NO149998B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av peptider med ubiquitinlignende aktivitet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av

peptider med ubiguitinlignende aktivitet.

US-patent nr. 4.002.602 omhandler det langkjedede polypeptidubiquitin (der betegnet ubiquitous immunopoietic polypeptide). US-patent nr. 4.19 0.647 beskriver pentapeptidet med sekvensen H-X-Y-Z-GLN-LYS-OH, hvor X er TYR eller ALA, Y er ASN eller ALA, og Z er ILE eller ALA. Dette skrift angir at dette pentapeptid har biologisk aktivitet lik den til det langkjedede polypeptid som er kjent som ubiquitin. Pentapeptidet med formelen H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH (heri også betegnet "ubiquitinpentapeptid"), som er

den mest aktive forbindelse som angis i ovennevnte US-søknad, viste en aktivitet i prøven med mus i eksempel II deri ved konsentrasjoner varierende fra 10 ng/ml til lyg/ml. Penta-peptidene med formel H-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-OH, H-TYR-ALA-ILE-GLN-LYS-OG og H-TYR-ASN-ALA-GLN-LYS-OH angis også å ha aktivitet i prøven med kyllinger i eksemplene XIV-XVI deri ved en konsentrasjon på 0,1 yg/ml (100 ng/ml).

Det er i det nedenstående vist til det ovenfor nevnte patent og patentsøknad i forbindelse med omtale av annen kjent teknikk og de biologiske metoder er involvert i foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes peptider som er minst like aktive som de tidligere kjente pentapeptider, samtidig som de har en betydelig enklere struktur. Disse nye peptider har derfor en betydelig fordel idet de er lette og billige å fremstille. Noen av disse nye peptider er overraskende og betydelig mer aktive enn de kjente pentapeptider.

Det er derfor et formål med oppfinnelsen å tilveie-bringe nye peptider som har ubiquitinlignende aktivitet idet de induserer differensiering av både T-forløperceller, samt B-forløperceller til T-celler og B-celler, respektivt, og er derfor meget nyttige i immunsystemet hos mennesker og dyr.

Det ønskes også peptider som har enklere struktur

enn andre peptider med ubiquitinlignende aktivitet, samt

har betydelig større virkning enn tidligere kjente peptider med ubiquitin-lignende aktivitet.

Det fremstilles nye peptider med formelen:

hvor A er valgt fra gruppen bestående av deamino-GLN, GLN,

og (SAR) -GLN, hvor n er et helt tall på 1-4; og B er valgt fra gruppen bestående av LYS-OH, LYS-NH2, dekarboksy LYS,

-HN-CH- CH2OH, LYS-SAR-OH og LYS-SAR-NH2 - Disse peptider kan (CH2)4NH2

anvendes i terapeutiske preparater og brukes for administrasjon til mennesker eller dyr for å forårsake biologiske virkninger.

De peptider hvor A er valgt fra gruppen bestående av deamino-GLN og GLN har betydelig enklere struktur og er lettere å fremstille enn nevnte kjente pentapeptider, siden disse materialer kun er dipeptider eller tripeptider. Peptidene hvor A er valgt fra gruppen bestående av deamino-GLN og (SAR)n~GLN, hvor n er 2, 3 eller 4 og B er valgt fra gruppen bestående av LYS-OH og LYS-NH2 er betydelig mer aktive enn de kjente pentapeptider, idet de viser aktivitet i den nedenfor omtalte kylling-induksjonsprøve ved konsentrasjoner på fra ca. 10 f emptogram (fg) /ml til ca. 100 ng/ml. Disse peptider er således så meget som 10 millioner ganger mer virksomme enn de kjente pentapeptider. Siden enkelte av disse mer virksomme peptider også har-en meget enkelt struktur, kombinerer de en betydelig forøket virkningsgrad med forholds-vis lett og billig fremstilling.

Oppfinnelsen omfatter også fremstilling av farmasøy-tisk akseptable salter av de aktuelle peptider. Som syrer som kan danne salter med peptidene kan nevnes uorganiske syrer, slik som saltsyre, hydrobromsyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforsyre, osv., og organiske syrer, slik som maursyre, eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, malein-syre, fumarsyre, antranilsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre eller sulfanilsyre, for eksempel.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles de ovenfor definerte nye peptider ved at man

a) binder en B-aminosyre som er beskyttet på

sin a-aminogruppe, til en polymerharpiks ved kovalent

binding, idet polymeren inneholder en funksjonell gruppe hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes sterkt ved nevnte kovalente binding, b) fjerner den a-amino-beskyttende gruppe fra B-aminosyre-delen,

c) reagerer med en A-aminosyre som er beskyttet

på sin a-aminogruppe, dersom en slik er tilstede, og

på sin e-aminogruppe, for å koble den sistnevnte med B-aminosyreharpiksen,

d) og, i de tilfeller hvor A-gruppen inkluderer

en eller flere sarcosyl-deler, binder den passende sarcosin

som er beskyttet på sin o-aminogruppe, til kjeden og fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra sarcosyl-delen,

og gjentar denne metode når n er større enn 1, og

e) i det tilfelle hvor B-grupper inkluderer en sarcsyldel, binder sarcosinforbindelsen, som er beskyttet på sin a-aminogruppe, til harpiksen før trinn a), fjerner den a-aminobeskyttende gruppe derfra og deretter binder resten av B-gruppen til SAR-harpiksen; og f) fjerner harpiksen og.alle beskyttende grupper fra det resulterende peptid med.passende reagenser og,

om ønsket, fremstiller farmasøytisk akseptable salter av produktet.

