CZ280695B6

CZ280695B6 - Analogy karboxyterminálního oktapeptidu B-23-B-30 B-řetězce lidského insulinu s modifikací v poloze B-24 a B-25

Info

Publication number: CZ280695B6
Application number: CS92704A
Authority: CZ
Inventors: Tomislav Rndr. Drsc. Barth; Jiří Rndr. Jiráček; Eva Rndr. Anzenchacherová; Jiří Ing. Csc. Velek; Ivo Rndr. Csc. Bláha; Jana Rndr. Csc. Barthová; Ivan Rndr. Svoboda; Jan Ing. Csc. Pospíšek; Martin Ing. Drsc. Čapka
Original assignee: Ústav Organické Chemie A Biochemie Avčr
Priority date: 1992-03-10
Filing date: 1992-03-10
Publication date: 1996-04-17
Also published as: CZ70492A3

Abstract

Peptidy obsahující racemické aminokyseliny v nosičích 24 nebo 25 se po uvolnění z nosiče kapalným fluorovodíkem čistí jednotlivě, analogy obsahující stereoisomery příslušné aminokyseliny se oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Peptidy, látky I-IX se též připraví z derivátů obsahujících fenylacetylovou skupinu na .SIGMA.-aminoskupině lysinu v posici 29 B-řetězce insulinu pomocí zakotvené penicilin- amidohydrolasy.ŕ

Description

Syntetické analogy oktapeptidické karboxytermální sekvence

B-řetězce lidského inzulínu a způsob jejich přípravy

Oblast techniky

Předmětem vynálezu jsou syntetické analogy oktapeptidické karboxyterminální sekvence B-řetězce lidského inzulínu s obměnou aminokyselin v pozici B-24 a/nebo v pozici B-25 a způsob jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Metoda enzymové semisyntézy je využívána v řadě případů nových analogů větších peptidů. Tato metoda je podmíněna primární strukturou modifikované oblasti s ohledem na použitý enzymový systém. V případě inzulínu se jedná o karboxyterminální oblast B-řetězce inzulínu, kde se dá využít trypsin a trypsinu podobné enzymy k semisyntetickým reakcím. Připravili jsme řadu analogů karboxyterminálního oktapeptidu B-řetězce inzulínu, ve kterých byla ε-aminoskupina lysinu chráněnou fenylacetylovou skupinou (CZ patent 280 690).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou syntetické analogy oktapeptidické karboxyterminální sekvence B-řetězce lidského insulinu s obměnou

aminokyselin v pozici B-24 a/nebo v pozici B-25	obecného vzorce I (I)
Gly - 23	• X - Y - Tyr - Thr - Pro - Lys - Thr
24 25	26	27	28	29 30
kde podle	vynálezu	X	je	D-Phe	a Y	je D-Phe	(látka	I)
	nebo	X	je	L-Phe	a Y	je L-p-MePhe	(látka	II)
	nebo	X	je	L-Phe	a Y	je D-p-MePhe	(látka	III)
	nebo	X	je	L-Phe	a Y	je L-p-EtPhe	(látka	IV)
	nebo	X	je	L-Phe	a Y	je D-p-EtPhe	(látka	V)
	nebo	X	je	L-p-MePhe	a Y je L-Phe	(látka	VI)
	nebo	X	je	D-p-MePhe	a Y je L-Phe	(látka	VII)
	nebo	X	je	L-p-EtPhe	a Y = L-Phe	(látka	VIII)
	nebo	X	je	D-p-EtPhe	a Y = L-Phe	(látka	IX)

Látky se připraví syntézou na pevné fázi, při níž se a a e-primární NH₂-skupiny z hydroxybenztriazolových esterů chrání pomocí Boc/Bzl chránících skupin a postranní hydroxyly jsou chráněny u tyrosinu skupinou 2,5-dichlorbenzyloxykarbonylovou a u threoninu skupinou benzylovou. Dále je výhodné, jestliže peptidy obsahující racemické aminokyseliny L,D-p-methylfenylalanin nebo L,D-p-ethylfenylalanin se uvolní z nosiče kapalným fluorovodíkem, jednotlivě se čistí a analogy se stereoisomery uvedených aminokyselin se oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií.

