SE446867B - Sett att framstella en polypeptid med formaga att inducera differentiering av t-lymfocyter men inte av komplementreceptor (cr?72+) b-lymfocyter - Google Patents

Description

446 867 att tymus således deltar i kroppens immunfunktioner. Tymus är känt för att vara ett organ, bestående av epitelstroma, härstam- mande från tredje grenbâgen, och lymfocyter, härstammande från stamceller, som har sitt ursprung i hemopoes-vävnader, Goldstein et al, "The Human Thymus", Heinemann, London, 1969. Lymfocyter urskiljes inom tymus och lämnar denna som mogna tymus-avledda cel- ler, kallade T-celler, vilka cirkulerar till blodet, lymfkörteln, mjälten och lymfknutarna. Framkallandet av stamcellutveckling in- om tymus förefaller förmedlas av avsöndring av epitelcellerna hos tymus men svårigheter med bioförsök har tidigare förhindrat en fullständig isolering och strukturbestämning av eventuellt befint- liga hormoner.

För att underlätta förståendet av vikten av de biologiska urskilj- ningskännetecknen hos polypeptiderna enligt föreliggande uppfin- ning måste det påpekas att funktionen hos tymus beträffande immu- nitet generellt kan beskrivas som produktion av tymus-härledda cel- ler, eller lymfocyter, vilka kallas T-celler. T-celler utgör en stor del av totalt recirkulerande små lymfocyter. T-celler uppvisar immunologisk specifitet och är direkt inbegripna i av celler för- medlat immungensvar (såsom homograft-gensvar) som effektorceller.

T-celler utsöndrar emellertid inte kroppsvätskeantikroppar, efter- som dessa antikroppar utsöndras av celler, härrörande direkt från benmärgen oberoende av tymusinverkan och dessa sistnämnda celler kallas B-celler. För många antigener erfordrar B-celler emellertid närvaro av lämpligt reaktiva T-celler, innan de kan alstra anti- kroppar. Mekanismen för denna process av samverkande celler har man ännu inte helt klart för sig.

Utgående från denna förklaring kan man beträffande funktionen sä- ga att tymus är nödvändig för utvecklingen av cellimmunitet och många kroppsvätske-antikroppsgensvar och påverkar dessa system ge- nom att inom tymus framkalla differentieringen av hemopoes-stam- celler till T-celler. Denna framkallningspâverkan förmedlas av ut- söndring av epitelceller hos tymus, dvs tymushormoner.

Det bör vidare påpekas - för förståelse av tymusfunktionen och cellsystemet hos lymfocyter samt cirkulationen av lymfocyter i kroppen - att stamcellerna bildas i benmärgen och kommer till tymus med blodströmmen. Inom tymus differentieras stamcellerna till im- 446 867 munologiskt kompetenta T-celler, vilka migrerar till blodströmmen och tillsammans med B-celler cirkulerar mellan vävnaderna, lym- ferna och blodströmmen.

Cellerna i kroppen, som utsöndrar antikroppar, utvecklas även från hemopoes-stamceller men deras differentiering bestämmes inte av tymus. De kallas därför benmärgs-avledda celler eller B-celler.

Hos fåglar differentieras de i ett organ, liknande tymus, som kal- las Fabricius-säck ("Bursa of Fabricius"). Hos däggdjur har inget ekvivalent organ upptäckts och man förmodar att B-celler avledes inom benmärgen. De fysiologiska substanser som dikterar denna av- ledning är fortfarande helt okända.

Det har under en tid varit känt att tymus har något samband med kroppens immunreaktioner och det föreligger därför stort intresse för substanser, som har isolerats från tymus. I detta sammanhang har det under senare år publicerats ett stort antal artiklar, ba- serade pá vetenskapligt arbete med material, som förekommer i nöt- kreaturs-tymus. Vi har i själva verket själva publicerat ett antal artiklar, som hänför sig till forskning på detta område. Hithöran- de artiklar kan exempelvis återfinnas i The Lancet, 20 juli 1968, sid. 119-122; Triangle, volym 11, nr. 1, sid. 7-14, 1972; Annals of the New York Academy of Sciences, volym 183, sid. 230-240, 1971; Clinical and Experimental Immunology, volym 4, nr. 2, sid. 181-189, 1967; Nature, volym 247, sid. 11-14, 1974; Proceedings of Uæ National Academy of Sciences, USA, volym 71, sid. 1474-1478, 1974; Cell, volym 5, sid. 361-365 och sid. 367-370, 1975 och Lancet, vo- lym 2, sid. 256-259, 1975.

I en artikel av Goldstein och Manganaro i Annals of the New York Academy of Sciences, volym 183, sid. 230-240, 1971, återfinnas avslöjanden beträffande närvaron av en tymus-polypeptid, som för- orsakar en myastenisk neuromuskulär blockering hos djur, vilken är analog med sjukdomen myastenia gravis hos människor. I denna ar- tikel beskrives vidare upptäckten aüztvå skilda effekter förorsa- kades av separata polypeptider i nötkreaturstymus. En av dessa polypeptider, kallad tymotoxin, förmodades förorsaka myositis men det pâpekades vidare, att denna polypeptid inte hade isolerats även om den förefaller vara en polypeptid med molekylvikt ca 7000, upp- visande en stark positiv nettoladdning och kvarhölls på CM-Sephadex vid pH 8,0. 446 867 _ 4 I publikationen "Nature", 247, 11, 4 januari 1975, beskrives pro- dukter, identifierade som Thymin I och Thymin II, vilka befanns va- ra nya polypeptider, isolerade från nötkreaturtymus, med speciell användning inom olika terapeutiska områden. På grund av användnin- gen av likartade namn för andra produkter, som isolerats från ty- mus tidigare, benämnes dessa Thyminlë och Thymin II-produkter nume- ra Thymipoietin I och Thymopoietin II. Dessa produkter och proces- ser beskrives i amerikanska patentansökningen 606 843, som utgör en continuation-in-part från patentansökan 429 202.