I de ovenfor angitte strukturer er aminosyrekompo-nentene i peptidene for letthets skyld identifisert med forkortelser. Disse forkortelser er som følger:

Betegnelsene "deamino-GLN" og "dekarboksy-LYS" angår henholdsvis en L-glutaminrest hvori cc-aminogrupper er erstattet med hydrogen og en L-lysinrest hvori karboksylgruppen er erstattet med hydrogen. Formlene for disse to grupper er henholdsvis H2NOC-(CH2)3<->CO- og -HN-(CH2)5NH2.

Peptidene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder dipeptiddelen -GLN-LYS- enten alene eller i kombinasjon med fra en til fem sarcosin-radikaler. Disse peptider er funnet å utvise egenskaper i likhet med det 74 aminosyreholdige polypeptidubiquitin som er beskrevet i US-patent nr. 4.002.602. Peptidene i denne oppfinnelse er spesielt kjennetegnet ved deres evne til å indusere den selektive differensiering av T-forløperceller og B-forløper-celler i konsentrasjoner så lave som femptogram/ml. Det er overraskende at dette dipeptidfragment, enten alene eller i kombinasjon med 1-5 rester av den ikke-naturlig forekommende aminosyresarcosin, i det hele tatt er i besittelse av noen aktivitet, langt mindre den overraskende sterke ubiquitin-lignende aktivitet. Det betydelige ved foreliggende oppfinnelse ligger i den unike kombinasjon av stor enkelhet hos peptidet og sterk virkningsgrad. Det vil si, det minst virksomme av de aktuelle peptider (H-GLN-LYS-NH2) har samme virkningsgrad som tymopoietin-pentapeptidet, samtidig som det bare er et dipeptid. Det mest virksomme av de aktuelle peptider (H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2) er omtrent 10 millioner ganger kraftigere enn tymopoietin-pentapeptidet. De ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilte peptider i konsentrasjoner på så lave som 10 femptogram pr. ml, er således funnet å indusere differensieringen av både T-forløperceller målt ved ervervelsen av de tymiske differensierende antigener TL og THY—1 (6) , samt B-forløperceller målt ved ervervelsen av reseptorer for komplement, en karakteristisk markør for B-celler..

For å få et innblikk i den overraskende virkningsgrad til de fremstilte peptider, gis følgende tabell:

En foretrukken utførelse av de fremstilte peptider er de med formel (I) hvor A er valgt fra gruppen bestående av deamino-GLN, og H-(SAR)n~GLN; n er 2, 3 eller 4, og hvor B er valgt fra gruppen bestående av LYS-OH og LYS-NH2. Disse foretrukne peptider utviser aktivitet ved konsentrasjoner i området fra 10 fg/ml til ca. 100 ng/ml.

Peptidet med sekvensen GLN-LYS-SAR-NH2 kan represen-teres kjemisk som følger:

En annen foretrukken utførelse av de fremstilte peptider er den med formel (deamino-GLN)-LYS-C-, hvor C er OH eller NH2. Disse foretrukne peptider kombinerer en sterk virkningsgrad med meget enkel struktur og lett fremstilling. Disse foretrukne dipeptider har slik enkel struktur at de

kan krystalliseres, i motsetning til større peptider som vanligvis ikke kan krystalliseres. Muligheten til å krystalli-sere disse peptider er en meget betydelig faktor når det

gjelder forenklingen av rensingen derav.

For å gi en forståelse av betydningen av de differensierende biologiske egenskaper til de ifølge oppfinnelsen fremstilte peptider, skal det påpekes at funksjonen av thymus i forhold til immunitet kan angis som produksjon av thymus-avledede celler (lymfocyter), som kalles T-celler. T-

celler utgjør en stor andel av mengden av resirkulerende små lymfocyter. T-celler har immunologisk spesifisitet og er direkte involvert i celle-formidlede immun-reaksjoner (slik som homograft-reaksjoner), som effektorceller. T-celler utskiller imidlertid ikke humorale antistoffer. Disse antistoffer utskilles av celler (betegnet B-celler) avledet direkte fra benmargen uavhengig av den thymiske innvirkning. For mange antigener krever imidlertid B-celler tilstede-værelsen av passende reaktive T-celler før de kan produsere antistoffer. T-celler er også involvert i reguleringen av immunsystem som hjelpeceller, suppressorceller osv. Prosessmekanismen for celle-samvirke er enda ikke helt ut forstått.

Ut fra det ovenstående kan det sies at-thymus er nød-vendig for utvikling av cellulær immunitet og mange humorale antistoff-reaksjoner, samt for regulering av immunsystemet. Disse resultater oppnås, idet mins€ delvis, ved induksjon innen thymus av differensieringen av hæmopoietiske stammeceller til T-celler. Denne induktive innvirkning formidles ved utskillinger iepithelcellene i thymus, dvs. av de thymiske hormoner.

For å forstå virkningen av thymus og cellesystemet

av lymfocyter, og sirkuleringer av lymfocyter i legemet, skal det videre påpekes at stammeceller oppstår i benmargen og når thymus gjennom blodstrømmen. I thymus blir stammeceller differensiert til immunologisk kompetente T-celler som migrerer til blodstrømmen og sammen med B-celler sirku-lerer mellom vev, lymfekar og blodstrømmen.

Cellene i legemet som utskiller antistoff (B-cellene) utvikles også fra hæmopoietiske stamme celler, men deres differensiering bestemmes ikke av thymus. Hos fugler differ-ensieres de i et organ som er analogt med'thymus og som betegnes bursa fabricii. Hos pattedyr er det ikke oppdaget noe ekvivalent organ og det antas at B-celler differensierer innen benmargen. De betegnes således benmarg-avledede celler eller B-celler. De fysiologiske stoffer som dikterer denne differensiering er helt ukjente.

