PT90596B

PT90596B - Processo para a preparacao de tetrapeptidos e de pentapeptidos com actividade auxiliar de celulas t

Info

Publication number: PT90596B
Application number: PT90596A
Authority: PT
Inventors: Gideon Goldstein; Tapan Audhya; George Heavner
Original assignee: Immunobiology Res Inst Inc
Priority date: 1988-05-19
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 1994-09-30
Also published as: CN1104217A; AU625598B2; DK14890A; KR900701296A; EP0342962B1; FI900267A0; WO1989011289A1; EP0342962A2; IE62555B1; PT90596A; FI94350B; RU2060998C1; GR3017451T3; AU3745589A; IE891542L; EP0342962A3; IL90229A0; DE68923401T2; FI94350C; DE68923401D1

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

REQUERENTE:

EPÍGRAFE:

INVENTORES:

N.°

596

IMMUNOBIOLOGY RESEARCH INSTITUTE, INC -,nor te-americana, com sede em Route 22 East. Annandale, New Jersey 08801-0999, Estados Unidos da América.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TETRAPÊPTI DOS E DE PENTAPÉPTIDOS COM ACTIVIDADE AU XILIAR DE CÉLULAS T

GEORGE HEAVNER, GIDEON GOLDSTEIN, ΤΑΡΑΝ AUDHYA.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América em 19 de Maio de 1988 e 8 de Novembro de 1988, respectivamente sob os n^s. 07/196,138 e 07/268,692.

INPI. MOO. 113 RF 18732

P.I.NS. 90 595

MElRjRIA descritiva do inverto para

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TETRAP2PTID0S E DE ΡΞΝΤΑΡ3ΡΤΙDOS COR ACTIVIDADE AUXILIAR DE CÉLULAS T que apresenta

IíE.7íjNGBIGL0GY RESEARCH INSTITUTE, INC., norte-americana, comercial e industrial, com sede em Route 22 East, Annandale,

New Jersey 08801-0999,

Estados Unidos da América

RESUMO ίA invenção refere-se ao processo para a preparação de tetral péptidos ou pentapéptidos de fórmulas R-Arg-X-Y-Z-R ou R i-Arg-X’-Ala-Y’-Z *-f3 ou dos seus sais de adição de ácido ou de base farmaceuticamente aceitáveis, em que os símbolos pos-, suem as significações mencionadas nas reivindicações, caracterizado por se proceder à síntese do péptido pretendido por mé^; todos em fase sólida ou em fase líquida. Os composto possuem , lja mesma actividade biológica que a tisplemia servindo para re-i igular o sistema imune num paciente que sofre de deficiência ou de excesso de funcionamento de células T. !

í^A presente invenção refere-se geralmente a um processo de preiiparação de péptidos sintéticos capazes de estimular a activida-

ί de auxiliar de células T. Mais especificamente, os péptidos i da presente invenção são tetrapéptidos e pentapéptidos bases.-;

dos na molécula de tisplenina.

HISTORIAL DA INVENÇÃO

I

I I iAs proteínas imunomodulatórias, timopoietina e tisplenina I (outrora denominada esplenina) foram isoladas a partir de timo e do baço humano e bovino respectivamente. Adicionalmente, pequenos péptidos têm sido sintetizados quimicamente, os quais imitam a actividade biológica da timopoietina e postériormente têm sido modificados no sentido de lhes conferir atributos adicionais tais como resistência à acção enzimática. Ver, por exemnlo, a patente de Invenção forte-Americana

I

Número 4 505 353.

Uma vasta variedade de artigos e patentes têm sido ultimamení _z ί te publicados referindo-se a tais proteínas e péptidos sinte-;

tizados. A Patente de Invenção Norte-Americana Número 4 190 646 refere-se ao pentapéptido timopentina, a qual constitui o ,sítio activo da timopoietina e apresenta a sequência Arg-Lys-Asj>-Val-Tyr, bem como composições de péptidos nas quais váírios grupos substituídos nas extremidade de amino e/ou de carboxi deste pentapéptido. Tanto a timopoietina como a timopentina induzem alterações biológicas em duas linhas de células T, CEM e I'OLT-4, apresentando consequentemente um papel estiiinulante da actividade biológica das células T. Não se desco- ; briram outros análogos da timopentina mais curtos que os pentapéptidos que apresentassem actividade sobre células CEM.

A Memória Descritiva do Pedido de Patente de Invenção Norte-Americana com o número de série 53186 copendente, depositado’

pela Requerente, refere-se a una proteína inunorcodulatória 'de 43 aminoácidos, a esplenina, (a partir daqui referida na presente memória descritiva como tisplenina) isolada a partir de baço humano. A tisplenina bovina estimula a actividade auxiliar de céulas T in vivo em ratos. Consequentemente espera-se que a tisplenina humana exiba actividade biológica análoga em seres humanos. A tisplenina humana foi descrita no Pedido de Patente acima identificado como provocando a elevação da cGMP intracelular na linha de células T humanas LíOLT- j í

-4. 0 sítio activo da tispfenina bovina, denominada SP-5, j ι

abrange 32 a 36 resíduo de aminoácidos e apresenta a sequên- ; cia Arg-Lys-C-lu-Yal-Tyr. A zona activa da sequência humana ! foi indicada no pedido de Patente SN-561S6 como sendo Arg-Lys-Ala-Val-Tyr. ·

A tisplenina, em contário da timopoietina, não produz alterações na actividade biológica das células ΟΕΙ.Ί.

Consequentemente a tisplenina é implicada na estimulação da actividade auxiliar das células T, não na actividade supressora de células T. Veja-se também, por exemplo j Goldstein, G. Nature (London) 247 : 11-74 (1974); Basch,

ÍR.S. e Goldstein, G. , Pro. Natl. Acad. Sei. USA, 71 : 1474-147S (1974); Scheid, Μ. P. et al J. Exp.med., 147 : 1727-1743 (1978/; Scheid, I.T. ?. et al Science, 190 : 1211-1213 (1975); Ranges, G. E. et al, J. Exp. Red., 156 : 1O57-1OÓ4 (1932); T. Audhya et al., Biochem, 20: 6195-6200 (1981); ίVankatasubramaninan, K., et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, i 83:3171-3174 (1936); àíalaise V. G. et al. in Immunoregulatory UC1A Symposium on Yolecular an Cellular Biology, Eds. Goldstein, G. st al (Liss New York) (1936) ; Sunshine. C-. H. et al, J. Immunol., 120 : 1594-1599 (1978) e E. Grantz et al, j Arch. Geschwulstforsch, 54 (2) : 113-118 (1948). Ver também as Patentes Norte-Americanas nos. 4 190 646; 4 261 886; .....

361 673; 4 420 424; e 4 629 723. Faz-se referência às Páutentes, Pedidos de Patente e artigos acima indicados para ;discussão de outro material anterior e processos biológicos envolvidos na presente invenção.

