FI67691B - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara peptider - Google Patents

Description

I~ 1 rftl KUULUTUSJULKAISU , n , Q >, V&g W ^UTLÄCCHINCSSIUUFT 67691 ^ ^ (51) K«Jk,^/im.Ct^ C 07 K 5/04 SUOM I — FIN LAN D (21) »*·«··»«ΛΛ·ιηΜ· —P*tentinrfWii* 800779 (22) HakemtapiM —Ai*eknln|»d#| 13.03-80 v 9 (23) ANnipUvt—GIWgh«C«daf 13.03.80 (41) Tullut {uOtiMfcfi — Blhrit offwitllg 1 5.09.80

Patentti· ia rekisterihallitut ... ________ ,_...,, . ._ · (44) NihtMUpatwn |s kiMil^ilkaltM pvm.— ni «5

Patent- OCh register ityrelm Amökan uttefd odi utl.skrtft«n pubUcerarf (32)(33)(31) Pyrlsey «OMikaut—B*fird prtorkat 14.03*79 USA(US) 020157 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceutical Corporation, Route 202, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey,

George Heavner, Flemington, New Jersey, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi - Förfahande för framstäl1 ning av nya terapeutiskt användbara pept ider

Keksintö koskee menetelmää uusien kaavan I mukaisten peptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, A - B (I) jossa A on deamino-GLN, GLN tai (SAR) -GLN, jossa n on kokonaisluku n 1-4, ja B on LYS-OH, LYS-NH2 tai LYS-SAR-NH2.

US-patenttijulkaisussa 4 002 602 on esitetty pitkäketjuinen peptidi, ubikitiini (josta mainitussa patentissa on käytetty nimitystä "Ubiquitous Immunopoietic Polypeptide"). US-patenttihakemuk-sessa 851 778, jätetty 1977-11-15, on esitetty pentapeptidi H-X-Y-Z-GLN-LYS-OH, jossa X on TYR tai ALA, Y on ASN tai ALA, ja Z on ILE tai ALA. Mainitussa patenttihakemuksessa on esitetty, että ko. pentapeptidillä on samankaltainen biologinen aktiviteetti, kuin pitkäketjuisella polypeptidillä, joka tunnetaan ubikitiinin nimellä. Aktiivisimmaksi esitetyllä kaavan H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH (josta tässä käytetään toisinaan nimitystä "ubikitiini-pentapeptidi") 67691 --'äkäisellä pentapeptidiilä oli aktiivisuutta siinä esitetyn esi-'merkki II :n hiirikokeen mukaan pitoisuuksilla 10 ng/ml - 1 ug/ir.i . kaavojen H-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-OH, H-TYR-ALA-ILE-GLN-LYS-OH ja lYR-ASN-ALA-GLN-LYS-OH mukaisilla pentapeptideillä ilmoitettiin riyÖs olevan aktiivisuutta esimerkkien XIV-XVI mukaisissa kananpoil kokeissa pitoisuuksilla 0,1yUg/ml (100 ng/ml).

Muiden tekniikan tasoa edustavien julkaisujen ja jäljempänä käytettyjen biologisten menetelmien suhteen viitataan edellä mainit Luun patenttiin ja patenttihakemukseen.

Kaavan I mukaiset peptidit ovat vähintään yhtä aktiivisia - ;in tekniikan tasoa edustavat tunnetut pentapeptidit ja samalla -katseitaan olennaisesti yksinkertaisempia. Näillä uusilla pep ä on siten olennaisena etuna helpompi ja halvempi valmistua äimä. Jotkut näistä uusista peptideistä ovat yllättäen sei /au. , ·, .-j. sompia kuin viite julkaisuissa mainitut pentapeptidit.

Kaavan I mukaisilla uusilla peptideillä on siis ubikitiinin-uk 3ta aktiivisuutta niiden saadessa aikaan sekä T-prekursoriicli . . .y 3-prekursorisolujen differentoitumisen vastaavasti T-soluiKsi --soluiksi, ja ne ovat siten erittäin käyttökelpoisia ihmisten eläinten immuunisysteemissä.

Kaavan I mukaisia peptidejä ja niiden farmaseuttisesti hyvä1-happoadditiosuoloja voidaan valmistaa siten, entä a) 3-aminohappo, jonka (Λ -aminoryhmä on suojattu, liitetään i en rt: iselia sidoksella polymeerihartsiin , loka sisältää fuukt . : ..:-::-1 ryhmän, johon ensimmäinen suojattu aminohappo voidaan . liittää kovelenttise 11a sidoksella, b) oi.-aminosuo jaryhmä poistetaan E-aminohaposta , c) A-aminohappo, jonka mahdollisesti läsnäoleva ^-aminory:-c.uojattu ja jonka £T -aminoryhmä on suojattu liitetään 3-amino · , ..,harts iin ,

Ja kur. ryhmä A sisältää yhden tai useampaa sarkosyylirynr..iä, ...ivä sarkosiini, jonka oC-aminoryhmä on suo jattu, liitetään ke i r,, ja aminosuo jaryhmä poistetaan sarkosyy liryhmästä, ja ,.-.-rn'ide toistetaan, kun n on suurempi kuin 1, ja e) kun ryhmä B sisältää sarkosyyliryhmän, sarkosiini, jonka , o -aminoryhmä on suojattu, liitetään hartsiin ennen vaihetta a), j ..,nni«osuojaryhmä poistetaan siitä, ja B-ryhmän muu osa liitetä!: -..hartsiin,

II

3 67691 f) saadusta peptidistä poistetaan hartsi ja kaikki suoja-ryhmät sopivilla reagensseilla, ja peptidi muutetaan haluttaessa farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Peptidit, joissa A on deamino-GLN tai GLN, ovat rakenteelta.- selvästi yksinkertaisempia kuin vertailuun käytettävät pentapept.i ' ja niiden valmistus on myös helpompi, koska ne ovat vain dipeptice -· V tai tripeptidejä. Peptidit, joissa A on deamino-GLN tai (SAR) -GIN. jossa n on 2, 3 tai 4, ja B on LYS-OH tai LYS-Ni^/ ovat merkitsevää aktiivisempia kuin vertailuun käytettävät pentapeptidit. Niillä on aktiivisuutta kananpoikainduktiokokeessa, joka esitetään jäljempää n pitoisuuksina noin 10 fg/mi - 100 ng/ml. Ne ovat siten jopa 10 miljoonaa kertaa vahvemmin vaikuttavia kuin vertailupentapeptidit. Kun jotkut näistä vahvasti vaikuttavista peptideistä ovat myös erittäin yksinkertaisia rakenteeltaan, niin niiden merkitsevästi vahv< -paan vaikutukseen liittyy samalla suhteellisen helppo ja taloudei: linen valmistus.

