FI70905C - Analogifoerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara pentapeptidderivat vilka har biologisk foermaoga att inucera differentiering av t-lymfocyter men ej av komplemen trceptor-(cr+)-b-lymfocyter - Google Patents

Description

ΓΒ1 M\ KUULUTUSJULKAISU

UTLÄGG NIN GSSKRI FT 70 90 5

•"•/λί? C (45) Γ- i: 0 t1 i 7 2::. _ 11J

\*§έΰ$) Pitr-r.t n:c.:’-ht G7 10 10CG

(51) Kv.ik.*/Int.ci.‘ C 07 K 7/06, 7/kS

(21) Patenttihakemus — Patentansökning 801 130 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 09.0*1.80 (FI) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 09 . Ok . 80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 1 3 · 1 0.80

Patentti- ja rekisterihallitus /44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm.— 18.07.86

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad ' ' (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 1 2,0*1.79 » 13.03.80 USA(US) 29595, 12^959 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceut icsl Corporation, Route 202, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey, George Heavner, Flemington,

New Jersey, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Analogiamenetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten pentapeptidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on biologinen kyky indusoida T-imusolujen, mutta ei kömpiementtireseptori-(CR+)-B-imusolujen erilaistumista - Analogiför-farande för framstälIning av terapeutiskt användbara pentapeptidder?vat, vilka har biologisk förmäga att inducera differentiering av T-lymfocyter, men ej av komplementreceptor-(CR+)-B-lymfocyter

Keksinnön kohteena on analogiamenetelmä pentapeptidijohdannaisten ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joilla on biologinen kyky indusoida T-imusolujen, mutta ei komplementtireseptori-(CR+)-B-imusolujen erilaistumista, ja joilla on yleinen kaava: H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R’ jossa X on LYS tai SAR, Y on Vai tai SAR, edellyttäen, että Y on SAR, kun X on LYS, ja R’ och OH tai N^· US-patenttijulkaisussa 4 190 646 on kuvattu sarjan H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH pentapeptidi sekä peptidivalmisteita, joissa erilaisia ryhmiä on substituoitu tämän pentapeptidin amino- tai karboksyy- 2 70905 lipääteryhmään. Pentapeptidistä, jonka järjestys on annettu yllä, käytetään tässä nimitystä "tymopoietiinipentapeptidi" tai "TP5". Yllä mainitussa julkaisussa on kuvattu, että tymopoietiinipentapeptidillä ja sen johdannaisilla on samanlaista biologista aktiivisuutta kuin pitkäketjuisella polypeptidillä, joka tunnetaan tymopoietiinina ja joka on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 002 740 ja 4 077 949. Tymopoietiinipentapeptidi, jonka on kuvattu olevan aktiivisin patentissa esitetty yhdiste, osoitti aktiivisuutta sen esimerkin II hiirikokees-sa väkevyyksillä, jotka vaihtelivat välillä 1 mg/ml-10 ug/ml. TP 5:n biologista aktiivisuutta on kuvattu myös artikkelissa M.E. Weksler, et. ai. J. Exp, Med. 148: 996-1006 (1978).

Keksinnön mukaiset peptidit ovat hämmästyttävästi ja merkittävästi aktiivisempia kuin tymopoietiinipentapeptidi.

Keksinnön mukaisilla pentapeptideillä on kyky aiheuttaa luuydin-solujen erilaistumista T-soluiksi indusoiden täten kateenkorvaperäi-siä imusoluja, ja ne ovat tämän vuoksi erittäin hyödyllisiä ihmisten ja eläinten immuunijärjestelmässä.

Keksinnön mukaiselle pentapeptidien valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että i) sidotaan L-tyrosiini, jonka Ot-aminoryhmä ja hydroksyyli-ryhmä on suojattu, polymeerihartsiin kovalenttisella sidoksella, joka polymeeri on sellainen, että se sisältää funktionaalisen ryhmän, johon L-tyrosiini voidaan lujasti yhdistää mainitulla kovalenttisella sidoksella; ii) poistetaan OC-aminoryhmää suojaava ryhmä L-tyrosiiniosas- ta; iii) annetaan tämän reagoida VAL- tai SAR-aminohapon kanssa, jonka OC-aminoryhmä ja mahdolliset muut reaktiokykyiset ryhmät, mutta ei OC-karboksyyliryhmä, on suojattu VAL- tai SAR-aminohapon liittämiseksi L-tyrosiini-hartsiin; iv) poistetaan OC-aminoryhmää suojaava ryhmä VAL- tai SAR-aminohappo-osasta; v) annetaan tämän reagoida asparagiinihapon kanssa, jonka

Oi-aminoryhmä ja terminaalinen karboksyyliryhmä, mutta ei OC-karboksyyliryhmä, on suojattu viimeksimainitun liittämiseksi VAL-(tai SAR) -L-tyrosiinihartsiin; vi) poistetaan OC-aminoryhmää suojaava ryhmä asparagiinihap-po-osasta; 3 70905 vii) annetaan tämän reagoida LYS- tai SAR-aminohapon kanssa, jonka ot-aminoryhmä ja mahdolliset muut reaktiokykyiset ryhmät, mutta ei <X-karboksyyliryhmä, on suojattu viimeksimainitun liittämiseksi ASP-VAL(tai SAR)-L-tyrosiinihartsiin; viii) poistetaan (K-aminoryhmää suojaava ryhmä LYS- tai SAR-aminohappo-osasta; ix) annetaan tämän reagoida arginiinin kanssa, jonka OC-amino-ryhmä ja guanidiinoryhmä, mutta ei sen OC-karboksyyliryhmä, on suojattu, viimeksimainitun liittämiseksi LYS(tai SAR)-ASP-VAL(tai SAR) -L-tyrosiinihartsiin; ja x) poistetaan hartsi ja kaikki suojaryhmät peptidistä sopivilla reagensseilla; ja haluttaessa valmistetaan yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Yllättäen on havaittu, että keksinnön mukaisesti peptidit ovat jopa 10 000 kertaa voimakkaampia kuin tymopoietiinipentapeptidi. Koska yleensä ei ole mahdollista polypeptidialalla ennustaa polypeptidin aktiivisella alueella olevien substituutioiden vaikutusta, ei ole mitenkään ilmeistä, että keksinnön mukaisilla yhdisteillä olisi lainkaan aktiivisuutta puhumattakaan havaitusta huomiota herättävästä voimakkuudesta. Ennustamatonta luonnetta osoittaa se, että keksinnön mukainen pentapeptidi oli aktiivinen väkevyydellä 0,1 pg/ml alla olevassa esimerkin II kokeessa.