A Patente de Invenção Norte-Americana N². 4 428 938 de Kisfaludy et al concedida em 31 de Janeiro de 1984 refere certos !péptidos que afectam a regulação imunitária. Entre tais péptidos encontram-se os seguintes tetrapéptidos:

Arg-Lys-Asp-Vai A rg- Lys- A sη- V a 1 f

Arg-Lys-Ala-Vai í

Arg-Lys-Asp-Ala ' í

Arg-Lys-Asp-Ile [

Arg-Lys-Glu-Vai i í

: Gip-Arg-Lys-Asp í

Ά Patente de Invenção Forte-Americana Numero 4 428 938 geral-!

j imente inclui os sais, as amidas, os ésteres de alquilo de baixo peso molecular e derivados protegidos destas sequências para tratamento de perturbações imunológicas devido a defi' ciências tímicas. Nesta Patente, os péptidos foram ensaiados ίrelativamente à sua actividade num ensaio de rosette E in vi:! tro. ' jOs mesmos pesquisadores registaram tais tetrapéptidos em

Lisfaiudy et al, 110006-367/-16^ s Z. Physiol. Chem. B. D. 364,

S. 933-940 (1983). Neste documento foi registado que a sequência Arg-Lys-Glu-Vai era um análogo altamente positivo num en-: saio de rosette E in vitro e que as sequências Arg-Ala-Asp-Val· e Arg-Lys-Ala-Val têm actividade drasticamente reduzida.

i Ra técnica mantém-se a necessidade da descoberta de péptidos adicionais os quais são úteis na estimulação do sistema imunitário de seres humanos para uma variedade de condições deficientes de células I.

SUMARIO BA INVENÇÃO

A presente invenção descreve uma série de péptidos análogos da tisplenina capazes de induzir a actividade biológica na ( linha de células T MOLT-4. Contrariamente aos análogos da timopentina previamente mencionados, péptidos de comprimento inferior a cinco aminoácidos e relacionados com a tisplenina :

I são activos na indução de acividade auxiliar de células I em células MOLT-4, bem como pentapéptidos análogos da tisplenina descritos na presente memória. i (Num aspecto, a presente invenção refere-se a novos tetrapép- j (tidos que têm a seguinte fórmula í ι

i : ι í i ι R- Arg-X-Y-Z-R¹ (I) ;

í !

ou um dos seus sais de adição de ácido ou de base farmacêuti-;

; camente aceitáveis, em que i

R é K, alquilo inferior, acetilo, formilo, alcanoilo infe- ; rior;

||X e Pro, desidro-Pro, hidroxi-Pro, D-Lys, o(-metilalanina (' (Aid) ou Lys ; ' ί ί !

Y é um isómero D ou L de um aminoácido escolhido de Ala, Asp,I C-lu, Gin, Asn, beta-Asp, Vai, Leu ou Ile;

ί Z é Gly ou um isómero L ou L de um aminoácido seleccionado de'

iVal, Ala, Leu ou Ile;

R^3- é OH ou HR²R³, _na qual R² e R³ são H ou um radical alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 6 átomos i

;de carbono, opcionalmente substituído por um grupo arilo ou um radical arilo substituído ou por um átomo de halogéneo ou por um radical alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou rami2 3 ficada, tendo 1 a 6 átomos de carbono, ou em que R e R , conjuntamente, formam um grupo metileno cíclico com 3 a 7 átomos de carbono; contanto que, quando X for Lys e Z for Vai, Y é diferente de Asp, Asn, Ala, Asu ou Glu; e quando X for Lys, Y é diferente de Asp; e quando X for Ala e Z for Vai

Y é diferente de Asp.

ι 'Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a novos pentapéptidos caracterizados pelo facto de possuírem a capacidade de aumentar a actividade de cGMP em células T humanas da j linha L’OLT-4 e apresentando a seguinte fórmula

R²-Arg-X'-Ala-Y'-Z'-R³ (II) ou um dos seus sais de adição de ácido ou de base farmaceutijcamente aceitáveis, em que i

R é H, alquilo inferior, acetilo, formilo, alcanoílo infe: rior ou des-amino;

I

X' é Pro, desidro-Pro, hidroxi-Pro, D-Lys, Aib ou Lys;

í

Y’ é um isómero D ou L de um aminoácido escolhido de Vai, 'Ile, Leu, Ala, Asp, Glu, Gin, Lys;

iíZ ¹ é um isómero D ou L de um aminoácido escolhido de Tyr, Vai í

Leu, His, Ala ou Trp;

IR³ é CII ou Hr4r³, em que R^ e R³ são H ou um radical alquilo

ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada tendo 1 a δ átomos de carbono, opcionalmente substituído por um grupo arilo ou um radical arilo substituído por um halogéneo ou um radical alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada de 1 a 6 4 5 átomos de carbono, ou em que R e R conjuntamente formam um grupo metileno cíclico com 3 a 7 átomos de carbono.

Estes péptidos e composições compreendendo estes péptidos

I preservam surpreendentemente a actividade biológica da tisple nina humana. Um vasto número deste péptidos são também caracterizados por uma maior resistência ao ataque por endopeptidases e exopeptidases e enzimas semelhantes à tripsina no tubo digestivo e no soro. Consequentemente, estes péptidos oferecem vantagens significativas no tratamento de deficiências imunitárias. Particularmente, os tetrapéptidos e os pentapéptidos em que X e X' é Pro ou Aib possuem uma resistência surpreendente à degradação causada pelas enzimas, tais como as peptidases do soro.

Um outro aspecto desta invenção inclui ainda um processo de preparação de composições farmacêuticas compreendendo estes péptidos e métodos para o uso destes péptidos no tratamento de uma variedade de condições ou doenças que requeiram regulação da imunidade.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são desvendados na descrição detalhada que se segue compreendendo exemplos das realizações presentemente preferidas.

I ί

BREVS_DESÇRISÃO_LOS_DESEXHOS

A Eig. 1 é uma representação gráfica de um ensaio de cGMP de KOLT-4 representando graficamente a concentração do péptido Çug/ml) em função dos níveis de cC-KP (picograma/ml) e comparando a actividade aí existente da timopentina (TP-5) e de péptidos desta invenção com controlos,

A Fig. 2 é uma representação gráfica de um ensaio de cGMP de KOLT-4 em que se representa graficamente a concentração do péptido Çug/ml) em função dos de níveis cGMP (picograma/ml) e comparando a sua actividade com a da timopentina (TP-5) e do péptido Ac-Arg-Pro-Val-Ala-NH^ desta invenção.

2^ÇRI2ÃO_LSTA1HALA_DA_INVEN5ÃO

A presente invenção refere-se a uma série de tetrapéptidos apresentando a seguinte fórmula:

í (I) R-Arg-X- Y-Z-R¹ [ou a um dos seus sais de adição de ácido ou de base farmaceuiticamente aceitáveis, na qual R, X, Y, Z e R possuem os significados acima mencionados, contanto que, quando X é Lys e Z é Val, Y é diferente de Asp, Asn, Ala, Asu ou Glu, e quando X é Lys, Y é diferente de Asp; e quando X é Ala e Z é Val,

Y é diferente de Asp. A invenção refere-se também a uma série de pentapéptidos caracterizados pela capacidade de indução de actividade em células MOLT-4 e apresentando a fórmula:

(II) R²-Arg-X'-Ala-Y'-Z '-R³

Sou de um seu sal de adição de ácido ou de base farmacêutica-

7 '

- mente aceitáveis, em que P, , X', Y', Σ’ e R^J têm os signifi- [ ' cados acima mencionados.

Tal como é asado na presente memória descritiva, o termo alquilo inferior inclui radicais de hidrocarbonetos saturados ramificados e de cadeia linear apresentando 1 a 6 átomos de carbono, tais como metilo, etilo, propilo, isopropilo, pentilo, hexilo, e semelhantes, enquanto o termo alcanoilo in- ( ferior significa |

O

II alquilo inferior -C-.

Ao longo desta descrição, os aminoácidos componentes dos péptidos e certos materiais usados na sua preparação são iden: tificados por meio de abrevitauras por uma questão de conveniência. A maior parte das abreviaturas de três letras para ;

i aminoácidos são bem conhecidas. Das várias abreviaturas, as menos conhecidas são Asu para amino-sucinimidil e C-lp para ! piroglutamilo (também p-C-lu). A menos que de outra forma se ;

; indique, todos os aminoácidos são isómeros de configuração L. ji Quando se desejar a configuração isomérica D, ela será indi' cada de maneira especial.