Peptidien kanssa farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja muodostavia happoja ovat esim. epäorgaaniset hapot, kuten kloorivety-happo, bromivetyhappo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo jne., ja orgaaniset hapot, kuten muurahaishappo, etikkahappo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, palo··· rypälehappo, oksaalihappo, malonihappo, meripihkahappo, maleiini-happo, fumaarihappo, antraniilihappo, kaneelihappo, naftaleenisn s -nihappo ja sulfaaniilihappo.

Edellä olevissa rakennekaavoissa on peptidien aminohappokom-ponenteista käytetty tarkoituksenmukaisuussyistä lyhenteitä. Lyhenteet ovat seuraavat: 4 67691

Aminohappo Lyhenne

L-glutamiini GLU

L-alaniini ALA

L-lysiini LYS

L-tyrosiini TYR

L-asparagiini ASN

L-isoleusiini ILE

Sarkosiini SAR

Ilmaisuilla "deamino-GLN" tarkoitetaan vastaavasti L-gluta-miinitähdettä, jossa -aminoryhmä on korvattu vedyllä. Näiden ryhmien kaavat ovat vastaavasti H2NOC-(CH2)3~C0.

Kaavan I mukaiset peptidit sisältävät dipeptidiryhmän -GLN-LYS- joko yksinään tai yhdessä 1-5 sarkosiiniradikaalin kanssa. Näillä peptideillä on havaittu olevan samankaltaisia ominaisuuksia kuin US-patentissa 4 002 602 esitetyllä 74 aminohappoa sisältävällä polypeptidillä, ubikitiinilla. Kaavan I mukaisille peptideille on osaksi tunnusomaista kyky indusoida selektiivinen T-prekursorisolujen ja B-prekursoridifferentiaatio niinkin alhaisissa konsentraatioissa kuin femtogramma/ml. On yllättävää, että tällä dipeptidifragmentilla joko yksinään tai yhdistettynä 1-5 luonnossa esiintymättömän aminohapon so. 1-5 sarkosiini-tähteen kanssa, on ylipäänsä aktiivisuutta ja lisäksi yllättävän vahvaa ubikitiinin-kaltaista aktiivisuutta. Tämän keksinnön olennainen merkitys perustuu peptidin äärimmäisen yksinkertaisuuden ja yllättävän vahvan vaikutuksen yhdistelmään. Kaavan I mukaisista peptideistä heikoimmin vaikuttavalla (H-GLN-LYS-NH2), joka on ainoastaandipeptidi, on nimittäin sama vaikutusteho kuin tymopoeettisella pentapepti-dillä. Kaikkein vahvimman vaikutuksen omaavalla kaavan I mukaisella peptidillä (H-SAR-SAR-SAR-GLYN-LYS-NH2) on noin 10-kertainen teho tymopoeettiseen pentapeptidiin verrattuna. Kaavan I mukaisten 5 67691 peptidien on siten havaittu niinkin alhaisina pitoisuuksina kuin 10 fg/ml indusoivan sekä T-prekursorisolujen differentiaatiota, joka on mitattu antigeenien TL ja THY-1 (ύ) tyymusdifferen-taatiolla, ettd B-prekursorisolujen differentiaatiota, joka on mitattu komplementin reseptorien saamisella, mikä on B-solujen selvä tunnistamismenetelmä.

Kaavan I mukaisten peptidien yllättävän tehon ymmärtämiseksi esitetään seuraava mittayksiköltä selvittävä taulukko.

Mittayksikkö paino grammoina (lyhennys) -3 milligramma (mg) 10 “6 mikrogramma (ug) 10 -9 nanogramma (ng) 10 -12 pikogramma (pg) 10 -15 femtogramma (fg) 10

Edullisia kaavan I mukaisia peptidejä ovat sellaiset kaavan I mukaiset peptidit, joissa A on deamino-GLN tai H-(SAR)n~GLN, n on 2, 3 tai 4, ja B on LYS-0H tai LYS-NH2· Näillä edullisilla peptideillä on aktiivisuutta konsentraatioalueella 10 fg/ml -noin 100 ng/ml.

Peptidisekvenssi GLN-LYS-SAR-NH2 voidaan esittää kaavoilla H9N-CH—CONH-CH-CON-CH-) -CONH- CH2 (CH2>4 ®3

I I

CH2 nh2 CONH2 H - GLN - LYS - SAR - NH2

Edullisia kaavan I mukaisia peptidejä ovat myös kaavan (deamino-GLN)-LYS-C mukaiset peptidit, jossa kaavassa C on OH tai NH2. Näillä edullisilla peptideillä erittäin hyvän vaikutustehon ohella yksinkertainen rakenne ja helppo valmistus. Näiden edullisten dipeptidien rakenne on siksi yksinkertainen, että ne voidaan kiteyttää, mikä ei yleensä onnistu suurempien peptidien ollessa ky- 6 67691 seessä. Mahdollisuus näiden dipeptidien kiteyttämiseksi helpottaa olennaisesti niiden puhdistusta.

Jotta voitaisiin ymmärtää, miten tärkeä kaavan I mukaisten peptidien kyky differentioida biologisia ominaisuuksia, on huomattava, että kateenkorvan tehtävän immuuniudessa voidaan laajasti määritellä johtuvan kateenkorvan tuottamista soluista (lymfosyytit), joita nimitetään T-soluiksi. T-solujen osuus verenkierrossa olevissa pienistä lymfosyyteistä on huomattava. T-solut ovat immunologisesta spesifisiä ja liittyvät suoraan soluvälitteiseen immuunivasteeseen (kuten homograftuvasteeseen) efektorisoluina. T-solut eivät kuitenkaan eritä humoraalivasta-aineita. Näitä vasta-aineita erittävät kateenkorvan vaikutuksesta riippumatta suoraan luuytimessä B-solut. Useita antigeenejä vastaan tarvitaan B-solujen lisäksi kuitenkin sopivia reaktiivisia T-soluja ennenkuin B-solut pystyvät muodostamaan vasta-aineita. T-solut ovat myös mukana immuunisysteemin säätelyssä auttajasoluina, suppressorisoluina jne. Tämä solujen yhteistoiminnan mekanismi ei ole vielä täysin selvitetty.

Edellä olevan perusteella voitaneen sanoa, että kateenkorva on välttämätön soluimmuniteetin ja monien humoraalisten vasta-aine-vasteiden muodostumis-elle sekä myös immuunisysteemin säätelylle.