Jiný způsob přípravy peptidů I-IX využívá působení penicilín amidohydrolazy, s výhodou zakotvené na inertním nosiči (AO 218 777), na peptidy s e-aminoskupinou lysinu v pozici 29 chráněnou skupinou fenyloctovou, které se připraví postupem dle našeho vynálezu (CZ patent 280 690).

-1CZ 280695 B6

Oktapeptidy s volnou e-aminoskupinou lysinu jsme připravili pro srovnávací a metabolické studie. Tyto byly připraveny jednak syntézou na pevné fázi, jednak odštěpením chránící fenylacetylové skupiny z e-aminoskupiny lysinu peptidů, jež byly předmětem našeho vynálezu (CZ patent 280 690).

Výsledné peptidy jsou čištěny a izolovány vysoce účinnou chromatograf ií.

Pro syntézu peptidu bylo použito obecné schéma připojení chráněné aminokyseliny k peptidickému řetězci na nosič.

Schéma syntetického postupu

Cyklus připojení chráněné aminokyseliny k peptidickému řetězci na nosiči lze popsat tímto schématem:

1. Odštěpením Boc-skupiny 20 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) po dobu 2 min, opakované po 10 min.

2. Promytí dichlormethanem (2x20 ml, 1 promytí 20 sekund).

3. Neutralizace 10 % diisopropylethylaminu (20 ml) v dichlormethanu (2x1 min).

4. Promytí dimethylformamidem (DMF) (2 x 20 ml, cyklus 20 sekund).

5. Přidání hydroxybenztriazolového esteru chráněné aminokyseliny v DMF do negativního ninhydrinového testu.

6. Promytí 50% ethanolem (EtOH) (2 x 20 ml, cyklus 20 sekund) v dichlormethanu.

Při přípravě diastereoizomerních směsí analogů s D,L-p-ethylfenylalaninem a D,L-p-methylfenylalaninem byl použit pouze 1,1 molární přebytek terč. butyloxykarbonyl-D,L-p-ethylfenylalaninu, respektive terč.butyloxykarbonyl-D,L-p-methylfenylalaninu. V ostatních případech byl použit 3 molární přebytek.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava Gly-D-Phe-D-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys(Pac)-L-Thr

Látka byla připravena v pevné fázi na chlormethylovaném polystyrénovém nosiči síťovaném 1% divinylbenzenu (0,96 mmol Cl/g). Karboxykoncový threonin byl připojen kaliumfluoridovou metodou (Horiki, K., a spol. Chem. Letters 1978, 165). Obsah navázané kyseliny byl stanoven aminokyselinovou analýzou a činil 0,56 mmol/g. K syntéze bylo použito 0,54 g (0,3 mmol) esterifikovaného nosiče.

Hydroxybenzotriazolové estery Boc-chráněných aminokyselin byly připraveny před kopulační reakcí mícháním směsi 0,9 mmol chráněné aminokyseliny, 0,9 mmol HOBt.H₂O a 0,9 mmol dicyklobenzylkarbodiimidu (DCC) v CH₂C1₂. Po 20 minutách při 20 °C byla odsáta vzniklá dicyklohexylmočovina a roztok v chladu za vakua zahuštěn na cca 3 ml a doplněn na 10 ml DMF. Jednotlivé aminokyseliny byly připojeny podle sledu peptidového řetězce způsobem

-2CZ 280695 B6 podle shora uvedeného postupu. Z důvodů urychlení reakce bylo v některých případech přidáno 50 mg 4-dimethylaminopyridinu. Po 5 minutách byla reakční směs odsáta, promyta 50% EtOH a testována Kaiserovým testem (Kaiser, E. a spol. Anal. Biochem. 34, 595, 1970). Po připojení aminokoncového glycinu byla jeho Boc skupina odštěpena TFA a reakce dovedena do kroku 4 syntetického postupu. Po -promytí EtOH a pečlivém vysušení bylo odštěpení peptidů od pryskyřice provedeno kapalným fluorovodíkem (HF) s přídavkem 10% anisolu (20 ml HF, 1 h, 0 °C) v teflonové aparatuře. Po vyfoukání HF a promytí pryskyřice etherem byl vzniklý peptid rozpuštěn v 100 ml 20% kyseliny octové a lyofilizován.

Surový peptid byl vyčištěn na vysokoůčinné kapalinové chromatografii (HPLC) (Separon C-18) v systému H₂O (0,05% TFA) (MeOH s gradientem MeOH 1%-min počínaje 30% MeOH). Produkt byl izolován a lyofilizován. Výtěžek 150 mg (46 %).

