FI67692C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara tripeptider - Google Patents

Description

fSSr^l [ft] (11) U t-UTUSJ ULKAISU ^692

$§&& 1 J ' ) UTLÄGCNINCSSICIUFT U

(51) K».kW^ c 07 K 5/08 SUOMI—FINLAND pi) iwrttih^c«nu,-p««fci«eknb,* 800780 (22) HakmntaplM — AmMciUnfriag 13-03-80 (23) AHotpUvt—Glltig(>«t»daf 13.03.80 (41) Taite |ulUMksi — Bllvk offantfg 1 5.0 9.8 0 _ * . (44) NUittytkri panon μ kimljulVil—n pvm.— 3i qi gc

Patent- och registerttyrelsen 7 AmMuk utbgd och utUkrifun pubiicarad J J

(32)(33)(31) Pyydetty «uoikau. -βη*”* pctartet 1^-03-79 USA(US) 020159 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceutical Corporation, Route 202, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey,

George Heavner, Flemington, New Jersey, USA(US) (7*0 Oy Koi ster Ab (5*0 Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten tripeptidien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av nya terapeutiskt användbara tripeptider

Keksintö koskee menetelmää uusien kaavojen I ja II mukaisten polypeptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, H-LYS-SAR-GLN-OH (I) H-LYS-SAR-GLN-NH2 (II)

On hyvin tunnettua, että eläinten kudoksista ja elimistä (myös verestä) on eristetty monia polypeptidejä. Useilla näistä on vaikutusta kehon immuunifunktioon, esimerkiksi erilaisilla immuno-globuliineilla, kateenkorvasta eritetyllä hormonilla tymopoetii-nilla jne. Näitä polypeptidejä on kuvattu esimerkiksi US-patentti-julkaisussa 4 002 602 ja 4 077 949.

Aina viime vuosikymmeneen asti tiedettiin kateenkorvasta vain vähän, vaikka nyt tiedetäänkin, että kateenkorva on yksi elimistä, joka pääasiallisesti vaikuttaa nisäkkäiden ja lintujen immuunifunk-tioon. Vaikka kateenkorvan mahdollisiin funktioihin tunnettiin suurta mielenkiintoa ja jo aikaisin laadittiin teorioita ja suoritettiin kokeita näiden funktioiden selvittämiseksi, niin niistä ei 2 67692 aina viime vuosiin asti ole paljoakaan tiedetty. Nyt on kuitenkin selvitetty, että kateenkorva on elin, joka koostuu sekä epiteeli-(endokriininen) että lymfoidi- (immunologinen) komponenteista ja että sillä on vaikutusta kehon immuunifunktioihin. Kateenkorva koostuu epiteeliperuskudoksesta, joka lähtee kolmannesta kiduskaa-resta ja kantasoluista johdetuista lymfosyyteista, jotka ovat peräisin hematopoeettisesta kudoksesta, Goldstein et ai., The Human Thymus, Heinemann, Lontoo, 1969. Lymfosyytit differentioituvat kateenkorvassa ja erittyvät kypsinä kateenkorvajohtoisina soluina, T-soluina verivirtaan, imunesteeseen, pernaan ja imusolmukkeisiin. Kantasolujen differentiaatio kateenkorvassa näyttää olevan kateen-korvan epiteelisolujen eritteiden indusoima.

Jo jonkin aikaa on tiedetty, että kateenkorva liittyy kehon immuuniominaisuuksiin, ja tästä syystä on tunnettu suurta mielenkiintoa kateenkorvasta eristettyihin aineisiin. Viime vuosina tätä koskevia, härän kateenkorvan sisältämistä aineista tehtyihin tieteellisiin tutkimuksiin perustuvia artikkeleita on julkaistu suhteellisen paljon. Tätä alaa koskevia julkaisuja ovat esimerkiksi:

The Lancet, heinäk. 20, 1968, s. 119-122; Triangle, voi. II, nro 1, sivut 7-14, 1972; Annals of the New York Academy of Sciences, voi. 183, sivut 230-240, 1971; ja Clinical and Experimental Immunology, voi. 4, nro 2, sivut 181-189, 1969; Nature, voi. 247, sivut 11-14, 1974; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, voi. 71, sivut 1474-1478, 1974; Cell, voi. 5, sivut 361-365 ja 367-370, 1975; Lancet, voi. 2, sivut 256-259, 1975; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, voi. 72, sivut 11-15, 1975; Biochemistry, voi. 14, sivut 2214-2218, 1974; Nature, voi. 255, sivut 423-424,1975.