I íl ^: j; Certos tetrapéptidos preferidos da presente invenção são aquej les que apresentam a Fórmula I em que X é Pro ou Aib. Os péptidos mais preferidos são aqueles de fórmula I na qual X é [j Pro, Y é Val, e Σ é Ala, ou na qual X é Pro, Y é Ala e Σ é ! Val. Vários dos tetrapéptidos preferidos são os péptidos se- :

c i jí guintes:

i ! I i

Acetil-Arg-Pro-Val-Ala-IÍHg μ Arg-Pro-Asp-Val :

í! i

Arg-Pro-Asp-ValFormil-Arg-Pro-Asp-Val

Acetil-Arg-Pro-Asp-Vai

Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-Nl·^ ' l· i : Ace til-Arg-Pro-A la-Vai-ÍIH2

Ace til-Arg-Pro-D-beta-Asp-Val-Ni^ j Acetil-Arg-Pro-Glu-Val-HHg í Ace til-Arg-Pro-C-lu-Vai

Acetil-Arg-Aib-Ala-Val-NH_O ί

Acetil-Arg-Aib-Glu-Val-NHg

Acetil-Arg-Pro-beta-Asp-Gly-NHg

Alguns pentapéptidos preferidos da presente invenção são os

1pentapéptidos da fórmula acima indicada em que X¹ é Pro ou ΊAib. Os pêptidos mais preferidos são os da fórmula em que X’ é Pro, Y' é Vai e Z’ é Tyr. Ainda são de maior preferência os' pêptidos seguintes: i

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr

Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-Nl·^ ' I j _ i acetil-Arg-nys-Ala-Val-Tyr-NH2 ίOs ácidos capazes de formar sais com estes pêptidos incluem “(mas não estão limitados) a ácido inorgânicos, tais como áci:ído clorídrico, ácido bromidrico, ácido perclórico, ácido ní- !

•trico, ácido tiociânico, ácido fosfórico e semelhantes. Os ;jácidos orgânicos podem também ser usados na preparação de sais lida invenção, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido!

Jjpropiónico, ácido glicóiico, ácido láctico, ácido pirúvico, !

íácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleiί co, ácido fumárico, ácido cinâmico, ácido naftalenossulfónico, ! i ' ácido sulfanílico e semelhantes.

I :

Uma lista não exclusiva de bases que são capazes de formar

sais coa estes péptidos qu.e têm agrupamentos acídicos incluem bases orgânicas, tais como hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, hidróxido de sódio e semelhantes. As bases orgânicas para tal uso incluem, sem limitações, monoalquilaminas, dialauilaminas, trialquilaminas, monoarilaminas, diárilaminas e triarilaminas (por exemplo, trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina) e etanolaminas opcionalmente substituídas (por exemplo, etanolamina, dietanolamina).

Os péptidos desta invenção podem geralmente ser preparados seguindo as técnicas conhecidas. A produção sintética dos polipéptidos da invenção, convenientemente, podem ser preparados por meio de métodos sintéticos em fase sólida descritos por Merrifield em J.A♦C.S, 85: 2149-2154 (1963). Esta técnica é bem conhecida e é um método comum para a preparação de péptidos. 0 método em fase sólida de síntese envolve a adição passo a passo de aminoácidos protegidos para obtenção de uma cadeia em crescimento de péptidos a qual é ligada por ligações covalentes a uma partícula de resina sólida. Através des-; ta técnica, os reagentes e os sub-produtos são removidos por ; filtração, eliminando portanto a necessidade de purificação ! dos intermediários. 0 conceito geral deste método depende da ligação do primeiro aminoácido da cadeia a um polímero sólido por meio de uma ligação covalente. São adicionados sucessivos aminoácidos protegidos, um de cada vez, ou em blocos, de uma maneira passo a passo até que a sequência desejada seja obti-i da. Finalmente, o péptido protegido é removido do suporte de resina sólida e os grupos de protecção são eliminados e clivados .

Os aminoácidos podem ser ligados a um qualquer polímero ade- j quado tal como a resina. A resina deve conter um grupo funcional ao qual o primeiro aminoácido protegido pode ligar-se firmemente por meio de uma ligação covalente. Vários polímeros

j são adequados para este propósito, como a celulose, álcool ! polivinílico, polimetilmetacrilato e poliestireno. Os grupos ί proteotores apropriados utilizáveis em tal síntese incluem t-butiloxicarbonilo (BOC), benzilo (BZL), t-amiloxicarbonilo (AOC), tosilo (TOS), o-bromo-fenilmetoxicarbonilo (BrZ), 2,6-diclorobenzilo (BZLClg) θ fenilnetoxicarbonilo (Z ou CBZ).

São identificados no texto anterior grupos proteotores adicioj nais, bem como no J. F. VZ. LícOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973. Ambos os livros são aqui incorporados como referência.

A maneira de proceder geral de preparação de péptidos desta invenção envolve inicialmente a ligação da extremidade do

I aminoácido à resina. Após a ligação, a resina é filtrada, lavada e o grupo protegido (desejavelmente o t-butiloxicarbonilo) no grupo alfa-amino da extremidade do aminoácido é removido. A remoção dos grupos proteotores deve realizar-se, evidentemente, sem quebrar.a ligação entre o aminoácido e a resina. Ao péptido resinoso resultante é então acoplado o pe- J núltimo C-terminal do aminoácido protegido. Estas ligações realizam-se por formação de uma ligação amida entre o grupo i

carboxilo livre do segundo aminoácido e o grupo amino do pri- ^!meiro aminoácido ligado à resina. Esta sequência de acontecimentos é repetida com aminoácidos sucessivos até que todos os

I

Íaminoácidos estejam ligados à resina. Finalmente, o péptido jprotegido é quebrado e separado da resina e os grupos protecitores são removidos para se obter o pópdito desejado. As téc- ί [nicas de clivagem usadas para separar o péptido da resina e ί ipara a remoção dos grupos proteotores dependem da selecção da ; resina e dos grupos proteotores seleccionados e são conheci- | dos pelos peritos na técnica de síntese peptídica.

I ¹ [Técnicas alternativas para síntese proteica são descritas em í

Peptide Synthesis por Bodanszky et al, 2-. Ed. John Víiley and Sons, 1976. Por exemplo, os péptidos da invenção podem tam

bém ser sintetizados usando metodologias de síntese em soluções peptídicas padrão, envolvendo tanto acoplamentos em blo;co ou passo a passo de aminoácidos ou fragmentos peptídicos usando métodos químicos ou enzimáticos de formação de ligação amida. Istes métodos de síntese em solução são bem conhecidos na técnica.

