FI94350C - Menetelmä T-soluavustaja-aktiivisuutta omaavien peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

94350

Menetelmä T-soluavustaja-aktiivisuutta omaavien peptidien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää synteettisten peptidien 5 valmistamiseksi, jotka kykenevät stimuloimaan avustaja-T-soluaktiivisuutta. Tarkemmin ottaen peptidit ovat tetra-peptidejä, joiden perustana on tyspleniinimolekyyli.

Keksinnön tausta

Immuunisäätelijäproteiinit, tymopoietiini ja tys-10 pieniini (jota aiemmin kutsuttiin "speliiniksi"), on eristetty naudan ja ihmisen kateenkorvasta ja vastaavasti pernasta. Lisäksi kemiallisesti on syntetisoitu pieniä peptidejä, jotka jäljittelevät tymopoietiinin biologista aktiivisuutta, ja niitä on edelleen modifioitu lisäominaisuuk-15 sien kuten vastustuskyvyn entsymaattisen vaikutuksen saamiseksi. Katso esim. US-patenttijulkaisu 4,505,853.

Nyttemmin on julkistettu suuri määrä tällaisia proteiineja ja syntetisoituja peptidejä koskevia artikkeleita ja patentteja. US-patenttijulkaisussa 4,190,646 julkiste-20 taan pentapeptidi tymopentiini, joka on tymopoietiinin aktiivinen keskus ja jonka sekvenssi on Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, sekä peptidikoostumuksia, joissa tämän pentapeptidin amino- ja/tai karboksyylipäätyyn on substituoitu erilaisia ryhmiä. Sekä tymopoietiini että tymopentiini indusoivat .· 25 biologisia muutoksia kahdessa humaani-T-solulinjassa, CEM:ssä ja M0LT-4:ssä, antaen täten osoituksen roolistaan biologisten aktiivisuuksien stimuloinnissa T-soluissa. Minkään pentapeptidejä (sekvenssissä 5 aminohappoa) ly-hyempien tymopentiinianalogien ei todettu olevan aktiivi-30 siä CEM-soluissa.

US-patentissa 4 923 964 julkistetaan ihmisen per-nasta eristetty 48 aminohapon immuunisäätelijäproteiini, spleniini (johon viitataan tästä eteenpäin "tyspleniini-nä"). Nautatyspleniini stimuloi avustaja-T-soluaktiivi- 2 94350 suutta in vivo hiirissä. Humaanityspleniinin odotetaan täten osoittavan analogista biologista aktiivisuutta ihmisissä. Humaanityspleniinin kuvattiin edellä identifioidussa hakemusjulkaisussa indusoivan solunsisäisen 5 cGMP:n kohoamista humaani-T-solulinjassa MOLT-4. Nautatys-pleniinin, jota kutsutaan SP-5:ksi, aktiivinen keskus kattaa sen aminohappojäännökset 32 - 36, ja sen sekvenssi on Arg-Lys-Glu-Val-Tyr. US-patentissa 4 923 964 humaanisek-venssin aktiiviseksi keskukseksi julkistettiin Arg-Lys-10 Ala-Val-Tyr.

Tyspleniini, päinvastoin kuin tymopoietiini, ei aiheuta muutoksia CEM-solujen biologisessa aktiivisuudessa. Täten tyspleniini vaikuttaa osallistuvan T-soluavus-taja-aktiivisuuden, eikä T-solusupressoriaktiivisuuden, 15 stimulointiin. Katso myös esimerkiksi Goldstein, G., Nature (Lontoo) 247 (1974) 11-14; Basch, R.S., ja Goldstein, G., Proc. Natl♦Acad♦Sei. U.S.A. 71 (1974) 1474-1478;

Scheid, M.P., et.ai., J.Exp.Med. 147 (1978) 1727-1743;

Scheid, M.P., et.ai., Science 190 (1975) 1211-1213; Ran-20 ges, G.E., et.ai., J.Exp.Med. 156 (1982) 1057-1064; T.

Audhya et.

ai., Biochem. 20 (1981) 6195-6200; Venkatasubramanian, K., et.ai., Proc.Natl.Acad.Sei. U.S.A. 83 (1986) 3171-3174;

Malaise, M.G., et.ai., kirjassa "Immunoregulatory UCLA 25 Symposium on Molecular and Cellular Biology", toim.

Goldstein, G., et.ai., Liss, New York, 1986; Sunshine, G.H., et.ai., J. Immunol. 120 (1978) 1594-1599, ja E. Rentz et.ai., Arch.Geschwulstforsch., 54:2 (1948) 113-118. Katso myös US-patenttijulkaisut 4,190,646; 30 4,261,886; 4,361,673; 4,420,424; ja 4,629,723. Kyseiseen ; keksintöön liittyvää muuta tausta-aineistoa ja liittyviä biologisia menetelmiä koskevan keskustelun osalta viitataan edellä kuvattuihin patenttijulkaisuihin, hakemusjul-kaisuihin sekä artikkeleihin.

35 US-patenttijulkaisussa 4,428,938, jonka omistavat

Kisfaludy et.ai. ja joka julkaistiin 31. tammikuuta 1984,

II

94350 3 julkistetaan tiettyjä immuunisäätelyyn vaikuttavia peptidejä. Näiden peptidien joukossa ovat seuraavat tetrapepti-dit:

Arg-Lys-Asp-Val 5 Arg-Lys-Asn-Val

Arg-Lys-Ala-Val Arg-Lys-Asp-Ala Arg-Lys-Asp-Ile Arg-Lys-Glu-Val 10 Glp-Arg-Lys-Asp

Patenttijulkaisu '938 sisältää yleisesti näiden sekvenssien suoloja, amideja, (alempi alkyyli)-estereitä sekä suojattuja johdannaisia, sekä menetelmiä näiden sekvenssien käyttämiseksi kateenkorvapuutoksista johtuvien 15 immunologisten häiriöiden hoitamiseksi. Tässä patentissa kyseisten peptidien aktiivisuutta testattiin in vitro E-ruusukemäärityksellä.

Samat tutkijat ilmoittivat tällaisista tetrapepti-deistä julkaisusssa Kisfaludy et.ai., Hoppe-Seyler * s 20 Z.Phy- siol.Chem. 364 (1983) 933-940. Tässä artikkelissa ilmoitettiin, että sekvenssi Arg-Lys-Glu-Val oli erittäin aktiivinen analogi in vitro -E-ruusukekokeessa, ja että sekvenssit Arg-Ala-Asp-Val ja Arg-Lys-Ala-Val omaavat erittäin voimakkaasti alentuneen aktiivisuuden.

. 25 Alalla on edelleen tarve saada muita peptidejä, jotka olisivat hyödyllisiä ihmisten immuunijärjestelmän stimuloinnissa erilaisissa T-solupuutostiloissa.

Keksinnön yhteenveto

Kyseinen keksintö kuvaa sarjaa tyspleniinipeptidi-30 analogeja, jotka kykenevät indusoimaan biologista aktiivisuutta M0LT-4-T-solulinjassa. Päinvastoin kuin tymopen-tiinianalogit, joista on ilmoitettu aiemmin, pienemmät kuin pituudeltaan viiden aminohapon ja tyspleniinille sukua olevat peptidit ovat aktiivisia T-soluavustaja-aktii-35 visuuden indusoinnissa M0LT-4-soluissa.