I amerikanska patentet 4 002 602, som är en continuation-in-part från amerikanska patentansökningen 449 686, beskrives långkedjiga polypeptideršom Ubiquitous Immunopoietic Polypeptides (UBIP), vil- ken polypeptid är en 74-aminosyrapolypeptid, kännetecknad av sin förmåga att in vitro i nanogram-koncentrationer framkalla urskilj- ning av både T-cell- och B-cell-immunocyter från prekursorer, före- liggande i benmärg eller mjälte. Polypeptiden är således användbar inom terapeutiska områden, inkluderande tymus- eller immunitets- brister och liknande. I amerikanska patentet 4 002 740 beskrives syntetiserade tridekapeptidkompositioner, vilka har förmåga att åstadkomma urskiljning av T-lymfocyter men inte av komplementrecep- torn B-lymfocyter. Denna polypeptid uppvisar således många av kän- netecknen på långkedjiga polypeptider, som isolerats och benämnts tymopoietin i ovan nämnda amerikanska patentansökan 606 843.

Föreliggande uppfinning ställer till förfogande en syntetiserad 5- -aminosyra-polypeptid med ett klart fastställt läge för en aktiv sekvens, vilken polypeptid har befunnits uppvisa många av känne- tecknen hos den långkedjiga polypeptiden, som isolerats och benämnts tymopoietin i ovan nämnda publikationer, inklusive amerikanska pa- tentansökningen 606 843, och hos tridekapeptiden, som beskrivits i amerikanska patentet 4 002 740.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser följaktligen åstadkommande av nya polypeptider, vilka uppvisar viktiga biologiska egenskaper genom att de i nanogram-koncentrationer uppvisar förmåga att framkalla utveckling av benmärgsceller till T-celler och således ger upphov till tymus-avledda lymfocyter och därigenom är i hög grad använd- bara inom immunitetssystemet hos människor och djur. 446 867 För lösande av ovan nämnda problem och åstadkommande av nämnda fördelar föreslås enligt föreliggande uppfinning nya polypepti- der, vilka uppvisar följande sekvens som aktiv del: -ARG~LYS-ASP-VAL-TYR-.

De nya peptid-hartsmellanprodukterna, som bildas vid framställnin- gen av polypeptiderna enligt uppfinningen, uppvisar följande sek- vens: 1.11 Ifz 1.23 34 U-Rs-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-harts.

I formeln ovan betecknar R1, R2, R3, R4 och R5 skyddande grupper hos aminosyrorna i den mån sådana grupper är nödvändiga och hartset är en fast polymer, som verkar som reaktionshjälpmedel.

Inom uppfinningens ram faller även framställningssätt för polypep- tiderna enligt uppfinningen medelst peptidsyntes i fast fas.

De nya pentapeptiderna enligt uppfinningen, vilka innehåller ovan angivna sekvens son1aktiv del, kan beskrivas medelst följande allmän- na formel: R-ARG-LYS~ASP-VAL-TYR-R' II varvid R och R' är substituenter hos pentapeptidsekvensen, som inte i nämnvärd grad påverkar den grundläggande aktiva sekvensens bio- logiska verkan. Härmed skall förstås att de avslutande aminosyror- na hos denna pentapeptidkedja kan vara modifierade utan att man faller utanför uppfinningens ram genom att funktionella grupper el- ler derivat (R och R') anbringas i anslutning till dessa aminosy- ror i ändläge, vilka grupper resp. derivat inte nämnvärt påverkar molekylens biologiska aktivitet. Det skall alltså understrykas att de i ändläge befintliga aminogrupperna och karbonsyragrupperna in- te är väsentliga för den biologiska aktiviteten hos pentapeptiden såsom hos vissa polypeptider. Inom uppfinningens ram faller såle- des sådana pentapeptider, vilka är osubstituerade i ändläge och så- dana vilka är substituerade i ändläge med en eller flera funktio- nella grupper, som inte nämnvärt pâverkar den beskrivna biologiska aktiviteten.

Av det ovan sagda skall förstås att dessa funktionella grupper in- nefattar sâdan normal substitution som acylering av den fria amino- '446 867 - 6 gruppen och amidering av den fria karboxylsyragruppen liksom sub- stitution med ytterligare aminosyror och polypeptider. I detta av- seende förefaller pentapeptiderna enligt uppfinningen vara unika, eftersom pentapeptiderna uppvisar samma biologiska aktivitet som långkedjiga naturliga peptider, hos vilka denna pentapeptidsekvens utgör en del eller i vilka peptider den ingår. Man kan således för- moda att aktivitetsförutsättningarna hos molekylen alstras genom stereoisometri hos molekylen, dvs genom den speciella "vikningen" av molekylen. I detta avseende skall påpekas att polypeptidbindnin- gar inte är styva utan flexibla och kan föreligga som band, spira- ler och liknande. Som resultat blir hela molekylen flexibel och kom- mer att "vikas" på ett visst sätt. Enligt föreliggande uppfinning har man upptäckt att pentapeptiden är "vikt" på samma sätt som den långkedjiga naturliga polypeptiden och därför uppvisar samma bio- logiska egenskaper. Av denna orsak kan pentapeptiden substitueras med olika funktionella grupper så länge substituenterna inte nämn- värt påverkar den biologiska aktiviteten eller inkräktar på den na- turliga "vikningen" hos molekylen.

Molekylens förmåga att bibehålla sin biologiska aktivitet och na- turliga vikning belyses klart av det faktum, att pentapentidsekeven- sen enligt föreliggande uppfinning uppvisar samma biologiska karak- teristika som den naturliga peptiden, innehållande 49 aminosyror och beskriven under benämningen Thymopoietin i amerikanska patentansök- ningen 606 843 och i publikationen Nature, 247, 11, 1975. Dessutom uppvisar pentapeptidfragmentet eller sekvensen samma biologiska ka- rakteristika som den syntetiserade tridekapeptiden som beskrivits i Cell, volym 5, 367-370, augusti 1975 och i amerikanska patent- skriften 4 002 740. Hos båda dessa långkedjiga polypeptider kan pentapeptiden enligt föreliggande uppfinning identifieras inom mo- lekylen men endast i kombination med övriga däri beskrivna amino- syror. Dessa publikationer utgör emellertid ett direkt bevis för att pentapeptiden enligt föreliggande uppfinning är den aktiva de- len, eftersom de biologiska aktiviteterna är desamma och aminosyror- na och peptidkedjor, substituerade vid de i ändläge befintliga ami- nosyrorna, inte påverkar den biologiska effekten hos det grundläg- gande pentapeptidfragmentet.

