ), 2,6-diklooribentsyyli (BZLC12) ja fenyy-20 limetoksikarbonyyli (Z tai CBZ). Lisää suojaryhmiä identifioidaan edeltävässä tekstissä sekä kirjassa J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973. Nämä kummatkin kirjat sisällytetään tähän viitteiksi.

*.! 25 Yleismenettelyssä peptidien valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti aluksi suojattu C-päätyaminohappo kiinnitetään hartsiin tämän keksinnön mukaisesti. Kiinnittymisen tapahduttua hartsi suodatetaan, pestään ja C-pää-tyaminohapon alfa-aminoryhmän käsittämä suojaryhmä (edul-30 lisesti t-butyylioksikarbonyyli) poistetaan. Tämän suoja-·· ryhmän poisto on luonnollisesti suoritettava katkaisematta tuon aminohapon ja hartsin välistä sidosta. Saatuun hartsi-peptidiin kytketään sitten toiseksi viimeinen C-päätyaminohappo suojattuna. Tämä kytkeminen suoritetaan muodos-35 tamalla amidisidos toisen aminohapon vapaan karboksyyli- li 96115 9 ryhmän sekä ensimmäisen, hartsiin kiinnitetyn aminohapon aminoryhmän välille. Tätä vaihesarjaa toistetaan peräkkäisillä aminohapoilla, kunnes kaikki aminohapot on kiinnitetty hartsiin. Lopuksi suojattu peptidi lohkaistaan hart-5 sista ja suojaryhmät poistetaan halutun peptidin saamiseksi. Pilkkomismenettelyt, joita käytetään peptidin erottamiseksi hartsista sekä suojaryhmien poistamiseksi, ovat riippuvaisia hartsin ja suojaryhmien valinnasta, ja ovat tuttuja peptidisynteesin alaan perehtyneille.

10 Vaihtoehtoisia peptidisynteesin tekniikoita kuvataan kirjassa "Peptide Synthesis", Bodanszky et ai. . 2.

painos, John Wiley & Sons, 1976. Esimerkiksi tässä kuvatut peptidit voidaan syntetisoida myös käyttäen tavanomaisia peptidisynteesin liuoksessa -menettelytapoja, joissa joko 15 askel kerrallaan tai ryhminä kytketään aminohappoja tai peptidifragmentteja käyttäen kemiallisia tai entsymaatti-sia menetelmiä amidisidoksen muodostamiseksi. Nämä liuos-synteesimenetelmät ovat alalla tunnettuja.

Tämän keksinnön mukaisten peptidien on todettu 20 osoittavan biologista aktiivisuutta, joka on samankaltaista kuin humaanityspleniinin, edellä mainitussa US-patent-tissa 4 923 964 ja edellä mainituissa artikkeleissa julkistetun mukaisesti. Tämä biologinen aktiivisuus osoitetaan ensisijaisesti määrityksellä, jolla mitataan syklisen 25 GMP:n tuotannon indusointia humaani-T-solulinjassa MOLT-4 humaanityspleniiniin ja humaanitymopentiiniin verrattuna. cGMP-tuotannon indusointi keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin toimesta tässä määrityksessä osoittaa tuon peptidin kykyä sitoutua humaanityspleniini-reseptorikeskukseen 30 solun pinnalla sekä indusoida humaanityspleniinin kaltais-.. ta biologista aktiivisuutta.

Monet kyseisistä pentapeptideistä tarjoavat toisen merkittävän edun humaanityspleniiniin verrattuna. Monille kyseisen keksinnön mukaisesti valmistetuille peptideille 35 on tunnusomainen vastustuskyky entsymaattiselle hajoami- 96115 10 selle joko ruoansulatus- tai seerumientsyymien toimesta. Täten ne osoittavat pidentynyttä puoliintumisaikaa in vivo annettaessa niitä ruiskeena biologiselle kohteelle. Toinen monien näistä peptideistä etu on, että niitä voidaan antaa 5 suun kautta. Humaanityspleniini sinänsä on liian suurikokoinen molekyyli, jotta se voitaisiin tehokkaasti antaa suun kautta ja jotta se tulisi sulatetuksi ruoansulatuskanavassa .

Ennen keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien 10 testaamista ei odotettu, että voitaisiin valmistaa humaa-nityspleniinin pentapeptidianalogeja, jotka omaisivat saman biologisen spesifisyyden, koska Arg-Lys-Ala-Val-Tyr, joka on nautapentapeptidin SP-5 (Arg-Lys-Glu-Val-Tyr) analogi ihmisessä, on epäaktiivinen MOLT-4-soluissa. Täten 15 oli odottamatonta, että löytyi humaanityspleniinin pentapeptidianalogeja, jotka osoittivat samaa biologista aktiivisuutta kuin ehyt humaanityspleniinimolekyyli.