94350 4

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on aminohapposekvenssi, jolla on kaava 5 R-Arg-X-Y-Z-R1 jossa kaavassa R on H, alempi alkyyli, asetyyli, formyyli, alempi alkanoyyli; X on Pro, dehydro-Pro, hydroksyyli-Pro tai Aib; 10 Y on D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka vali taan seuraavista: Ala, Asp, Glu, Gin, Asn, beta-Asp, Vai tai Ile; Z on Gly tai D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valitaan seuraavista: Vai, Ala, Leu tai Ile? 15 R1 on H tai NRZR3, jossa R2 ja R3 ovat toisistaan riippumatta vetyjä tai suoraketjuisia tai haarautuneita alkyylejä, jotka käsittävät 1-6 hiiliatomia Näillä peptideillä ja näitä peptidejä sisältävillä koostumuksilla on yllättävästi tallella humaanitysplenii-20 nin biologinen aktiivisuus. Suurelle määrälle näitä peptidejä on niinikään tunnusomainen parantunut vastustuskyky hyökkäyksille endo- ja eksopeptidaasien sekä trypsiinin kaltaisten entsyymien toimesta ruoansulatuskanavassa ja seerumissa. Täten nämä peptidit tarjoavat merkittäviä etu-25 ja immuunipuutosten hoidossa. Erityisesti kyseiset tetra-peptidit, joissa X on Pro tai Aib, omaavat yllättävää vastustuskykyä hajoamista vastaan entsyymien kuten seerumi-peptidaasien toimesta.

Kyseisen keksinnön muita näkökohtia ja etuja jul-30 kistetaan seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa, joka sisältää esimerkkejä tämänhetkisistä edullisista suoritusmuodoista.

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 on graafinen esitys M0LT-4-cGMP-määrityk-35 sestä, jossa esitetään peptidipitoisuuden (mikrogrammaa/ 94350 5 ml) funktiona cGMP-tasot (pikogrammaa/ml), ja verrataan tymopentiinin (TP-5:n) ja tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien aktiivisuutta verrokkeihin.

Kuvio 2 on graafinen esitys MOLT-4-cGMP-määrityk-5 sestä, jossa esitetään peptidipitoisuuden (mikrogrammaa/ ml) funktiona cGMP-tasot (pikogrammaa/ml), ja verrataan tymopentiinin (TP-5:n) ja tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidin Ac-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 aktiivisuutta. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 10 Kyseinen keksintö tarjoaa sarjan tetrapeptidejä, joiden kaava on: (I) R-Arg-X-Y-Z-R1 tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävän happo- tai emäs-additiosuolan, jolloin kaavassa R, X, Y, Z ja R1 ovat kuten 15 edellä määritelty.

Tässä käytettynä ilmaisu "alempi alkyyli" kattaa haarautuneet ja suoraketjuiset tyydytetyt hiilivedyt, jotka omaavat 1-6 hiiliatomia, kuten metyyli, etyyli, pro-pyyli, isopropyyli, pentyyli, heksyyli ja muut samankal-20 täiset, kun puolestaan ilmaisulla "alempi alkanoyyli" tar- 0

M

koitetaan ryhmää (alempi alkyyli)-C-,

Kautta tämän hakemusjulkaisun peptidien aminohap-porakenneosat ja tietyt niiden valmistuksessa käytetyt .. 25 materiaalit identifioidaan kätevyyden vuoksi lyhenteillä.

Useimmat aminohapoista käytetyt kolmen kirjaimet lyhenteet ovat varsin tunnettuja. Muita vähemmän tunnettuja lyhenteitä ovat Asu, aminosukkiini-imidyylistä, ja Glp, pyroglutamyylistä (myös p-Glu). Ellei toisin mainittu 30 kaikki aminohapot ovat L-isomeerikonfiguraatiossa. Tarkoi-.· tettaessa D-isomeerikonfiguraatiota se on merkitty.

Tiettyjä kyseisen keksinnön mukaisia edullisia tetrapeptidejä ovat ne edeltävän kaavan I mukaiset tetra-peptidit, joissa X on Pro tai Aib. Edullisempia peptidejä 35 ovat ne kaavan I mukaiset peptidit, joissa X on Pro, Y on 6 94350

Vai ja Z on Ala, tai joissa X on Pro, Y on Ala ja Z on Vai. Seuraavat peptidit edustavat useita edullisia tetra-peptidej ä: asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 5 Arg-Pro-Asp-Val

Arg-Pro-Asp-Val-NH2 formyyli-Arg-Pro-Asp-Val asetyyli-Arg-Pro-Asp-Val asetyyli-Arg-Pro-Asp-Val-NH2 10 asetyyli-Arg-Pro-Ala-Val-NH2 asetyyli-Arg-Pro-D-beta-Asp-Val-NH2 asetyyli-Arg-Pro-Glu-Val-NH2 asetyyli-Arg-Pro-Glu-Val asetyyli-Arg-Aib-Ala-Val-NH2 15 asetyyli-Arg-Aib-Glu-Val-NH2 asetyyli-Arg-Pro-beta-Asp-Gly-NH2 Näiden peptidien kanssa suoloja muodostamaan kykeneviä happoja ovat kuitenkaan mainittuihin rajoittumatta epäorgaaniset hapot kuten kloorivetyhappo, bromivetyhap-20 po, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihap po, fosforihappo ja vastaavat. Orgaanisia happoja voidaan niinikään käyttää keksinnön mukaisten suolojen muodostamiseksi, esim. muurahaishappoa, etikkahappoa, propionihap-poa, glykolihappoa, maitohappoa, palorypälehappoa, oksaa-25 lihappoa, malonihappoa, meripihkahappoa, maleiinihappoa, fumaarihappoa, antraniliinihappoa, kanelihappoa, naftalee-nisulfonihappoa, sulfaniliinihappoa ja muita vastaavia.

Ei-kattava luettelo emäksistä, jotka kykenevät muodostamaan suoloja happamia osuuksia omaavien peptidien 30 kanssa, ovat epäorgaaniset emäkset, kuten natriumhydroksi-. di, ammoniumhydroksidi, kaliumhydroksidi ja muut vastaa vat. Orgaanisia emäksiä tällaiseen käyttöön ovat mainittuihin rajoittumatta mono-, di- ja tri-alkyyli- ja aryy-liamiinit (esim. trietyyliamiini, di-isopropyyliamiini, 35 metyyliamiini, dimetyyliamiini) ja mahdollisesti substi- • 7

Q '1 C Π /-f jjU

tuoidut etanoliamiinit (esim. etanoliamiini, dietanoli-amiini).