På basis av det ovan sagda förstår man att R och R' i formeln II kan uppvisa varje substituent som inte i nämnvärd grad påverkar den 446 867 biologiska aktiviteten hos den grundläggande aktiva sekvensen.

Saledes kan, såsom belysande exempel, R och R' vara vilken som helst av följande substituenter: 13 R' väte OH C1-C7 alkyl NH2 C5-C12 aryl NHR7 C6-C20_alkaryl N(R7)2 C6-C20 aralkyl OR7 C1-C7 alkanoyl C2-C7 alkenyl C2-C7 alkinyl där R7 betecknar alkyl med 1-7 kolatomer, alkenyl med 2-7 kolato- mer, alkinyl med 2-7 kolatomer, aryl med 6-20 kolatomer eller alkaryl eller aralkyl med 6-20 kolatomer.

Såsom påpekats ovan kan R och R' emellertid även vara neutrala ëflßßïflfigflëïfifffllefrester av polypeptidkedjor med 1-20 kolatomer.

Följande kan nämnas såsom belysande exempel: 3 EL GLN VAL GLU GLN GLY LEU GLU~GLN TYR GLY-GLN VAL-GLN GLY-GLU VAL-LEU GLY-GLU-GLN VAL-TYR GLN-Lau GLN-TYR GLN-VAL LEU-TYR LEU-LEU TYR-Lau VAL-GLN-LEU VAL-GLN-Lau-TYR En speciell utföringsform av uppfinningen hänför sig till en ny pentapeptid med nämnda sekvens: R-ARG-Lys-ASP-VAL-TYR-R' 446 867 där R betecknar väte, alkyl med 1-7 kolatomer, t.ex. metyl eller etyl, vidare aryl med 5-12 kolatomer, t.ex. fenyl, eller alkanoyl med 1-7 kolatomer, t.ex. acetyl eller propionyl, och R' betecknar OH, NH2, NHR, N(R)2 eller klor. Speciellt föredragna polypeptider är sådana, där R betecknar väte och R' betecknar OH.

Inom uppfinningens ram faller även farmaceutiskt acceptabla salter av pentapeptiderna.

Som syror, vilka är lämpliga för saltbildning med pentapeptiden, kan nämnas oorganiska syror såsom klorvätesyra, bromvätesyra, per- klorsyra, salpetersyra, tiocyansyra, svavelsyra, fosforsyra etc, och organiska syror såsom myrsyra, ättiksyra, propionsyra, glykol- syra, mjölksyra, druvsyra, oxalsyra, malonsyra, bärnstenssyra, ma- leinsyra, fumarsyra, antranilsyra, kanelsyra, naftalensulfonsyra och sulfanylsyra.

Iïmfifllnämnda Stnfldlmër iåêntifieräáaminosyrakomponenterna hos peptider- na för enkelhetens skull med förkortningar. Dessa förkortningar är följande: Aminosyra Förkortad beteckning glycin GLY L-glutaminsyra GLU L-glutamin GLN L-arginin ARG L-lysin LYS L-asparaginsyra ASP L-valin VAL L-tyrosin TYR L-leucin LEU.

Polypeptidsekvensen, som utgör den aktiva delen enligt uppfinnin- gen, är en peptid med 5 aminosyror, som har befunnits uppvisa kän- netecknen liknande med en polypeptid med 49 aminosyror, som isole- rats från nötkreaturtymus enligt uppgifter i amerikanska patent- ansökningen 606 843. Peptiderna enligt föreliggande uppfinning kän- netecknas speciellt av sin förmåga att framkalla en selektiv ut- veckling av Thy-1+-T-celler (men inte CR+-B~celler) i koncentratio- ner av 1 ng - 10 pg/ml. Thy-1 är en utvecklings-alloantigen, som föreligger hos T-celler men inte hos B-celler, medan CR är en komp- n 446 867 lementreceptor som föreligger hos B-celler men inte hos T-celler.

Studier av dessa syntetiska peptider vid framkallningsförsök in vitro visade att de har samma framkallnings- dvs alstrings-specifi- tet som Thymopoietin II. Peptiderna inducerar med andra ord en ut- veckling av Thy-1_-celler till Thy-1+-T-celler men inducerar inte utveckling av CR--celler till CR+-celler. Även om många substanser har identififerats, vilka kan härma Thymopoietin in vitro och åstad- komma T-cell-utveckling genom åstadkommande av intracellulär cyk- lisk AMP, måste det poängteras att få substanser är aktiva i så lå- ga koncentrationer och att peptiderna enligt uppfinningen är selek- tiva med avseende på framkallande av T-cell-utveckling men inte med avseende på CR+-B-cell-utveckling. Dessa syntetiska peptider har även befunnits påverka neuromuskulär transmission på liknande sätt som Thymopoietin självt. Således påvisades 24 timmar efter en enda injektion av 10-100 pg per mus en klar neuromuskulär transmissions- förbättring, som kunde påvisas medelst elektromyografi.