Nämä tulokset johtuvat ainakin osittain kateenkorvassa tapahtuvan hematopoeettisten kantasolujen induktiivisesta differentiaatiosta T-soluiksi. Tätä induktiivista vaikutusta välittävät kateenkorvan epiteelisolujen eritteet, so. kateenkorvahormonit.

Jotta ymmärrettäisiin kateenkorvan ja lymfosyyttien solusystee-min toimintatapaa ja lymfosyyttien kulkeutumista kehossa, en korostettava, että kantasolut muodostuvat luuytimessä ja saapuvat ka-teenkorvaan verenkierron mukana. Kateenkorvassa kantasolut diffe-rentioituvat. immunologisesta vaikuttaviksi T-soluiksi, jotka kulkeutuvat verivirtaan ja yhdessä B-solujen kanssa kiertävät kudoksissa, imunesteessä ja verivirrassa.

Vasta-aineita erittäviä kehonsoluja (B-solut) kehittyy myös hematopoeettisista kantasoluista, mutta niiden differentioitumista ei määrää kateenkorva. Linnuissa ne differentioituvat kateenkorvaa vastaavassa elimessä, jolle on annettu nimi Fabritiuksen bursa. Nisäkkäillä ei ole havaittu olevan vastaavaa elintä, ja on oletettu että B-solut differentioituvat luuytimessä. Siitä johtuen niitä nimitetään luuytimestä johdetuiksi soluiksi eli B-soluiksi. Tämän 7 67691 differentiaation määräävät fysiologiset aineet ovat yhä täysin tuntemattomia.

Kuten edellä esitettiin, uudet kaavan I mukaiset peptidit ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia ihmisten ja eläinten hoidossa . Koska uusilla peptideillä on kyky indusoida hemato-poeettisista kudoksista peräisin olevien lymfatopoeettisten kanta-solujen differentiaatiota sekä kateenkorvasta peräisin oleviksi lymfosyyteiksi (Tpsolut) että immunokompetenteiksi B-soluiksi, jotka pystyvät vaikuttamaan kehon immuunivasteeseen, niin kaavan I mukaisilla yhdisteillävoidaan katsoa olevan monenlaista terapeuttista käyttöä. Ensisijaisesti, koska yhdisteet pystyvät suorittamaan tiettyjä osoitettuja, kateenkorvan funktioita, niillä on käyttöä kateenkorvan eri vaikutusaloilla ja immuuniuden alueella. Niiden ensisijainen käyttö on DiGeorge-oireyhtynän käsittelyssä, joka oireyhtymä johtuu synnynnäisestä kateenkorvan puuttumisesta. Tämä puute on voitettavissa antamalla injektiona polypeptidejä. Toisena käyttönä on agammaglobulinemia, joka oletettavasti johtuu kehon B-solujen differentioitumista aiheuttavan hormonin puutoksesta. Tämä puutos voidaan korjata antamalla injektiona polypeptidejä. Koska peptidit ovat aktiivisia erittäin alhaisilla pitoisuuksilla, niitä voidaan käyttää auttamaan kehon kollektiivista immuniteettia niiden lisätessä soluvälitteisen immuniteetin ja humoraali-immuniteetin terapeuttista stimulaatiosta, joten ne ovat käyttökelpoisia kroonisten infektioiden in vivo käsittelyyn, kuten sieni- tai mykoplas-mainfektioiden, tuberkuloosin, lepran, akuuttien tai kroonisten infektioiden ym. käsittelyyn. Lisäksi peptidejä pidetään käyttökelpoisina kaikilla sellaisilla aloilla, joissa solu- tai humoraali-immuniteetti tuo ratkaisun ja erityisesti immuniteettihäiriöissä, kuten edellä mainitussa DiGeorge-oireyhtymässä. Peptidien ominaisuudet tekevät ne lisäksi käyttökelpoisiksi in vitro, sillä ne pystyvät indusoimaan T-solujen pinta-antigeenien kehittymistä, ne indusoivat funktionaalista kykyä antigeeni- ja mitogeenivas-teen saavuttamiseksi ja soluyhteistoimintaa, jolloin ne parantavat B-solujen kykyä tuottaa vasta-aineita. Niillä on il vitro käyttöä niiden indusoidessa B-solujen kehittymistä, mikä on osoitettu komplementin pinnan vastaanottokohtien kehittymisellä. Peptidiejä voidaan käyttää myös ubikitiinille herkkien lymfosyyttien kontrol- 8 67691 loimattoman tuottamisen estämiseen(tämä on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 002 602). Eräs peptidien tärkeä ominaisuus on niiden kyky in vivo elvyttää soluja, joilla on T-solujen ominaisuudet, sekä niiden kyky in vivo elvyttää soluja, joilla on B-solujen ominaisuudet. Ne ovat siten käyttökelpoisia hoidettaessa suhteellista tai absoluuttista T-soluvajavaisuutta riippumatta siitä, johtuvatko nämä vajavaisuudet kudoksen vajavaisuudesta, joka differentioiB-soluja tai kateenkorvan vajavaisuudesta tai muusta syystä.

Eräänä tärkeänä piirteenä uusilla kaavan I mukaisilla peptideillä on lisäksi niiden korkea aktiivisuus erittäin alhaisilla pitoisuuksilla On havaittu, että peptidit ovat yleensä aktiivisia pitoisuuksina noin 10 pg/ml - 10 ng/ml ja edulliset peptidit pitoisuuksina noin 10 fg/ml. Kantaja-aineena voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua tähän tarkoitukseen käytettyä kantaja-ainetta, kuten tavallisia suolaliuoksia, edullisesti yhdessä proteiinilai-mennu-saineen kanssa, kuten härän seerumialbumiinin kanssa, jotta vältettäisiin näin alhaisilla pitoisuuksilla lasitavaraan adsorboitunut ainehukka. Peptidit ovat yleensä aktiivisia määrinä yli noin ly.ug/kehon kg ja edulliset peptidit määrinä noin 10 pg/kg. DiGeor-gen oireyhtymän hoitoon peptidejä voidaan antaa noin 1 - noin 100^,ug/kehon kg. Yleensä myös muiden tautien hoitoon voidaan käyttää samoja annosmääriä. Edellä olevat annostukset koskevat parenteraa-lista lääkeantoa. Voidaan kuitenkin käyttää myös oraalista lääke-antoa, jolloin annokset ovat yleensä noin 100 - 1000-kertaisia injektioannoksiin verrattuna. Voidaan käyttää myös muita tunnettuja lääkeantotapoja, kuten sublinguaalista, rektaalista, nasaalista ym. tapaa.

Farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi kaavan I mukainen peptidi tai sen happoadditiosuola aktiivisena aineena sekoitetaan farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa tavallisen farmaseuttisen käytännön mukaisesti. Kantaja-aine vaihtelee riippuen lääkemuodosta ja halutusta lääkkeen antotavasta, joka voi olla sublinguaalinen, rektaalinen, nasaalinen tai parenteraalinen. Oraalisten lääkekoostumusten valmistamiseen voidaan käyttää mitä tahansa tavallisia farmaseuttisia aineosia, kuten vettä, glykoleja, öljyjä, alkoholeja, makuaineita, säilöntäaineita, värejä, kun kyseessä ovat nestemäiset koostumukset, kuten suspensiot, eliksiirit ja liuokset ja kantaja-aineina tärkkelyksiä, sokereita, laimentimia, rakeistus- 9 67691 aineita, liukastusaineita, hajoamista edistäviä aineita ym., kun kyseessä ovat kiinteät oraaliset valmisteet, kuten jauheet, kapselit tai tabletit. Lääkeannon helppouden kannalta edullisempia annosmuotoja ovat oraaliset yksikköannokset, joissa käytetään kiinteitä kantaja-aineita. Tabletit voivat olla sokeripäällysteisiä tai enteropäällysteisiä. Parenteraalisiin valmisteisiin käytetään kantaja-aineena tavallisesti vettä, vaikkakin myös muita aineosia voidaan sisällyttää koostumukseen esimerkiksi liukoisuuden parantamiseksi tai säilöntäaineeksi. Voidaan myös valmistaa injektioita-via suspensioita, joissa käytetään sopivia nestemäisiä kantaja-aineita, suspendointiaineita jne. Parenteraalisesti käytettävät farmaseuttiset koostumukset tulisi suunnitella sellaisiksi, että niitä käytettäessä peptidi annos on noin 10 pg/kg - noin 100 ng/kg. Oraalisesti annettavien koostumusten tulisi sisältää annosyksikköä kohti 100-1000 kertaa parenteraalisen annoksen määrän, so. noin 1 ng/kg - noin 100^ug/kg. Annosyksikköä kohti parenteraalisten koostumusten tulisi sisältää näin ollen noin 500 pg - noin 5^ug ja oraalisten koostumusten noin 50 ng - noin 5 mg peptidiä.

Kaavan I mukaisia peptideistä valmistetaan käyttäen Merrifield' in julkaisussa Journal of American Chemical Society, 85, 2149-2154, 1963, kuvaamaa menetelmää. Synteesissä lisätään vaiheittain suojattuja aminohappoja kasvavaan peptidiketjuun, jotka on kovalenttisesti sidottu kiinteään hartsihiukkaseen. Tässä menetelmässä reagenssit ja sivutuotteet poistetaan suodattamalla ja välituotteiden puhdistusta ei tarvita. Tämä menetelmä perustuu yleisesti ottaen ketjun C-pääteaminohapon liittämiseen kovalenttisella sidoksella kiinteään polymeeriin ja aminohappojen liittämiseen peräkkäin yksi kerrallaan vaiheittain, kunnes haluttu sarja on koottu. Lopuksi peptidi poistetaan kiinteästä tukiaineesta ja suojaryhmät poistetaan. Tällä menetelmällä saadaan kasvava peptidiketju, joka on liittynyt täysin liukenemattomaan kiinteään hiukkaseen, joten se on sopivassa muodossa reagenssien ja sivutuotteiden erottamiseksi suodattamalla ja pesemällä.

10 67691

Aminohapot voidaan liittää mihin tahansa sopivaan polymeeriin, joka on helposti erotettavissa reagoimattomista reagensseista. Polymeeri voi olla liukenematon käytettyihin liuottimiin tai liukeneva tiettyihin liuottimiin ja liukenematon toisiin. Polymeerillä tulisi suodatuksen helpottamiseksi olla pysyvä fysikaalinen muoto. Siinä tulee olla funktionaalinen ryhmä, johon ensimmäinen suojattu aminohappo liitetään lujasti kovalehttisella sidoksella. Erilaisia tähän tarkoitukseen sopivia polymeerejä ovat esimerkiksi selluloosa, polyvinyylialkoholi, polymetakrylaatti ja sulfonoitu polystyree-ni .Esillä olevan keksinnön synteetissä käytettiin kuitenkin kloo-rimetyloitua styreenidivinyylibentseenikopolymeeria. Voidaan myös käyttää polymeerejä, jotka liukenevat orgaanisiin liuottimiin, mutta ovat liukenemattomia vesipitoisiin liuottimiin. Yksi tällainen polymeeri on polyetyleeniglykoli, jonka molekyylipaino on noin 20 000 ja joka on liukoinen metyleenikloridiin ja liukenematon veteen. Tämän polymeerin käyttöä peptidisynteesiin on esitetty julkaisussa: F.Bayer ja M.Mutter, Nature, 237, 512 (1972) ja kirjallisuusviitteet .

Aminohapon erilaiset funktionaaliset ryhmät, jotka ovat aktiivisia, mutta joiden ei tarkoiteta joutuvan reaktioihin, suojataan tavanomaisin suojaryhmin, joita polypeptidien reaktiossa käytetään. Lysiinin funktionaalinen ryhmä suojataan siten suojaryhmällä, joka voidaan poistaa reaktiosarjän päätyttyä ja jolla ei ole haitallista vaikutusta lopputuotteeseen. Synteesissä todetaan ninhydriinil-lä, onko liittymisreaktio täydellinen. Jollei liittyminen ole täydellinen, suoritetaan sama liittymisreaktio saman suojatun aminohapon kanssa ennen suojaryhmän poistamista.

C-päätteiset aminohapot voidaan kiinnittää polymeeriin monin hyvin tunnetuin menetelmin. Kiinnittysmismenetelmiä halogeenimetyy-lihartseihin on kuvattu seuraavissa julkaisuissa: Horiki et ai., Chem. Letters, s. 165-168 (1978) ja Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973), sekä niiden kirjallisuusviitteet. Valmistettaessa C-päätteisiä amideja voidaan käyttää seuraavaa kahta menetelmää.

Joko peptidi-hartsista, joka on valmistettu Merrifield-tekniikalla, peptidi lohkaistaan hartsista vedettömällä ammoniakilla, tai voidaan käyttää bentshydryyliamiinihartsia. Viimeksimainitusta hartsista peptidi lohkaistaan fluorivedyllM, jolloin saadaan- C-päättei-nen amidipeptidi. Bentshydryyliamiinihartsin käyttöä ovat kuvanneet 11 67691 esimerkiksi J.Rivier at ai., J.Med. Chem. 16, s. 545 - 549 (1973) .