Os pêptidos desta invenção podem também ser produzidos por i outras técnicas conhecidas por aqueles que são especialistas ! no assunto, por exemplo, técnica de engenharia genética. Ver,; por exemplo, T. Maniatis et al, em Molecular Cloning, a laborai ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring :Harbor, New York (1982).

i

Cs pêptidos desta invenção descobriu-se que têm propriedades de actividade biológica similar à tisplenina humana como é -referido na Patente e artigos acima referenciados. ”sta actiividade biológica é primeiramente evidenciada por um ensaio de medição da indução da produção de GIJP cíclico em células T í humanas da linha KOLT-4 em comparação com Tisplenina humana e timopentina humana. A indução da produção de c-GHP por um pép'tido da presente invenção neste ensaio indica a capacidade 'desse péptido para se ligar à zona receptora da tisplenina ijhumana na célula e induzir actividade biológica semelhante à ^tisplenina humana. :

Ί ilVários dos tetrapéptidos e pentapéptidos objecto da presente invenção oferecem uma outra vantagem significativa sobre a tisplenina humana. Muitos pêptidos da presente invenção são í ί caracterizados pela resistência à degradação enzimatica tanto ί Jpelas enzimas digestivas como pelas enzimas do soro. Consequ- ‘ ientemente, esses pêptidos demonstram um tempo de vida médio ' jprolongado in vivo quando administrado por injecção num organismo biológico. Uma outra vantagem de vários destes pêptidos í

á a sua capacidade de serem administrados oralmente. A Oró-oria tisplenina huma é urna molécula demasiado grande para ser efectivamente administrada por via oral e seria digerida no tracto

I castro-intestina.

Antes de ensaiar os péptidos da presente invenção não se esperava que fosse possível preparar tetrapéptidos ou pentapéptidos análogos da tisplenina humana apresentando a mesma esoecií ficidade biológica porque Arg-Lys-Ala-Val-Tyr, que é o análo-J go humano do pentapéptido bovino SP-5 (Arg-Lys-C-lu-Vai-Tyr) , é inactivo nas células MOLT-4. Assim, a descoberta de pentapéptido e tetrapéptidos análogos da tisplenina humana que apresentam actividade biológica igual à da molécula de tisplenina humana intacta era inesperada.

í I

Devido às características imunomodulatórias dos péptidos ob- ί jecto da presente invenção, estes são terapeuticamente úteis no tratamento de seres humanos, e possivelmente de animais, desde que apresentem capacidade de indução de diferenciação e maturação de células T as quais são capazes de envolvimento na resposta imune do organismo. Como resultado, os referidos peptidos são considerados como tendo usos terapêuticos múltiplos.

;Cs péptidos desta invenção são considerados úteis no auxílio jda imunidade colectiva do organismo, pois aumentam ou auxiliam a estimulação terapêutica da imunidade celular. São portanto úteis no tratamento de doenças envolvendo infecçoes crónicas, tais como infecçoes fúngicas ou micoplásmicas, tubercolose, !

lepra, virémias crónicas e agudas e semelhantes.

i

Os péptidos objecto da presente invenção ou as composições farmacêuticas compreendendo os péptidos e seus sais derivados : de ácidos ou de bases são geralmente considerados como sendo úteis em qualquer área na qual a imunidade celular é uma saída e particuiarmente no caso de existência de deficiências na i imunidade. !

!

I s

Conseauentemente, quando existe um excesso de produção de anticorpos devido ao desequilíbrio de células T, os mencionados péptidos podem corrigir esta condição estimulando a função das células T. logo, que estes sejam de uso terapêutico em certas doenças de autdmunidade nas quais são produzidos anticorpos prejudiciais, tais como eritematoses lupus sistémicos, artrites reumatoides ou semelhantes.

Na sua aplicação mais larga, os péptidos objecto da invenção ou as composições farmacêuticas compreendendo os referidos i péptidos são úteis na regulação do sistema de imunidade de um indivíduo, humano ou animal, em estado de carência de tal regulação. Tal como aqui é usado o termo regula significa que os compostos objecto da invenção provocam um retorno do sistema imune de um estado anormal que acompanha um estado de ! doença para um estado normal, equilibrado. Enquanto esta regulação pode ser considerada de grande aplicação na correcção de deficiências imunolégicas (por exemplo, síndroma de DiGeorge), é também aplicável na correcção de condições de excesso j de actividade imunológica (por exemplo, doenças de auto-imunidade). j í

A presente invenção inclui portanto métodos para regulação do[ ^sistema imunitário de um ser humano ou animal em estado de j [necessidade de tal regulação a qual compreende a administra- ι ‘ção ao referido indivíduo ou animal de pelo menos um dos pép-ΐ !tidos numa quantidade efectiva para a regulação do sistema í íimunitário, bem como composições farmacêuticas para a prática i , !destes métodos.

i

A invenção proporciona ainda um método para o tratamento de condições resultantes de deficiências relativas ou absolutas do sistema imunitário de um indivíduo, narticularmente na fun- í ção auxiliar de células T, o qual compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efec-

ί tiva de pelo menos um dos péptidos desta invenção.

rComo aqui é usada a expressão quantidade efectiva terapeuticamente significa uma quantidade que é efectiva no tratamento das condições acima referidas. A invenção proporciona também um método para indução da diferenciação e maturação de células T a qual compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade indutora efectiva de pelo menos um dos péptidos da presente invenção.

A presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas para a prática de tais métodos. Para preparar as compo: sições farmacêuticas da presente invenção, um péptido desta invenção é combinado como ingrediente activo numa mistura íntima com um veículo farmacêutico de acordo com as técnicas de composição farmacêutica convencionais. Esta substância veicular pode apresentar variadas formas dependendo da forma de preparação para administração oral, sublingual, rectal, nasal ou parentérica.

í

Ea preparação de composições sob a forma de dosagem oral preferida pode ser usado um qualquer meio farmacêutico usual. Pa! ra as preparações orais líquidas (por exemplo, suspensões, li elixires θ soluções) podem ser usados meios compreendendo, ij por exemplo, água, óleos, álcoois, agentes edulcorantes, coní’ jservantes, corantes e semelhantes. Veículos, tais como amidos i

[açúcares, diluentes, agentes granuladores, lubrificantes, liI gantes, agentes de desintegração e semelhantes podem ser usaHdos para a preparação de composiçoes solidas para administrais ção por via oral (por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos), i Podem ser também usadas formas de libertação controlada. Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e as ί i cápsulas representam as formas de dosagem oral unitária vantajosas, casos estes em que são obviamente usados veículos farmacêuticos sólidos. Se desejado, os comprimidos podem ser

-(ίrevestidos com açúcar ou revestidos entericamente por técnicab padrão. !

N * ι

I I jPara produtos parentéricos, o veículo compreenderá usualmente água esterilizada muito embora esta possa compreender outros ingredientes, por exemplo, para ajudar a solubilidade ou para a preservação. Soluções injectáveis podem também ser preparadas, caso este em que veículos podem ser usados, líquidos apropriados, agentes de suspensão e semelhantes.

Um tetrapéptido ou um pentapéptido da presente invenção é ge-! ralmente activo quando administrado em quantidades de cerca ι de 1 yUg/kg de peso corporal. Geralmente, pode ser usado a mes| ma gama de quantidades de dosagem no tratamento de doenças ou condições mencionadas onde se pretende tratar a imunodeficiência. Quantidades maiores (por exemplo, cerca de 10-100 mg/kg de peso do animal) são úteis para a superssão de actividade í

í imunitária excessiva.

Os Exemplos que se seguem têm como objectivo a ilustração da i invenção sem limitar especificamente a própria invenção. Nos ^!