På grund av dessa kännetecken hos polypeptiderna enligt uppfinnin- gen är de terapeutiskt användbara vid behandling av människor och djur, eftersom de förmår inducera utveckling av lymfopoes-stamcel- ler med ursprung i hemopoes-vävnader till tymus-härstammande celler eller T-celler, vilka förmår ingripa i kroppens immungensvar. Resul- tatet härav är att produkterna enligt föreliggande uppfinning har en mångsidig terapeutisk användning. Eftersom föreningarna förmår bringa ut vissa av de angivna funktionerna hos tymus, kan de i förs- ta hand användas inom olika tymusfunktionsområden och immunitets- områden. Ett första appliceringsområde är vid behandling av DiGeor- ge-syndrom, ett tillstånd vid vilket det föreligger en medfödd frånvaro av tymus. Injektion av polypeptiderna enligt uppfinningen råder bot på denna bristfällighet. Pâ grund av sina biologiska kän- netecken, vilka uppträder extremt tydligt vid låga koncentrationer, är föreningarna enligt uppfinningen användbara som medhjälp till kroppens totala immunförsvar genom att de ökar eller bidrar till en terapeutisk stimulering av cellimmuniteten och därigenom blir an- vändbara vid behandling av sjukdomar, inklusive kronisk infektion, in vivo såsom svamp- eller mykoplasmainfektnmær, tuberkulos, spetäls- ka, akuta och kroniska virusinfektioner och liknande. Vidare kan föreningarna anses som värdefulla inom varje område, där cellimmu- nitet är inbegripen och speciellt då det föreligger brister eller 446 867 ' 10 fel i immuniteten såsom vid ovan nämnda DiGeorge-syndrom. Även i det fall då det föreligger ett överskott av antikroppsproduktion på grund av obalans mellan T-celler och B-celler, kan föreningarna enligt uppfinningen korrigera detta tillstånd genom att stimulera T-cell-produktionen. De kan således anses som terapeutiskt värde- fulla vid vissa autoimmuna sjukdomstillstånd, vid vilka det före- ligger förstörande antikroppar, exempelvis systemisk lupus-erythe- matosus. Vidare är föreningarna på grund av egenskaperna hos poly- peptiderna värdefulla för inducering av T-cell-ytantigener, vid inducering av utveckling av funktionell kapacitet för uppnående av gensvar på mitogener och antigener och Cellsamarbete för höjning av B-cellernas förmåga att alstra antikroppar. Polypeptiderna är även värdefulla för inhibering av okontrollerad fortplantning av Thymopoietin-ansvariga lymfocyter.

Ett viktigt kännetecken på polypeptiderna är deras in vivo-förmåga att återupprätta celler med T-cellernas karakteristika. Polypepti- derna enligt uppfinningen är därför verksamma inom många områden som ett resultat av deras förmåga att höja kroppens immungensvar.

Eftersom polypeptiderna enligt uppfinningen påverkar neuromuskulär transmission kommer mycket höga doser av peptiderna att vara lämp- liga för behandling av sjukdomar med överskott av neuromuskulär trans- mission såsom spasticitet.

En ytterligare viktig egenskap hos peptiderna enligt uppfinningen är att de ärhögaktiva i mycket låga koncentrationer av från 1 nanogram per milliliter och är maximalt aktiva vid koncentrationer av från ca 100 nanogram per milliliter. Bäraren kan vara vilken som helst känd bärare för detta ändamål, inklusive saltlösningar, företrädes- vis med ett protein-utspädningsmedel såsom bovint serumalbumin för förhindrande av adsorptionsförluster till glaskärl vid dessa låga koncentrationer. Peptiderna enligt uppfinningen är aktiva inom ett område av från ca 1 mg/kg kroppsvikt. För behandling av DiGeorge- -syndrom kan polypeptiderna administreras i en mängd av ca 1,0-10 mg/kg kroppsvikt. Generellt kan samma doseringsintervall användas för behandling av övriga omnämnda tillstånd eller sjukdomar.

Polypeptiderna enligt uppfinningen framställes enligt ett förfaran- de analogt med den metod av Merrifield, som beskrivits i Journal of American Chemical Society, 85, sid. 2149-2154, 1963. Syntesen 446 86-7 11 innefattar en stegvis tillsats av skyddade aminosyror till en växande peptidkedja, som är bunden medelst kovalenta bindningar till en fast hartspartikel. Vid förfarandet avlägsnas reagenser och biprodukter genom filtrering och omkristallisering av elimine- rade mellanprodukter. Denna metod baserar sig allmänt på vidhäft- ning av den första aminosyran i kedjan till en fast polymer medelst en kovalent bindning och addition av övriga aminosyror stegvis med en åt gången, tills den önskade sekvensen uppnåtts. Slutligen av- lägsnas peptiden från den fasta bäraren och skyddsgrupper avlägsnas.

Denna metod åstadkommer en växande peptidkedja, ansluten till en fullständigt olöslig fast partikel, så att den lämpligen kan filt- reras och tvättas fri från reagenser och biprodukter.

Aminosyrorna kan vara anslutna till varje lämplig polymer, som en- dast mäste vara olöslig i de använda lösningsmedlen och uppvisa en stabil fysikalisk form, som möjliggör en snabb filtrering. Den mås- te innehålla en funktionell grupp, till vilken den första skyddade aminosyran kan fast förenas medelst en kovalent bindning. Olika po- lymerer lämpar sig för detta ändamål, t.ex. cellulosa, polyvinyl- alkohol, polymetakrylat och sulfonerad polystyren men vid syntesen enligt föreliggande uppfinning användes en klormetylerad sampolymer av styren och divinylbensen.

De olika funktionella grupperna hos aminosyran, vilka var aktiva men vilka inte skulle ingå i reaktionerna, skyddades under hela reaktionsförloppet medelst konventionella skyddsgrupper av det slag som används inom polypeptidkemin. Således skyddades funktio- nella grupper såsom sidokedjan hos arginin, lysin, asparaginsyra och tyrosin medelst skyddsgrupper, som kunde avlägsnas efter upp- nâdd fullständig sekvens utan menlig inverkan på den slutliga po- lypeptiden. Syntesen genomfördes som en modifiering av syntesmeto- den med substanser i fast form genom att fluorescamin användes för bestämning av huruvida kopplingsreaktionen var fullständig genom indikering av positiv fluorescens (jämför Felix et al, Analyt.

Biochem., 52, 377, 1973). Om en fullständig koppling inte indike- rades, upprepades kopplingsreaktionen med samma skyddade aminosy- ra före a-amino-skyddsupphörande.