Tässä kuvatut peptidit voidaan yleensä valmistaa tunnettuja tekniikoita noudattaen. Keksinnön mukaiselle 5 menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Käytännöllisesti esitetyn polypeptidin synteettinen valmistus voi tapahtua kiinteäfaasisynteesi-menetelmän mukaan, jota on kuvannut Merrifield artikkelissa J.A.C.S. 85 (1963) 2149-2154. Tämä tekniikka ymmärre-10 tään hyvin ja se on tavallinen menetelmä peptidien valmistamiseksi. Kiinteäfaasisynteesimenetelmässä suojattuja aminohappoja lisätään vaihe kerrallaan kasvavaan peptidi-ketjuun, joka on sidottu kovalenttisilla sidoksilla kiinteään hartsiosaseen. Tässä menettelyssä reagenssit ja si-15 vutuotteet poistetaan suodattamalla, jolloin vältytään välituotteiden puhdistamiselta. Tämän menetelmän yleisohje on riippuvainen ketjun ensimmäisen aminohapon kiinnittymisestä kiinteään polymeeriin kovalenttisella sidoksella. Seuraavat suojatut aminohapot lisätään vaiheittain 20 yksi kerrallaan, tai ryhminä, kunnes haluttu sekvenssi on koottu. Lopuksi suojattu peptidi poistetaan kiinteästä hartsikantajasta ja suojaryhmät pilkotaan pois.

Aminohapot voidaan kiinnittää mihin tahansa sopivaan, hartsina toimivaan polymeeriin. Hartsin tulee sisäl-. 25 tää funktionaalinen ryhmä, johon ensimmäinen suojattu ami nohappo voidaan tukevasti kytkeä kovalenttisella sidoksella. Tähän tarkoitukseen soveltuvat erilaiset polymeerit, kuten selluloosa, polyvinyylialkoholi, polymetyylimetakry-laatti ja polystyreeni. Tarkoituksenmukaisia tällaisessa 30 synteesissä käytettäviksi soveltuvia suojaryhmiä ovat ,· t-butyylioksikarbonyyli (BOC), bentsyyli (BZL), t-amyyli- oksikarbonyyli (AOC), tosyyli (TOS), o-bromifenyylimetok-sikarbonyyli (BrZ), 2,6-diklooribentsyyli (BZLC12) ja fe-nyylimetoksikarbonyyli (Z tai CBZ). Lisää suojaryhmiä i-35 dentifioidaan edeltävässä tekstissä sekä kirjassa J.F.W.

8 94350

McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973. Nämä kummatkin kirjat sisällytetään tähän viitteiksi.

Yleismenettelyssä peptidien valmistamiseksi aluksi 5 suojattu C-päätyaminohappo kiinnitetään hartsiin tämän keksinnön mukaisesti. Kiinnittymisen tapahduttua hartsi suodatetaan, pestään ja C-päätyaminohapon alfa-aminoryh-män käsittämä suojaryhmä (edullisesti t-butyylioksikarbo-nyyli) poistetaan. Tämän suojaryhmän poisto on luonnol-10 lisesti suoritettava katkaisematta tuon aminohapon ja hartsin välistä sidosta. Saatuun hartsi-peptidiin kytketään sitten toiseksi viimeinen C-päätyaminohappo suojattuna. Tämä kytkeminen suoritetaan muodostamalla amidisidos toisen aminohapon vapaan karboksyyliryhmän sekä ensimmäi-15 sen, hartsiin kiinnitetyn aminohapon aminoryhmän välille. Tätä vaihesarjaa toistetaan peräkkäisillä aminohapoilla, kunnes kaikki aminohapot on kiinnitetty hartsiin. Lopuksi suojattu peptidi lohkaistaan hartsista ja suojaryhmät poistetaan halutun peptidin saamiseksi. Pilkkomismenet-20 telyt, joita käytetään peptidin erottamiseksi hartsista sekä suojaryhmien poistamiseksi, ovat riippuvaisia hartsin ja suojaryhmien valinnasta, ja ovat tuttuja peptidisynteesin alaan perehtyneille.

Vaihtoehtoisia peptidisynteesin tekniikoita kuva-25 taan kirjassa "Peptide Synthesis", Bodanszky et.ai., 2.

painos, John Wiley & Sons, 1976. Esimerkiksi tässä kuvatut peptidit voidaan syntetisoida myös käyttäen tavanomaisia peptidisynteesin liuoksessa -menettelytapoja, joissa joko askel kerrallaan tai ryhminä kytketään aminohappoja tai 30 peptidifragmentteja käyttäen kemiallisia tai entsymaatti-. siä menetelmiä amidisidoksen muodostamiseksi. Nämä liuos- synteesimenetelmät ovat alalla tunnettuja.

Tämän keksinnön mukaisten peptidien on todettu osoittavan biologista aktiivisuutta, joka on samankaltais-35 ta kuin humaanityspleniinin, edellä mainitussa US-patent- • 9 Q A 'i c. n

/n jjU

tissa 4 923 964 ja edellä mainituissa artikkeleissa julkistetun mukaisesti. Tämä biologinen aktiivisuus osoitetaan ensisijaisesti määrityksellä, jolla mitataan syklisen GMP:n tuotannon indusointia humaani-T-solulinjassa 5 MOLT-4 humaanityspleniiniin ja humaanitymopentiiniin verrattuna. cGMP-tuotannon indusointi kyseisen keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin toimesta tässä määrityksessä osoittaa tuon peptidin kykyä sitoutua humaanityspleniini-reseptorikeskukseen solun pinnalla sekä indusoida humaani-10 tyspleniinin kaltaista biologista aktiivisuutta.

Monet kyseisistä tetrapeptideistä tarjoavat toisen merkittävän edun humaanityspleniiniin verrattuna. Monille kyseisen keksinnön mukaisesti valmistetuille peptideille on tunnusomainen vastustuskyky entsymaattiselle hajoami-15 selle joko ruoansulatus- tai seerumientsyymien toimesta. Täten ne osoittavat pidentynyttä puoliintumisaikaa in vivo annettaessa niitä ruiskeena biologiselle kohteelle. Toinen monien näistä peptideistä etu on, että niitä voidaan antaa suun kautta. Humaanityspleniini sinänsä on liian suuriko-20 koinen molekyyli, jotta se voitaisiin tehokkaasti antaa suun kautta ja jotta se tulisi sulatetuksi ruoansulatuskanavassa.

Ennen keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien testaamista ei odotettu, että voitaisiin valmistaa humaa-25 nityspleniinin tetrapeptidianalogeja, jotka omaisivat sa-man biologisen spesifisyyden, koska Arg-Lys-Ala-Val-Tyr, joka on nautapentapeptidin SP-5 (Arg-Lys-Glu-Val-Tyr) analogi ihmisessä, on epäaktiivinen M0LT-4-soluissa. Täten oli odottamatonta, että löytyi humaanityspleniinin tetra-30 peptidianalogeja, jotka osoittivat samaa biologista aktiivisuutta kuin ehyt humaanityspleniinimolekyyli.

Kyseisten peptidien immuunisäätelijäominaisuuksien ansiosta ne ovat terapeuttisesti hyödyllisiä ihmisten, ja mahdollisesti eläinten, hoidossa, koska niillä on kyky 35 indusoida T-solujen differentiaatio ja kypsyminen, jotka • · < 94350 10 (T-solut) kykenevät osallistumaan elimistön immuunivasteeseen. Tämän johdosta kyseisillä peptideillä katsotaan olevan moninaisia terapeuttisia käyttöjä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja peptidejä 5 pidetään hyödyllisinä avustamassa elimistön kollektiivisessa immuniteetissa siinä mielessä, että ne nostavat tai avustavat soluimmuniteetin terapeuttista stimulaatiota. Ne ovat siten hyödyllisiä sairauksien hoitamiseksi, joihin liittyy krooninen tulehdus, kuten sieni- ja mykoplasmatar-10 tunnat, tuberkuloosi, lepra, akuutit tai krooniset virustartunnat ja muut vastaavat.