Tämän keksinnön pentaptidit osoittautuvat erittäin epätavallisiksi, sillä niillä on sama biologinen aktiivisuus kuin pitkäketjui-sella luonnon peptidillä, tymopoietiinilla, jonka osaa keksinnön mukaiset pentapeptidit muistuttavat. Tämän vuoksi arvellaan, että molekyylin aktiivisuuden kehittää molekyylin stereokemia, ts. molekyylin erityinen "laskostus". Tässä suhteessa on ymmärrettävä,että polypepti-disidokset eivät ole jäykkiä, vaan taipuisia tehden näin polypepti-deille mahdolliseksi esiintyä lamelleina, kierukoina yms. Tästä johtuen koko molekyyli on joustava ja "laskostuu" tietyllä tavalla.

Tässä keksinnössä on havaittu, että pentapeptidi "laskostuu" samalla tavoin kuin pitkäketjuinen luonnon polypeptidi ja tämän vuoksi sillä on samat biologiset ominaisuudet.

Pentapeptidin kykyä säilyttää biologinen aktiivisuutensa ja luonnollinen laskostus kuvaa se seikka, että sillä on sama aktiivisuus kuin on kuvattu olevan tymopoietiinipentapeptidillä yllä mainitussa patentissa samoin kuin itse tymopoietiinilla.

4 70905

Happoina, jotka kykenevät muodostamaan suoloja peptidien kanssa voidaan mainita epäorgaaniset hapot kuten kloorivetyhappo, bromivety-happo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosfo-rihappo jne ja orgaaniset hapot, kuten esim. muurahaishappo, etikka-happo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, palorypälehappo, oksaalihappo, malonihappo, meripihkahappo, maleiinihappo, fumaarihappo, antraniilihappo, kanelihappo, naftaleenisulfonihappo tai sulfaniili-happo.

Yllä olevissa rakenteissa peptidien aminohappokomponentit merkitään mukavuussyistä lyhenteinä. Nämä lyhenteet ovat seuraavat: Aminohappo Lyhennetty nimi

L-arginiini ARG

L-lysiini LYS

L-asparagiinihappo ASP

L-valiini VAL

L-tyrosiini TYR

Sarkosiini SAR

Tämän keksinnön peptideillä on havaittu olevan samantapaiset ominaisuudet kuin tetradekanona-aminohappopolypeptideillä, jota on eristetty naudan kateenkorvasta (tymopoietiini), keksinnön peptideille on erityisesti luonteenomaista niiden kyky aiheuttaa selektiivistä Thy-1+ T-solujen (mutta ei CR+ B-solujen) erilaistumista väkevyyksillä 0,1 pg/ml - 10 ng/ml. Thy-1 on erilaistumisalloantigeeni, jota on läsnä T-soluissa, mutta ei B-soluissa, kun taas CR on komplementti-reseptori, jota on läsnä B-soluissa, mutta ei T-soluissa.

Näiden synteettisten peptidien tutkimukset indusointikokeessa in vitro osoittivat niillä olevan saman indusointispesifisyyden kuin Thymopoietin II-yhdisteellä. Toisin sanoen ne aiheuttivat Thy-1 -solujen erilaistumisen Thy-1+-soluiksi, mutta eivät aiheuttaneet CR -solujen erilaistumista CR+B-soluiksi. Vaikka on tunnistettu monia aineita, jotka voivat jäljitellä tymopoietiinia in vitro ja aiheuttaa T-solujen erilaistumista kohottamalla solunsisäistä syklistä AMP-arvoa, korostetaan että vain harvat aineet ovat aktiivisia näin pienellä väkevyydellä ja tämän keksinnön peptidit ovat selektiivisiä aiheuttaen T-solun erilaistumisen, mutta eivät CR+ B-solujen erilaistumista.

5 70905

Johtuen näistä tämän keksinnön peptidien ominaisuuksista ne ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia ihmisten ja eläinten hoidossa, sillä ne kykenevät indusoimaan punasoluja synnyttävistä kudoksista peräisin olevien imusoluja synnyttävien kantasolujen erilaistumisen kateenkorvaperäisiksi soluiksi tai T-soluiksi, jotka kykenevät aiheuttamaan immunireaktion kehoon. Tästä johtuen tämän keksinnön tuotteella katsotaan olevan lukuisia terapeuttisia käyttöjä. Ensi sijassa koska yhdisteillä on kyky suorittaa tiettyjä kateenkorvan toimintoja, niillä on käyttöä erilaisilla kateenkorvatoiminnan ja immuniteetti-alueilla. Pääasiallinen käyttöalue on DiGeorge-oireiston hoidossa, tilan, jossa esiintyy kateenkorvan synnynnäinen puuttuminen. Peptidien ruiskuttaminen korvaa tämän puutteen. Johtuen niiden biologisista ominaispiirteistä, jolloin ne ovat erittäin aktiivisia pienillä väkevyyksillä, niiden katsotaan olevan hyödyllisiä avustamaan kehon yhteisimmuniteettiä siten, että peptidit lisäävät tai avustavat solu-immuniteetin terapeuttisessa kiihottamisessa ja ovat täten hyödyllisiä tautien hoidossa, joihin liittyy krooninen tartunta in vivo, kuten sieni- tai mykoplasmatartunnat, tuberkoloosi, lepra, akuutit ja krooniset virustartunnat yms. Edelleen ko. yhdisteiden katsotaan olevan hyödyllisiä millä tahansa alueella, jossa soluimmuniteetista on kysymys ja erityisesti siellä, missä esiintyy immuniteetin puutteita, kuten yllä mainitussa DiGeorge-oireistossa. Samoin kun esiintyy liiallista vasta-ainetuotantoa johtuen T-solujen ja B-solujen epätasapainosta, nämä yhdisteet voivat korjata tämän tilan kiihdyttämällä T-solutuotantoa. Näin ollen niillä voi olla terapeuttista käyttöä tietyissä auto inunun i sa ir auk s i s s a, joissa on läsnä vahingollisia vasta-aineita, esim. systeeminen lupus erythematosus. Edelleen johtuen peptidien ominaispiireistä niistä on hyötyä in vitro T-solujen pinta-antigeenien kehittymisen indusoinnissa, toimintakapasiteetin kehittymisen aiheuttamisessa reaktiokyvyn saavuttamiseksi mitogeeneille ja antigeeneille ja solujen yhteistoiminnan indusoimiseksi parannettaessa B-solujen kykyä tuottaa vasta-aineita. Peptidit ovat hyödyllisiä myös imusolujen kontrolloimattoman lisääntymisen hillitsemisessä.