Yleisessä menetelmässä C-päätteisten karboksyylipeptidine valmistamiseksi esteröidään alliksi L-lysiini, jonka aminoryhmät on suojattu, sen kiinnittämiseksi kloorimetyylihartsiin CsHC03~ menetelmällä, joka on kuvattu edellä mainitussa Gisin'in artikkelissa. Lysiiniaminohapon σ(-aminosuojaryhmä (esim. t-BOC, so. tert-butyylioksikarbonyyli) poistetaan sitten siten, ettei vaikuteta muihin suojaryhmiin. Yhteenliitetty aminohappo-hartsi suodatetaan, pestään ja neutraloidaan. Saatu aminohappo-hartsi, jossa on L-glutamiinin liittämiseksi vapaa aminoryhmä, saatetaan sitten reagoimaan suojatun L-glutamiinin kanssa, edullisesti -t-BOC-L-glutamiinin kanssa. Reaktiosarja suoritetaan seuraavasti:

Hartsi

a-R2~Lys-COOH

K η j ^ I1 v a-R2-Lys- hartsi I eh - amino suo j aryhmän poisto R1 I 1 ~ H-Lys- hartsi a-R2_Gln R1 | 1 a-R2“Gln-Lys- hartsi

Kaikkien suojaryhmien ja hartsin poisto >1

H-Gln-Lys-OH

Edellä olevassa reaktiosarjassa R^ on L-lysiinin reaktiivisessa sivuketjussa oleva suojaryhmä, johon (k -aminoryhmän suojaryhmän poistaminen ei vaikuta, ja^-R2 on ^-aminoryhmän suojaryhmä. Edellä olevassa pentapeptidi-hartsi-välituotteessa suojaryhmä R·^ on edullisesti 2-klooribentsyylioksikarbonyyli, ja R2 ter- butyylioksikarbo-nyyli. Hartsi voi olla mikä tahansa edellä mainituista tällaiseen reaktioon sopivista hartseista.

12 67691

Viimeisen välituotteen valmistuksen jälkeen peptidi-hartsi pilkotaan R^- ja R2~suojaryhmien ja hartsin poistamiseksi. Suojaryhmät poistetaan tavalisella tavalla, esimerkiksi käsittelemällä vedettömällä fluorivedyllä, jolloin saadaan vapaa peptidi.

Kuten edellä korostettiin, menetelmän suorituksessa on reaktion kontrolloimiseksi välttämätöntä suojata aminoryhmät, jotta saataisiin haluttuja tuotteita. Käytettäviksi vahvasti emäksisen amino-ryhmän kanssa sopivia aminosuojaryhmiä ovat esimerkiksi suolan muodostavat ryhmät tai suojaavat uretaaniryhmät, kuten bentsyyli-oksikarbonyyli ja tert-butyylioksikarbonyyli. Edullisesti käytetään tert-butyylioksikarbonyyliä (t-BOC) tai tert-amyylioksikarbonyyliä (AOC) aminohappojen ^-aminoryhmän suojaamiseen aminohappomolekyy-lin karboksyyliryhmän reaktion aikana, sillä BOC- ja AOC-suojaryhmät voidaan helposti poistaa ennen seuraavaa reaktiovaihetta (jossa tällainen ^»-aminoryhmä itse reagoi) käsittelemällä suhteellisen lievissä olosuhteissa hapolla (esimerkiksi trifluorietikkahapolla), joka käsittely ei muulla tavoin vaikuta muiden reaktiivisten sivu-ketjujen suojaamiseen käytettyihin ryhmiin, «^-aminoryhmät voidaan siten suojata minkä tahansa sellaisen yhdisteen avulla, joka suojaa aminoryhmät seuraavassa reaktiossa tai seuraavissa reaktioissa, mutta joka voidaan myöhemmin poistaa olosuhteissa, jotka eivät muuten vaikuta molekyyliin. Esimerkkejä tällaisista yhdisteistä ovat orgaanisten karboksyylihappojen tai hiilihapon johdannaiset, joiden avulla aminoryhmä voidaan asyloida.

Yleisesti aminoryhmät voidaan suojata reaktiossa yhdisteen kanssa, joka sisältää kaavan 0 R3-0-C- mukaisen ryhmän, jossa R3 on ryhmittymä, joka estää aminoryhmän reaktion seuraavissa kytkentäreaktiossa ja joka voidaan helposti poistaa ilman molekyylin hajoa nista. R-j voi olla suora tai haarautunut, mahdollisesti tyydyttymätön, edullisesti 1-10 hiiliatomia sisältävä alkyyli, joka on edullisesti halogeeni- tai syaanisubsti-tuoitu, edullisesti 6-14 hiiliatomia sisältävä aryyli, edullisesti 5-8 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli, edullisesti 7-18 hiiliatomia sisältävä aralkyyli, edullisesti 7-18 hiiliatomia sisältävä alkaryyli tai heterosyklinen ryhmä, kuten isonikotinyyli. Aryyli-, i3 67691 aralkyyli- ja alkaryyliryhmät voivat lisäksi olla substituoituja esimerkiksi yhdellä tai useammalla 1-4 hiiliatomia sisältävällä alkyyliryhmällä. Ryhmä on edullisesti tert-butyyli, tert-amyyli, fenyyli, tolyyli, ksylyyli tai bentsyyli. Erityisen edullisia amino-suojaryhmiä ovat bentsyylioksikarbonyyli, substituoitu bentsoyyli-oksikarbonyyli, jonka fenyylirenkaassa on yksi tai useampi halogeeni, kuten Cl tai Br, nitro,alempialkoksi, esim. metoksi tai alempi-alkyyli; tert-butyylioksikarbonyyli, tert-amyylioksikarbonyyli, sykloheksyylioksikarbonyyli, vinyylioksikarbonyyli, adamantyylioksi-karbonyyli, bifenyyli-isopropoksikarbonyyli jne. Muita käytettäviksi sopivia suojaryhmiä ovat esimerkiksi isonikotinyylikarbonyyli, ftaloyyli, p-tolyylisulfonyyli, formyyli jne.