Kyseisiä peptidejä tai kyseisiä peptidejä tai niiden happo- tai emässuoloja sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia pidetään yleensä hyödyllisinä millä tahansa alu-15 eella, jolla eräänä tekijänä on soluimmuniteetti, ja erityisesti, milloin kyseessä ovat immuniteettipuutokset. Täten tapauksissa, joissa esiintyy epätasapainossa olevista T-soluista johtuen liiallista vasta-ainetuotantoa, kyseiset peptidit kykenevät korjaamaan tämän tilan stimu-20 loimalla T-solufunktiota. Täten niiden odotetaan olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia tietyissä autoimmuunisairauksissa, joissa muodostuu vahingollisia vasta-aineita, kuten systeeminen punahukka, nivelreuma tai vastaava tila.

Kattavimpana sovellutuksenaan kyseiset peptidit tai 25 niitä sisältävät farmaseuttiset koosteet ovat hyödyllisiä tällaista säätelyä tarvitsevan kohteen, ihmisen tai eläimen, immuunijärjestelmän säätelemiseksi. Tässä käytettynä ilmaisulla "säädellä" tarkoitetaan, että kyseiset yhdisteet saavat immuunijärjestelmän palaamaan epänormaalista, 30 sairaasta tilasta normaaliin, tasapainossa olevaan tilaan.

, Vaikka tälle säätelylle saattaa hyvinkin löytyä runsaasti sovellutuksia immunologisten puutoksien korjauksessa (esim. DiGeorge-oireyhtymä), se soveltuu niinikään liiallista immunologista aktiivisuutta käsittävien tilojen kor-35 jaukseen (esim. autoimmuunisairaudet).

94350 11

Esitetyt peptidit soveltuvat tilojen hoitamiseen, jotka ovat seurausta kohteen immuunijärjestelmän suhteellisista tai absoluuttisista puutoksista, erityisesti T-soluavustajafunktiossa, jolloin sanotulle kohteelle anne-5 taan terapeuttisesti tehokas määrä ainakin yhtä tämän keksinnön mukaista peptidiä.

Tässä käytettynä ilmaisulla "terapeuttisesti tehokas määrä" tarkoitetaan määrää, joka on tehokas edellä mainittujen tilojen hoitamiseksi. Peptidejä voidaan myös 10 käyttää T-solujen differentiaation ja kypsymisen indusoi-miseen, jolloin tehokas indusoiva määrä ainakin yhtä peptidiä annetaan kohteelle.

Voidaan edelleen valmistaa farmaseuttisia koostumuksia hoitomenetelmien harjoittamiseksi. Farmaseuttisten 15 koostumuksien valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti valmistettu peptidi yhdistetään vaikuttavana ainesosana likeiseksi seokseksi farmaseuttiseen kantajaan tavanomaisten farmaseuttisen koostamisen tekniikoiden mukaan. Tämä kantaja voi esiintyä hyvin erilaisissa muodoissa riippuen 20 annettavan valmisteen toivotusta muodosta, esim. suun kautta, kielen alle, peräsuolen kautta, nenän kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annettavana muotona.

Keksinnön mukaisesti valmistettu tetrapeptidi on yleensä aktiivinen, jos sitä annetaan määrinä, jotka ylit-25 tävät noin 1 mikrogrammaa/kg ruumiinpainoa, ja määrät ovat edullisesti noin 0,001 - noin 10 mg/kg ruumiinpainoa.

Yleensä samaa annostusmääräaluetta voidaan käyttää hoidettaessa mainittuja sairauksia tai tiloja, joissa on määrä hoitaa immuunipuutosta. Suuret määrät (esim. noin 30 10 - 100 mg/kg ruumiinpainoa) ovat hyödyllisiä liial- . lisen immuuniaktiivisuuden supressoimiseksi.

Virusvastainen aktiivisuus

Koe suoritettiin käyttäen normaaleja, terveitä, CDl-laboratoriohiiriä. Hiiret jaettiin 30: n ryhmiin ja 35 niihin ruiskutettiin ihon alaisesti LD50-tappava annos » · « 12 94350 hiireen adaptoitua A/HK/68-influenssavirusta. Alkaen 2 vuorokautta infektoimisen jälkeen jokaiselle hiirelle annettiin 0,03 pg keksinnön mukaisesti valmistettua peptidiä asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 formulaationa, joka sisälsi 5 glysiiniä ja raffinoosia. Kontrolliryhmälle hiiriä annettiin vastaavasti 0,03 pg glysiini-raffinoosi-kantajaa ilman peptidiä. Jokaiselle hiirelle annettiin samaa annosta joko peptidiä tai pelkkää kantajaa viisi kertaa viikossa.

Hiiret, jotka oli käsitelty edellä mainitulla pep-10 tidillä, selvisivät hengissä merkittävästi paremmin kuin kontrollihiiret 12 vuorokauden aikana. Toisin sanoen peptidillä oli terapeuttinen tai immuunijärjestelmää vahvistava vaikutus hiirissä, jolloin suurempi määrä hiiriä pystyi torjumaan virusinfektiota.

15 Sokeritautia potevat hiiret

Kasvatettiin ei liikalihavuudesta kärsivää labora-toriohiirikantaa NOD, jota ylläpidetään Pariisissa, Ranskassa, Hospital Neekerissä, ja jonka naaraat spontaanisti kehittävät haiman autoimmuunisairautta. Taudin normaalissa 20 kulussa haiman solut rappeutuvat, mikä johtaa insuliini-tuoton menetykseen ja diabetes mellitus-tautiin. Tämä hii-rikanta sen sijaan kehittää paljolti tyyppiä I vastaavaa sokeritautia, jota tavallisesti hoidetaan insuliinin korvauksella, mutta jota tyypillisesti voidaan hidastaa im-25 munosuppressiivisilla lääkkeillä esim. syklosporiinilla.

12-20 naarasta käsittäville ryhmille annettiin 1 mg/kg ruumiinpainoa peptidiä asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 formulaatiossa, joka sisälsi glysiiniä ja raffinoosia. Kontrolliryhmälle annettiin vastaava määrä glysiini-raf-30 finoosi-kantajaa ilman peptidiä kerran viikossa. 21 viikon kuluttua noin 28 %:lle kontrollihiiristä oli kehittynyt sokeritauti, kun sen sijaan vain noin 12 %:lle peptidiä saaneista hiiristä oli kehittynyt tauti. Tämä osoittaa peptidin myönteistä vaikutusta, esim. näiden eläinten 35 puuttuvan suppressori T-solufunktion stimulaatiota tai • 94350 13 korjaantumista. Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön havainnollistamiseksi, jolloin keksintöä ei erityisesti rajoiteta näihin. Esimerkeissä ja kautta selitysosan osuudet ovat paino-osuuksia, ellei toisin mainittu. Esimer-5 keissä käytetään seuraavia lyhenteitä: TFA trifluorietik-kahaposta; HOAc etikkahaposta; CH2C12 metyleenikloridista; CH3CN asetonitriilistä; DMF dimetyyliformamidista; NH4OAc ammoniumasetaatista; NH4OH ammoniumhydroksidista; n-PrOH n-propanolista; n-BuOH n-butanolista; pyr pyridiinistä; 10 DCC disykloheksyylikarbodi-imidistä; HOBt 1-hydroksibent-sotriatsolista; DMAP dimetyyliaminopyridiinistä; HF fluo-rivedystä; TCA trikloorietikkahaposta; BHA bentshydryyli-amiinista; ja MeOH metanolista.