I i

Exemplos e ao longo da memória descritiva, as partes são con-, sideradas em peso, a menos que se indique o contrário. Nos I Exemplos empregam-se as seguintes abreviaturas: TEA para áci-ί ί do trifluoracético; HOAc para ácido acético; Cí^C^ para cloíjreto de metileno; CH^CN par acetonitrilo; UME para dimetil-formamida; NH.OAc para acetato de amónio; NH. OH rara hidró- i A A xido de amónio; n-PrOH para n-propanol; n-BuOH para n-butanolj pyr para piridina; UCC para diciclohexilcarboiimida; HOBt para i'1—hidroxibenz otriaz ol; UNA? para dimetilaminopiridina; HE pa! ra fluoreto de hidrogénio; UCA para ácido tricloroacético; I

BHA para benzidrilamina; e MeOH para metanol. J

(EXEMPLO 1. Síntese de um Tetrapéptido; Acetil-Arg-Pro-Ala-Val-MHg tetrapéptido acima mencionado foi sintetizado usando métodos de síntese em fase sólida por meio de acoplamento passo a passo. Todos os aminoácidos foram protegidos no seu grupo

-amino com um grupo t-butiloxicarbonilo (BOC). Usou-se ιοί silo (TOS) para proteger a cadeia lateral de Arg. Os aminoáci dos protegidos foram usados com 2,5 equivalentes em excesso comparado com cada equivalente de substituição da resina. Todos os acoplamentos foram feitos por DCC/HOBt e com igual número de equivalentes de aminoácidos protegidos. Todos os aminoácidos foram dissolvidos em CH₂C1₂ à excepção de Arg a qual foi dissolvida em BMP.

As fase de lavagem, desprotecção e acoplamento foram os se-

guintes:
1.	CH₂C1₉			2	X	3 min
2.	50 por cento	de	t?a-ch₂ci₂	1	X	3 min
3.	50 por cento	de	TFA - CH₂C1₂	1	X	30 min
4.	ch₂ci₉			1	X	3 min
5.	40 por cento OH₂C1₂	de	isopropanol	2	X	3 min
/- o .	CH₂C1₂			2	X	3 min
7.	10 por cento	de	diisopropiletila-
	mina			2	X	10 min
3.	oH₂01₂			1	X	3 min
9.	aminoácido			1	X	3 min
10	HOBt			1	X	3 min

ECO x 120 min

ί 12.	CH_?01₂
< 13.	40 por cento
	-CH₂C1₂
14.	Dí.íF
15.	CH₂C1₂
a.	Síntese

2x3 min

1x3 min

2x3 min !0 péptido protegido foi sintetizado asando para tal um sintetizador de péptidos Beckman Modelo 990. A tetrapéptido-re sina resultante foi de 0,67 meg/g e a síntese iniciou-se co 5,0 g (3,35 mmol) de resina, 0 tetrapéptido resultante foi então acetilado tratando para tal a resina com:

1. 2.	CH₂C1₂	de
50 por	cento
3.	50 por	cento	de
4.	CH₂C1₂
5.	40 por	cento	de
6.	ch₂ci₂
7. ι	10 por	cento	de
2.	CH₂C1₂

TFA - CH₂C1₂TFA - CH₂C1₂ isopropanol - CH, diisopropiletila:

	2x3 min
	1x3 min 1 x 30 min 1x3 min
ci₂	2x3 min 2x3 min
ina	2 x 10 min 1x3 min

. o í *	50 por	cento	de andrido acético -
	0H₂	Cl₂ com uma quantidade catalít
	de	DÍ.IAP
!0.	CH₂C1₂
¹¹.	40 por	ceuto	de isopropanol-CH₂Cl₂
12.	LM?
13.	CH₂C1₂

x 120 min

2x3 min

1x3 min

2x3 min

A péptido-resina foi seca sob pressão reduzida após lavegei com etanol (2 x 50 ml).

b. Clivagem com HF tetrapéptido bruto foi obtido por clivagem da péptido-resina com HE (25 ml) e anisol (25 ml) durante 4 horas a O^C. 0 HF foi removido sob pressão reduzida. Adicionou-se éter dietílico (150 ml) à mistura. A solução foi agitada e transferida para um funil de vidro sinterizado e lavada com uma quantida-; ide adicional de éter dietilico (3 x 100 ml). 0 péptido foi j extraído da resina com HOAc a 10 % (3 x 100 ml) e a solução I (aquosa liofilizada para se obter 1,20 g. !

i ί

I !

! c. Purificação ! ^; produto foi purificado por cromatografia em fase líquida de alto rendimento preparativa (HPLC) com as seguintes condições: YHiatman Column Partisil 1,120 10/50 0DS3; 300 mg da amostra usando um sistema isocrático de 15 CH^CN/NH^OAc 0,01 M (pH ^:5 ajustado com HOAc); caudal de 15 ml/mn; comprimento de onda de detecção 220 mn. iodas as fracções puras foram colectadas.' 0 solvente orgânico foi evaporado e a solução aquosa foi liofilizada para se obter 258 mg de um sólido branco.

i

Análise de aminoácidos: Pro, 1,00 ; Ala, 1,00 : Vai, 1,00; j í Arg, 1,01 ; 83 / de péptido. j

I :

i !

Cromatografia em camada fina (Sílica 60/Analtech)

I

R^ (I) = 0,50 (butanol:ácido acético:água/3:1:1) I

R_f (II) = 0,59 (3utanol:piridina:ácido acético:água/4:1:1:2)

Rx. (III) = 0,29 (Butanol:ácido acético:água:acetato de etilo/ ¹ ‘ /1:1:1:1)

ΕΧΞΗΡηΟ 2 Síntese de u.m tetrapéptido: Acetil-Arg-Pro-Val-Ala-F.-i₂

a. Síntese tetrapéptido foi preparado num Sintetizador Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. Foi usada a técnica cíclica Std 1 (Versão do fabricante 1.40) a qual acoplou cada amino ácido de sua vez à excepção de BOC-Tos-Arg o qual foi acoplando por acoplamento duplo. Na síntese foram usados os seguin!tes materiais de partida pré-embalados:

Reagente	Fonte	mmoles	Quantidades
p-íJe til- BHA- Re s ina	ABI	0,50	760 mg
BOC-Tos-Arg	ABI	2,0	850 mg
BOC-Pro	ABI	2,0	430 mg
BOC-Val	ABI	2,0	434 mg
BOC-Ala	ABI	2,0	378 mg

Após o grupo BOC da arginina ser removido, a péptido-resina ífoi lavada e neutralizada, o composto foi acetilado usando í para tal anidrido acético em (15 ml) em presença de

14- d ime ti lamino piridina (20 mg). Após -50 minutos, o péptido ! jfoi verificado pelo teste com ninidrina para asseguar a ace:tilação completa. A péptido-resina foi lavada com CHgClg (3 x| 15 ml) e seca sob vácuo (à temperatura ambiente) para se obter 1,0 g do material.

'k· Clivagem com H?

péptido foi clivado a partir da resina usando para tal 10 ml de HF em presença de 1,5 ml de anisol. A mistura foi agi-

tada a 0°C durante 1,5 horas, após o que o HP foi removido sob pressão reduzida. Λ mistura foi lavada com Et₂C (3 x 50 ml) e seca ao ar. A mistura péptido-resina foi extraída com HCAc 25 $ aquoso (3x50 ml).

c. Purificação filtrado aquoso foi liofilizado para se obter 240 mg de material bruto. Este material foi passado através de Amberlite¹IRA 68 (forma de acetato) resina de permuta iónica em água.

As fracções compreendendo o péptido foram combinadas e liofilizadas (220 mg).

péptido foi purificado numa coluna Y/hatman Partisil 20 M 10 ODS-3 (22 mmm x 50 cm) usando para tal acetonitrilo 15 $ (0,1 $ ácido trifluoracético) e ácido trifluoracético aquoso a 0,1 $ como solventes eluentes (10,0 ml/minuto). A eluição foi monitorizada por HPLC e as fracções apropriadas foram combinadas e o solvente removido sob pressão reduzida. 0 resíduo foi dissolvido em HgO e liofilizada duas vezes para se obter 167 mg do produto com rendimento total de 50 /.