Kyseisten peptidien immuunisäätelijäominaisuuksien ansiosta ne ovat terapeuttisesti hyödyllisiä ihmisten, ja 20 mahdollisesti eläinten, hoidossa, koska niillä on kyky indusoida T-solujen differentiaatio ja kypsyminen, jotka (T-solut) kykenevät osallistumaan elimistön immuunivasteeseen. Tämän johdosta kyseisillä peptideillä katsotaan olevan moninaisia terapeuttisia käyttöjä.

25 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja peptidejä pidetään hyödyllisinä avustamassa elimistön kollektiivisessa immuniteetissa siinä mielessä, että ne nostavat tai avustavat soluimmuniteetin terapeuttista stimulaatiota. Ne ovat siten hyödyllisiä sairauksien hoitamiseksi, joihin 30 liittyy krooninen tulehdus, kuten sieni- ja mykoplasmatar-tunnat, tuberkuloosi, lepra, akuutit tai krooniset virustartunnat ja muut vastaavat.

Kyseisiä peptidejä tai kyseisiä peptidejä tai niiden happo- tai emässuoloja sisältäviä farmaseuttisia koos-35 tumuksia pidetään yleensä hyödyllisinä millä tahansa li 96115 11 alueella, jolla eräänä tekijänä on soluimmuniteetti, ja erityisesti, milloin kyseessä ovat immuniteettipuutokset. Täten tapauksissa, joissa esiintyy epätasapainossa olevista T-soluista johtuen liiallista vasta-ainetuotantoa, 5 kyseiset peptidit kykenevät korjaamaan tämän tilan stimuloimalla T-solufunktiota. Täten niiden odotetaan olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia tietyissä autoimmuunisairauksissa, joissa muodostuu vahingollisia vasta-aineita, kuten systeeminen punahukka, nivelreuma tai vastaava tila.

10 Kattavimpana sovellutuksenaan kyseiset peptidit tai niitä sisältävät farmaseuttiset koosteet ovat hyödyllisiä tällaista säätelyä tarvitsevan kohteen, ihmisen tai eläimen, immuunijärjestelmän säätelemiseksi. Tässä käytettynä ilmaisulla "säädellä” tarkoitetaan, että kyseiset yhdis-15 teet saavat immuunijärjestelmän palaamaan epänormaalista, sairaasta tilasta normaaliin, tasapainossa olevaan tilaan. Vaikka tälle säätelylle saattaa hyvinkin löytyä runsaasti sovellutuksia immunologisten puutoksien korjauksessa (esim. DiGeorge-oireyhtymä), se soveltuu niinikään liial-20 lista immunologista aktiivisuutta käsittävien tilojen korjaukseen (esim. autoimmuunisairaudet).

Esitetyt peptidit soveltuvat tilojen hoitamiseksi jotka ovat seurausta kohteen immuunijärjestelmän suhteellisista tai absoluuttisista puutoksista, erityisesti ΤΙ: 25 soluavustajafunktiossa, jolloin mainitulle kohteelle anne taan terapeuttisesti tehokas määrä ainakin yhtä tämän keksinnön mukaista peptidiä.

Tässä käytettynä ilmaisulla "terapeuttisesti tehokas määrä" tarkoitetaan määrää, joka on tehokas edellä 30 mainittujen tilojen hoitamiseksi. Peptidejä voidaan myös ·· käyttää T-solujen differentiaation ja kypsymisen indusoi- miseen, jolloin tehokas indusoiva määrä ainakin yhtä peptidiä annetaan kohteelle.

Voidaan edelleen valmistaa farmaseuttisia koostu-35 muksia hoitomenetelmien harjoittamiseksi. Farmaseuttisten 12 96115 koostumuksien valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti valmistettu peptidi yhdistetään vaikuttavana ainesosana likeiseksi seokseksi farmaseuttiseen kantajaan tavanomaisten farmaseuttisen koostamisen tekniikoiden mukaan. Tämä 5 kantaja voi esiintyä hyvin erilaisissa muodoissa riippuen annettavan valmisteen toivotusta muodosta, esim. suun kautta, kielen alle, peräsuolen kautta, nenän kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annettavana muotona.

Keksinnön mukaisesti valmistettu pentapeptidi on 10 yleensä aktiivinen, jos sitä annetaan määrinä, jotka ylittävät noin l mikrogrammaa/kg ruumiinpainoa, ja määrät ovat edullisesti noin 0,001 - noin 10 mg/kg ruumiinpainoa.

Yleensä samaa annostusmäärääluetta voidaan käyttää hoidettaessa mainittuja sairauksia tai tiloja, joissa on määrä 15 hoitaa immuunipuutosta. Suuret määrät (esim. noin 10 - 100 mg/kg ruumiinpainoa) ovat hyödyllisiä liiallisen immuuni-aktiivisuuden supressoimiseksi.