Esimerkki 1 15 Tetrapeptidin asetyyli-Arg-Pro-Ala-Val-NH2 synteesi

Edellä mainittu tetrapeptidi syntetisoitiin käyttäen kiinteäfaasisynteesiä vaihe kerrallaan tapahtuvien kytkentöjen avulla. Kaikkien aminohappojen alfa-aminoryh-mä oli suojattu t-butyylioksikarbonyyli-(BOC-)ryhmällä. 20 Arg:n sivuketjun suojaamiseksi käytettiin tosyyliä (TOS). Suojattuja aminohappoja käytettiin 2,5 ekvivalenttia ylimäärin verrattuna kuhunkin substituutioekvivalenttiin hartsissa. Kaikki kytkennät suoritettiin DCC/HOBt:llä, joita käytettiin suojattuja aminohappoja vastaavat ekviva-. 25 lentit. Kaikki aminohapot liuotettiin CH2Cl2:een lukuunottamatta Arg:tä, joka liuotettiin DMF:ään.

Pesu-, suojaryhmänpoisto- ja kytkentävaiheet olivat seuraavat: 1. CH2C12 2x3 min 30 2. 50-%:inen TFA - CH2C12 1x3 min 3. 50-%:inen TFA - CH2C12 1 x 30 min 4. CH2C12 1x3 min 5. 40-%:inen isopropanoli - CH2C12 2x3 min 6. CH2C12 2x3 min 35 7. 10-%:inen di-isopropyylietyyliamiini 2 x 10 min 8. CH2C12 1x3 min 94350 14 9. aminohappo 1x3 min 10. HOBt 1x3 min 11. DCC 1 x 120 min 12. CI^C^ 2x3 min 5 13. 40-%:inen isopropanoli - Cl^C^ 2x3 min 14. DMF 1x3 min 15. CH2CI2 2x3 min a. Synteesi

Suojattu peptidi syntetisoitiin käyttäen Beckmanin 10 malli 990 peptidisyntetisaattoria. Saatu tetrapeptidi-hartsi oli 0,67 meg/g ja synteesi alkoi 5,0 g:11a (3,35 mmol) hartsia. Saatu tetrapeptidi asetyloitiin sitten käsittelemällä hartsia seuraavilla: 1. CH2CI2 2x3 min 15 2. 50-%:inen TFA - CH2C12 1x3 min 3. 50-%:inen TFA - CH2C12 1 x 30 min 4. CH2CI2 1x3 min 5. 40-%:inen isopropanoli - CI^C^ 2x3 min 6. CH2CI2 2x3 min 20 7. 10-%:inen di-isopropyylietyyliamiini 2 x 10 min 8. CH2CI2 1x3 min 9. 50-%:inen asetanhydridi - + 1 x 120 min katalyyttinen määrä DMAPrtä 10. CH2CI2 2x3 min . 25 11. 40-%:inen isopropanoli - Ci^C^ 2x3 min 12. DMF 1x3 min 13. CH2CI2 2x3 min

Peptidihartsi kuivattiin alipaineessa, kun se oli ensin pesty etanolilla (2 x 50 ml).

30 b. Pilkkominen HF:llä

Raakatetrapeptidi saatiin pilkkomalla hartsi-peptidiä HF:llä (25 ml) ja anisolilla (25 ml) 4 tunnin ajan 0 °C:ssa. HF poistettiin alipaineessa. Seokseen lisättiin dietyylieetteriä (150 ml). Liuosta sekoitettiin ja se 35 siirrettiin lasisintterisuppiloon ja pestiin vielä dietyy-lieetterillä (3 x 100 ml). Peptidi uutettiin hartsista 94350 15 10 %:isella HOAc:llä (3 x 100 ml) ja kylmäkuivaamalla vesiliuos saatiin 1,20 g peptidituotetta. c. Puhdistus

Tuotetta puhdistettiin preparatiivisella korkean 5 suorituskyvyn nestekromatografia-ajolla (HPLC) seuraa- vissa olosuhteissa: Whatman-kolonni Partisil M20 10/50 0DS3; 300 mg:n näyte käyttäen isokraattista 15-%:ista CH3CN/0,01 M NH40Ac-järjestelmää (pH säädetään 5:ksi HOAcillä); virtausnopeus 15 ml/min; 220 nm:n detektio-aal-10 lonpituus. Kaikki puhtaat fraktiot kerättiin. Orgaaninen liuotin haihdutettiin, minkä jälkeen vesiliuos kylmäkuivaamalla saatiin 258 mg valkeaa kiinteää ainetta.

Aminohappoanalyysi: Pro, 1,00; Ala, 1,00; Vai, 1,00; Arg, 1,01; 83 % peptidiä.

15 Ohutlevykromatografia-ajo (Silica 60/Analtech):

Rf(I) = 0,50 (butanoli:etikkahappo:vesi/3:1:1) Rf(II) - 0,59 (butanoli:pyridiini:etikkahappo: vesi/4:1:1:2)

Rf(III) = 0,29 (butanoli:etikkahappo:vesi:etyyli-20 asetaatti/1:1:1:1)

Esimerkki 2

Tetrapeptidin asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 synteesi a. Synteesi

Tetrapeptidi valmistettiin Applied Biosystems 430A-. 25 peptidisyntetisaattorilla. Käytettiin 1 tunnin syklin menettelyä (valmistajan muoto 1.40), joka kytki jokaisen aminohapon kerran lukuunottamatta BOC-Tos-Arg:tä, joka kaksoiskytkettiin. Synteesissä käytettiin seuraavia esi-pakattuja lähtömateriaaleja: 30

Reagenssi Lähde mmol Määrä p-metyyli-BHA-hartsi ABI 0,50 760 mg BOC-Tos-Arg ABI 2,0 857 mg BOC-Pro ABI 2,0 430 mg 35 BOC-Val ABI 2,0 434 mg BOC-Ala ABI 2,0 378 mg 16 Q a R n y-Γ J Ju

Sitten kun arginiinin BOC-ryhmä oli poistettu ja peptidi-hartsi oli neutraloitu ja pesty, yhdiste asetyloitiin käyttäen 10-%:ista asetanhydridiliuosta CH2Cl2:ssa (15 ml) 4-dimetyyliaminopyridiinin (20 mg) läsnäollessa. 60 minuu-5 tin kuluttua peptidi tutkittiin ninhydriinikokeella täydellisen asetyloitumisen varmistamiseksi. Peptidi-hartsi pestiin CH2Cl2:lla (3 x 15 ml) ja kuivattiin tyhjössä (huoneen lämpötila), jolloin saatiin 1,0 g materiaalia.

b. HF:llä pilkkominen 10 Peptidi lohkaistiin hartsista käyttäen 10 ml HF:ää 1,5 ml:n anisolia läsnäollessa. Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 1,5 tunnin ajan, minkä jälkeen HF poistettiin alipaineessa. Seos pestiin Et20:lla (3 x 50 ml) ja kuivattiin ilmassa. Peptidi/hartsi-seosta uutettiin 25-%:isella 15 HOAc-vesiliuoksella (3 x 50 ml).

c. Puhdistus

Vesisuodos kylmäkuivaarnalla saatiin 240 mg raaka-materiaalia. Tämä materiaali käytettiin Amberlite IRA 68 (asetaattimuoto) -ioninvaihtohartsissa vedessä. Peptidiä 20 sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin (220 mg).