Som nevnt ovenfor er de ifølge oppfinnelsen fremstilte peptider nyttige ved terapeutisk behandling av mennesker og dyr. Siden de nye peptider har evne til å indusere differensiering av lymfopoietiske stammeceller som har oppstått i de hæmopoietiske vev til både thymus-avledede lymfocyter (T-celler) og immunokompetente B-celler som kan involveres i kroppens immunreaksjon, ansees de fremstilte peptider å

ha flere terapeutiske anvendelser. Primært, siden forbindelsene har evne til å utføre enkelte av de angitte funksjoner i thymus, har de anvendelse i forskjellige thymiske funksjons-og immunitetsområder. Et hovedanvendelsesområde er behand-lingen av DiGeorge syndrom, en tilstand hvorved det er en medfødt mangel på thymus. Injeksjon av polypeptidene vil overkomme denne mangel. En annen anvendelse er ved agamma-globulinemia, som skyldes en defekt hos det putative B-celle-differensierende hormon i legemet. Injeksjon av polypeptidene vil overkomme denne mangel. Siden peptidene er aktive ved meget lave konsentrasjoner, er de nyttige med hensyn til å hjelpe legemets kollektive immunitet idet de øker eller assisterer i terapeutisk stimulering av cellulær imminutet og humoral immunitet og derved blir nyttige ved behandling av sykdommer som omfatter kronisk infeksjon in vivo, slik som fungal- eller mycoplasma-infeksjoner, tuberkulose, spedalskhet, akutte og kroniske virale infeksjoner og lignende. Videre ansees peptidene å være nyttige i et hvilket som helst område hvori cellulær eller humoral immunitet forekommer og spesielt der det er immunitetsmangler slik som i det ovennevnte DiGeorge syndrom. På grunn av peptidenes egenskaper har de dessuten in vitro nyttevirkning når det gjelder å indusere utviklingen av overflate-antigener i T-celler, videre når det gjelder å indusere utviklingen av den funksjonelle evne til å oppnå respons overfor mitogener og antigener og celle-samvirke med hensyn til å fremme B-cellenes evne til å produsere

antistoffer. De har in vitro nyttevirkning når det gjelder å indusere utviklingen av B-celler målt ved utviklingen av overflatereseptorer for komplement. Peptidene er også nyttige for inhibering av den ukontrollerte formering av lymfocyter som reagerer overfor ubiquitin (kfr. US-patent nr. 4.002.602). En viktig egenskap hos peptidene er deres in vivo evne til å gjenopprette celler med egenskapene til T-celler og også deres vivo evne til å gjenopprette celler med egenskapene til B-celler. De er derfor nyttige ved behandling av relative eller absolutte B-cellemangler, samt relative eller absolutte T-cellemangler, uansett om disse mangler skyldes mangler i de vevs-differensierende B-celler eller thymus, respektivt, eller en annen årsak.

En ytterligere viktig egenskap hos peptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er at de er meget aktive i meget lave konsentrasjoner. Det er således funnet at peptidene er generelt aktive i konsentrasjoner på ca. 10 pg/ml - 10 ng/ml, mens de foretrukne peptider er aktive ved konsentrasjoner varierende fra ca. 10 fg/ml. Bærerstoffet kan være et hvilket som helst av de kjente bærere for dette formål inkludert normale saltoppløsninger, fortrinnsvis med et proteinfortynningsmiddel, slik som kvegserumalbumin for å hindre adsorpsjonstap til glassapparatur ved disse lave konsentrasjoner. Peptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er generelt aktive i et område på over ca. 1 yg/kg legemesvekt, mens de foretrukne peptider er aktive fra ca. 10 pg/kg. For behandling av DiGeorge syndrom kan peptidene administreres i en mengde på fra ca. 1 til ca. 100 yg/kg legemesvekt. Det samme område for doseringsmengder kan generelt anvendes ved behandling av de andre nevnte tilstand-er eller sykdommer. Selvom det ovenfor angitte er i forbindelse med parenteral administrasjon, skal det forstås at oral administrasjon også er mulig i doseringsområder generelt omkring 100-1000 ganger større enn de for injeksjon. Andre velkjente administrasjonsveier, f.eks. sublingualt, rektalt, nasalt, osv. kan også benyttes.

For å fremstille farmasøytiske preparater blir peptidet med formel (I) eller et syreaddisjonssalt derav kombinert som aktiv bestanddel i intim blanding med en farmasøytisk bærer ifølge konvensjonell farmasøytisk blandeteknikk. Bæreren kan ha mange former avhengig av den preparatform som er ønsket for administrasjon, f.eks. sublingual, rektal, nasal, oral eller parenteral. Ved fremstilling av preparatene i oraldoseringsform kan et hvilket som helst av de vanlige farmasøytiske media anvendes, slik som f.eks. vann, glykoler, oljer, alkoholer, smaksstoffer, preservativer, fargestoffer og lignende, i tilfelle for orale væskeformige preparater slik som f.eks. suspensjoner, eliksirer og opp-løsninger; eller bærere slik som stivelser, sukkere, for-tynningsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemilder, disintegreringsmidler og lignende, i tilfelle for orale faste preparater, slik som f.eks. pulvere, kapsler og tabletter. På grunn av deres lette administrasjon representerer tabletter og kapsler den mest fordelaktige orale doserings-form hvorved faste farmasøytiske bærere anvendes. Om ønsket, kan tablettene være sukkerbelagte eller enterisk belagte ved hjelp av standard teknikker. For parenteral administrasjon vil bæreren vanligvis omfatte sterilt vann, skjønt andre bestanddeler som kan hjelpe oppløseligheten eller for preserverende formål kan inkluderes. Injiserbare suspensjoner kan også fremstilles hvorved passende væskeformige bærere, suspensjonsmidler og lignende kan anvendes. De parenterale farmasøytiske preparater bør være tilpasset til å admini-strere de aktuelle peptider i en mengde på fra ca. 10 pg/kg til ca. 100 ng/kg legemesvekt. De orale preparater bør kunne administere ca. 100-1000 ganger dosen for parenteral administrasjon, dvs. fra 1 ng/kg til 100 ug/kg legemsvekt.