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön havainnollistamiseksi, jolloin keksintöä ei erityisesti rajoiteta 20 näihin. Esimerkeissä ja kautta selitysosan osuudet ovat paino-osuuksia, ellei toisin mainittu. Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: TFA trifluorietikkahaposta; HOAc etikkahaposta; CH2C12 metyleenikloridista; CH3CN ase-tonitriilistä; DMF dimetyyliformamidista; NH40Ac ammonium- • ·« ·: 25 asetaatista; NUjOH ammoniumhydroksidista; n-PrOH n-propan- olista; n-BuOH n-butanolista; pyr pyridiinistä; DCC disyk-loheksyylikarbodi-imidistä; HOBt l-hydroksibentsotriatso-lista; DMAP dimetyyliaminopyridiinistä; HF fluorivedystä; TCA trikloorietikkahaposta; BHA bentshydryyliamiinista; ja 30 MeOH metanolista.

Vertailuesimerkki 1

Tetrapeptidin asetyyli-Arg-Pro-Ala-Val-NH2 synteesi

Edellä mainittu tetrapeptidi syntetisoitiin käyttäen kiinteäfaasisynteesiä vaihe kerrallaan tapahtuvien 35 kytkentöjen avulla. Kaikkien aminohappojen alfa-aminoryhmä

II

96115 13 oli suojattu t-butyylioksikarbonyyli-(BOC-)ryhmällä. Arg:n sivuketjun suojaamiseksi käytettiin tosyyliä (TOS). Suojattuja aminohappoja käytettiin 2,5 ekvivalenttia ylimäärin verrattuna kuhunkin substituutioekvivalenttiin hart-5 sissa. Kaikki kytkennät suoritettiin DCC/HOBt:llä, joita käytettiin suojattuja aminohappoja vastaavat ekvivalentit. Kaikki aminohapot liuotettiin CH2Cl2:een lukuunottamatta Arg:tä, joka liuotettiin DMF:ään.

Pesu-, suojaryhmänpoisto- ja kytkentävaiheet olivat 10 seuraavat: 1. CH2C12 2x3 min 2. 50-%:inen TFA - CH2C12 1x3 min 3. 50-%:inen TFA - CH2C12 1 x 30 min 4. CH2C12 1x3 min 15 5. 40-%:inen isopropanoli - CH2C12 2x3 min 6. CH2C12 2x3 min 7. 10-%:inen di-isopropyylietyyliamiini 2 x 10 min 8. CH2C12 1x3 min 9. aminohappo 1x3 min 20 10. HOBt 1x3 min 11. DCC 1 x 120 min 12. CH2C12 2x3 min 13. 40-%:inen isopropanoli - CH2C12 2x3 min 14. DMF 1x3 min 25 15. CH2C12 2x3 min a. Synteesi

Suojattu peptidi syntetisoitiin käyttäen Beckmanin malli 990 peptidisyntetisaattoria. Saatu tetrapeptidihart-si oli 0,67 meg/g ja synteesi alkoi 5,0 g:11a (3,35 mmol) 30 hartsia. Saatu tetrapeptidi asetyloitiin sitten käsittele- ·· mä llä hartsia seuraavilla: 1. CH2C12 2x3 min 2. 50-%:inen TFA - CH2C12 1x3 min 3. 50-%:inen TFA - CH2C12 1 x 30 min 35 4. CH2C12 1x3 min 96115 14 5. 40-%:inen isopropanoli - CH2C12 2x3 min 6. CH2C12 2x3 min 7. 10-%:inen di-isopropyylietyyliamiini 2 x 10 min 8. CH2C12 1x3 min 5 9. 50-%:inen asetanhydridi - CH2C12 + lx 120 min katalyyttinen määrä DMAPitä 10. CH2C12 2x3 min 11. 40-%:inen isopropanoli - CH2C12 2x3 min 12. DMF 1x3 min 10 13. CH2C12 2x3 min

Peptidihartsi kuivattiin alipaineessa, kun se oli ensin pesty etanolilla (2 x 50 ml).

b. Pilkkominen HF:llä

Raakatetrapeptidi saatiin pilkkomalla hartsi-pepti-15 diä HFrllä (25 ml) ja anisolilla (25 ml) 4 tunnin ajan 0 °C:ssa. HF poistettiin alipaineessa. Seokseen lisättiin dietyylieetteriä (150 ml). Liuosta sekoitettiin ja se siirrettiin lasisintterisuppiloon ja pestiin vielä dietyy-lieetterillä (3 x 100 ml). Peptidi uutettiin hartsista 20 10 %:isella HOAcillä (3 x 100 ml) ja kylmäkuivaarnalla ve siliuos saatiin 1,20 g peptidituotetta.

c. Puhdistus

Tuotetta puhdistettiin preparatiivisella korkean suorituskyvyn nestekromatografia-ajolla (HPLC) seuraavissa •ί 25 olosuhteissa: Whatraan-kolonni Partisil M20 10/50 ODS3; 300 mg:n näyte käyttäen isokraattista 15-%:ista CH3CN/0,01 M NH40Ac-järjestelmää (pH säädetään 5:ksi HOAc:llä); virtausnopeus 15 ml/min; 220 nm:n detektio-aallonpituus. Kaikki puhtaat fraktiot kerättiin. Orgaaninen liuotin haihdutet-30 tiin, minkä jälkeen vesiliuos kylmäkuivaamalla saatiin 258 ·* mg valkeaa kiinteää ainetta.