Peptidiä puhdistettiin Whatman Partisil 20M 10 0DS3 (22 mm x 50 cm) -kolonnissa käyttäen eluoivina liuottimina (10,0 ml/min) 15-%:ista asetonitriiliä (0,1 % trifluori-. 25 etikkahappoa) ja 0,l-%:ista trifluorietikkahapon vesi- ’ liuosta. Eluoitumista tarkkailtiin HPLC:n avulla ja tar koituksenmukaiset fraktiot yhdistettiin ja poistettiin liuotin alipaineessa. Jäännös liuotettiin veteen (H20) ja kylmäkuivaamalla (liuos) kahdesti saatiin 167 mg tuotetta 30 kokonaissaannon ollessa 50 %.

Aminohappoanalyysi: Arg, 1,04; Pro, 1,02; Vai, 1,00; Ala, 1,01; 72 % peptidiä.

Ohutlevykromatografia-ajo (Silica Gel GF 250 mikrometrin levyt): 35 Rf( I) = 0,37 (n-Bu0H:HOAc:H20/3:1:1)

Rf (II) = 0,15 (CHC13:MeOH: HOAc/60:35:5)

Rf(III) = 0,48 (n-BuOH:HOAc:H20:EtOAc/l:1:1:1) 17 94350

Esimerkki 3

Tetrapeptidin asetyyli-Arg-Pro-Asp-Val-NH2 synteesi a. Synteesi

Otsikkoyhdiste syntetisoitiin tavanomaisella kiin-5 teäfaasisynteesillä käyttäen automaattista Beckman malli 990 syntetisaattoria. Synteesi aloitettiin 5,0 g:11a BHA-hartsia (0,67 meg/g). Kun BOC-Arg(Tos) oli kytketty, t-butyylioksikarbonyylisuojaryhmä poistettiin 50-%:isella TFA-liuoksella CH2Cl2:ssa ja hartsi-peptidi asetyloitiin 10 käyttäen 50-%:ista asetanhydridiliuosta CH2Cl2:ssa katalyyttisen määrän DMAP:tä läsnäollessa. Peptidi-hartsi pestiin etanolilla (2 x 50 ml) ja kuivattiin alipaineessa yön yli ennen HF:llä pilkkomista. Kuiva peptidi-hartsi painoi 6,5 g.

15 b. Pilkkominen HF:llä

Raakatetrapeptidi saatiin pilkkomalla 6,5 g hartsi-peptidiä HF:llä (25 ml) ja anisolilla (25 ml) 0 °C:ssa 4 tunnin ajan. HF haihdutettiin alipaineessa ja reaktio-seokseen lisättiin dietyylieetteriä (150 ml). Raakapep-20 tidi ja hartsi siirrettiin lasisintterisuppiloon ja pestiin dietyylieetterillä (3 x 100 ml). Peptidiä uutettiin 10 %:isella HOAc-liuoksella (3 x 100 ml) ja vesiliuos kyl-mäkuivaamalla saatiin 900 mg valkeata kiinteätä ainetta, c. Puhdistus . 25 Raakatuotteesta (puhtaus 98 % HPLC:n mukaan) pois tettiin suolat Sephadex LH-20 -kolonnissa (100 g, 2,5 cm x 89 cm) käyttäen eluenttina 10-%:ista HOAc-liuosta. Kyl-mäkuivauksen jälkeen tuote oli valkea kuohkea kiinteä aine, joka painoi 800 mg.

30 Aminohappoanalyysi: Arg, 0,99; Vai, 1,00; Pro, 1,05; Asp, 1,01.

Ohutlevykromatografia-ajo (Silica 60/Merck, 250 F): Rf (I) = 0,51 (n-BuOH:HOAc:H20/3:1:1)

Rf(11) = 0,60 (n-BuOH:HOAc:H20:EtOAc/1:1:1:1) 35 Rf (III) = 0,59 (n-BuOH:pyridiini:HOAc:H20/4:1:1:2) « · 18 94350

Esimerkki 4 N-alfa-formyyli-Arg-Pro-Asp-Val:n synteesi a. N-t-butyylioksikarbonyyli-beta-bentsyyli-aspar-tyyli-valiinin bentsyyliesteri 5 80 ml:aan CH2Cl2:ta liuotettiin 3,23 g N-t-butyyli- oksikarbonyyli-beta-bentsyyli-Asp:tä ja 3,97 g Val-bent-syyliesteri-p-tosylaattia. Lisättiin di-isopropyylietyyli-amiinia (1,74 ml) ja liuos saatettiin 5 °C:seen. Seokseen lisättiin 2,06 g DCC:tä. Seosta sekoitettiin 5 °C:ssa 30 10 minuutin ajan ja sen jälkeen vielä 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sakka suodatettiin eroon ja suodosta uutettiin vedellä, 10-%:isella sitruunahappoliuoksella ja kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella. Liuotin poistamalla saatiin öljy, jota puhdistettiin kromatogra-15 fisesti silikageeli 60 -valmisteessa (eluoiden) 97:3 CH2Cl2-MeOH:11a. Tuote, (joka oli) öljy, painoi 3,46 g.

b. N-t-butyylioksikarbonyyli-prolyyli-beta-bent-syy1i-aspartyy1i-vaiiinin bentsyyliesteri Poistamalla suojaryhmiä 3,41 g:sta edeltävää tuot- 20 että 60 ml:11a 2:1 CH2C12-TFA:ta 30 minuutin ajan saatiin trifluoriasetaattisuola öljynä. Vapaa amiini saatiin neutraloimalla kyllästetyllä natriumkarbonaattiliuoksella ja uuttamalla CH2Cl2:een. Uutteen tilavuutta pienennettiin haihduttamalla, minkä jälkeen se lisättiin 1,05 g:aan N-. 25 t-butyylioksikarbonyyli-Pro:ta. Lisättiin liuos, jossa oli 0,73 g HOBt:tä 2 ml:ssa DMF:ää, ja sitten 0,99 g DCC:tä. Seosta sekoitettiin 2,5 tunnin ajan, minkä jälkeen se suodatettiin. Suodosta uutettiin vedellä, 10-%:isella sitruunahappoliuoksella sekä kahdesti kyllästetyllä natriumbi-30 karbonaattiliuoksella. Kuivauksen jälkeen liuotin poistettiin, jolloin jäljelle jäi öljy. Tuotetta puhdistettiin flash-kromatografisesti silikageeli 60 -valmisteessa ♦ (eluoiden) 9:1 CH2C12-CH3CN:llä. Pääasiallisen komponentin sisältävästä fraktiosta saatiin 2,31 g väritöntä öljyä. 35 IR-spektri: 1740 cm'1, 1695 cm'1 ja 1675 cm'1.