De parenterale preparatene bør følgelig pr. doseringsenhet inneholde fra 500 pg til 5 yg, mens derimot de orale preparater pr. doseringsenhet bør inneholde fra 50 ng til 5 mg av det aktuelle peptid.

Mange av de nye peptidene ble tilveiebrakt under anvendelse av metoder i likhet'med de som er beskrevet av Merrifield i Journal of American Chemical Society, 85, sidene 2149-2154, 1963. Syntesen omfatter trinnvis tilsetning av beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede som er bundet ved hjelp av kovalente bindinger til en fast harpiks-partikkel. Ved denne metode blir reagenser og biprodukter fjernet ved filtrering og rensingen av mellomprodukter eli-mineres. Denne metode avhenger generelt av festing av den C-terminale aminosyre i kjeden til en fast polymer ved en kovalent binding og addisjon av de påfølgende aminosyrer,

en av gangen på en trinnvis måte inntil den ønskede sekvens er sammensatt. Til slutt fjernes peptidet fra den faste bæreren og beskyttende grupper fjernes. Denne metoden gir en voksende peptidkjede festet til en fullstendig uoppløse-lig fast partikkel slik at den befinner seg i en hensiktsmessig form som kan filtreres og vaskes fri for reagenser og biprodukter.

Aminosyrene kan festes til en hvilken som helst egnet bærer som kun må være lett separerbar fra de uomsatte reagenser. Polymeren kan være uoppløselig i de benyttede opp-løsningsmidler eller kan være oppløselig i bestemte oppløs-ningsmidler og uoppløselig i andre. Polymeren bør ha en stabil fysisk form som tillater hurtig filtrering. Den må inneholde en funksjonell gruppe til hvilken den første beskyttede aminosyre kan bindes sterkt ved hjelp av en kovalent binding. Forskjellige uoppløselige polymerer egnet for dette formål er f.eks. cellulose, polyvinylalkohol, polymetakrylat og sulfonert polystyren, men i foreliggende fremgangsmåte ble det benyttet en klormetylert kopolymer av styren og divinyl-behzen. Polymerer som er oppløselige i organiske oppløs-ningsmidler mens de er uoppløselige i vandige oppløsnings-midler, kan også anvendes. En slik polymer er polyetylen/ glykol med en molekylvekt på omkring 20 000, som er oppløse-lig i metylenklorid, men uoppløselig i vann. Bruken av denne polymer i peptidsyntese er beskrevet av F. Bayer og M. Mutter i Nature, 237, 512 (1972) og referanser deri.

De forskjellige funksjonelle grupper på aminosyren som var aktive, men som ikke skulle inngå i reaksjonene, ble beskyttet ved hjelp av konvensjonelle beskyttende grupper som benyttet innen polypeptidteknikken, gjennom hele reaksjonen. Den funksjonelle gruppen på lysin ble således beskyttet ved hjelp av beskyttende grupper som fjernes ved fullendelse av sekvensen uten skadelig innvirkning på polypeptid-sluttprodukt-et. I syntesen ble ninhydrin benyttet for å bestemme om kobling var fullstendig. Dersom fullstendig kobling ikke ble indikert, ble koblingen gjentatt med den samme beskyttede aminosyren før fjerning av den beskyttende gruppe.

Den C-terminale aminosyre kan festes til polymeren

på en rekke forskjellige velkjente måter. Oversikt over metode for festing til halogenmetylharpikser er gitt i Horiki, et al., Chem. Letters, sidene 165-168 (1978) og Gisin,

Heiv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973), og deri angitte referanser. Dersom et C-terminal amid skal fremstilles, kan en av to

veier anvendes. Enten kan peptidharpiksen fremstilt ifølge Merrifield-teknikken spaltes fra harpiksen under anvendelse

av vannfri ammoniakk, eller en benzhydrylaminharpiks kan anvendes. Spalting fra denne sistnevnte harpiks med hydrogenfluorid gir det C-terminale amid-petid. Bruken av en benzhydrylaminharpiks er f.eks. omtalt i J. Rivier, et al.,

J. Med. Chem., 16, sidene 545-549 (1973).

Den generelle fremgangsmåte for fremstilling av C-terminale karboksylpeptider innebærer til å begynne med forestring av L-lysin, beskyttet på dens aminogrupper, til klormetylharpiksen ved CsHCO^-metoden omtalt i ovennevnte artikkel av Gisin. Den beskyttende gruppen på a-aminogruppen i lysin-aminosyren (f.eks. t-BOC, dvs. t-butyloksykarbonyl), ble deretter fjernet uten på påvirke andre beskyttende grupper.