Det allmänna förfaringssättet innefattade till en början förest- ring av L-tyrosin, som var skyddad vid amino- och hydroxylgrupper- 446 867 12 I na, till harts i absolut alkohol, innehållande en amin. Det kopp- lade aminosyrahartset filtrerades därefter, tvättades med alkohol och vatten och torkades. Skyddsgruppen för aminogruppen hos det skyddade tyrosinet (t.ex. t-bensyloxikarbonyl, förkortad t-BOC), avlägsnades därefter utan att nâgra andra skyddsgrupper påverkades.

Det resulterande kopplade aminosyrahartset med den fria aminygrup- pen reagerades därefter med skyddad L-valin, företrädesvis u-t-BOC- -L-valin för koppling av L-valin till aminosyraharts. Reaktionerna upprepades därefter med skyddad L-asparaginsyra, L-lycin och L-ar- ginin, tills den fullständiga molekylen hade framställts.

Förfarandet användes för bildning av den grundläggande aktiva sek- vensen med fem aminosyror. Additionen av andra neutrala aminosyra- rester vid varje kedjeände utfördes med användning av samma sekvens av reaktioner som är känd i och för sig inom denna teknik. Sekven- sen av reaktioner för framställning av den aktiva delen, omfattande fem aminosyraled, kan åskádliggöras på följande sätt: _ f' harts §4 J, a-Boc-ïfiyr-OH H4 I m-B00-ïär-harts i, avlägsnande av a-amino-skyddsgrupp Ru H -Tyr-harts G-BOC-L-valin \/ En I a-BOC-Val-iïr-harts avlägsnande av m-amino-algyddsgrupp ' R Jr ll* H-Val-flïyr-harts 5 cz-BOC-Lsp-OH ä; V .H4 a-BOC-Asp-Val-iyr-harts _ 446 867 13 avlägsnande av a-amino-skyddsgrupp Ifö V Ifu H-Asp-Val-Tyr-harts H2 a- BOC - Lys-OH H2 Hav' 1,34 a-BOC-Lys-Asp-Val-Tyr-harts avlägsnande av a-amino-skyddsgrupp 32 ?5\/ R” H -Lys-Asp-Val-Tyr-harts H1 u-Aoc-Aåg-on \/ R R *fl 32 .ß J* u-AOC-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-harts \L avlägsnande av alla skyddsgrupper H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH I ovanstående sekvens av reaktioner är R1, R2, R3 och R4 skydds- grupper för olika reaktiva grupper hos aminosyrasidokedjorna, vil- ka inte pâverkas eller avlägsnas då u-amino-skyddsgruppen avlägs- nas för möjliggörande av fortsatt reaktion. I ovan angivna penta- peptidharts såsom mellanprodukt har R företrädesvis betydelsen 1 tosyl (Tos), medan R2 betecknar bensyloxikarbonyl (Z), R3 beteck- nar bensyl (Bzl), R betecknar 0-2,6-diklorbensyl och a-R5 beteck- 4 nar t-amyloxikarbonyl (tAOC). Hartset kan vara vilket som helst av ovan såsom användbara för förfarandet Omnämnda hartser.

Peptidhartset spjälkas för frigöring av peptiden från hartset och skyddsgrupperna R1, R2, R3, R4 och a-R5 för samtidigt erhållande av den som slutprodukt önskade polypeptiden. Skyddsgrupperna och hartset spjälkades på konventionellt sätt, t.ex. medelst behand- ling med vattenfri fluorid, och peptiden uppsamlades.

Ehuru en föredragen metod för framställning av polypeptiderna en- ligt uppfinningen är med användning av en olöslig, fast polymer, såsom beskrivits av Merrifield, kan även andra framställningssätt 446 867 - 14 tillämpas. Således kan exempelvis ett annat fast underlag använ- das såsom ett N-metyl-benshydrylaminharts eller benshydrylamin- harts, vilket är fördelaktigt under vissa betingelser. Vid detta förfarande binds den C-avslutande aminosyran direkt till hartset och den slutliga peptiden kan separeras från underlaget (substra- tet) i HF för bildning av C-avslutade amider. Metoder med använd- ning av ett N-metyl-benshydrylaminharts har beskrivits av Monahan et al. i Biochemical and Biophysical Research Communications, 48, 1100-1105 (1972). Metoder med användning av ett benshydrylaminharts har beskrivits av J. Rivier et al. i Journal of Medicinal Chemis- try, 1973, vol. 16, p. 545-549.

Olika derivat av den grundläggande pentapeptiden kan även framstäl- las med användning av i och för sig kända metoder. Vid framställ- ningen av sådana derivat är det uppenbarligen nödvändigt att bloc- kera funktionella grupper, som skulle kunna påverka reaktionssek- vensen, och för erhållande av den önskade produkten. Exempelvis bör a-karbonsyragruppen hos asparaginsyra eller a-aminogruppen hos lysin blockeras under framställningen av dessa derivat.