Peptidien tärkeä ominaispiirre on niiden kyky in vivo palaut taa soluihin T-solujen ominaisuudet. Tämän vuoksi tämän keksinnön peptidit ovat aktiivisia monilla alueilla seurauksena niiden kyvystä 6 70905 lisätä immunireaktiota kehossa. Koska tämän keksinnön peptidit vaikuttavat neuromuskulaariseen transmissioon, erittäin suuret annokset tämän keksinnön peptidejä ovat hyödyllisiä tautien kuten kankeuden hoidossa, joissa esiintyy liiallista neuromuskulaarista transmissiota .

Toinen tämän keksinnön peptidien tärkeä ominaisuus on se, että ne ovat erittäin aktiivisia hyvin pienissä pitoisuuksissa, jotka vaih-televat alkaen 0,1 pg/ml:sta. Kantoaine voi olla mikä tahansa tarkoitukseen hyvin tunnetuista kantoaineista mukaanluettuna normaalit fysiologiset suolaliuokset, joissa on edullisesti proteiinilaimenninta, kuten naudan seerumialbumiinia (BSA) adsorptiohäviöiden estämiseksi lasitavaraan näillä pienillä pitoisuuksilla. Tämän keksinnön peptidit ovat aktiivisia ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annoksella n. 1 ng/kg ruumiinpainoa. DiGeorge-oireiston hoitoon polypeptidejä voidaan antaa n. 0,1 - 10 ng/kg:n määrä ruumiinpainoa kohti. Yleensä samoja annostusmääriä voidaan käyttää muiden mainittujen tilojen tai tautien hoidossa.

Tämän keksinnön farmaseuttisten valmisteiden valmistamiseksi kaavan (I) polypeptidi tai sen happoadditiosuola yhdistetään aktiivisena aineosana perusteellisesti sekoitettuna farmaseuttiseen kanto-aineeseen tavanomaisen farmaseuttisen sekoitustekniikan mukaisesti, jolla kantoaineella voi olla lukuisia eri muotoja riippuen antamista-vasta, (esim. kielenalainen, peräsuolen, nenän tai suun kautta tapahtuva anto tai ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antotapa). Valmistettaessa seoksia oraaliseen annostusmuotoon voidaan käyttää mitä tahansa tavallisia farmaseuttisia väliaineita, kuten esimerkiksi vettä, glykoleja, öljyjä, alkoholeja, mausteaineita, säilytysaineita, vär-jäysaineita yms. oraalisten nestemäisten valmisteiden, kuten esimerkiksi suspensioiden, lääkejuomien ja liuosten tapauksessa; tai kan-toaineita, kuten tärkkelyksiä, sokereita, laimentimia, rakeistus-aineita, voiteluaineita, sideaineita, hajotusaineita yms. oraalisten kiinteiden valmisteiden, kuten esimerkiksi jauheiden, kapseleiden ja tablettien kyseessä ollen. Tablettien ja kapseleiden antamisen helppoudesta johtuen ne edustavat edullisinta oraalista annostusyksikko-muotoa, jossa tapauksessa käytetään luonnollisesti kiinteitä farmaseuttisia kantoaineita. Haluttaessa tabletit voivat olla sokeri- tai enteropäällystettyjä standarditekniikalla. Ruoansulatuskanavan ulkopuolisia valmisteita varten kantoaine koostuu tavallisesti steriilis- 7 70905 tä vedestä, vaikka muita aineosia, esimerkiksi liukenevuuden auttamiseksi tai säilytystarkoituksiin voidaan sisällyttää mukaan. Voidaan myös valmistaa ruiskutettavia suspensioita, missä tapauksessa voidaan käyttää sopivia nestemäisiä kantoaineita, suspendointiaineita yms. Keksinnön ruoansulatuskanavan ulkopuoliset farmaseuttisest valmisteet tulisi laatia antamaan potilaalle esillä olevia polypeptidejä n. 0,1-100 ng/kg:n määrä ruumiinpainoa kohti. Oraalisina valmisteina tulisi antaa potilaalle n. 100-1000 kertaa ruoansulatuskanavan ulko-puolisesti annettava annos, ts. n. 10 ng/kg - 100 yug/kg ruumiinpainoa. Näin ollen ruoansulatuskanavan ulkopuolisten valmisteiden tulisi sisältää annostusyksikköä kohti n. 5 ng - 5 /ug, kun taas oraalisten valmisteiden tulisi sisältää annotusyksikköä kohti n. 500 nq - 5 mg esillä olevaa polypeptidiä.