Análise dos aminoácidos: Arg, 1,04: Pro, 1,02; Val, 1,00;

Ala, 1,01; 72 ' do péptido.

Cromatografia em camada fina (sílica Gel GP 250 am placas)

^Rf	(I)	- 0,37	(n-BuOH:HOAc:H₂O/3:l:1)
Rf	(II)	= 0,15	(CHClp MeOH:HCAc 60:35:5)
Rf	(III)	= 0,48	(n-Butanol:HOAc lí^OEtOAc/l: 1:1:1)

EXEMPLO 3.

Síntese de um tetrapéptido:Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-1H₂

Síntese composto mencionado em título foi sintetizado por meio de métodos de síntese padrões em fase sólida usando um sintetizador automático Beckman Synthesizer Modelo 990. A síntese foi iniciada com 5,0 g de resina BHA (0,67 meg/g). Após a ligação BOG-Arg(Tos) estar completa, o grupo protector terc,-butiloxicarbonilo foi removido com 50 % de TFA em Cí^C^ e o péptido-resina foi acetilado com 50 % de anidrido acético em CH₂C1_Oem presença de uma quantidade catalítica de DMAP. A péptido-resina foi lavada com etanol (2 x 50 ml) e seca sob pressão reduzida durante a noite antes da clivagem com HF. A péptido-resina seca pesava 6,5 g.

b. Clivagem com H?

tetrapéptido bruto foi obtido clivando 6,5 g de péptido-resina com IIF (25 ml) e anisole (25 ml) a 0°C durante 4 horas.

HF foi evaporado sob pressão reduzida e éter diétílico (150 ml) foi adicionado à mistura reaccional. 0 péptido bruto e a resina foram transferidos para um funil de vidro sinterizado a HOAc a 10 / e lavado com éter dietilico (3 x 100 ml). 0 péptido foi extraído com HOAc a 10 / (3 x 100 ml) e a solução aquosa liofilizada para se obter 900 mg de um sólido branco.

c. Purificação produto bruto (a 98 / puro por HPLC) foi dessalificado numa coluna de Sephadex LH-20 (100 g, 2,5 cm x 89 cm) usando HOAc

f cceo eluente. Após a liofilização o produto tinha um aspecto de um sólido branco macio pesando SCO mg.

Análise do Aminoácido: Arg, 0,99; Vai, 1,00; Pro, 1,05;

Asp, 1,01.

Cromatografia em camada fina (Sílica Gel 60/l.'erck, 250 F)

R_f (I) = 0,51 (n-BuOH:HOAc:H₂O/3:l:l)

R_f (II) = 0,60 (n-BuOH:HOAc:H₂O:StOAc/l:1:1:1)

R_f (III) = 0,59 (n-BuOH: Piridina:H0A:H_p0/4:1:1:2)

EXEIPIO 4 Síntese do N-ot -formil-Arg-Pro-Asp-Val

a. Ester de benzilo de N-t-butiloxicarbonil-β-benzi 1- As partil-Valina

Em S0 ml de CH₂C1₂ foram dissolvidos 3,23 g de 1-t-butiloxicarbonil--benzil-Asp e 3,97 g de éster de p-tosilato de Vai-benzilo. Foram adicionados 1,74 ml de diisopropiletilamina e arrefeceu-se a solução a 5-0. λ mistura adicionaram-se 2,05 g de DOO. A mistura foi agitada a 5²C durante 30 minutos e então durante mais duas horas à temperatura ambiente. 0 precipitado foi filtrado e o filtrado extraído com água, com uma solução de ácido cítrico a 10 > e com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. A remoção do solvente originou um óleo que foi purificado por cromatografia em gel de sílica 60 com 97:3 de CH₂C1₂ meOH. 0 produto, um óleo, pesava 3,46 g.

1.

Ester de benzilo de Π-t-butiloxicarbonll-Prolil·

-benzil-Asoartil-Valina

A desprotecção de 3,41 g do produto anterior com 60 ml de

-TFA 2 : 1 durante 30 minutos originou o sal de triiluoracetato sob a forma de um óleo. A amina livre foi obtida por neutralização com uma solução de carbonato de sódio saturada e extraída em 0Η₂01₂· 0 extracto foi reduzido em termos de volume por evaporação e então adicionado a 1,05 g de N-t-butiloxicarbonilo-Pro. Foi adicionada uma solução de 0,73 g de HOBt em 2 ml de LL1F seguidos de 0,99 g de DCC. A mistura foi agitada durante 2,5 horas e então filtrada. 0 filtrado foi extraído com água, com uma solução de ácido cítrico a 10f' e duas vezes com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. Após secagem, 0 solvente foi removido deixando um óleo.

produto foi purificado por cromatografia flash em sílica geR com 9 : 1 A fracção contendo 0 componente maio ritário originou um óleo incolor pesando 2,31 g. Espectro de IV; 1740 cm^-1, 1695 cm^-1, e 1675 cm“.

c. Ester de benzilo de R- o(-formil-N-nitro-Arginil-Prolil-ft -benzil-Aspartil-Valina

A 2,23 g do produto anterior foram adicionados 60 ml de TPA-CH2CI2 1 : 2. A solução foi agitada durante 30 minutos, e então 0 solvente foi removido sob pressão reduzida originando um. sólido com o aspecto de cera, o qual foi lavado com éter de petróleo. 0,72 g de R- q-form.il-R-nitro-Arginina e 0,33 ml de R-metilmorfolina foram dissolvidos em 15 ml de DL’E. A solução foi arrefecida a -20²C e adicionou-se gota a gota 0,40 g de cloroformato de isobutil. A mistura foi agitada a uma temperatura de -20 a -10° durante 20 minutos e então adicionou-se uma solução de trifluoracetato de éster de benzilo de propil-(9-benzil-Aspartil-Valina benzílico em 20 mi de DMF e 0,33 ml de metil-morfolina fortemente arrefecida. A mistura foi agitada a -15²C durante 20 minutos, sendo posteriormente retirado 0 banho de arrefecimento e a agitação continuada à temperatura ambiente durante 2 horas.

A maior parte do solvente foi removido sob pressão reduzida.

resíduo foi dissolvido em 50 ml de CH₂C1₂ e extraído com ί água, com uma solução de ácido cítrico a 10 / e com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi seca e o solvente evaporado rendendo 2,08 g.

Cromatografia em Camada Fina (sílica gel GF) :

R_f (I) = 0,55 (CH₂Cl:MeOH/9:l)

R_f (II) = 0,72 (CHCl^:Me0H:H0Ac/8:1:1)

d. N-cX -f ormil-Arginil-Prolil-Aspartil-Valina

A operação de desprotecção foi realizada por hidrogenação de transferência com 30 ml de ácido fórmico-formato de amónio a 5 / sobre negro de paládio. A mistura reaccional foi agitada num balão rolhado durante 18 horas. Após a filtração da mistura através de Celite, o solvente foi removido sob pressão reduzida. 0 resíduo foi dissolvido em água e liofilizado. 0 i

produto foi purificado numa coluna cromatográfica de 1,5 x 50 cm de DEAE-Sephade x. K eluição iniciou-se com bicarbonato de amónio 0,02 m pH 8,5, recolhendo fracções de 150 gotas. Após se terem recolhido 52 fracções, iniciou-se uma eluição com um gradiente de bicarbonato de amónio de 0,02 í.i e 0,20 K com o total de 2 litros. 0 pico mais largo no cromatograma eluído estava centrado na fracção 88. As fracções 75-100 foram combinadas e liofilizadas obtendo-se um sólido amorfo leve.