Såsom framhållits ovan är det vid genomföringen av förfarandet nöd- vändigt att skydda eller blockera amingrupperna för att kunna kont- rollera reaktionen och erhålla de önskade produkterna. Lämpliga aminoskyddsgrupper, vilka med fördel kan användas, innefattar salt- bildningsgrupper för skydd av starkt basiska aminogrupper eller uretanskyddssubstituenter såsom bensyloxikarbonyl och t-butyloxi- karbonyl. Företrädesvis använder man tert.-butyloxikarbonyl (tBOC) eller t-amyloxikarbonyl (tAOC) för skydd av a-aminogruppen hos aminosyrorna so” undergår reaktionen vid molekylens karboxylände, eftersom BOC och AOC-skyddsgrupper lätt kan avlägsnas efter en sådan reaktion och före det efterföljande steget (där en sådan a- -aminogrupp själv undergår reaktion) medelst relativt mild inver- kan av syror (t.ex. trifluorättiksyra). Denna behandling påverkar inte på något annat sätt skyddsgrupper hos nämnda kedjor. Det skall således förstås att a-aminogruppen kan skyddas genom reaktion med ett vilket som helst material, som kommer att skydda ß-aminogrup- pen under efterföljande reaktion(er) men som senare kan avlägsnas under betingelser som i övrigt inte påverkar molekylen. Exempel på sådana material är organiska karboxylsyraderivat, som kommer att acylera aminogruppen. 446 867 ' 15 I allmänhet kan aminogrupperna skyddas genom reaktion med en för- ening, innehållande en grupp med formeln: 0 Il R - O - C - där R är en grupp, som förhindrar aminogruppen från att ingå i ef- terföljande kopplingsreaktioner och som kan avlägsnas utan att mo- lekylen nedbrytes eller förstöres. R är således en rakkedjig eller grenad alkylgrupp, som kan vara omättad, företrädesvis en sådan med 1-10 kolatomer, vidare aryl, företrädesvis med 6-15 kolatomer, cykloalkyl, företrädesvis med 5-8 kolatomer, aralkyl, företrädes- vis med 7-18 kolatomer, alkaryl, företrädesvis med 7-18 kolatomer, eller en heterocyklisk grupp, t.ex. isonikotinyl. Aryl-, aralkyl- och alkarylgrupperna kan även vara ytterligare substituerade, t.ex. med en eller flera alkylgrupper med 1-4 kolatomer. Föredragna be- tydelser av R innefattar tert.-butyl, tert.-amyl, fenyl, tolyl, xylyl och bensyl. Speciellt föredragna specifika aminoskyddande grupper innefattar bensyloxikarbonyl, substituerad bensyloxikarbo- nyl, där fenylringen är substituerad med en eller flera halogenato- mer, t.ex. klor eller brom, med nitro, lägre alkoxi, t.ex. metoxi, eller lägre alkyl, vidare tert.-butyloxikarbonyl, tert.-amyloxi- karbonyl, cyklohexyloxikarbonyl, vinyloxikarbonyl, adamantyloxi- karbonyl, bifenylisopropoxikarbonyl och liknande. Andra skyddsgrup- per, som kan användas, innefattar isonikotinyloxi-karbonyl, ftaloyl, para-tolysylfonyl, formyl och liknande.

Vid genomföringen av den allmänna processen enligt uppfinningen uppbygges peptiden genom reaktion av den fria d-aminogruppen med en förening, innehållande en blockerad a-aminogrupp. För reaktion eller koppling aktiveras karboxylkomponenten hos föreningen, som "angripes", vid sin karboxylgrupp så att denna sedan kan reagera med den fria d-aminogruppen hos peptidkedjan. För uppnående av ak- tivering kan karboxylgruppen omvandlas till en godtycklig reaktiv grupp såsom en estergrupp, anhydridgrupp, azidgrupp, syraklorid- grupp eller liknande. Det skall förstås att under dessa reaktioner innehåller aminosyradelarna både aminogrupper och karboxylgrupper och vanligtvis ingår en grupp i reaktionen medan den andra är skyd- dad. Före kopplingssteget avlägsnas skyddsgruppen vid a-gruppen eller vid den i ändläge befintliga aminogruppen hos peptiden, som är ansluten till hartset, under betingelser som inte nämnvärt på- 446 867 ' 16 verkar övriga skyddsgrupper, t.ex. grupperna vid epsilon-amino- gruppen hos lysinmolekylen. En föredragen procedur för genomfö- ring av detta steg är mild syrahydrolys såsom reaktion med trifluor- ättiksyra vid rumstemperatur.

Ovan beskrivna serier av processteg resulterar i alstrandet av en specifik pentapeptid med följande formel: H-ARG-LYS-ASP~VAL-TYR-OH.

Denna pentapeptid innefattar även den grundläggande aktiva sekven- sen av polypeptiden enligt uppfinningen. Den substituerade penta- peptiden med formeln II, där i ändläge befintliga ARG- och TYR- -aminosyragrupper kan vara ytterligare substituerade i enlighet med det ovan sagda, framställes därefter genom reaktion av denna baspentapeptid med lämpliga reagenser för framställning av de öns- kade derivaten. Reaktioner av denna typ såsom acylering, förest- ring, amidering och liknande är givetvis i och för sig väl kända.

Andra aminosyror, dvs aminosyragrupper, som inte påverkar den bio- logiska aktiviteten hos den grundläggande pentapeptidmolekylen, kan dessutom adderas till peptidkedjan medelst samma sekvens av re- aktioner som den enligt vilken pentapeptiden syntetiserades.

Nedan följande exempel belyser uppfinningen utan att avgränsa den- samma. I exemplen angivna delar avser viktdelar såvida inte annat anges.

Exempel 1 Vid framställningen av polypeptiden enligt uppfinningen utgick man från följande kommersiella material: a-AOC-Ng-Tos-L-arginin a-BOC-2-klor-bensyloxikarbonyl-L-lysin a-BOC-O-bensyl-L-asparaginsyra u-BOC-L-valin a-BOC-2,6-diklorbensyl-L-tyrosin.

I ovan angivna uttryck betyder BOC t-butyloxikarbonyl medan AOC är t-amyloxikarbonyl och Tos är tosyl. Man utgick även från kom- mersiellt tillgängliga "Sequenal"-grade-reagenser för aminosyra- sekvensbestämning, dicyklohexylkarbodiimid, fluorescamin och harts.

Det använda hartset var ett polystyrendivinylbensenharts, korn- 446 867 ' 17 storlek 200-400 mesh, innehållande 1% divinylbensen och 0,75 mM klorid per gram harts.

Vid framställningen av polypeptiden förestrades 2 m mol av a-BOC- O-2,6-diklorbensyl-L-tyrosin till 2 m mol klormetylerat harts i absolut alkohol, innehållande 1 mM trietylamin, under 24 timmar vid 80°C. Det resulterande kopplade aminosyrahartset filtrerades, tvät- tades med absolut alkohol och torkades. Därefter kopplades på lik- nande sätt a-BOC eller a-AOC-aminosyror till den inte längre skyd- dade a-aminogruppen hos peptidhartset i korrekt ordningsföljd för erhållande av polypeptiden enligt uppfinningen med användning av ekvivalenta mängder dicyklohexylkarbodiimid. Efter varje kopplings- reaktion testades en alikvot del harts med fluorescamin och om en positiv fluorescens pâvisades ansåg man kopplingsreaktionen vara ofullständig och den upprepades då med samma skyddade aminosyra.