Aminohappoanalyysi: Pro, 1,00; Ala, 1,00; Vai, 1,00; Arg, 1,01; 83 % peptidiä.

Ohutlevykromatografia-ajo (Silica 60/Analtech): 35 Rf(I) = 0,50 (butanoli:etikkahappo:vesi/3:1:1) 96115 15

Rf(II) = 0,59 (butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi/ 4:1:1:2)

Rf(III) = 0,29 (butanoli:etikkahappo: vesi etyyliasetaatti /1:1:1:1).

5 Vertailuesimerkki 2

Tetrapeptidin asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 synteesi a. Synteesi

Tetrapeptidi valmistettiin Applied Biosystems 430A -peptidisyntetisaattorilla. Käytettiin l tunnin syklin melo nettelyä (valmistajan muoto 1.40), joka kytki jokaisen aminohapon kerran lukuunottamatta BOC-Tos-Arg:tä, joka kaksoiskytkettiin. Synteesissä käytettiin seuraavia esi-pakattuja lähtömateriaaleja: 15 Reaaenssi Lähde mmol Määrä p-metyyli-BHA-hartsi ABI 0,50 760 mg BOC-Tos-Arg ABI 2,0 857 mg BOC-Pro ABI 2,0 430 mg BOC-Val ABI 2,0 434 mg 20 BOC-Ala ABI 2,0 378 mg

Sitten kun arginiinin BOC-ryhmä oli poistettu ja peptidi-hartsi oli neutraloitu ja pesty, yhdiste asety-loitiin käyttäen 10-%:ista asetanhydridiliuosta CH2Cl2:ssa ·* 25 (15 ml) 4-dimetyyliaminopyridiinin (20 mg) läsnäollessa.

60 minuutin kuluttua peptidi tutkittiin ninhydriinikokeel-la täydellisen asetyloitumisen varmistamiseksi. Peptidi-hartsi pestiin CH2Cl2:lla (3 x 15 ml) ja kuivattiin tyhjössä (huoneen lämpötila), jolloin saatiin 1,0 g materiaalia.

30 b. HF:llä pilkkominen

Peptidi lohkaistiin hartsista käyttäen 10 ml HF:ää 1,5 ml: n anisolia läsnäollessa. Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 1,5 tunnin ajan, minkä jälkeen HF poistettiin alipaineessa. Seos pestiin Et20:lla (3 x 50 ml) ja kuivattiin 35 ilmassa. Peptidi/hartsi-seosta uutettiin 25-%:isella HOAc-vesiliuoksella (3 x 50 ml).

96115 16 c. Puhdistus

Vesisuodos kylmäkuivaamalla saatiin 240 mg raaka-materiaalia. Tämä materiaali käytettiin Amberlite IRA 68 (asetaattimuoto) -ioninvaihtohartsissa vedessä. Peptidiä 5 sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin (220 mg) .

Peptidiä puhdistettiin Whatman Partisil 20M 10 ODS3 (22 mm x 50 cm) -kolonnissa käyttäen eluoivina liuottimina (10,0 ml/min) 15-%:ista asetonitriiliä (0,1 % trifluori-10 etikkahappoa) ja 0,l-%:ista trifluorietikkahapon vesi-liuosta. Eluoitumista tarkkailtiin HPLC:n avulla ja tarkoituksenmukaiset fraktiot yhdistettiin ja poistettiin liuotin alipaineessa. Jäännös liuotettiin veteen (H20) ja kylmäkuivaamalla (liuos) kahdesti saatiin 167 mg tuotetta 15 kokonaissaannon ollessa 50 %.

Aminohappoanalyysi: Arg, 1,04; Pro, 1,02; Vai, 1,00; Ala, 1,01; 72 % peptidiä.

Ohutlevykromatografia-ajo (Silica Gel GF 250 mikrometrin levyt): 20 Rf(I) = 0,37 (n-BuOH: HOAc: H20/ 3:1:1)

Rf(II) = 0,15 (CHC13: MeOH: HOAc /60:35:5)

Rf(III) = 0,48 (n-BuOH:HOAc:H20:EtOAc/1:1:1:1) .