HPLC: rt = 9,4 minutos com MeOH a 10 % - NH^OAc 0,01

E - pH 5 a 1,5 ml/minuto em Bondapak-C,_o.

J-O

Cromatografia em camada fina (Sílica Gel 50):

R_f (I) = 0,16 (n-BuCH:H0Ac;H₂0/3:l:l)

R_f (II) = 0,27 (n-Bu0H:H0Ac:H₂0/15:3:12:10)

R_f (III) = 0,42 (EtOAc:Pyr:HOAc:H₂O/5:5:l:3)

Análise dos aminoácidos: Asp, 0,99; Pro, 0,97; Vai, l;o5;

Arg, 1,00; 38 do péptido.

EXEMPhO 9 Síntese de nm Pentapéptido: Arg-Pro-Ala-Val-Tyr péptido foi sintetizado por um método em fase sólida, iniciando-se a partir de éster de BOC-(BZLC1₂)-Tyr resina (4,4 g, 0,40 meg/g). A resina foi ligada sequencialmente com três equivalentes de cada BOC-Val, BOC-Ala, BOC-Pro e CBZ^-Arg.

Os agentes de acoplamento foram DCC e HOBT em CHgClg 4 : 1. A resina foi clivada com H7 (40 ml) em anisol (5 ml) durante 45 minutos à temperatura de 0°C. 0 resíduo sólido foi extraído com HOAc a 10 ¢, filtrado e a solução aquosa liofilizada para obter 1,56 g de péptido bruto.

A purificação foi realizada por cromatografia em coluna com Sephadex SPC 25 (2,6 x 90 cm), eluindo com um gradiente de concentrações múltiplas de NH^0Ac:0,05 M, pH 5 (21), 0,15 M, pH 5 (1 1), 0,15 lí pH 6,7, (2 1); 10C ml/hora de caudal; frac ‘ções de 12,5 ml, Detecção a 280 nm. A isolação das fracções 198-207 originaram o péptido título como um sólido incolor

1,13

Cromatografia em camada fina, (Sílica Gel G, 250):

R_f (I) = 0,24 (n-PrOH:NH₄CH/84:37)

R_f (II) = 2,64 (Trifluoretanol:BH₄OH/7S:22)

R_f (III) = 0,58 (n-Bu0H:H0Ac:H₂0/15:3:l2:10)

Análise dos aminoácidos: Arg, 1,00; Ala, 0,96; Pro, 0,97;

Vai, 1,03; Tyr, 1,01, 67 % do péptido.

EXEMPLO 6 Actividade Biológica: Ensaio de G.MP cíclico

Este ensaio mede a capacidade de um péptido de acordo com a presente invenção se ligar ao receptor da membrana celular de células MOLT-4 intactas e estimularem selectivamente a produção de GMP cíclico, tal como a tisptenina e timopentina humanas .

j ;A linha de células MOLT-4 foi obtida a partir de American Type Culture Collection of Rockville, Md, Estados Unidos da América Células MOLT-4 foram frescamente e cresceram durante 3 dias usando o método de recolha descrito em T. Audhya et al, Arch. Bionhem Biophys., 234: 167-177 (1984). As células foram ilavadas 3 x em BBS e ressuspensas em meio de RPMI 1640 com a concentração de 1,0 x 10 células/ml e deixaram-se equilibrar a 37²C durante 30 minutos antes da adição dos tetrapéptidos ;e pentapéptidos a ensaiar (25 ^ul) e de péptidos de controlo, í Deixou-se prosseguir a incubação em um banho de água sob agi-i tação durante 4 a 5 minutos e foi então terminada com a adição de 1 ml de TCA gelado (10 ¢).

As células em TCA foram homogeneizadas e submetidas à acção j de Ultrassons para libertar nucleótidos cíclicos. A suspensão ifoi centrifugada a 3000 g durante 20 minutos a 4^SC. 0 preci[ 'pitado resultante foi dissolvido em NaOH 0,1 N para determiijnar o conteúdo proteico. 0 TCA foi removido a partir da frac-

te 10 minutos em banho de água a 50^0. Após liofilização, a amostra foi reconstruída em tampão de acetato 50 mM (pH 5,2) para um ensaio de radioimunidade do CMP cíclico.

A Fig. 1 representa curvas típicas de dose-resposta determinadas a partir de 1 a 1000 para péptidos cíclicos Acetil-

:-Arg-Pro-β -D-Asp-Val-NHg, Arg-Pro-Ala-Val-Tyr e Acetil-Argj,-Pro-Ala-Val-NHp e comparadas com a timopentina e pêptidos il jinactivos Acetil-Arg-Pro-Asp-Pro-NHg, Ala-Lys-Asp-Vai e lys-Lys-Asp-Val-NHg em células MOLT-4.

A Fig. 2 representa curvas de dose-resposta avaliadas a partir de 1 a 100 ^ug/ml para pêptidos cíclicos Acetil-Arg-Pro-Val-Ala-NHg, comparados com timopentina padrão para células KOLT-4.

i

I

A actividade limiar foi determinada para cada péptido ensaia-; do. Fsta é definida como sendo a concentração mais baixa do péptido de ensaio induziu um nível intracelular do GAP cíclico superior em dois desvios padrão acima do controlo. Cs controlos apresentaram valores de GKP cíclico intracelular de menos de 0,5 picomoles/ml (média + desvio padrão). Os resul!tados do ensaio foram considerados positivos se o nível do GLI? cíclico foi superior a 2 vezes (2 desvios padrão) o determinado para o controlo paralelo negativo.

!Os resultados dos ensaios GMP cíclicos são aoresentados na í

'Fig. 1 e sua correspondente Tabela I e na Fig. 2 correspon|dente Tabela II na qual os pêptidos representativos da inveni íção foram ensaiados em comparação com a timopentina e com os roéntidos de controlo. Sstes resultados foram comoarados com a ·* itimopentina (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) em LOLT-4 porque o pentapépjtido tisplenina humana SP-5 (Arg-Lys-Ala-Vai-Tyr) é inactivo em LOLT-4. Fstes resultados demonstram a actividade biológica dos pêptidos da invenção na estimulação da actividade auxiliar de células T em células LOLt-4.

TABELA I

Concentração de cGVP (cicogramas/ml)	100	1000
ι Concentração do Péptido Çug/ml): 1	10
A rg- L y s - A s p- Vai- T yr	6,4	18,3	20,8	21,9
A rg- Pr o- A s p- V al- EH ₂	0,1	17,1	19,3	24,8
Acetil-Arg-Pro-Asp-Vai-NH₂	4,55	8,99	19,62	24,09
Acetil-Arg-?ro-Glu-Val-EH₂	4,7	9,41	16,76	25,00
Acetil-Arg-?ro-Ala-Val-HH₂	7,1	14,6	19,1	24,5
Acetii-Arg-Aib-Glu-Val-EH₂	3,7	11,0	17,7	24,9
ι A c e t i 1- A rg- Pr o- G in- V a 1- NH₂	18,75	29,68	34,98	40,23
Ace til-Arg-Pro-Glu.-Vai	4,1	11,9	7,9	30,8
A c e t i1-Arg-A i b-Ala-Val-MH₂	18,78	30,45	36,17	39,48
Acetil-Arg-Pro-y? -D-Asp-Val-HH₂	6,6	14,3	20,5	25,0
Acetil-Arg-Pro-^ -Asp-Gly-EH₂	20,56	31,83	36,66	34,95
Lys-Lys-Asp-Val-HH_O	0,33	0,31	0,34	0,33
Lys-Arg-As p-Vai	0,44	0,43	0,44	0,39
Arg-Gly-Λs p-S e r	0,71	0,50	0,68	0,58
i Ar g- Pr o- A la- V al- T yr	0,09	16,41	27,90	37,14
Arg- Pr o- A1 a- Va 1- T yr- EH₂	3,71	14,15	12,83	12,57
A c e t i1-Arg-Lys-Ala-V al-T yr-NH?	3,00	8,86	12,83	18,43
0 péptido de controlo varia entre 0 -	- 0,3 pg/ml

TABELA II

Concentração de cGLP (picogramas/ml)

Concentração do péptido Çug/ml): 1

100 1000

Arg-Lys-Asp-Val-iyr

Acetil-Arg-Pro-Val-Ala-NH₂

3,55 13,56 18,70 24,85

7,77 17,39 24,47 —

Nota: o fundo corresponde a 0,19 picomole de cGKP/ml.