Som ett resultat av de olika kopplingsreaktionerna resulterade föl- jande pentapeptidharts: Tos Z Bzl Bzl (C12) I I I I u-AOC-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-harts där AOC betecknar amyloxikarbonyl, Tos betecknar tosyl, Z beteck- nar bensyloxikarbonyl och Bzl är bensyl och Bzl (C12) är 0-2,6- -diklorbensyl.

Detta peptidharts spjälkades och skyddsgrupperna avlägsnades i en Kelf-avspjälkningsapparaünr(Peninsula Laboratories, Inc.) med an- vändning av vattenfritt fluorväte vid OOC under 60 minuter med 1,2 ml anisol per gram peptidharts som rengöringsmedel. Peptidblandnin- gen lyofiliseradegoch tvättades med vattenfri eter och peptiden extraherades med isättika och vatten. Peptiden kromatograferades över P-6 bio-gel i 1 N ättiksyra. Den resulterande polypeptiden befanns ha en renhet av 94% och uppvisade följande sekvens: H-ARG-LYS-ASP~VAL~TYR-OH.

Exempel 2 För bestämning av akviteteten och karakteristika hos polypeptiden utfördes bestämningar med friska 5-6 veckor gamla nu/nu-möss av båda könen, varvid mössen uppföddes i en BALB/c-miljö (tymocyter lika med Thy-1,2-ytantigen) och hölls under konventionella betin- gelser. För erhållande av antisera framställdes anti-Thy-1,2 i 446 867 18 Thy-1-kongeniala möss.

För alstrande in vitro av Thy-1+-T-celler eller CR+-B-cell-ut- veckling utfördes induceringen av tymocytutveckling från protymo* cyter in vitro såsom beskrivits av Komuro och Boyse, (Lancet, 1, 740, 1973), med användning av erhâllandet av Thy-1,2 som ett tec- ken på T-cell-utveckling. Induceringen av CR+-B-cellutveckling från CR--B-cellprekursorer in vitro utfördes under liknande betin- gelser, varvid man som försökskriterium använde CR+-B-cellernas kapacitet att binda fårerytrocyter, belagda med subagglutinerings- mängder kanin-antikroppar och icke-lytiskt ("non-lytic") komplement.

Mjältcellodlingar från friska nu/nu-möss, fraktionernade på diskon- tinuerliga bovin-serumalbumingradienter, användes som källa för bå- da prekursortyper (Thy-1- och CR_) på grund av att de uppvisar en- dast få eller inga Thy-1+-celler och lågt antal CR+-celler.

Som ett resultat av bestämningen fann man att polypeptiden utveck- lade en selektivitet av verkningar liknande med vad som är fallet för Thymopoietin II vid inducering av utveckling av T-lymfocyter men inte av komplementreceptor (CR+)-B-lymfocyter. Pentapeptiden inducerade utveckling av Thy-1+-T-celler i koncentrationer av från 1 ng till 10 pg/ml. Den inducerade inte utvecklingen av CR+-B-cel- ler vid koncentrationer av från 0,01 ng till 10 pg/ml.

Exempel 3 För bestämning av effekten av denna peptid på neuromuskulär trans- mission (fortplantning) injicerades möss intraperitonealt med 10- 100Apg peptid i N-saltlösning. 24 timmar senare fastställdes neuro- muskulär transmission medelst elektromyografi såsom beskrivits i Lancet, volym 12, sid. 256-259, 1975. Det förelåg en påvisbar neu- romuskulär försämring hos mössen, som injicerats med peptiden.

Exempel 4 Pentapeptiden enligt exempel 1 framställdes på ett substrat, om- fattande ett benshydrylaminoharts med användning av metoden en- ligt J. Rivier et al. i Journal of Medicinal Chemistry, vol. 16, nr. 5, sid. 545-548 (1973). I syntesen var dicyklohexylkarbodiimid kopplingsmedel och kopplingen utfördes i CH2Cl2.

Peptiden separerades från substratet medelst vätefluorid för fri- göring av peptiden och avlägsnande av skyddande grupper och bil- 446 867 19 dande av följande derivat: H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-NH2.

För identifiering användes tdnnskiktskromatografi och elektrofo- res, varvid följande resultat erhölls: Tunnskiktskromatografi: Prov: 30 pg.

Silikagel (Brinkman-glasskiva, 5 x 20 cm, 0,25 mm tjock) 1 _ .

Rf : n-BuOH : pyridin : HOAC : H20 30 : 15 : 3 : 12 2 . .

Rf : EtOAc : pyridin : HOAC : H20 5 ; 5 ; 1 ; 3 Rš : Et0Ac : n-BuOH : HOAC : H20 1 : 1 : 1 : 1 Spray-reagens: Pauly, Ninhydrin, Sakaguchi och I2 1 TLS 3 Elektrofores: Rf Rf Rf peptiden vandrade Förening till katoden ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-NH2 0,53 0,68 0,26 7,5 cm Elektrofores: Whatman 3 mm papper (11,5 cm x 56 cm) Prov: 100 pg pH 5,6, pyridinacetat-buffertlösning 1000 V, 1 timme Sprayreagens: ninhydrin och Sakaguchi Denna amiderade pentapeptid uppvisade, då den användes i en kon- centration av 14pg/ml i 89%-ig Twomey-lösning en maximal aktivitet av 105% och en minsta aktivitet av 70%, jämfört med baspentapep- tiden enligt exempel 1.