Vertailuesimerkki 3

Tetrapeptidin asetyyli-Arg-Pro-Asp-Val-NH2 synteesi •:25 a. Synteesi

Otsikkoyhdiste syntetisoitiin tavanomaisella kiin-teäfaasisynteesillä käyttäen automaattista Beckman malli 990 syntetisaattoria. Synteesi aloitettiin 5,0 g:11a BHA-hartsia (0,67 meg/g). Kun BOC-Arg(Tos) oli kytketty, t-bu-30 tyylioksikarbonyylisuojaryhmä poistettiin 50-%:isella TFA-liuoksella CH2Cl2:ssa ja hartsi-peptidi asetyloitiin käyttäen 50-%:ista asetanhydridiliuosta CH2Cl2:ssa katalyyttisen määrän DMAP:tä läsnäollessa. Peptidi-hartsi pestiin etanolilla (2 x 50 ml) ja kuivattiin alipaineessa yön yli 35 ennen HF:llä pilkkomista. Kuiva peptidi-hartsi painoi 6,5 g· 96115 17 b. Pilkkominen HF:llä

Raakatetrapeptidi saatiin pilkkomalla 6,5 g hartsi-peptidiä HF:llä (25 ml) ja anisolilla (25 ml) 0 °C:ssa 4 tunnin ajan. HF haihdutettiin alipaineessa ja reaktioseok-5 seen lisättiin dietyylieetteriä (150 ml). Raakapeptidi ja hartsi siirrettiin lasisintterisuppiloon ja pestiin di-etyylieetterillä (3 x 100 ml). Peptidiä uutettiin 10 %-:isella HOAc-liuoksella (3 x 100 ml) ja vesiliuos kylmä-kuivaamalla saatiin 900 mg valkeata kiinteätä ainetta.

10 c. Puhdistus

Raakatuotteesta (puhtaus 98 % HPLC:n mukaan) poistettiin suolat Sephadex LH-20 -kolonnissa (100 g, 2,5 cm x 89 cm) käyttäen eluenttina 10-%:ista HOAc-liuosta. Kylmä-kuivauksen jälkeen tuote oli valkea kuohkea kiinteä aine, 15 joka painoi 800 mg.

Aminohappoanalyysi: Arg, 0,99; Vai, 1,00; Pro, 1,05; Asp, 1,01.

Ohutlevykromatografia-ajo (Silica 60/Merck, 250 F):

Rf (I) = 0,51 (n-Bu0H:H0Ac:H20/3:1:1) 20 Rf(II) - 0,60 (n-BuOH:HOAc:H20: EtOAc/1:1:1:1)

Rf(III) = 0,59 (n-Bu0H:pyridiini:H0Ac:H20/4:1:1:2) .

Vertailuesimerkki 4 N-alfa-formyyli-Arg-Pro-Asp-Val:n synteesi a. N-t-butyylioksikarbonyyli-beta-bentsyyli-aspar ** 25 tyyli-valiinin bentsyyliesteri 80 ml:aan CH2Cl2:ta liuotettiin 3,23 g N-t-butyyli-oksikarbonyyli-beta-bentsyyli-Asp:tä ja 3,97 g Val-bent-syyliesteri-p-tosylaattia. Lisättiin di-isopropyylietyyli-amiinia (1,74 ml) ja liuos saatettiin 5 °C:seen. Seokseen 30 lisättiin 2,06 g DCC:tä. Seosta sekoitettiin 5 °C:ssa 30 minuutin ajan ja sen jälkeen vielä 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sakka suodatettiin eroon ja suodosta uutettiin vedellä, 10-%:isella sitruunahappoliuoksella ja kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella. Liuotin 35 poistamalla saatiin öljy, jota puhdistettiin kromatogra- 96115 18 fisesti silikageeli 60 -valmisteessa (eluoiden) 97:3 CH2Cl2-MeOH: 11a. Tuote, (joka oli) öljy, painoi 3,46 g.

b. N-t-butyylioksikarbonyyli-prolyyli-beta-bents-yyli-aspartyyli-valiinin bentsyyliesteri 5 Poistamalla suojaryhmiä 3,41 g:sta edeltävää tuot etta 60 ml: 11a 2:1 CH2C12-TFA: ta 30 minuutin ajan saatiin trifluoriasetaattisuola öljynä. Vapaa amiini saatiin neutraloimalla kyllästetyllä natriumkarbonaattiliuoksella ja uuttamalla CH2Cl2:een. Uutteen tilavuutta pienennettiin 10 haihduttamalla, minkä jälkeen se lisättiin 1,05 g:aan N-t-butyylioksikarbonyyli-Pro:ta. Lisättiin liuos, jossa oli 0,73 g H0Bt:tä 2 ml:ssa DMF:ää, ja sitten 0,99 g DCC:tä. Seosta sekoitettiin 2,5 tunnin ajan, minkä jälkeen se suodatettiin. Suodosta uutettiin vedellä, 10-%:isella sitruu-15 nahappoliuoksella sekä kahdesti kyllästetyllä natriumbi-karbonaattiliuoksella. Kuivauksen jälkeen liuotin poistettiin, jolloin jäljelle jäi öljy. Tuotetta puhdistettiin flash-kromatografisesti silikageeli 60 -valmisteessa (eluoiden) 9:1 CH2C12-CH3CN:llä. Pääasiallisen komponentin 20 sisältävästä fraktiosta saatiin 2,31 g väritöntä öljyä. IR-spektri: 1740 cm1, 1695 cm'1 ja 1675 cm1.