Menetelmä suoritetaan rakentamalla peptidi saattamalla vapaa -aminoryhmä reagoimaan yhdisteen kanssa, jossa on suojattuja aminoryhmiä. Reaktion eli kytkennän suorittamiseksi liitettävän yhdisteen karboksyyliryhmä aktivoidaan, jolloin se voi reagoida peptidiketjun vapaan ^-aminoryhmän kanssa. Karboksyy-liryhmän aktivoimiseksi se voidaan muuttaa reaktiiviseksi ryhmäksi , kuten esteriksi, anhydridiksi, atsidiksi, happokloridiksi tms. Vaihtoehtoisesti reaktiossa voidaan käyttää sopivaa kytkentärea-genssia. Sopivia kytkentäreagensseja on esitetty esimerkiksi teoksessa: Bodanszky et ai., Peptide Synthesis, Interscience, toinen painos, 1976, luku 5. Niistä voidaan mainita karbodi-imidit (esim. disyklohek-syylikarbodi-imidi), karbonyyli-di-imidatsolit jne.

On huomattava, että näiden reaktioiden aikana aminohapporyhmät sisältävät sekä aminoryhmiä, että karboksyyliryhmiä, joista tavallisesti toinen ryhmä reagoi ja toinen on suojattuna. Ennen kytkentävai-hetta liitetyn peptidin J*. -tai pääteaminoryhmän suojaryhmä poistetaan olosuhteissa, jotka eivät olennaisesti, vaikuta muihin suojaryhmiin, esimerkiksi lysiinimolekyylin £-aminoryhmän suojaryhmään. Edullisesti tämä suoritetaan lievissä olosuhteissa happokäsittelyllä, esimerkiksi käsittelemällä huoneen lämpötilassa trifluorietikkahapolla.

Edellä kuvatussa reaktiosarjassa saadaan tietty, määritelty peptidi, jolla on kaava

H-GLN-LYS-OH II

Vastaavan sarkosiinia sisältävän peptidin valmistus voidaan suorittaa käyttäen samaa reaktiosarjaa, jolloin käytetään suojattua 67691 1 4 sarkosiinia sopivassa menetelmävaiheessa tai sopivissa menetelmävai-heissa. Tällä tavoin voidaan valmistaa seuraavien kaavojen mukaiset peptidit: H-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-OH. Kaavan I mukaisia peptidejä, joissa A on deamino-GLN, voidaan valmistaa korvaamalla edellä kuvatuissa menetelmissä GLN suojatulla deamino-GLNryhmällä. Näin voidaan valmistaa deamino-GLN-LYS-OH.

Kaavan I mukaisia peptidejä, joissa B on LYS-NH^ tai LYS-SAR-NH^, voidaan valmistaa edellä kuvatulla menetelmällä käyttämällä siinä käytetyn kloorimetyylihartsin sijasta bentshydryylihartsia. Tällä tavalla voidaan valmistaa edellä kuvattuja C-päätekarboksipep-tidejä vastaavia C-pääteamidipeptidejä. Vaihtoehtoisessa menetelmässä näitä peptidiamideja valmistetaan suorittamalla lohkaiseminen kloorimetyylihartsista vedettömällä ammoniakilla.

Vaikka uusien kaavan I mukaisten peptidien valmistuksessa on käytetty Merrifield'in kiinteäfaasitekniikkaa, niin on käsitettävä, että voidaan käyttää myös klassisia menetelmiä, joita ovat kuvanneet esimerkiksi Bodanszky et ai. (c.l.). Esimerkkinä tämän menetelmän käytöstä esimerkissä 9 valmistettiin liuostekniikalla deamino-GLN-LYS-OH.

Valmistetut peptidit identifioitiin ja niiden aminohapposekvenssit ja puhtaus määritettiin tunnetuilla menetelmillä, kuten ohut-kerro s kr oma togr a f iällä , elektroforeesilla, aminohappoanalyysillä, NMR-spetroskopialla, alkuaineanalyysillä, IR-spektroskopialla jne.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Esimerkeissä ja koko selityksessä tarkoittavat paino-osia, jollei muuta ilmoiteta.

Esimerkki 1

Erään kaavan I mukaisen peptidin valmistuksessa seuraavat lähtöaineet olivat kaupallisia tuotteita: <A-BOC-L-glutamiini <A- BOC- £ -bentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini Näissä BOC tarkoittaa tertbutyylioksikarbonyyliryhmää. Aminohappo-sekvenssin määritykseen käytettävät "Sequenal"-reagenssit, disyklo-heksyylikarbodi-imidi (DCC), ninhydriini ja hartsi olivat kaupallisia tuotteita. Käytetty hartsi oli bentshydryyliamiinihartsi, jonka kapasiteetti oli 0,5 mekv/g hartsia.

Il 15 67691

Peptidin valmistuksessa ^-BOC-£-bentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini kytkettiin bentshydryyliamiinihartsiin käyttäen DCC-kytkentä-reagenssia. Saatu suojattu aminohappo-hartsi sisälsi 0,4-0,5 iranol aminohappoa yhtä hartsi-grammaa kohti. Laitteella Schwarz/Mann Automatic Peptide Synthesizer suoritettiin seuraava ohjelma kunkin BOC-suojatun aminohapon kytkemiseksi BOC-aminohappo-hartsiin: 1. Esipesu 40-%:isella trifluorietikkahapolla (TFA) Cf^C^iSsa, 1 x, 1,5 min.

2. Suojaryhmän poisto 40-%:isella TFA:lla O^C^sssa, 1 x, 20 min.

3. Pesi CHCljilla, 1 x, 1,5 min.

4. Pesu etanolilla, 1 x, 1,5 min.

5. Pesu Cl^C^illa/ 2 x, 1,5 min.

6. Esipesu 10isella Cl^C^iSsa, 1 x, 1,5 min.

7. Nautralointi 10-%:isella ( C2Hs)3N:-^^ Cl^C^issa, 1 x, 10 min.

8 Pesu Cl^C^illa/ 3 x, 1,5 min.

9. BOC-suojatun aminohapon lisäys (5 mol ylimäärin) dimetyyliform-amidissa (DMF) ja Cl^C^sssa )1 s 9 vol/vol) .

10. DCC:n pisäys Ct^C^sssa (0,5-m, 5 mol ylimäärin), reaktioaika aina 2 tuntiin asti.

11. Pesu C^C^slla, 2 x, 1,5 min.

Tämän jälkeen J\ -BOC-aminohapot kytkettiin samalla tavalla käyttäen ekvivalenttisia määriä DCCrtä oikeassa järjestyksessä peptidi-hartsin ^v-aminoryhmiin, joista suojaryhmät oli poistettu, jolloin saatiin kaavan I mukainen peptidi. Kunkin kytkentäreaktion jälkeen hart-sinäytteestä kokeiltiin ninhydriinillä, ja jos tulos oli positiivinen niin kytkentä oli epätäydellinen ja toistettiin käyttäen samaa suojattua aminohappoa. Yhdestä kytkentäreaktiosta qt-BOC-L-glutamiinin kanssa saatiin seuraava peptidi-hartsi:

CBZ

-BOC-GLN-LYS-harts i jossa BOC on butyylioksikarbonyyli ja CBZ on bentsyylioksikarbonyyli.