Tämän keksinnön polypeptidit valmistetaan käyttäen samoja periaatteita kuin Merrifield'in menetelmässä,joka on kuvattu julkaisussa Journal of American Chemical Society, 85, sivut 2149-2154, 1963. Synteesiin liittyi suojattujen aminohappojen asteittainen lisäys kasvavaan peptidiketjuun, joka sidottiin kovalenttisin sidoksin kiinteään hartsikantajaan. Tällä menettelyllä reagensseja ja sivutuotteita poistettiin suodattamalla ja välituotteiden uudelleenkiteytys eliminoitiin. Tämän menetelmän yleisenä periaatteena on ketjun C-pääte-aminohapon kiinnittäminen kiinteään polymeeriin kovalenttisidoksella ja seuraavien aminohappojen lisääminen yksi kerrallaan vaiheittaisella tavalla, kunnes haluttu järjestys on kokoonpantu. Lopuksi peptidi poistetaan kiinteästä kantajasta ja suojaryhmät poistetaan. Tällä menetelmällä aikaansaadaan kasvava peptidiketju kiinnitettynä täysin liukenemattomaan kiinteään kantajaan niin, että se on sopivassa muodossa suodatettavaksi ja pestäväksi puhtaaksi reagensseista ja sivutuotteista.

Aminohapot voidaan kiinnittää mihin tahansa sopivaan polymeeriin, jonka on oltava ainoastaan helposti erotettavissa reagoimattomista reagensseista. Polymeeri voi olla liukenematon käytettyihin liuottimiin tai se voi olla liukeneva tiettyihin liuottimiin ja liukenematon toisiin. Polymeerillä tulee olla stabiili fysikaalinen muoto, joka sallii helpon suodatuksen. Sen on sisällettävä funktionaalinen ryhmä, johon ensimmäinen suojattu aminohappo voidaan lujasti liittää kovalenttisella sidoksella. Erilaisia liukenemattomia polymeerejä, jotka sopivat tähän tarkoitukseen, ovat sellaiset kuin sellu- 8 70905 loosa, polyvinyylialkoholi, polymetakrylaatti ja sulfonoitu poly-styreeni, mutta tämän keksinnön synteesissä käytettiin styreenin ja divinyylibentseenin kloorimetyloitua kopolymeeria. Polymeerejä, jotka ovat liukenevia orgaanisiin liuottimiin samalla, kun ne ovat liukenemattomia vesipitoisiin liuottimiin, voidaan myös käyttää. Eräs tällainen polymeeri on polyetyleeniglykoli, jonka molekyylipaino on n.

20 000, joka liukenee metyleenikloridiin, mutta on liukenematon veteen. Tämän polymeerin käyttöä peptidisynteesissä on kuvattu artikkelissa F. Bayer ja M. Mutter, Mature 237, 512 (1972) ja siihen sisältyvissä kirjallisuusviitteissä.

Ne aminohapossa olevat eri funktionaaliset ryhmät, jotka olivat aktiivisia, mutta joiden ei ollut tarkoitus osallistua reaktioihin, suojattiin tavanomaisilla suojäävillä ryhmillä, joita käytetään poly-peptidialalla, koko reaktion ajaksi. Niinpä lysiinissä oleva funktionaalinen ryhmä suojattiin suojäävillä ryhmillä, jotka voitiin poistaa peräkkäisen sarjan tultua valmiiksi, vaikuttamatta haitallisesti poly-peptidilopputuotteeseen. Synteesissä ninhydriiniä käytettiin määrittämään oliko liittyminen mennyt loppuun. Ellei täydellistä liittymistä osoitettu, liittäminen toistettiin.

C-pääteaminohappo voidaan kiinnittää polymeerin lukuisilla tunnetuilla tavoilla. Yhteenvetoja menetelmistä kiinnittämiseksi halo-metyylihartseihin on esitetty artikkeleissa Horiki, et ai, Chem. Letters sivut 165-168 (1978) ja Gisin, Helv. Chim, Acta, 56, 1476 (1973) ja niissä annetuissa kirjallisuusviitteissä. Jos on määrä valmistaa C-pääteamidi, voidaan käyttää yhtä tai kahta tietä. Joko pep-tidihartsi, joka on valmistettu Merrifield'in tekniikan mukaisesti, voidaan lohkaista hartsista käyttäen vedetöntä ammoniakkia tai voidaan käyttää bentshydryyliamiinihartsia. Lohkaisu tästä jälkimmäisestä hartsista fluorivedyllä tuottaa C-pääteamidipeptidin. Bentshydryy-liamiinihartsin käyttö esitetään esimerkiksi artikkelissa J. Rivier et ai, J. Med. Chem. 16, sivut 545-549 (1973).

Yleiseen menettelyyn C-päätekarboksyylipeptidien valmistamiseksi kuului aluksi L-tyrosiinin esteröinti, joka oli suojattu amino-ja hydroksyyliryhmistään, kloorimetyylihartsiin Gisin'in CsHCO-j-me-netelmällä. Tyrosiiniaminohapon <x-aminoryhmässä oleva suojaava ryhmä (esim. t-BOC, ts. t-butoksikarbonyyliryhmä) poistettiin sitten vaikuttamatta muihin suojääviin ryhmiin. Aminohappohartsi suodatettiin, pestiin ja neutraloitiin sitten. Saadun aminohappohartsin, jossa oli 9 70905 vapaa aminoryhmä, annettiin sitten reagoida suojatun L-valiinin, edullisesti alfa-t-BOC-L-valiinin kanssa L-valiinin liittämiseksi aminohappo-hartsiin. Reaktiot toistettiin sitten suojatulla L-aspar-giinihapolla, sarkosiinilla ja L-arginiinilla, kunnes lopullinen molekyyli oli valmistettu. Tätä menettelyä käytettiin viiden aminohapon aktiivisen perussarjan muodostuksessa. Muiden neutraalien aminohappotähteiden lisääminen ketjun jompaan kumpaan päähän suoritetaan käyttäen samaa reaktioiden järjestystä, joka tunnetaan alalla. Reaktioiden järjestys viiden aminohapon aktiivisen perussarjan valmistamiseksi voidaan toteuttaa seuraavasti: 10 70905

Hartsi i fa

R-, x -BOC-Tyr-OH

i3 X-BOC-Tyr-Hartsi ] _ j Poistetaanoc-aminoryhmää suojaava |3|/ ryhmä H-Tyr-Hartsi j