c. N-alfa-formyyli-N*-nitro-arginyyli-prolyyli-beta-bentsyy1i-aspartyy1i-va1iinin bentsyyliesteri 2,23 g:aan edellisen vaiheen tuotetta lisättiin 60 ” 25 ml 1:2 TFA-CH2Cl2:ta. Liuosta sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa, jolloin jäljelle jäi vahamainen kiinteä aine, joka pestiin petro-lieetterillä. 15 ml:aan DMF:ää liuotettiin 0,72 g N-alfa-formyyli-N*-nitro-arginiinia ja 0,33 ml N-metyylimorfolii-30 nia. Liuos jäähdytettiin -20 °C:seen ja 0,40 g isobutyyli-kloroformaattia lisättiin tipoittain. Seosta sekoitettiin -20 - 10 °C:ssa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen siihen lisättiin jäähdytetty liuos, jossa oli prolyyli-beta-bent-syyliaspartyyli-valiinin bentsyyliesteri trifluoriasetaat-35 tina 20 ml:ssa DMF:ää ja 0,33 ml:ssa N-metyyli- morfolii- 96115 19 nia. Seosta sekoitettiin -15 °C:ssa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen jäähdytyshaude poistettiin ja sekoittamista jatkettiin ympäristön lämpötilassa 2 tunnin ajan. Valtaosa liuottimesta poistettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin 5 50 ml:aan CH2Cl2:ta ja uutettiin vedellä, 10-%:isella sit- ruunahappoliuoksella sekä kyllästetyllä natriumbikarbo-naattiliuoksella. Orgaaninen faasi kuivaamalla ja liuotin haihduttamalla saatiin 2,08 g tuotetta.

Ohutlevykromatografia-ajo (silikageeli-GF): 10 Rf (I) = 0,56 (CH2Cl2:MeOH/9 :1)

Rf(II) = 0,72 (CHCl3:MeOH:HOAc/8 :1:1) .

d. N-alfa-formyyli-arginyyli-prolyyli-aspartyyli- valiini

Suojaryhmät poistettiin siirtohydrauksella käyttäen 15 30 ml 5 % muurahaishappo - ammoniumformaattia palladium- mustalla. Reaktioseosta sekoitettiin pallolla suljetussa kolvissa 18 tunnin ajan. Seos suodatettiin Celitellä, minkä jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin veteen ja (liuos) kylmäkuivattiin. Tuotetta puh-20 distettiin 1,6 x 60 cm DEAE-Sephadex-kolonnissa. Eluointi aloitettiin 0,02 M ammoniumbikarbonaattiliuoksella, pH 8,5, keräten 150 pisaran fraktioita. Kun oli kerätty 52 fraktiota, otettiin käyttöön gradientti 0,02 - 0,20 M ammoniumbikarbonaatti käyttäen 2 litran nestetilavuus. Kro-25 matogrammin suurin piikki eluoitui fraktion 88 keskellä. Fraktiot 75 - 100 yhdistettiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin kuohkea amorfinen kiinteä aine. HPLC: rt = 9,4 min, 10 % MeOH - 0,01 N NH40Ac, pH 5, 1,5 ml/min, Bondapak-

Ci8.

30 Ohutlevykromatografia-ajo (silikageeli 60):

Rf(I) = 0,16 (n-Bu0H:H0Ac:H20/3 :1:1)

Rf(II) - 0,27 (n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr/15:3:12:10)

Rf(III) 0,42 (EtOAc:pyr:HOAc:H20/5:5:1:3) . Aminohappoanalyysi: Asp, 0,99; Pro, 0,97; Vai, 35 1,05; Arg, 1,00; 38 % peptidiä.

96115 20

Esimerkki 1

Pentapeptidin Arg-Pro-Ala-Val-Tyr synteesi Peptidi syntetisoitiin kiinteäfaasimenetelmällä lähtien BOC-(BZLCl2)-Tyr-hartsiesteristä (4,4 g, 0,40 meg/ 5 g). Hartsiin kytkettiin toisiaan seuraten kolme (3) ekvivalenttia kutakin BOC-Val, BOC-Ala, BOC-Pro ja CBZjArg. Kytkentääineina käytettiin DCC:tä ja HOB:tä 4:1 CH2C12:DMF-:ssä. Hartsia pilkottiin HFrllä (40 ml) anisolissa (5ml) 45 minuutin ajan 0 °C:ssa. Kiinteää jäännöstä uutettiin 10 10 ml:11a HOAc:tä ja (liuos) suodatettiin, minkä jälkeen vesiliuos kylmäkuivaamalla saatiin 1,56 g raakapeptidiä.