Den koblede aminosyreharpiks ble deretter filtrert, vasket og nøytralisert. Den resulterende koblede aminosyreharpiks med den frie aminogruppen, ble deretter omsatt med en beskyttet L-glutamin, fortrinnsvis alfa-t-BOC-L-glutamin for å koble L-glutaminforbindelsen. Sekvensen av reaksjoner ble utført som følger:

I den ovenfor angitte reaksjonssekvens er en beskyttende gruppe på den reaktive sidekjeden på L-lysinfor-bindelsen som ikke påvirkes eller fjernes når den beskyttende gruppen på a-aminogruppen fjernes for å tillate videre reaksjon og ct-R2 er en beskyttende gruppe på a-aminogruppen.

I det ovenfor angitte pentapeptidharpiks-mellomprodukt er

R^ fortrinnsvis en beskyttende gruppe slik som 2-klorbenzyl-oksykarbonyl og R2 er t-butyloksykarbonyl. Harpiksen er en hvilken som helst av de ovennevnte harpikser som er nyttige i prosessen.

Etter at det siste mellomprodukt er fremstilt spaltes peptidharpiksen for å fjerne de beskyttende grupper R^ og R2 og harpiksen. De beskyttende grupper fjernes på konvensjonell måte, f.eks. ved behandling med vannfri hydrogenfluorid, og det resulterende peptide blir deretter innvunnet.

Som angitt ovenfor er det ved utførelse av prosessen nødvendig å beskytte eller blokkere aminogruppene for å kon-trollere reaksjonen og oppnå de ønskede produkter. Egnede aminobeskyttende grupper som kan anvendes inkluderer salt-dannelse for beskyttelse av sterkt basiske aminogrupper, eller uretan-beskyttende substituenter slik som benzyloksykarbonyl og t-butyloksykarbonyl. Det er foretrukket å benytte t-butyloksykarborj^l. (t-BOC) eller t-amyloksykarbonyl (AOC) for beskyttelse av a-aminogruppen i aminosyrene som gjennomgår reaksjon ved molekylets karboksylende, fordi de BOC og AOC-beskyttende grupper lett lar seg fjerne etter reaksjonen og før det etterfølgende trinn (hvori en slik a-aminogruppe selv gjennomgår reaksjon) ved relativ mild innvirkning av syrer (f.eks. trifluoreddiksyre), hvilken behandling ellers ikke påvirker grupper som er benyttet for å beskytte andre reaktive sidekjeder. Det skal således forstås at a-aminogruppene kan beskyttes ved omsetning med et hvilket som helst .materiale som vil beskytte aminogruppene for den etterfølg-ende reaksjon(-er), men som senere kan fjernes under betingelser som ellers ikke vil påvirke molekylet. Illustrerende for slike materialer er organiske karboksyl- eller karbonsyre-derivater som vil acylere aminogruppen.

Generelt kan en hvilken som helst av aminogruppene beskyttes ved omsetning med en forbindelse inneholdende en gruppe med formelen:

hvor R 3 er en hvilken som helst gruppe som vil beskytte aminogruppen fra å inngå i etterfølgende koblingsreaksjoner og som kan fjernes uten å ødelegge molekylet. er således en rett eller forgrenet alkylgruppe som kan være umettet, fortrinnsvis 1-10 karbonatomer og fortrinnsvis halogen- eller cyan-substituert, aryl, fortrinnsvis 6-14 karboner, cyklo-alkyl, fortrinnsvis 5-8 karbonatomer; aralkyl, fortrinnsvis 7-18 karbonatomer, alkaryl, fortrinnsvis 7-18 karbonatomer, eller heterocykliske grupper f.eks. isonikotinyl. Aryl-aralkyl- og alkarylgruppene kan også være ytterligere substituert slik som en eller flere alkylgrupper med 1-4 karbonatomer. Foretrukne grupper for R^ er t-butyl, t-amyl,

fenyl, tolyl, xylyl og benzyl. Meget foretrukne spesifikke aminobeskyttende grupper er benzyloksykarbonyl; substituert benzyloksykarbonyl hvor fenylringen er substituert med en eller flere halogener, f.eks. Cl eller Br, nitro, lavere-alkoksy f.eks. metoksy, eller lavere-alkyl; t-butyloksykarbonyl, t-amyloksykarbonyl; cykloheksyloksykarbonyl; vinyloksykarbonyl; adamantyloksykarbonyl; bifenylisopropoksykarbonyl; og lignende.

Andre beskyttende grupper som kan anvendes er isonikotinyl-oksykarbonyl, ftaloyl, p_-tolylsulfonyl, formyl og lignende.

Ved utførelse av foreliggende fremgangsmåte bygges peptidet opp ved omsetning av den frie a-aminogruppen med en forbindelse som har beskyttede aminogrupper. For reaksjon eller kobling blir forbindelsen som tilfestes aktivert ved sin karboksylgruppe slik at karboksylgruppen kan reagere med den frie a-aminogruppen på den tilfestede peptidkjeden. For å oppnå aktivering kan karboksylgruppen omdannes til en hvilken som helst reaktiv gruppe slik som en ester, anhydrid, azid, syreklorid eller lignende. En passende koblingsreagens kan alternativt tilsettes iløpet av reaksjonen. Egnede koblingsreagenser er beskrevet f.eks. i Bodanszky, et al. - Peptide Synthesis, Interscience, annen utgave, 19 76, kapittel fire, inkludert karbodiimider (f.eks. dicykloheksylkarbodiimid), karbonyldiimidizol og lignende.

Det skal også forstås at iløpet av disse reaksjoner inneholder aminosyre-delene både aminogrupper og karboksyl-grupper og vanligvis deltar en gruppe i reaksjonen mens den andre er beskyttet. Før koblingstrinnet blir den beskyttende gruppe på a-aminogruppen eller terminale aminogruppe i det tilfestede peptid, fjernet under betingelser som ikke vesent-lig vil påvirke andre beskyttende grupper, f.eks. gruppen på epsilon-aminodelen i lysinmolekylet. Den foretrukne metode for utførelse av dette trinn er mild acidolyse,

som ved reaksjon ved romtemperatur med trifluoreddiksyre.