Tämä peptidi-hartsi pilkottiin ja suojaryhmät poistettiin Kel-F-pilkkomislaitteessa (Peninsula Laboratories, Inc.) käyttäen 10 ml vedetöntä fluorivetyä yhtä hartsi-grammaa kohti 0°C:ssa 60 minuutin aikana anisolin läsnäollessa (5 ml/peptidi-hartsi-g) sivutuotteita sitovana aineena. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin tyhjössä ja jäännös pestiin vedettömällä eetterillä. Epäpuhdas peptidi liuotettiin _____ - 16 67 6 91 10-%:iseen etikkahapon vesiliuokseen ja suodatettiin. Hartsi pestiin 10-%:isella etikkahapon vesiliuoksella ja yhdistetyt suodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin epäpuhdasta peptidiä. Epäpuhdas peptidi puhdistettiin vastavirtajakautumalla käyttäen partitiofaasina n-butanoli: etikkahappo: vesiseosta (4:1:5), jolloin saatiin puhdas peptidi. Saadulla peptidillä oli kaava: h-gln-lys-nh2

Sen identifioimiseen käytettiin ohutkerroskromatografiaa ja elektroforeesia. Aminohappokoostumus määritettiin aminohappoanalysaattorilla.

Ohutkerroskromatografia-analyysi suoritettiin 20^,ug näytteillä silik'ageelillä (Kieselgel, 5 x 20 cm) käyttäen liuotinsysteemiä n- butanoli:etikkahappo:etyyliasetaatti:vesi (1:1:1:1) (R^1) ja selluloosa 6064:llä (Eastman 20 x 20 cm) käyttäen liuotinsysteemiä n-butanoli: pyridiini:etikkahappo:vesi )15:10:3:12) (R^2). R^-arvot H-ARG-LYS-ASP- 1 2 r VAL-TYR-0H:n suhteen olivat R^ =1,16 ja Rf = 0,57. Sumutusreagenssi-na käytettiin ninhydriiniä.

Elektroforeesi suoritettiin lGO^ug näytteellä Whatman nro 3 paperilla (5,7 x 55 cm) pH-arvossa 5,6 käyttäen pyridiini-asetaatti-puskuria ja 1000 V jännitettä 1 tunnin aikana. Pentapeptidin'liikkuvuus katodia kohti suhteessa H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-0H:n liikkuvuuteen oli 2,21. Sumutusreagensseina käytettiin ninhydriiniä ja Pauly-rea-genssia.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 peptidin aktiivisuuden ja ominaisuuksien määrittämiseen käytettiin 5-6 viikon ikäisiä, kumpaakin sukupuolta olevia nu/nu-hiiriä, jotka oli kasvatettu BALB/c-taustalla (tymosyyttejä, jotka ilmaisevat Thy-1,2-pinta-antigeenin) ja pidetty tavallisissa olosuhteissa. Antiseerumit, anti-Thy-1,2-seerumit valmistettiin saman-syntyisissä Thy-l-hiirissä.

*f- "f"

Thy-1 T-solujen tai CR -B-solujen differentiaation indusoimisek-si in vitro suoritettiin tymosyyttien differe.a toiminen protymosyy-teistä in vitro Komuron ja Boysen (Lancet, 1, 740, 1973) kuvaamalla tavalla käyttämällä T-soludifferentiaation merkitsijänä Thy-1,2:n saamista. CR+ B-solujen differentaation induktio CR B-soluprekurso-reista in vitro saatiin aikaan samankaltaisissa olosuhteissa käyttämällä kokeen kriteerinä CR+ B-solujen kykyä sitoa lampaan erytrosyyttejä, jotka oli päällystetty subagglutinoivilla määrillä kaniinin vas- 17 67691 ta-ainetta ja ei-lyyttistä komplementtia. Molempien prekursorityyp-pien (Thy-1 ja CR ) lähteenä käytettiin terveistä nu/nu-hiiristä peräisin olevia pernasolupopulaatioita, jotka oli fraktioitu epäjatkuville härän seerumialbumiinigradienteille, sillä nämä prekurorit sisältävät vain harvoja tai ei lainkaan Thy-l+-soluja ja vähäisen määrän CR+-soluja.

Tämän määrityksen tulokseksi saatiin, että peptidillä oli samankaltainen selektiivinen vaikutus kuin ubikitiinilla sen pystyessä indusoimaan Thy-1+ T-lymfosyyttien differentiaatiota ja komplementti-reseptorien, (CR+) B-lymfosyyttien dif ferentiaatiota pitoisuuksina 10 ng/ml - lO^ug /ml.

Esimerkit 3-7

Noudattamalla esimerkin 1 menetelmää, mutta lepyttämällä suojattua sarkosiinia (esim. i. -BOC-sarkosiinia) sopivissa vaiheissa valmistettiin seuraavat yhdisteet:

Esim· Yhdiste 3 h-gln-lys-sar-nh2 4 H-SAR-GLN-LYS-NH, 5 H-5AR-SAR-GLN-LYS-NH2 6 h-sar-sar-sar-gln-lys-nh2 7 H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH 2 Näiden peptidien aminohapposekvenssi määritettiin aminohappo-analysaattorilla. Ohutkerroskromatografia ja elektriforeesi suoritettiin samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1, jolloin saatiin seuraavat tulokset: 18 67691

Liikkuvuus katodia n 1 D 2 kohti Esim. f f 3 0,73 0,52 1,52 (2 tuntia) 4 1,16 0 f 5 7 2,04 5 0,83 0,61 1,38 6 0,5 0^53 1,83 7 0,32 0, 54 1,98 (2 tuntia)

Kaikki R^- ja elektroforeesiarvot ovat suhteessa referenssipeptidiin H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH.