Puhdistus suoritettiin Sephadex SPC 25 -hartsissa kromatografisesti (2,6 x 90 cm:n kolonni) eluoiden asteittaisella NH4OAc-gradientilla: 0,05 M, ph 5 (2 litraa), 0,15 15 M, pH 5 (1 litra), 0,15 M, pH 6,7 (2 litraa); virtausnopeus 100 ml/tunti, 12,5 ml:n fraktiot, detektio 280 nm. Fraktiot 198 - 207 eristämällä saatiin otsikkopeptidi värittömänä kiinteänä aineena, 1,13 g.

Ohutlevykromatografia-ajo (silikageeli G, 250): 20 Rf (I) = 0,24 (n-PrOH:NH4OH/84 : 37)

Rf(II) = 0,64 (trif luorietanoli:NH4OH/78 : 22)

Rf(III) =0,58 (n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr/15: 3 :12:10) . Aminohappoanalyysi: Arg, 1,00; Ala, 0,96; Pro, 0,97; Vai, 1,03; Tyr, 1,01; 67 % peptidiä.

25 Esimerkki 2

Biologinen aktiivisuus: syklisen GMP:n määritys Tällä määrityksellä mitataan tämän keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin kykyä sitoutua solumembraa-nireseptoriin ehyessä MOLT-4-solussa ja selektiivisesti , 30 stimuloida syklisen GMP:n tuotantoa samoin kuin humaani- tyspleniini ja humaanitymopentiini.

MOLT-4-solulinja saatiin talletuslaitokselta the American Type Culture Collection, Rockville, Md. Vasta-' siirrostettuja MOLT-4-soluja kasvatettiin 3 päivän ajan 35 ottaen ne sitten talteen kuten kuvattu lähteessä T. Audhya 96115 21 et ai.. Arch. Biochem. Biophvs. 234 (1984) 167-177. Solut pestiin 3 kertaan PBS:ssä ja uudelleenlietettiin RPMI 1640 -kasvualustaan pitoisuudeksi 1,0 x 107 solua/ml, minkä jälkeen niiden annettiin tasapainoittua 37 “C:ssa 30 minuutin 5 ajan ennen tutkittavien pentapeptidien (25 mikrolitraa) ja verrokkipeptidien lisäämistä. Inkuboinnin annettiin kestää ravistellen vesihauteessa 4-5 minuutin ajan, minkä jälkeen se keskeytettiin lisäämällä 1 ml jääkylmää TCA:ta (10-%:inen liuos).

10 Solut TCA:ssa homogenoitiin ja niitä käsiteltiin ultraäänellä syklisen nukleotidin vapauttamiseksi. Lietettä sentrifugoitiin 3000 x g:ssä 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Saatu sakka liuotettiin 0,1 N NaOH-liuokseen proteiinisi-sällön määrittämiseksi. TCA poistettiin supernatanttifrak-15 tiosta uuttamalla 4 kertaa 5 ml:11a vedellä kyllästettyä dietyylieetteriä. Viimeisen uuttokerran jälkeen jäljellä oleva eetterijäämä poistettiin kuumentamalla 10 minuutin ajan vesihauteessa 50 eC:ssa. Kylmäkuivauksen jälkeen näyte rekonstituoitiin 50 mM asetaattipuskurissa (pH 6,2) 20 syklisen GMP:n radioimmuunimääritystä silmälläpitäen.

Kuviossa 1 esitetään tyypillisiä annos-vastekuvaa-jia, jotka on määritetty pitoisuuksille 1 - 1000 mikro-grammaa/ml aktiivisille peptideille asetyyli-Arg-Pro-beta-D-Asp-Val-NH2, Arg-Pro-Ala-Val-Tyr ja asetyyli-Arg-Pro-Ala-25 Val-NH2, verrattuna tymopentiiniin ja epäaktiivisiin pep-tideihin asetyyli-Arg-Pro-Asp-Pro-NH2, Ala-Lys-Asp-Val ja Lys-Lys-Asp-Val-NH2 MOLT-4-soluissa.

Kullekin tutkitulle peptidille määritettiin kyn-nysaktiivisuus. Tämä määritellään tutkittavan peptidin 30 alimmaksi pitoisuudeksi, joka indusoi korkeamman syklisen GMP:n solunsisäisen tason kuin kaksi (2) standardipoik-keamaa yli verrokin. Verrokkien solunsisäisen syklisen GMP:n lukemat olivat alle 0,5 pikomoolia/ml (keskiarvo +/-standardipoikkeama). Koetulokset katsottiin positiivisik-35 si, jos syklisen GMP:n taso oli korkeampi kuin 2 kertaa (2 96115 22 standardipoikkeamaa +) taso, joka oli määritetty rinnakkaiselle negatiiviselle verrokille.