c. N-alfa-formyyli-r^-nitro-arginyyli-prolyyli-beta-bentsyyli-aspartyyli-valiinin bentsyy1iesteri 94350 19 2,23 g:aan edellisen vaiheen tuotetta lisättiin 60 ml 1:2 TFA-CH2C12:ta. Liuosta sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa, jolloin jäljelle jäi vahamainen kiinteä aine, joka pestiin petro-5 lieetterillä. 15 ml:aan DMF:ää liuotettiin 0,72 g N-alfa-formyyli-N9-nitro-arginiinia ja 0,33 ml N-metyylimorfolii-nia. Liuos jäähdytettiin -20 °C:seen ja 0,40 g isobutyyli-kloroformaattia lisättiin tipoittain. Seosta sekoitettiin -20 - 10 °C:ssa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen siihen li-10 sättiin jäähdytetty liuos, jossa oli prolyyli-beta-bent-syyliaspartyyli-valiinin bentsyyliesteri trif luoriasetaat-tina 20 ml:ssa DMF:ää ja 0,33 ml:ssa N-metyyli- morfolii-nia. Seosta sekoitettiin -15 °C:ssa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen jäähdytyshaude poistettiin ja sekoittamista 15 jatkettiin ympäristön lämpötilassa 2 tunnin ajan. Valtaosa liuottimesta poistettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin 50 ml:aan CH2Cl2:ta ja uutettiin vedellä, 10-%:isella sit-ruunahappoliuoksella sekä kyllästetyllä natriumbikarbo-naattiliuoksella. Orgaaninen faasi kuivaamalla ja liuotin 20 haihduttamalla saatiin 2,08 g tuotetta.

Ohutlevykromatografia-ajo (silikageeli-GF):

Rf (I) = 0,56 (CH2C12:MeOH/9:1)

Rf(II) = 0,72 (CHC13:MeOH:HOAc/8:1:1) d. N-alfa-formyyli-arginyyli-prolyyli-aspartyyli- 25 väliini

Suojaryhmät poistettiin siirtohydrauksella käyttäen 30 ml 5 % muurahaishappo - ammoniumformaattia palla-diummustalla. Reaktioseosta sekoitettiin pallolla suljetussa kolvissa 18 tunnin ajan. Seos suodatettiin Celitel-30 lä, minkä jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin veteen ja (liuos) kylmäkuivattiin. Tuotetta puhdistettiin 1,6 x 60 cm DEAE-Sephadex-kolonnissa. Eluointi aloitettiin 0,02 M ammoniumbikarbonaattiliuok-sella, pH 8,5, keräten 150 pisaran fraktioita. Kun oli ke-35 rätty 52 fraktiota, otettiin käyttöön gradientti 0,02 -0,20 M ammoniumbikarbonaatti käyttäen 2 litran nestetila-vuus. Kromatogrammin suurin piikki eluoitui fraktion 88 20 94350 keskellä. Fraktiot 75 - 100 yhdistettiin ja kylmäkuivatuin, jolloin saatiin kuohkea amorfinen kiinteä aine. HPLC: rt = 9,4 min, 10 % MeOH - 0,01 N NH40Ac, pH 5, 1,5 ml/min, Bondapak-C18.

5 Ohutlevykromatografia-ajo (silikageeli 60):

Rf(I) = 0,16 (n-BuOH:HOAc:H20/3:1:1)

Rf(11) = 0,27 (n-BuOH:HOAc:H20:pyr/15:3:12:10)

Rf (III) = 0,42 (EtOAc:pyr:HOAc:HzO/5: 5:1:3) Aminohappoanalyysi: Asp, 0,99; Pro, 0,97; Vai, 10 1,05; Arg, 1,00; 38 % peptidiä.

Biologinen aktiivisuus: syklisen GMP:n määritys Tällä määrityksellä mitataan tämän keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin kykyä sitoutua solumembraa-nireseptoriin ehyessä M0LT-4-solussa ja selektiivisesti 15 stimuloida syklisen GMP:n tuotantoa samoin kuin humaani-tyspleniini ja humaanitymopentiini.

M0LT-4-solulinja saatiin talletuslaitokselta the American Type Culture Collection, Rockville, Md. Vasta-siirrostettuja M0LT-4-soluja kasvatettiin 3 päivän ajan 20 ottaen ne sitten talteen kuten kuvattu lähteessä T. Aud-hya et.ai., Arch.Biochem.Biophys. 234 (1984) 167-177. Solut pestiin 3 kertaan PBS:ssä ja uudelleenlietettiin RPMI 1640 -kasvualustaan pitoisuudeksi 1,0 x 107 solua/ml, minkä jälkeen niiden annettiin tasapainoittua 37 °C:ssa 30 minuu- • 25 tin ajan ennen tutkittavien tetrapeptidien (25 mikrolit- • · raa) ja verrokkipeptidien lisäämistä. Inkuboinnin annettiin kestää ravistellen vesihauteessa 4-5 minuutin ajan, minkä jälkeen se keskeytettiin lisäämällä 1 ml jääkylmää TCA:ta (10-%:inen liuos).

30 Solut TCA:ssa homogenoitiin ja niitä käsiteltiin ultraäänellä syklisen nukleotidin vapauttamiseksi. Lietettä sentrifugoitiin 3000 x g:ssä 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Saatu sakka liuotettiin 0,1 N NaOH-liuokseen proteiinisi-sällön määrittämiseksi. TCA poistettiin supernatanttifrak-35 tiosta uuttamalla 4 kertaa 5 ml:11a vedellä kyllästettyä dietyylieetteriä. Viimeisen uuttokerran jälkeen jäljellä oleva eetterijäämä poistettiin kuumentamalla 10 minuutin

II

21 94350 ajan vesihauteessa 50 °C:ssa. Kylmäkuivauksen jälkeen näyte rekonstituoitiin 50 mM asetaattipuskurissa (pH 6,2) syklisen GMP:n radioinunuunimääritystä silmälläpitäen.

Kuviossa 1 esitetään tyypillisiä annos-vastekuvaa-5 jia, jotka on määritetty pitoisuuksille 1 - 1000 mikro-grammaa/ml aktiivisille peptideille asetyyli-Arg-Pro-be-ta-D-Asp-Val-NH2, Arg-Pro-Ala-Val-Tyr ja asetyyli-Arg-Pro-Ala-Val-NH2, verrattuna tymopentiiniin ja epäaktiivisiin peptideihin asetyyli-Arg-Pro-Asp-Pro-NH2, Ala-Lys-Asp-Val 10 ja Lys-Lys-Asp-Val-NH2 M0LT-4-soluissa. Kuviossa 2 on esitetty annos-vastekuvaajät, jotka on määritetty pitoisuuksille 1 - 100 mikrogrammaa/ml aktiiviselle peptidille ase-tyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2, verrattuna tymopentiinistandar-diin M0LT-4-soluissa.