Esimerkki 8

Noudattamalla esimerkin 2 menetelmää määritettiin esimerkkien 3-7 yhdisteiden kyky indusoida Tht-1+ T-lymfosyyttien ja CR+ B-lymfosyyttien differentiaatiota. Aktiviteettialueet olivat seuraavat:

Yhdiste Aktiivinen konsentraatio- esimerkistä nro alue_ 3 100 ρσ/xl - 100 ησ/ml 4 1-10 ug/nl 5 100 pc/ml - 10 ng/xi 6 10 fc/xl - 100 pc/xl 1 1-100 pc/xl

Esimerkki 9 N£ -bentsyvlioksikarbonyyli-L-lysiinin (20,0 g, 0,0713 mol) suspensioon pyridiinissä (400 ml) lisättiin 0°:ssa N2~kehässä voimakkaasti sekoittaen 4-(klooriformyyli)butyraattia (12,9 g 0,0785 mcl). Seosta sekoitettiin 1,5 tuntia 0°C:ssa ja 0,5 tuntia 23°C:ssa. Pyri-diini haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin epäpuhdasta keltaista öljyä (38 g), joka kromatografoitiin SilicAR CC-7:llä (600 g). Eluoimalla l,3-%:isella MeOH/CHCl^-seoksella saatiin vaaleankeltaista öljyä (30,6 g), joka kromatografoitiin uudelleen SilicaAR-CC-7:llä (900 g). Eluoimalla l,3-%:isella MeOH/CHCl^:11a saatiin kirkas väritön öljy (24,3 g). Se kiteytettiin kahdesti etyyliasetaat-ti/heksaani-seoksesta 2:1, jolloin saatiin valkea kiinteä aine, deamino-GLU-OMe-N^ -bentsyylioksikarbonyyli-LYS, sp. 64-66°C.

19 67691 Tämän valkean kiinteän aineen (5,0 g, 0,018 mol) liuokseen metanolissa (200 ml) lisättiin 10-%:ista Pd/C-katalysaattoria (500 mg). Seosta hydrattiin 280 kPa paineessa 4 tuntia, se suodatettiin ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin valkeata kiinteätä ainetta (3,6 g), joka kiteytettiin MeOH: Et20-seokse sta (LO :1), jolloin saatiin valkeata kiinteätä ainetta, deamino-GLU-OMe-LYS, sp. 203-204°C.

Saatu tuote (200 mg, 0,00073 mol) liuotettiin väkevään ammoniakkiin (58 %, 10 ml) ja seosta sekoitettiin 16 tuntia 23°C:ssa. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin valketa kiinteätä ainetta (190 mg), joka kiteytettiin MeOH:Et20: 1^0-seoksesta 10:4:1, jolloin saatiin valkea kiinteä tuote, deamino-GLN-LYS (100 mg), sp. 235°C (hajoaa), NMR (D2) vi ' 1/75 (m, 8H, metyleeni H), 2,43 (m, 4H, C-CH2-CH2-CH2-C-) 3,02 (m, 2H, -C^-NH^ , 4,15 (m, 1H,- II " o o CH-CO^H); IR (KBr)3436 cm"1 (-C-NH-, NH venytys), 1642 cm"1 (-C-NH-,

^ Il II

o o

C=0 venytys, amidi I nauha), 1541 cm 1 (-C-NH, C=0 venytys, amidi II

II

o nauha); MS (näyte): m/e 259 (pääpiikki) .

Analyysi, laskettu kaavalle <-ρρ^21^3^*4: ^ ^0,95 H, 8,16 N 16,20 saatu: C 51,10 H, 8,28 N 15,96.

Esimerkit 10-11

Noudattamalla esimerkkien 1 ja 3 menetelmää, mutta käyttämällä niissä käytetyn suojatun L-glutamiinin sijasta ekvivalenttista määrää deaminoglutamiinia valmistettiin seuraavat yhdisteet:

Esimerkki Kaava 10 d eami no-GLN-LYS-NH 2 11 deamino—GLN-LYS-SAR-NH2

Esimerkki 12

Noudattamalla esimerkkien 1, 3-7 ja 10,11 menetelmää, mutta käyttämällä niissä käytetyn bentshydryyliamiinihartsin sijasta poly-styreenidivinyylibentseenihartsia, joka sisälsi 1 % divinyylibentsee-niä ja 0,75 mmol kloridia hartsi-grammaa kohti, valmistettiin C-kar- 20 67691 boksyylipäätepeptidit, jotka vastasivat mainituissa esimerkeissä valmistettuja C-amidipäätepeptidejä.

Esimerkeissä 10 - 12 valmistetulla peptideillä on esimerkissä 2 kuvattu biologinen aktiivisuus.

Claims (4)

21 67691

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan I mukaisten peptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, A - B (I) jossa A on deamino-GLN, GLN tai (SAR)n~GLN, jossa n on kokonaisluku 1-4, ja B on LYS-OH, LYS-NH2 tai LYS-SAR-NH2, tunnettu siitä, että a) B-aminohappo, jonka cL -aminoryhmä on suojattu, liitetään kovalenttisella sidoksella polymeerihartsiin, joka sisältää funktionaalisen ryhmän, johon ensimmäinen suojattu aminohappo voidaan lujasti liittää kovelenttisella sidoksella, b) cK -aminosuojaryhmä poistetaan B-aminohaposta, c) A-aminohappo, jonka mahdollisesti läsnäoleva oC -aminoryhmä on suojattu ja jonka S -aminoryhmä on suojattu liitetään B-amino-happohartsiin, d) kun ryhmä A sisältää yhden tai useampia sarkosyyliryhmiä, sopiva sarkosiini, jonka ^-aminoryhmä on suojattu, liitetään ketjuun, ja <*. -aminosuojaryhmä poistetaan sarkosyyliryhmästä, ja tämä toimenpide toistetaan, kun n on suurempi kuin 1, ja e) kun ryhmä B sisältää sarkosyyliryhmän, sarkosiini, jonka ^-aminoryhmä on suojattu, liitetään hartsiin ennen vaihetta a) , ot-aminosuojaryhmä poistetaan siitä, ja B-ryhmän muu osa liitetään SAR-hartsiin, f) saadusta peptidistä poistetaan hartsi ja kaikki suojaryhmät sopivilla reagensseilla, ja peptidi muutetaan haluttaessa farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan h-gln-lys-nh2 mukaisen peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa a) käytetään LYS-aminohappoa ja vaiheessa c) GLN-amino-happoa ja hartsi on bentshydryyliamiinihartsi. 67691 22

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan H-SAR-GLN-LYS-NH2, H-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2, H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2, tai H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2 mukaisen peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että reaktiovaihe d) suoritetaan tarvittavan monta kertaa ennen hartsin ja kaikkien suojaryhmien poistamista peptidistä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan deamino-GLN-LYS-OH mukaisen peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa s) käytetään LYS-aminohappoa ja vaiheessa c) deamino-GLN-aminohappoa. Il 23 67691