Tulokset syklisen GMP:n määrityksistä on esitetty kuviossa 1 sekä sitä vastaavassa taulukossa I, joissa pep-5 tidejä on analysoitu verrattuna tymopentiiniin ja verrok-kipeptideihin. Näitä tuloksia verrattiin tymopentiiniin (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) M0LT-4-soluissa, koska humaanitys-pleniinipentapeptidi "SP-5" (Arg-Lys-Ala-Val-Tyr) on epä-aktiivinen M0LT-4-soluissa. Nämä tulokset osoittavat pep-10 tidien biologisen aktiivisuuden T-soluavustaja-aktiivisuu-den stimuloinnissa M0LT-4-soluissa.

* 1 ·

Taulukko I

23 9 6115 cGMP-pitoisuus (pikogrammaa/ml Peptidipitoisuus 5 (mikrogr./ml): _1_10_100_1000

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 6,4 18,3 20,8 21,9

Arg-Pro-Asp-Val-NH2 0,1 17,1 19,31 24,8 10 Asetyyli-Arg-Pro-Asp- 4,55 8,99 19,62 24.09

Val-NH^

Asetyyli-Arg-Pro-Glu- 4j7 9,41 16,76 25,00

Val-NH^

Asetyyli-Arg-Pro-Ala- 14,6 19,1 24,5

Val-NH„ B 2. 37 un 17,7 24,9

Asetyylx-Arg-Aib-Glu- 1 · ' »

Val_NH2 18,75 29,68 34,98 40,23

Asetyyli-Arg-Pro-Gln-

Val-NH2 4,1 11,9 7,9 30,8

Asetyyli-Arg-Pro-Glu-Val

Asetyyli-Arg-Aib-Ala-Val- 18,78 30,45 36,17 39,48 nh2 yn Asetyyli-Arg-Pro- Ä-D- Asp- 6,6 14,3 20,5 25,0

Val-NH2 ^

Asetyyli-Arg-Pro-^-Asp- 20,56 31,83 36,66 34,95

Gly-NH2

Lys-Lys-Asp-Val-NH2 0,33 0,31 0,34 0,33

Lys-Arg-Asp-Val 0,44 0,43 0,44 0,39 25 Arg-Gly-Asp-Ser 0,71 0,50 0,68 0,58

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr 0,09 16,41 27,90 37,14

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2 3f7l 14,15 12,83 12,57

Asetyyli-Arg-Lys-Ala-Val- 3,00 8.86 12,83 18.43 30 Tyr-NH2 35 0 peptldlverrokki on 0-0,3 pikogrammaa/ml

Claims (4)

96115

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on aminohapposekvenssi, jolla 5 on kaava R2-Arg-X' -Ala-Y' -Z' -R3 jossa kaavassa R2 on H, alempi alkyyli, asetyyli, formyyli, 10 alempi alkanoyyli tai des-amino; X' on Pro, dehydro-Pro, hydroksi-Pro, D-Lys, Aib tai Lys; Y' on D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valitaan seuraavista: Vai, Ile, Leu, Ala, Asp, Glu, Gin,

15 Lys; Z' on D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valitaan seuraavista: Tyr, Vai, Leu, His, Ala ja Trp; R3 on OH tai NR4R5, jossa R4 ja R5 ovat vetyjä tai suoraketjuisia tai haarautuneita alkyylejä tai alkenyyle-20 jä, jotka käsittävät 1-6 hiiliatomia, tai R4 ja R5 muodostavat yhdessä 3-7 hiiliatomin syklisen metyleeniryh-män, tunnettu siitä, että a) suoritetaan kiinteäfaasimenetelmä, jossa käytetään peptidihartsivälituotetta, joka käsittää yllä määri- 25 tellyn sekvenssin aminohapporyhmät, liittyneinä suojaryh- miin, jotka ovat toisistaan riippumatta aminoa suojaavia ryhmiä, hydroksyyliä suojaavia ryhmiä, indolia suojaavia ryhmiä tai imidatsolia suojaavia ryhmiä ja hartsin, joka on kiinteäfaasipolymeeri, johon arginiini voidaan sitoa 30 kiinteästi kovalenttisella sidoksella; tai b) suoritetaan peptidin liuos-synteesi, johon sisältyy yllä olevaan kaavaan sisältyvien aminohappojen tai peptidifragmenttien kytkeminen vaiheittain tai lohkoittain toisiinsa muodostamalla amidisidoksia niiden väliin, jol- 35 loin menetelmällä saadaan kaavan mukainen peptidi. 96115

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidissä X' on Pro ja Y' on Vai.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että peptidi on Arg-Pro-Ala-Val-Tyr Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2 asetyyli-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2, a s e tyy1i-Arg-Lys-A1a-Va1-Tyr-NH2, tai Arg-Pro-Ala-Val-Tyr. · · »· 115