X-BOC-L-Val-OH

x'.-BOC-Val-Tyr-Hartsi

Poistetaan -aminoryhmää suojaava j3 ryhmä H-Val-Tyr-Hartsi i K9

I <X -BOC-Asp-OH

R9 j cs-BOC-Asp-Val-Tyr-Hartsi ! j Poistetaan ><-aminoryhmää suo- D j jaava ryhmä K λ I K *5 I 2 xl' I 3 H-Asp-Val-Tyr-Hartsi

°< -BOC-Sar-OH

R~ i, R- j 2 y | 3 k-BOC-Sar-Asp-Val-Tyr-Hartsi j Poistetaan '^-aminoryhmää suojaava j ryhmä

Rft ^ R-j j 2 v j 3 H-Sar-A^p-Val-Tyr-Hartsi V/ X-AOC-Arg-OH R- R.·» R-j i 1 I 1 , 13 x-AOC-Arg-Sar-Asp-Val-Tyr-Hartsi j Poistetaan kaikki suojaavat ryhmät , ja hartsi i M-

H-Arg-Sar-Asp-Val-Tyr-OH

H 70905

Yllä olevassa reaktiosarjassa R^, R2 ja R^ ovat suojaaavia ryhmiä aminohapposivuketjujen erilaisissa reaktiokykyisissä ryhmissä, joihin ei vaikuteta tai joita ei poisteta, kun9* -aminoryhmää suojaava ryhmä poistetaan jatkoreaktion sallimiseksi. Yllä olevassa välituote-pentapeptidihartsissa R1 on edullisesti tosyyliryhmä (Tos), R2 esittää bentsyyliryhmää (Bzl) ja R3 esittää bromibentsyylioksikarbonyyli-ryhmää. Hartsi on mikä tahansa hartseista, joiden on yllä mainittu olevan käyttökelpoisia prosessissa C-päätekarboksyylipeptidin tuottamiseksi.

Peptidi-hartsi lohkaistaan peptidin vapauttamiseksi hartsista ja suojaavista ryhmistä R^, R2, R^ ja t-AOC samanaikaisesti loppu-tuotepeptidin aikaansaamiseksi. Suojaavat ryhmät ja hartsi lohkaistiin tavanomaisin keinoin, esim. käsittelemällä vedettömällä fluori-vedyllä ja peptidi otettiin talteen.

Kuten yllä osoitettiin, tätä prosessia toteutettaessa on välttämätöntä suojata tai sulkea aminoryhmät reaktion kontrolloimiseksi ja haluttujen tuotteiden saamiseksi. Sopivia aminoryhmää suojaavia ryhmiä, joita voidaan hyödyllisesti käyttää, ovat suolan muodostus erittäin emäksisten aminoryhmien suojaamiseksi tai uretaanisuojasubs-tituentit, kuten bensyylioksikarbonyyli- ja t-butyylioksikarbonyyli-ryhmä. On suositeltavaa käyttää t-butyylioksikarbonyyliryhmää (t-BOC) tai t-amyylioksikarbonyyliryhmää (t-AOC) -aminoryhmän suojaamiseksi aminohapoissa,joissa tapahtuu reaktio molekyylin karbok-syylipäässä, sillä BOC- ja AOC-suojaryhmät on helppo tämän reaktion jälkeen ja ennen seuraavaa vaihetta (jossa tällaiselle >^-aminoryhmäl-le itselleen tapahtuu reaktio), suhteellisen lievällä happojen (esim. trifluorietikkahapon) vaikutuksella. Tämä käsittely ei vaikuta muuten sivuketjuissa oleviin suojääviin ryhmiin. Näin ollen on ymmärrettävissä, että o<.-aminoryhmä voidaan suojata reaktiolla minkä tahansa materiaalin kanssa, joka suojaa xK-aminoryhmää seuraavissa reaktioissa, mutta joka voidaan myöhemmin poistaa olosuhteissa, jotka eivät muuten vaikuta molekyyliin. Tyypillisiä tällaisia materiaaleja ovat orgaaniset karboksyyli- tai hiilihappojohdannaiset, jotka asyloivat aminoryhmän.

Yleensä aminoryhmät voidaan suojata reaktiolla yhdisteen kanssa, joka sisältää ryhmityksen, jolla on kaava: 0 r4-o-c- 12 70905 jossa R^ on mikä tahansa ryhmä, joka estää aminoryhmää osallistumasta' seuraaviin liittämisreaktioihin ja joka voidaan poistaa tuhoamatta molekyyliä. Näin ollen on suora- tai haaraketjuinen alkyyli-ryhmä, joka voi olla tyydyttämätön, jossa on edullisesti 1-10 hiili-atomia ja joka on edullisesti halogeeni- tai syanosubstituoitu; aryy-liryhmä, jossa on edullisesti 6-15 hiiltä; sykloalkyyliryhmä, jossa on edullisesti 5-8 hiiliatomia; aralkyyliryhmä, jossa on edullisesti 7-18 hiiliatomia; alkaryyliryhmä, jossa on edullisesti 7-18 hiiliatomia tai heterosyklinen ryhmä, esim. isonikotinyyliryhmä. Aryyli-, aralkyyli- ja alkaryyliosat voivat myös olla edelleen substituoitu esim. yhdellä tai useammalla alkyyliryhmällä, jossa on 1- n. 4 hiiliatomia. Edullisia merkityksiä symbolille R^ ovat t-butyyli-, t-amyyli-, tolyyli-, ksylyyli- ja bentsyyliryhmät. Erittäin suositeltavia spesifisiä aminoryhmää suojaavia ryhmiä ovat bentsyylioksikarbo-nyyliryhmä; substituoitu bentsyylioksikarbonyyliryhmä, jossa fenyyli-rengas on substituoitu yhdellä tai useammalla halogeenilla, esim. Cl-tai Br-atomilla, nitro-, alempi-alkoksi- esim. metoksiryhmällä tai alemmalla alkyyliryhmällä; t-butyylioksikarbonyyliryhmä; t-amyyli-oksikarbonyyliryhmä; sykloheksyylioksikarbonyyliryhmä; vinyylioksi-karbonyyliryhmä; adamantyylioksikarbonyyliryhmä; bifenyyli-isopropok-sikarbonyyliryhmä tms. Muita suojaavia ryhmiä, joita voidaan käyttää, ovat isonikotinyylioksikarbonyyli-, ftaloyyli-, p-tolyylisulfonyyli-formyyliryhmä yms.