Den ovenfor omtalte serie av prosesstrinn resul-

terer i fremstilling av det spesifikke peptid med følgende formel:

Fremstilling av de tilsvarende sarcosin-holdige peptider kan oppnås ved hjelp av samme sekvens av reaksjoner som angitt ovenfor, hvorved beskyttet sarcosin tilsettes ved den passende del (-er) i fremgangsmåten. På denne måte kan peptider med følgende formler fremstilles: H-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-OH og H-GLN-LYS-SAR-OH. Peptider med formel (I) hvor A er deamino-GLN kan fremstilles ved å benytte beskyttet deamino-GLN isteden for GLN i de ovenfor beskrevne metoder.' Man kan dermed fremstille deamino-GLN-LYS-OH, og deamino-GLN-LYS-SAR-OH.

Peptider med formel (I) hvori B er LYS-NH2 eller LYS-SAR-NH2 kan fremstilles ved hjelp av den ovenfor beskrevne metode, men ved å erstatte klormetylharpiksen som benyttes deri med en benzhydrylaminharpiks. På denne måte kan C-terminal-amidpeptider tilsvarende de ovenfor beskrevne C-terminal-karboksypeptider fremstilles. En alternativ metode for fremstilling av disse peptidamider er å spalte klormetylharpiksene under anvendelse av ammoniakk.

Mens fastfase-teknikken ifølge Merrifield har blitt benyttet for å fremstille de aktuelle polypeptider, er det klart at klassiske teknikker som f.eks. er beskrevet i den ovenfor nevnte Bodanszky, et al., tekst, også kan anvendes. Som et eksempel på denne metode ble deamino-GLN-LYS-OH fremstilt under anvendelse av oppløsningsteknikker som vist i eksempel IX nedenfor.

Forbindelsene med formel (I) hvori B er dekarboksy-

LYS eller

fremstilles ikke lett ved hjelp av fastfase-teknikker ifølge Merrifield på grunn av mangélen av en karboksylgruppe til å koble GLN-aminosyrederivatet til harpiksen. Disse forbindelser fremstilles hensiktsmessig som følger: Forbindelse med formel (I) hvori B er dekarboksy-LYS kan fremstilles ved å omsette 1,5-diaminopentan med en aktiv ester av den passende beskyttede A-gruppe (f.eks. a-aminobeskyttet L-glutamin-aktiv ester) fulgt av fjerning av de beskyttende grupper og rensing. Fremstillingen av aktive estere av aminosyrer er velkjent innen peptidsyntese-teknikken. Forbindelsen med formel (I) hvor B er

kan fremstilles ved å omsette passende beskyttet utgangs-materiale med formel ( ) med en passende beskyttet A-gruppe (f.eks. a-aminobeskyttet L-glutamin-aktiv ester), fulgt av fjerning av beskyttende grupper og rensning. Denne reak-

sjon illustreres som følger:

hvor og R^ er (f.eks.) benzyloksykarbonyl, R4 er (f.eks.) benzyl, og R2 er en aktiv estergruppe slik som (f.eks.) p_-nitrof enyl eller p_-nitrotiof enyl.

Identiteten, renheten og sekvensen hos de aktuelle peptider ble bestemt ved hjelp av velkjente teknikker slik som tynnsjiktskromatografi, elektroforese, aminsyreanalyse, kjernemagnetisk resonansspektroskopi, elementanalyse, infra-rød spektroskopi og lignende.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen, og delan-givelser er ved vekt med mindre annet er angitt.

Eksempel I

Ved fremstilling av et nytt peptid ble følgende materialer oppnådd kommersielt.

Alfa-BOC-L-glutamin

Alfa-BOC-e-benzyloksykarbonyl-L-lysin

Disse reagenser er BOC t-butyloksykarbonyl. Reagenser av "sekvenal"-kvalitet for aminosyresekvensbestemmelse, dicykloheksylkarbodiimid (DCC), ninhydrin og harpiksen ble oppnådd kommersielt. Den benyttede harpiks var en benzhydrylaminharpiks med en kapasitet på 0,5 meq/g harpiks.

Ved fremstilling av peptidet ble a-BOC-e-benzyloksykarbonyl-L-lysin koblet med benzhydrylaminharpiksen under anvendelse av DCC som koblingsreagens. Den resulterende beskyttende aminosyreharpiks inneholdt 0,4-0,5 mmol aminosyre pr. gram harpiks. Under anvendelse av Schwarz/Mann Automatic Peptide Synthesizer ble følgende program benyttet for å koble hver BOC-beskyttede aminosyre til BOC-aminosyreharpiksen: 1. Forvasking med 40% trifluoreddiksyre (TFA) i CH2CL2, en gang, 1,5 minutter.

2. Fjerning av beskyttelse med 40% TFA i CH2C12,

en gang, 20 minutter.

3. Vasking med CHC13, en gang, 1,5 minutter.

4. Vasking med EtOH, en gang, 1,5 minutter.

5. Vasking med CH2C12, to ganger, 1,5 minutter.

6. Forvasking med 10% Et^N i CH2Cl2, en gang,

1,5 minutter.

7. Nøytralisering med 10% Et3N i CH2C12, en gang,

10 minutter.

8. Vasking med CH2C12, tre ganger, 1,5 minutter.

9. Tilsetning av BOC-beskyttet aminosyre (5 molar overskudd) i dimetylformamid (DMF) og CH2C12

(1:9 vol/vol).