Exempel 5 Den enligt exempel 1 framställda grundläggande pentapeptiden för- estrades för framställning av etylalkoholderivatet. Vid framställ- ningen av denna ester var det nödvändigt att blockera syragruppen hos asparaginsyran med en svagt sur sensitiv blockeringsgrupp un- der framställningen, varvid en föredragen sådan blockeringsgrupp är t-butyl. u-amino-blockeringsgruppen är känslig för en svag bas och utgöres företrädesvis av fluorenylmetoxikarbonyl. Med använd- ning av en sådan u-amino-blockeringsgrupp kan denna avlägsnas för addition av varje aminosyrarest utan att man inverkar på den sy- 446 867 20 rakänsliga skyddande gruppen för asparaginsyraresten. Efter fram- ställningen av det skyddade pentapeptidhartset kommer en behand- ling med en svag bas, efterföljd av behandling med en svag syra att avlägsna dessa tvâ skyddsgrupper. Transförestring med etyl- formiat med användning av sulfurylklorid som katalysator spjälkar pentapeptiden från hartset för att selektivt bilda den C-termina- la estern. Förestring kommer inte att uppträda vid den fria syra- gruppen hos asparaginsyraresten. Återstående skyddsgrupper avlägs- nas och peptiden enligt följande sekvens uppsamlas: H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OC2H5.

Exempel 6 Enligt detta exempel framställdes pentapeptiden från exempel 1 med användning av N-metyl-benshydrylaminharts som fast substrat enligt en metod av Monahan et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 48, 1100-1105 (1972). Den skyddade pentapep- tiden spjälkas sedan från hartset medelst vätefluorid för fram- ställning av följande aminsubstituerade derivat: HZN-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-CONHCH3.

Exempel 7 Enligt detta exempel framställdes det N-metyl-substituerade deri- vatet av den grundläggande pentapeptiden från exempel 1 med använd- ning av sättet i exempel 1 men med insättning av en ekvivalent mängd N-metyl-L-arginin istället för den där använda skyddade Irarginin. Man erhöll en peptid med följande formel: CH3NH-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-COOH.

Exempel 8 Den enligt exempel 7 framställda metylaminopolypeptiden framställ- des här med användning av bensylhydrylaminhartset som fast subst- rat såsom beskrivits i exempel 4. Den resulterande skyddade och "uppburna" pentapeptiden spjälkades frân hartset medelst väte- fluorid, skyddsgrupperna avlägsnades och det bildades en amido- polypeptid med följande formel: 'CH3NH-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-CONH2.

Exempel 9 Med användning av förfarandet enligt exempel 5 men med utbyte av där använd skyddad L-arginin mot en ekvivalent mängd N-metyl-L- -arginin framställdes följande förestrade polypeptid: CH3NH~ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-COOC2H5_ 446 867 Ü 21 Exempel 10-19 Med användning av ovan beskrivna reaktionsteknik för förlängning av polypeptidkedjan framställdes följande polypeptider, vilka innehöll den aktiva aminosyrasekvensen men vilka var substituera- de vid amino- och karboxylgrupperna i ändläge med R och R', för åstadkommande av basaminosyran med följande formel: R~HN-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-COR' som var substituerad med de i nedanstående tabell angivna amino- syrorna.

Tabell bxempel nr R Rv 10 GLN OH ll GLU-GLN OH 12 GLY-GLU-GLN OH 13 GLY-GLU-GLN VAL lä GLY-GLU-GLN VAL-GLN 15 GLY-GLU-GLN VAL-GLN-LEU 16 GLY-GLU-GLN VAL-GLN-LEU-TYR l7 GLN VAL l8 GLN VAL-GLN 19 GLN VAL-GLN-LEU Exempel 20 Pentapeptiden enligt exempel 1 acylerades genom reaktion med ace- tylklorid pâ i och för sig känt sätt för framställning av följande acylerade derivat: CH3CONH-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-COOH.

Exempel 21 Pentapeptiden enligt exempel 20 amiderades även genom reaktion med ammoniak på i och för sig känt sätt för framställning av följande derivat: CH3CONH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH.

Polypeptidderivaten enligt exemplen 5-21 bibehöll sin biologiska aktivitet såsom beskñyits här för bas-aminosyrasekvensen.

Ehuru uppfinningen ovan har beskrivits med hjälp av speciella ut- föringsformer är det uppenbart för fackmannen att olika variatio- ner kan komma ifråga utan att man överskrider unpfinningens ram_

Claims (3)

446 867 ”- Patentkrav

1. Sätt att framställa en polypeptid med förmåga att inducera differentíering av T-lymfocyter men inte av komplementreceptor (CR+) B-lymfocyter. vilken peptid har sekvensen Arg-Lys-Asp-Val-Ty: k ä n n e t e c k n a t av följande steg: (1) förestring av L-tyrosin. uppvisande skyddade amíno- och hydroxylgrupper. till en olöslig hartspolymer medelst kovalent bindning, (2) avlägsnande av a-amíno-skyddsgruppen från L-tyrosin-delen, (3) reaktion med en a-amino-skyddad L-valín för kopp- ling av L-valin till L-tyrosin-harts. (4) avlägsnande av a-amíno-skyddsgruppen från L~valin- -delen. (5) reaktion med en a-amino-skyddad L-asparagínsyra för koppling av L-asparaginsyra till L-valín-L-tyrosín- -harts. (6) avlägsnande av a-amino~skyddsgruppen från L-asparaginsyra-delen. (7) reaktion med en a-amino-skyddad L-lysín för kopp- ling av L-lysin till L-asparaginsyra-L-valin-tyrosin-harts. (8) avlägsnande av a-amino-skyddsgruppen från L-1ysin- -delen. (9) reaktion med en a-amino-skyddad L-argínin för koppling av L-argínin till L-lysin-L-asparaginsyra-L-va1in-L- -tyrosín-harts. v (10) avlägsnande av alla skyddsgrupper från peptiden. och (11) avlägsnande av peptiden från hartset och eventuellt amíderíng av Tyr genom reaktion med ammoniak. '

2. Sätt enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att reak- 23 446 867 tiva sidokedjor hos de reagerande aminosyrorna skyddas under reaktionen.

3. Sätt enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att harts- polymeren väljes ur gruppen bestående av cellulosa. polyvínyl- alkohol. polymetakrylat. sulfonerad polystyren och en klor- metylerad sampolymer av styren och divinylbensen.