Keksinnön yleisprosessia toteuttaessa peptidi konstruoidaan vapaan <x-aminoryhmän reaktiolla yhdisteen kanssa, joka sisältää suojatun ot-aminoryhmän. Reaktiota tai liittämistä varten kiinnitettävän yhdisteen karboksyylikomponentti aktivoidaan karboksyyliryhmästä niin, että karboksyyliryhmä voi sitten reagoida peptidiketjussa olevan vapaan c<-aminoryhmän kanssa. Aktivoinnin saavuttamiseksi karboksyyliryhmä voidaan muuttaa miksi tahansa reaktiokykyiseksi ryhmäksi, kuten esteriksi, anhydridiksi, atsidiksi, happokloridiksi tms. Vaihtoehtoisesti sopiva liittämisreagenssi voidaan lisätä reaktion aikana. Sopivia liittämisreagensseja on kuvattu esim. teoksessa Bodansz-ky, et ai. Peptide Synthesis, Intersciense, toinen painos, 1976, viides luku ja niitä ovat karbodi-imidit (esim. disykloheksyylikar-bodi-imidi) karbonyylidi-imidatsoli yms.

13 70905

On myös ymmärrettävää, että näiden reaktioiden aikana aminohappo-osat sisältävät sekä aminoryhmiä että karboksyyliryhmiä ja tavallisesti toinen ryhmä osallistuu reaktioon, kun taas toinen suojataan. Ennen liittämisvaihetta hartsiin kiinnittyneen peptidin alfa-tai pääteaminoryhmää suojaava ryhmä poistetaan olosuhteissa, joka ei oleellisesti vaikuta muihin suojaaviin ryhmiin, esim. tyrosiini-molekyylin hydroksiryhmää suojaavaan ryhmään. Suositeltava menettely tämän vaiheen suorittamiseksi on lievä happohydrolyysi esim. reaktiolla trifluorietikkahapon kanssa huoneenlämpötilassa.

Kuten voidaan todeta, yllä kuvattu prosessivaiheiden sarja johtaa spesifisen pentapeptidin muodostamiseen, jolla on kaava:

IV. H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH

Halutut pentapeptidiamidit voidaan myös valmistaa yllä kuvatulla tavalla, mutta korvaamalla siinä käytetty kloorimetyylihartsi bentshydryyliamiinihartsilla ja liittämällä C-pääteaminohappo siihen sopivalla liittämisaineella kuten disykloheksyylikarbodi-imidillä.

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön kuvaamiseksi, jolloin kaikki osat ovat paino-osia, ellei toisin mainita.

Esimerkki I

Valmistettaessa peptidiä H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH seuraavat materiaalit ostettiin kaupallisesti.

Alfa-AOC-N-Tos-L-argiini

Alfa-BOC-sarkosiini

Alfa-BOC-bentsyyli-L-asparagiinihappo

Alfa-BOC-L-valiini

Alfa-BOC-O-bromibentsyylioksikarbonyyli-L-tyrosiini Näissä reagensseissa BOC on t-butyylioksikarbonyyliryhmä, AOC on t-amyylioksikarbonyyliryhmä ja Tos on tosyyliryhmä. "Sekvenssi"-laatuiset reagenssit aminohappojärjestyksen määrittämiseksi, disyklo-heksyylikarbodi-imidi, ninhydriini ja hartsi ostettiin kaupallisesti. Käytetty hartsi oli polystyreenidivinyylibentseenihartsi, 200 - 400 meshin hiukkaskokoa sisältäen 1 % divinyylibentseeniä ja 0,75 mM kloridia grammaa kohti hartsia.

Valmistettaessa pentapeptidiä ιχ-BOC-O-bromibentsyylioksikarbo-nyyli-L-tyrosiini esteröitiin kloorimetyloiduksi hartsiksi CsHCO^-menetelmällä, johon viitattiin yllä mainitussa Gisin'in artikkelissa.

14 7 0 9 0 5

Saatu suojattu amonihappohartsi sisälsi 0,4-0,5 mmol aminohappoa grammaa kohti hartsia. Käyttäen Schwarz/Mann’in automaattista pepti-disyntetisoijaa seuraavaa ohjelmaa käytettiin kunkin BOC-suojatun aminohapon liittämiseksi BOC-aminohappohartsiin: 1. Esipesu 40 %:sella TFArlla CH2Cl2:ssa, kerran 1,5 min.

2. Suojauksen poisto 40 %:sella TFA:lla CH2Cl2:ssa, kerran 20 min.

3. Pesu CHCl^rlla kerran 1,5 min.

4. Pesu EtOH:lla kerran 1,5 min.

5. Pesu CH2Cl2:lla kahdesti 1,5 min.

6. Esipesu 10 %:sella Et3N:lla CH2Cl2:ssa kerran 1,5 min.

7. Neutralointi 10 %:sella Etoilla CH2Cl2:ssa kerran 10 min.

8. Pesu CH2Cl2:lla kolme kertaa 1,5 min.

9. BOC-suojatun aminohapon (5-molaarinen ylimäärä) lisääminen DMFissa ja CH2Cl2:ssa (1:9 til/til).

10. DCC:n lisäys CH2Cl2:ssa (0,5-M, 5-molaarinen ylimäärä) reaktioaika oli jopa 2 tuntia.

11. Pesu CH2Cl2:lla kahdesti 1,5 min.

Tämän jälkeen muutX.-BOC- tai c*-AOC-aminohapot liitettiin samalla tavoin peptidi-hartsin X-aminoryhmään, josta suojaus oli poistettu, oikeassa järjestyksessä halutun pentapeptidin saamiseksi käyttäen ekvivalentteja määriä disykloheksyylikarbodi-imidiä. Jokaisen liittämisreaktion jälkeen pieni erä hartsista testattiin ninhyd-riinillä ja jos saatiin positiivinen tulos, liittäminen katsottiin epätäydelliseksi ja toistettiin samalla suojatulla aminohapolla. Useiden liittämisreaktioiden seurauksena saatiin seuraava pentapepti-dihartsi.