10. Tilsetning av DCC i CH2C12 (0,5M, 5 molar overskudd) , reaksjonstiden var opp til 2 timer. 11. Vasking med CH2C12, to ganger, 1,5 minutter.

Deretter ble a-BOC-aminosyrene likeledes koblet til den avbeskyttede a-aminogruppe i peptidharpiksen i den korrekte sekvens for å resultere i et nytt peptid under anvendelse av ekvivalente mengder dicykloheksylkarbodiimid. Etter hver koblingsreaksjon ble en aliquot av harpiksen testet med ninhydrin og dersom et positivt resultat ble funnet, ble kobling ansett for å være ufullstendig og ble gjentatt med den samme beskyttede aminosyren. Som resultat av en enkel koblingsreaksjon under anvendelse av a-BOC-L-glutamin, ble følgende peptidharpiks oppnådd:

hvor BOC er butyloksykarbonyl CBZ er benzyloksykarbonyl.

Denne peptidharpiks ble spaltet og de beskyttende grupper fjernet i et "Kel-F"-spaltningsapparat under anvendelse av 10 ml vanfritt hydrogenfluorid pr. gram harpiks ved 0°C i 60 minutter med 5 ml anisol pr. gram peptid-harpiks som rensemiddel. Etter inndampning i vakuum til tørrhet, ble resten vasket med vannfri eter. Det urene peptid ble oppløst i 10% vandig eddiksyre og filtrert. Harpiksen ble vasket med 10% vandig eddiksyre og de kombinerte filtrater ble opp-samlet og lyofilisert for oppnåelse av urent peptid. Det urene peptid ble renset ved motstrømsfordeling under anvendelse av n-butanol:eddiksyre:vann (4:1:5) som skillefase for oppnåelse av det rene peptid. Det resulterende peptid har følgende sekvens:

For identifikasjon ble tynnsjiktskromatografi og elektroforese benyttet. Aminosyresammensetningen ble bestemt under anvendelse av en aminosyre-analyseringsinnretning.

Tynnsjiktskromatografi ble foretatt på 20 yg prøver på silisiumdioksydgel (kieselgel, 5x20 cm) under anvendelse av 1:1:1:1 n-butanol:eddiksyre:etylacetat:vann som oppløs-ningsmiddelsystem (R^"*") og på cellulose "6064" ("Eastman" 20 x 20 cm) under anvendelse av 15:10:3:13 n-butanol:pyridin: eddiksyre:vann som oppløsningsmiddelsystem (R^ 2 ), Rf 1~ verdiene i forhold til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH var Rj 1 = 1,16 og R^ 2= 0,57. Ninhydrin ble benyttet som spray-reagens.

Elektroforese ble foretatt på en 100 yg prøve på Whitman nr. 3 papir (5,7 x 55 cm) under anvendelse av pH 5,6 pyridinacetatbuffer ved en spenning på 1000 V i 1,0 time. Pentapeptidet hadde en mobilitet på 2,21 mot katoden i forhold til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH. Ninhydrin og Pauly-sprayreagenser ble benyttet.

Eksempel II

For å bestemme aktiviteten og egenskapene til peptidet i eksempel I ble det foretatt bestemmelser på friske 5-6 uker gamle nu/nu-mus av begge kjønn, idet musene var opprettet på en BALB/c bakgrunn (thymocyter som uttrykker Thy-1,2 overflate-antigen) og holdt under konvensjonelle forhold. For antisera ble anti-Thy-1,2 sera fremstilt i Thy-1 kongeniske mus.

For induksjon in vitro av Thy-1<+> T-celler eller CR<+ >B-celledifferensiering, ble induksjonen av thymocyt-differensiering fra prothymocyter in vitro foretatt ifølge Komuro og Boyse, (Lancet, 1, 740,1973) under anvendelse av ervervelsen av Thy-1,2 som markør for T-celledifferensiering. Induksjonen av CR+ B-celledifferensiering fra CR B-celleforløp-ere in vitro ble foretatt under lignende betingelser under anvendelse som prøvekriterium av kapasiteten til CR<+> B-celler til å binde saue-erythrocyter belagt med subagglutinerende mengder av kanin-antistoff og ikke-lytisk komplement. Milt-celle-polulasjoner fra friske nu/nu mus fraksjonert på diskontinuerlige kvegserum-albumingradienter ble benyttet som en kilde for begge forløpertyper (Thy-1 og CR ) fordi de hadde få eller ingen Thy-1+ celler og lave antall av CR+ celier.

Som et resultat av denne bestemmelse ble det funnet

at peptidet viste en selektivitet av virkninger i likhet med den til ubiquitin når det gjaldt å indusere differensieringen av Thy-1<+> T-lymfocyter og av komplement-reseptorer (CR+) B-lumfocyter i konsentrasjoner varierende fra 10 ng/ml til

10 yg/ml.

Eksempler III- VII

Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel I, men ved anvendelse av beskyttet sarcosin (f.eks. a-BOC-sarcosin)

ved passende trinn, fremstilles følgende:

Sekvensen av disse peptider ble bestemt ved hjelp av en aminosyre-analysator. Tynnsjikstkromatografi og elektroforese under de samme betingelser som i eksempel I ga følg-ende informasjon:

Alle Rf- og elektroforeseverdier er i forhold til referansepeptidet H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH.