15 Kullekin tutkitulle peptidille määritettiin kyn- nysaktiivisuus. Tämä määritellään tutkittavan peptidin alimmaksi pitoisuudeksi, joka indusoi korkeamman syklisen GMP:n solunsisäisen tason kuin kaksi (2) standardipoik-keamaa yli verrokin. Verrokkien solunsisäisen syklisen 20 GMP:n lukemat olivat alle 0,5 pikomoolia/ml (keskiarvo +/-standardipoikkeama). Koetulokset katsottiin positiivisiksi, jos syklisen GMP:n taso oli korkeampi kuin 2 kertaa (2 standardipoikkeamaa +) taso, joka oli määritetty rinnakkaiselle negatiiviselle verrokille.

25 Tulokset syklisen GMP:n määrityksistä on esitetty kuviossa 1 sekä sitä vastaavassa taulukossa I ja kuviossa 2 ja sitä vastaavassa taulukossa II, joissa edustavia peptidejä on analysoitu verrattuna tymopentiiniin ja verrok-kipeptideihin. Näitä tuloksia verrattiin tymopentiiniin 30 (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) M0LT-4-soluissa, koska humaanitys- pleniinipentapeptidi "SP-5" (Arg-Lys-Ala-Val-Tyr) on epä-aktiivinen M0LT-4-soluissa. Nämä tulokset osoittavat peptidien biologisen aktiivisuuden T-soluavustaja-aktiivi-suuden stimuloinnissa M0LT-4-soluissa.

• - 22 94350

Taulukko I

cGMP-pitoisuus (pikogrammaa/ml Peptidipitoisuus 5 (mikrogr./ml): _1_10_100_1000

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 6,4 18,3 20,8 21,9 10 Arg-Pro-Asp-Val-UH2 0,1 17,1 19,3* 24,8

Asetyyli-Arg-Pro-Asp- 4,55 8,99 19,62 24.09

Val-NH2

Asetyyli-Arg-Pro-Glu- 4,7 9,41 16,76 25,00

Val-NH2

Asetyyli-Arg-Pro-Ala- 14,6 19,1 24,5 15 Val-NH_ *2 _ ·» ^ 3,7 11.0 17.7 24,9

Asetyyli-Arg-Aib-Glu- rill

Val-NH2 18,75 29,68 34,98 40,23

Asetyyli-Arg-Pro-Gln-

Val-NH2 4,1 11,9 7,9 30,8

Asetyyli-Arg-Pro-Glu-Val 2q Asetyyli-Arg-Aib-Ala-Val- 18,78 30,45 36,17 39,48 nh2

Asetyyli-Arg-Pro-BrD-Asp-· 6,6 14,3 20,5 25,0

Val-NH

Asetyyli-Arg-Pro- β-Asp- 20,56 31,83 36,66 34,95

Gly-NH2

Lys-Lys-Asp-Val-NH2 0,33 0,31 0,34 0,33 25 Lys-Arg-Asp-Val 0,44 0,43 0,44 0,39

Arg-Gly-Asp-Ser 0,71 0,50 0,68 0,58

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr 0,09 16,41 27,90 37,14

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2 3,71 14,15 12,83 12,57 30

Asetyyli-Arg-Lys-Ala-Val- 3,00 8.86 12,83 18.43

Tyr-NH2 35 0 peptidiverrokki on 0 - 0,3 pikogrammaa/ml 23 94350

Taulukko II

cGMP-pitoisuus (pikoorammaa/ml) 5 Peptidipitoisuus (mikroar. /ml): 1_10_100_1000

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 3,55 13,56 18,70 24,85 asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2 7,77 17,39 24,47

Huomautus: Tausta on 0,19 pikomoolia cGMP/ml.

10

Entsymaattinen stabiilisuus

Keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin stabiili-suuden vastaan pilkkomista entsyymien ruoansulatuskanavassa ja seerumissa toimesta esittelemiseksi mallipeptidiä 15 asetyyli-Arg-Pro-Asp-Val-NH2 inkuboitiin 37 °C:ssa rotan suolinesteessä ja humaaniseerumissa aina 120 minuutin ajan. Vastaavasti käsiteltiin vertailun vuoksi tetrapepti-diä Arg-Lys-Asp-Val ja tymopentiiniä. HPLCrn mukaan Arg-Lys-Asp-Val oli tullut täysin sulatetuksi 25 sekunnin jäl-20 keen. Tymopentiini oli 50-%:isesti hajonnut noin 20 sekunnin jälkeen. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettu peptidi säilyi oleellisesti hajoamattomana sekä seerumissa että suolinesteessä ainakin 120 sekunnin ajan.

• ·

Claims (4)

94350

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on aminohapposekvenssi, jolla 5 on kaava R-Arg-X-Y-Z-R1 jossa kaavassa R on H, alempi alkyyli, asetyyli, formyyli, 10 alempi alkanoyyli; X on Pro, dehydro-Pro, hydroksyyli-Pro tai Aib; Y on D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valitaan seuraavista: Ala, Asp, Glu, Gin, Asn, beta-Asp, Vai tai Ile; 15. on Gly tai D- tai L-muodossa oleva aminohappo, joka valitaan seuraavista: Vai, Ala, Leu tai Ile; R1 on H tai NR2R3, jossa R2 ja R3 ovat toisistaan riippumatta vetyjä tai suoraketjuisia tai haarautuneita alkyylejä, jotka käsittävät 1-6 hiiliatomia, t u n -20 n e t t u siitä, että a) suoritetaan kiinteäfaasimenetelmä, jossa käytetään peptidihartsivälituotetta, joka käsittää yllä määritellyn sekvenssin aminohapporyhmät, liittyneinä suojaryh-miin, jotka ovat toisistaan riippumatta aminoa suojaavia 25 ryhmiä, hydroksyyliä suojaavia ryhmiä, indolia suojaavia ryhmiä tai imidatsolia suojaavia ryhmiä ja hartsin, joka on kiinteäfaasipolymeeri, johon arginiini voidaan sitoa kiinteästi kovalenttisella sidoksella; tai b) suoritetaan peptidin liuos-synteesi, johon si-30 sältyy yllä olevaan kaavaan sisältyvien aminohappojen tai peptidi fragmenttien kytkeminen vaiheittain tai lohkoi ttain toisiinsa muodostamalla amidisidoksia niiden väliin, jolloin menetelmällä saadaan kaavan mukainen peptidi. li 94350

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on Arg-Pro-Asp-Val-NHCH(CH3)2 formyyli-Arg-Pro-Asp-Val 5 asetyyli-Arg-Pro-Asp-Val-NH2 asetyyli-Arg-Pro-Ala-Val-NH2 tai asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on NR2R3, R2 on CH3 ja R3 10 on H.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on Arg-Pro-Asp-Val-NHCH3 formyyli-Arg-Pro-Asp-Val-NHCH3 tai 15 asetyyli-Arg-Pro-Val-Ala-NHCH3. 26 94350