Tos Bzl BrZ

J I T

^-AOC-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-hartsi jossa AOC on amyylioksikarbonyyliryhmäf Tos on tosyyliryhmä, Bzl on bentsyyliryhmä ja BrZ on bromibentsyylioksikarbonyyliryhmä.

Tämä peptidi-hartsi lohkaistiin ja suojaavat ryhmät poistettiin Kel-F-lohkaisulaitteessa (Peninsula Laboratories, Inc.) käyttäen 10 ml vedetöntä fluorivetyä grammaa kohti hartsia 0°C:ssa 60 minuutin ajan ja käyttäen 10 ml anisolia grammaa kohti peptidi-hartsia puhdistavana aineena. Kuiviin haihdutuksen jälkeen tyhjössä jäännös pestiin vedettömällä eetterillä. Epäpuhdas peptidi liuotettiin 10 %:seen etikkahapon vesiliuokseen ja suodatettiin. Hartsi pestiin 10 %:sella 70905 etikkahapon vesiliuoksella ja yhdistetyt suodokset kerättiin talteen ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin epäpuhdas peptidi. Epäpuhdas peptidi puhdistettiin vastavirtaerotuksella käyttäen n-butanoli: etikka-happo:vettä (4:1:5) partitiofaasina puhtaan peptidin saamiseksi. Saadulla polypeptidillä on seuraava aminohappojärjestys:

V. H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH

Tunnistamiseen käytettiin ohutlevykromatografiaa ja elektroforeesia. Aminohappokoostumus määritettiin käyttäen aminohappoanaly-saattoria.

Ohutlevykromatografinen määritys suoritettiin 20 ^ug:n näytteellä piihappogeelillä (Kieselgel, 5 x 20 cm) käyttäen liuotinsysteeminä 1:1:1:1 n-butanoli-etikkahappo: etyyliasetaatti:vettä (R^ ) ja selluloosa 6064:llä Eastman 20 x 20 cm) käyttäen liuotinsysteeminä 2 15:10:3:12 n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vettä (R^ ). Rf-arvot polypeptidin H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH suhteen olivat R-1 = 1,84 ja 2 r Rf = 1,11. Ninhydriiniä käytettiin suihkutusreagenssina.

Elektroforeesi suoritettiin 100 ^ug:n näytteellä Whitman No.

3-paperilla (5,7 x 55 cm) käyttäen pH-arvoltaan 5,6 olevaa pyridiini-asetaattipuskuria 1000 V:n jännitteellä 1,0 tunnin ajan. Pentapepti-din liikkuvuus oli 0,29 kohti katodia verrattuna polypeptidiin H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH. Käytettiin ninhydriini- ja Pauly'n suihku-tusreagensseja.

Esimerkki II

Esimerkin I polypeptidin aktiivisuuden ja ominaispiirteiden määrittämiseksi määritykset suoritettiin terveillä, molempia sukupuolia olevilla 5-6 viikon nu/nu-hiirillä ja hiiriä elätettiin BALB/c-taustalla (tymosyyttien ilmaistessa Thy-1,2-pinta-antigeenia) ja pidettiin tavanomaisissa olosuhteissa. Vastaseerumeita varten anti-Thy- 1,2-seerumit valmistettiin samangeenisissä Thy-1-hiirissä.

Thy-1£ T-solujen tai CR+ B-solujen erilaistumisen indusoimisek-si in vitro suoritettiin tymosyyttien erilaistumisen indusointi pro-tymosyyteista in vitro Komuro'n ja Boyse'n kuvaamalla tavalla (Lancet, 1_, 740, 1 973) käyttäen Thy-1,2:n saantoa T-soluerilaistumisen markke-rina. CR+ B-solujen erilaistumisen indusointi CR B-solujen esiasteista in vitro suoritettiin samanlaisissa olosuhteissa käyttäen analyy-sikriteerinä CR+ B-solujen kapasiteettia sitoa lampaan punasoluja, jotka oli päällystetty pienemmillä kuin agglutinaation aiheuttavilla 16 70905 määrillä kaniinin vasta-ainetta ja ei-hajottavaa komplementtia. Per-nasolupopulaatioita terveistä nu/nu-hiiristä fraktioituina epäjatkuvilla naudan seerumialbumiinigradienteilla, käytettiin molempien esi-astetyyppien (Thy-1 ja CR ) lähteenä, koska niissä on vain harvoja tai ei lainkaan Thy-1δ-soluja ja pieni määrä CR+-soluja.

Tämän määrityksen tuloksena havaittiin, että pentapeptidi osoitti samantapaista vaikutusselektiivisyyttä kuin tymopoietiini II indusoimalla T-imusolujen, mutta ei komplementtireseptoreiden (CR+) B-imsolujen erilaistumista. Pentapeptidi indusoi Thy-1+ T-solujen erilaistumista väkevyyksillä välillä 1 pg - 10 ng/ml. Se ei indusoinut CR+ B-solujen erilaistumista samoilla väkevyyksillä.

Esimerkki III

Noudattaen esimerkin I menettelyä käyttäen ekvivalentteja määriä sopivia aminohappoja (sopivasti suojattu) valmistetaan seuraavat pentapeptidit (bentshydryyliamiinihartsia käytettiin "B":n valmistamiseen) :

A. H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-OH

B. h-arg-sar-asp-sar-tyr-nh2

C. H-ARG-LYS-ASP-SAR-TYR-OH

Nämä pentapeptidit indusoivat konsentraatiolla 1 pg/ml - 10 ^ug/ml Thy-1 T-solujen erilaistumisen, mutta ei CR+ B-solujen erilaistumista.