Eksempel VIII

Ved å benytte fremgangsmåten i eksempel II, ble forbindelsene i eksemplene III-VII bedømt med hensyn til deres evne til å indusere differensiering av Thy-1<+> T-lymfocyter og CR<+> B-lymfocyter. Aktivitetsområdene er som følger:

Eksempel IX

Til en suspensjon av N -benzyloksykarbonyl-L-lysin (20,0 g; 0,0713 M) pyridin (400 ml), ble det ved 0°C i en N2-atmosfære tilsatt metyl-4-(klorformyl)-butyrat (12,9 g, 0,0785 M) under kraftig omrøring. Blandingen ble omrørt i 1,5 timer ved 0°C og 0,5 time ved 23°C. Pyridinet ble fjernet ved redusert trykk og dette ga en uren gul olje (38 g) som ble kromatografert på "SilicAR CC-7" (600 g). Eluering med 1-3 % MeOH/CHCl3 ga en lysegul olje (30,6 g) som ble rekromatografert på "SilicAR CC-7" (900 g). Eluering med 1-3% MeOH/CHCl3 ga en klar fargeløs olje

(24,3 g). Dette materiale ble omkrystallisert to ganger fra 2:1 EtOAc/heksan og dette ga et hvitt fast stoff, smp. 64-66°C, som er deamino-GLU-OMe-Ne<->benzyloksykarbonyl-LYS.

Til en oppløsning av dette hvite faste stoff (5,0 g, 0,018 M) i MeOH (200 ml) ble tilsatt Pd/C 10% (500 mg). Blandingen ble hydrogenert ved 2,8 kg/cm 2 i 4 timer, filtrert og oppløsningsmidlet fjernet ved redusert trykk og dette ga et hvitt fast stoff (3,6 g) som ble omkrystallisert fra 10:1 MeOH:Et20 til et hvitt fast stoff, smp. 203-204°C, som er deamino-GLU-OMe-LYS.

Dette produkt (200 mg, 0,00073 M) ble oppløst i kon-sentrert NH4OH (58%, 10 ml) og blandingen omrørt i 16 timer ved 23°C. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved redusert trykk og dette ga et hvitt fast stoff (190 mg) som ble omkrystallisert fra 10:4:1 MeOH:Et20:H20 til deamino-GLN-LYS som et hvitt fast stoff (100 mg), smp. 235°C (dekomp.); nmr (D20)6,

1,75 (m, 8H, metylen H), 2,43

C=0 strekking, amid I bånd), 1541 cm<-1> (-C-NH, C=0 strekking, amid II bånd); 0

M.S. (undersøkelse): m/e 259 (hoved-topp).

Analyse:

Beregnet for c1iH2iN3°4: C 50,95; H 8,16; N 16,20

Funnet: C 51,10; H 8,28; N 15,96 Eksempler X- XI

Ved å benytte fremgangsmåten i eksemplene I og III, men ved å erstatte den deri benyttede L-glutamin med en ekvivalent mengde deamino-glutamin, ble følgende fremstilt:

Eksempel XII

Ved å benytte fremgangsmåten i eksemplene I, III-VII og X-XI, men ved å erstatte benzhydrylaminharpiksen som benyttet deri med en polystyren-divinylbenzenharpiks inneholdende 1% divinylbenzen og 0,75 mM klorid pr. gram harpiks, fremstilles C-terminal-karboksylpeptidene tilsvarende C-terminal-amidpeptidene fremstilt i referanseeksemplet.

Peptidene fremstilt i eksemplene X-XII har biologisk aktivitet som angitt i eksempel II.

Claims (4)

1. Analogifremgangsmåte til fremstilling av et peptid med ubiquitin-lignende aktivitet og med formelen: hvor A er deamino-GLN, GLN eller (SAR)n~GLN, n er et helt tall 1-4, og B er LYS-OH, LYS-NH , dekarboksy-LYS, LYS-SAR-OH eller LYS-SAR-NH2, og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at man a) binder en B-aminosyre som er beskyttet på sin a-aminogruppe, til en polymerharpiks ved kovalent binding, idet polymeren inneholder en fuksjonell gruppe hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes sterkt ved nevnte kovalente binding, b) fjerner den a-amino-beskyttende gruppe fra B-aminosyre-delen, c) reagerer med en A-aminosyre som er beskyttet på sin a-aminogruppe, dersom en slik er tilstede, og på sin e-aminogruppe, for å koble den sistnevnte med B-aminosyreharpiksen, d) og, i de tilfeller hvor A-gruppen inkluderer en eller flere sarcosyl-deler, binder den passende sarcosin som er beskyttet på sin a-aminogruppe, til kjeden og fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra sarcosyl-delen, og gjentar denne metode når n er større enn 1, og e) i det tilfelle hvor B-grupper inkluderer en sarcosyldel, binder sarcosinforbindelsen, som er beskyttet på sin a-aminogruppe, til harpiksen før trinn a), fjerner den a-aminobeskyttende gruppe derfra og deretter binder resten av B-gruppen til SAR-harpiksen; og f) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra det resulterende peptid med passende reagenser og, om ønsket, fremstiller farmasøytisk akseptable salter av produktet.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, til fremstilling av et peptid med formelen: karakterisert ved at man anvender en LYS-aminosyre i trinn a) og en GLN-aminosyre i trinn c), og at det som harpiks anvendes en benzhydrylaminharpiks.

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, til fremstilling av et peptid med formelen H-SAR-GLN-LYS-NH2, et peptid med formelen H-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2, et peptid med formelen H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2, et peptid med formelen H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2, karakterisert ved at man utfører trinn d) et passende antall ganger før man fjerner harpiksen og alle de beskyttende grupper fra peptidet.

4. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, til fremstilling av et peptid med formelen deamino-GLN-LYS-OH, karakterisert ved at man anvender en LYS-aminosyre i trinn a) og en deamino-GLN i trinn c).