Aminokyselinová analýza: Gly 1,02, Phe 2,14, Tyr 1,04, Thr 1,84, Pro 0,95, Lys 1,01.

Příklad 2

Příprava Gly-X-Y-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys-L-Thr kde X = L-Phe a Y = L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin nebo L-p-ethylfenylalanin nebo D-p-ethylfenylalanin. Na pryskyřici s navázaným pentapeptidem byl připojen Boc racemátů p-methylfenylalaninu nebo p-ethylfenylalaninem podle obecného schéma a postupu uvedeného v příkladu 1. Také připojení dalších aminokyselin Boc-L-fenylalaninu a Bog-glycinu bylo provedeno jako v příkladu 1. Po odštěpení byly jednotlivé peptidy rozděleny pomocí kapalinové chromatografie na L- a D-formu. Byla použita modulární sestava firmy Knauer. Peptid byl dělen na koloně se Sepharonem SG-X-C18 (10 μιη, 250x16 mm), koncentračním gradientem MeOH.

Příklad 3

Příprava peptidů VI-IX

Gly - X - Y - Tyr - Thr - Pro - Lys - Thr

24 25 26 27 28 29 30 kde X = L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin, nebo L-p-ethylfenylalanin nebo D-p-ethylfenylalanin a Y=L-fenylalanin. Na pryskyřici s navázaným hexapeptidem byl připojen Boc-racemátu p-methylfenylalanin nebo p-ethylfenylalaninem podle obecného schéma a postupu uvedeného v příkladu 1. Připojení Boc-glycinu, odštěpení peptidů a jejich čištění bylo provedeno podobně jako v příkladu 2.

Příklad 4

Příprava peptidů - látek I-IX lmM roztok látek 1 až IX obsahující chránící fenylacetylovou skupinu na e-NH₂~lysinu v poloze B-29 řetězce lidského inzulínu

-3CZ 280695 B6 v roztoku 1M močoviny a 40 mM Na-fosfátového pufru pH 6,5 byl cirkulován přes kolonu porézního skla se zakotvenou penicilín amidohydrolazou; do systému byla dále zapojena kolonka s Dowexem 1x8, kde byla vychytávána odštěpená kyselina fenyloctová, inhibitor enzymu. Průběh reakce byl sledován a izolace produktů látek I-IX byla provedena pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Syntetické analogy oktapeptidické karboxyterminální B-řetězce lidského inzulínu s obměnou aminokyselin B-24 a/nebo lidského inzulínu v pozici B-25 obecného vzorce I sekvence v pozici

Gly - X - Y - Tyr - Thr - Pro - Lys - Thr 23 24 25 26 27 ' 28 29 30 (I) kde X je D-Phe a Y je D-Phe (látka I) nebo X je L-Phe a Y je L-p-MePhe (látka II) nebo X je L-Phe a Y je D-p-MePhe (látka III) nebo X je L-Phe a Y je L-p-EtPhe (látka IV) nebo X je L-Phe a Y je D-p-EtPhe (látka v) nebo X je L-p-MePhe a Y je L-Phe (látka VI) nebo X je D-p-MePhe a Y je L-Phe (látka VII) nebo X je L-p-EtPhe a Y je L-Phe (látka VIII) nebo X je D-p-EtPhe a Y je L-Phe (látka IX)

2. Způsob přípravy látek obecného vzorce I podle nároku 1 syntézou na pevné fázi, vyznačený tím, že se a a e-primární NH₂- skupiny hydroxybenztriazolových esterů chrání pomocí Boc/Bzl chránících skupin a postranní hydroxyly jsou chráněny u tyrosinu skupinou 2,5-dichlorbenzyloxykarbonylovou a u threoninu skupinou benzylovou.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že peptidy obsahující racemické aminokyseliny L,D-p-methylfenylalanin nebo L,D-p-ethylfenylalanin se uvolní z nosiče kapalným fluorovodíkem, jednotlivě se čistí a analogy se stereoisomery uvedených aminokyselin se oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií.
4. Způsob přípravy látek obecného vzorce I až IX podle nároku 1, vyznačený tím, že se na e-aminoskupině lysinu v pozici 29B-řetězce použije chránící fenylacetylové skupina a odštěpí se pomocí zakotvené penicilinamidohydrolazy.