Näiden peptidien aminohapposekvenssi määritettiin aminohappo-halysaattorilla. Pentapeptidien B ja C ohutlevykromatografia ja elektroforeesi samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä I antoi seuraavat tulokset. 1 2

Peptidi R^ Rf Liikkuvuus katodia kohti B 1,76 0,95 1,03 C 0,80 0,78 0,97

Claims (6)

17 70905

1. Analogiamenetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten penta-peptidijohdannaisten ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joilla on biologinen kyky indusoida T-imuso-lujen, mutta ei komplementtireseptori-(CR+)-B-imusolujen erilaistumista, ja joilla on yleinen kaava H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R' jossa X on LYS tai SAR, Y on VAL tai SAR, edellyttäen, että Y on SAR, kun X on LYS, ja R' on OH tai tunnettu siitä, että i) sidotaan L-tyrosiini, jonka OC-aminoryhmä ja hydroksyyli-ryhmä on suojattu, polymeerihartsiin kovalenttisella sidoksella, joka polymeeri on sellainen, että se sisältää funktionaalisen ryhmän, johon L-tyrosiini voidaan lujasti yhdistää mainitulla kovalenttisella sidoksella; ii) poistetaan OC-aminoryhmää suojaava ryhmä L-tyrosiiniosas- ta; iii) annetaan tämän reagoida VAL- tai SAR-aminohapon kanssa, jonka DC-aminoryhmä ja mahdolliset muut reaktiokykyiset ryhmät, mutta ei OC-karboksyyliryhmä, on suojattu, VAL- tai SAR-aminohapon liittämiseksi L-tyrosiinihartsiin; iv) poistetaan 0£-amino ryhmää suojaava ryhmä VAL- tai SAR-aminohappo-osasta; v) annetaan tämän reagoida asparagiinihapon kanssa, jonka -aminoryhmä ja terminaalinen karboksyyliryhmä, mutta ei (X.-karboksyyliryhmä, on suojattu viimeksimainitun liittämiseksi VAL(tai SAR)-L-tyrosiinihartsiin; vi) poistetaan oC-aminoryhmää suojaava ryhmä asparagiinihap-po-osasta? vii) annetaan tämän reagoida LYS- tai SAR-aminohapon kanssa, jonka <X-aminoryhmä ja mahdolliset muut reaktiokykyiset ryhmät, mutta ei OC-karboksyyliryhmä, on suojattu, viimeksimainitun liittämiseksi ASP-VAL(tai SAR)-L-tyrosiinihartsiin; viii) poistetaan (X.- amino ryhmää suojaava ryhmä LYS- tai SAR-aminohappo-osasta;

1 R 70905 ix) annetaan tämän reagoida arginiinin kanssa, jonka oC-ami-noryhmä ja guanidiinoryhmä, mutta ei αί-karboksyyliryhmä, on suojattu, viimeksimainitun liittämiseksi LYS(tai SAR)-ASP-VAL(tai SAR)-L-tyrosiinihartsiin; ja x) poistetaan hartsi ja kaikki suojaryhmät peptidistä sopivilla reagensseilla; ja haluttaessa valmistetaan yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pentapeptidin valmistamiseksi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: h-arg-sar-asp-sar-tyr-nh2 tunnettu siitä, että käytetään bentsyylihydryyliamiini-hartsia vaiheessa i), SAR-aminohappoa vaiheessa iii), ja SAR-amino-happoa vaiheessa vii).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pentapeptidin valmistamiseksi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH tunnettu siitä, että käytetään styreenin ja divinyylibent-seenin kloorimetyloitua kopolymeeria vaiheessa i), VAL-aminohappoa vaiheessa iii) ja SAR-aminohappoa vaiheessa vii). 19 70905

1. Analogiförfarande för framställning av terapeutiskt an-vändbara pentapeptidderivat och farmaceutiskt godtagbara salter där-av, vilka har biologisk förmäga att inducera differentiering av T-lymfocyter, men ej av komplementreceptor-(CR+)-B-lymfocyter, och vilka har den allmänna formeln H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R' väri X är LYS eller SAR, Y är VAL eller SAR, förutsatt, att Y är SAR, när X är LYS, och R' är OH eller kännetecknat därav, att man i) binder L-tyrosin vars OC-aminogrupp och hydroxylgrupp är skyddade, vid ett polymerharts genom kovalent bindning, vilken polymer är en sadan som innehäller en funktionell grupp, vid vilken L-tyrosin fast kan bindas genom nämnda kovalent bindning; ii) avlägsnar CK-aminoskyddsgruppen frän L-tyrosindelen; iii) omsätter denna med en VAL- eller SAR-aminosyra vars CX-aminogrupp och eventuella andra reaktiva grupper, men ej X-kar-boxylgrupp, är skyddade, för kopplande av VAL- eller SAR-aminosy-ran vid L-tyrosinhartset; iv) avlägsnar Oi-aminoskyddsgruppen frän VAL- eller SAR-ami-nosyradelen; v) omsätter denna med asparaginsyra vars <X-aminogrupp och terminala karboxylgrupp, men ej <X-karboxylgrupp, är skyddade, för kopplande av den sistnämnda tili VAL(eller SAR)-L-tyrosinhartset; vi) avlägsnar (K -aminoskyddsgruppen frän asparaginsyradelen; vii) omsätter denna med en LYS- eller SAR-aminosyra vars -aminogrupp och eventuella andra reaktiva grupper, men ej o£-kar- boxylgrupp, är skyddade, för kopplande av den sistnämnda till ASP-VAL(eller SAR)-L-tyrosinhartset; viii) avlägsnar C<-aminoskyddsgruppen frän LYS- eller SAR-aminosyradelen ? ix) reagerar denna med arginin vars OC-aminogrupp och guanidinogrupp,men ej C<-karboxylgrupp, är skyddade, for