EXELPLO 7 Estabilidade Enzimática

Para demonstrar a estabilidade de um péptido da presente invenção contra a degradação pelas enzimas intestinais e do soro, o péptido Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-NH₂ foi incubado a 37° em suco intestinal de rato e em soro humano durante mais de 120 minutos. Trataram-se de maneira semelhante para comparação os tetrapéptidos Arg-Lys-Asp-Val e timopentina. HPLC revelou que o Arg-Lys-Asp-Val foi totalmente digerido após 25 segundos. A timopentina encontrava-se 50 í degradada ao fim de cerca de 20 segundos. 0 péptido desta invenção manteve-se substancialmente não-degradado tanto no soro como no suco intestinal durante pelo menos 120 segundos.

0s Exemplos anteriores foram apresentados com finalidade ilustrativa apenas e não com o fim de limitar o âmbito da presente invenção como aqui é estabelecido nas reivindicações que se seguem.

Claims

,Íl^â. - Processo para a preparação de tetrapéptidos com actii vidade auxiliar de células I, de fórmula ί ί R-Arg-X-Y-Z-R¹ (Ou dos respectivos sais de adição de ácido ou de base farmajceuticamente aceitáveis, na qual R é H, alquilo inferior, ;

acetilo, formilo, alcanoílo inferior; X é Pro, desidro-Pro, ' hidroxi-Pro, D-lys, Aib ou lys; Y é um isómero D ou 1 de um aminoácido escolhido de Ala, Asp, Glu, Gin, Asn, beta-Asp,

Vai, Leu ou Ile; Z é Gly ou um isómero D ou I de um aminoácido escolhido de Vai, Ala, Leu ou Ile; R é OH ou NR R , em 2 3 que R e R sao H ou um radicai alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada, com 1 a ó átomos de carbono, opcionalmente substituídos por um grupo arilo, ou um radical arilo i substituído ou por um átomo de halogéneo ou por um radical !

alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada, tendo 1 i ja 6 átomos de carbono, ou em que R“ e R conjuntamente formam [ íum grupo metileno cíclico com 3 a 7 átomos de carbono; con- ¹'tanto que, quando X for Lys, e Z for Vai, Y é diferente de Asp, Asn, Ala, Asu ou Glu; e quando X for Lys, Y é diferente j de Asp; e quando X for Ala e Z for Vai, Y é diferente de Asp, i caracterizado pelo facto de compreender a realização da síntese química em fase sólida ou em fase aquosa do composto pretendido .
2^â. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado j pelo facto de o tetrapéptido obtido ter a capacidade de aumen-; far a actividade cGMP na linha LOLT-4 de células T humanas.

i
3-· - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado !

peio facto de X ser Pro, Y ser Asp, Ala, Glu, D-beta Asp,

Vai, Leu ou Ile, e Z ser Yal ou Ala.
4- · - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter um dos seguintes péptidos:

Arg-Pro-Asp-Vai

Arg-Pro-Asp-Val-NH^

Formil-Arg-Pro-Asp-Vai Acetil-Arg-Pro-Asp-Vai Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-NH^

A c et i1-Arg-Pro-Ala-Val-NH₂Acetil-Arg-Pro-D-beta Asp-Val-NH₂Acetil-Arg-Pro-Glu-Val-NH₂A c e t i 1- A rg- Pr o- Gl u- Vai A c e t i 1- A r g- A ib- G1 u-V al- ÍTH ₂A c e t i 1- A r g- A i b- A1 a- V a 1-11 í _?

A c e t i 1- A r g- Pr o- b e t a-Asp- G1 y- YH ₂.
5- . - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter acetil-Arg-Pro-Val-Ala-1H₂.

oã. - Processo para a preparação de pentapéptidos com a capacidade de aumentarem a actividade de cGYP na linha LiOL'T-4 de células T humanas, da fórmula:

R“-Arg-X'-Ala-Y’-Z »-R³ dos respectivos sais de adição de ácido, ou de base farmaceuticainente aceitáveis, na qual R é H, alquilo inferior, acetilo, formilo, alcanoílo inferior ou de des-araino; X' é Pro, desidro-Pro, hidroxil-Pro, D-lys, Aib ou lys; Y' é um isómero

D ou 1 de um aminoácido escolhido de Vai, Ile, leu, Ala, Asp,

C-lu, Gin, Lys; Z ’ é um isómero D ou 1 de um aminoácido esco7 -1 c:

lhido de Tyr, Vai. leu, His, Ala ou Trp; R é OH ou MR R , em 4 5 ’ que R e R sao H ou um radical alquilo ou ábenilo de cadeia linear ou ramificada, tendo 1 a
6 átomos de carbono, opcional mente substituído por um grupo arilo, ou um radical arilo sub tituído por um halogéneo ou um radical alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada tendo 1 a 6 átomos de carbono, 4 S ou em que R e conjuntamente formarem um grupo metileno cíclico, com 3 a 7 átomos de carbono, caracterizado pelo facto de compreender a realização da síntese química em fase sólida ou fase de solução, do composto pretendido.
7-. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado oelo facto de X' ser Pro.
8^g. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado oelo facto de Y' ser Vai.
9-. - Processo de acordo com a reivindicação jpelo facto de, como produto final, se obter ^escolhido do grupo formado por caracterizado pentapéptido um k rg - P r o- A1 a- V a 1- T y r

Arg-Pro-Ala-Vai- TyrA c e t i 1- A rg- Ly s- A1 a- V a 1- T y r- ’ Ή _?
10^a·. Processo para a preparação de composições farmacêuticas, ^;caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um tetrapéptido de acordo ;com a reivindicação 1 ou um pentapéptido de acordo com a reiI ívindicação 6, com as substâncias veiculares e/ou auxiliares !farmaceuticamente aceitáveis.

,jll^ê. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizaido pelo facto de se conferir à mistura uma forma apropriada para a administração por via oral.

^!12-. - Método para o tratamento de seres humanos com o fim de Íse regular o seu sistema imune, caracterizado pelo facto de se administrar aos pacientes que necessitam esse tratamento um tetrapéptido de acordo com a reivindicação 1 ou um pentajpéptido de acordo com a reivindicação 6, ou um seu sal farmajceutiamente aceitável, numa quantidade de preferência compre.'endida entre cerca de 0,001 e cerca de 10 mg de substância lactiva por kg de peso corporal.

i p_3^s. - Processo de acordo com a reivindicação 12 para a reguÍlação, num indivíduo, de uma deficiência ou de um excesso de funcionamento de células T, caracterizado pelo facto de se lhe administrar uma composição farmacêutica.