B-lymfosyytit eli B-solut ovat toinen lymfosyyttinen luokka, jolla on immuunifunktio. Ne erittyvät linnuilla Bursa Fabricius-rauhasesta ja nisäkkäillä toistaiseksi tuntemattomasta elimestä. T-solut ja B-solut vaikuttavat monissa suhteissa yhdessä immuuniuteen. Tätä on käsitelty esimerkiksi artikkelissa Science 193, 319 (23. heinäkuuta 1976) ja julkaisussa Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, voi. XLI, 5 (1977).

II

3 67692 J.F. et ai. ovat äskettäin eristäneet sian seerumista nona-peptidimateriaalin, jolle he ovat antaneet nimen "facteur thymic serique" (FTC). Tämän materiaalin eristäminen ja rakenne on esitetty julkaisuissa C.R. Acad. Sc., Paris, 283 (29. marraskuuta 1976), Series D-1605 ja Nature 266, 55 (3. maaliskuuta 1977). Tämän nona-peptidin rakenne on seuraava: GLX-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN, jossa GLX on joko glutamiini tai pyroglutaamihappo. Yhdiste, jossa BLX on glutamiini tai pyroglutaamihappo, on syntetisoitu. E-rosette-kokeella Bach esittää todenneensa nonapeptidin FTS selektiivisesti differentioivan T-soluja (mutta ei B-soluja). Bach veti tästä sen johtopäätöksen, että kyseessä ei ollut kateenkorvahormoni. Perusteellisemmassa tutkimuksessa on kuitenkin osoitettu, että tämä nona-peptidi FTS differentioi sekä T-soluja että B-soluja ja että sen aktiivisuus siten on enemmän ubikitiininkaltainen kuin tymoportii-nilla, Brand, Gilmour ja Goldstein, Nature, 269, 597-598 (1977).

US-patenttihakemuksessa 960 550, jätetty 17.11.1978, on todettu, että 4-amino-happopolypeptidisekvensseiilä H-ALA-LYS-SER-GLN-OH ja H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2 (mm. näillä) on samankaltainen aktiivisuus kuin FTS:llä.

Nyt on yllättäen havaittu, että kaavojen I ja II mukaisilla tripeptideillä, jotka muistuttavat FTS-nonapeptidin osaa, on monia edellä käsitellyn nonapeptidin ominaisuuksista.

Kaavojen I ja II mukaisilla polypeptideillä on kyky indusoida sekä T-lymfosyyttien että B-lymfosyyttien differentiaatiota ja ne ovat siten erittäin käyttökelpoisia ihmisten ja eläinten immuuni-systeemissä.

Kaavojen I ja II mukaisia polypeptidejä ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan valmistaa siten, että a) L-glutamiini, jonka o(.-aminoryhmä on suojattu, liitetään kovalenttisella sidoksella polymeerihartsiin, joka sisältää funktionaalisen ryhmän, johon ensimmäinen suojattu aminohappo voidaan liittää lujasti kovalenttisella sidoksella, b) L-glutamiinin oC-aminosuojaryhmä poistetaan, c) SAR-aminohappo, jonka (λ.-aminoryhmä ja mahdolliset muut reaktiiviset ryhmät on suojattu, mutta jonka -karboksyyliryhmä ei ole suojattu, liitetään L-glutamiini-hartsiin, 4 67692 d) SAR-aminohapon aminosuojaryhmä poistetaan, e) LYS-aminohappo, jonka -aminoryhmä ja €. -aminoryhmä on suojattu, liitetään SAR-aminohappo-L-glutamiini-hartsiin, ja f) peptidistä poistetaan sopivilla reagensseilla hartsi ja kaikki suojaryhmät, ja haluttaessa saatu tuote muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Vaikka kaavojen I ja II mukaisten tripeptidien aminohapposekvenssi esiintyykin eräiden US-patenttihakemuksessa 960 550 (jätetty 17.11.1978) kuvattujen polypeptidien osana, niin ei voida pitää itsestään selvänä, että lyhyemmällä sekvenssillä olisi sama aktiivi-teetti tai ylipäänsä lainkaan aktiiviteettia. Oli myös vähemmän todennäköistä, että nyt kuvatuilla tripeptideillä olisi voimakas vaikutus.

Peptidien kanssa farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja muodostavia happoja, ovat esimerkiksi epäorgaaniset hapot, kuten kloori-vetyhappo, bromivetyhappo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo jne. ja orgaaniset hapot, kuten muurahaishappo, etikkahappo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, palo-rypäiehappo, oksaalihappo, malonihappo, meripihkahappo, maleiini-happo, fumaarihappo, antraniilihappo, kaneelihappo, naftaleenisulfoni-happo ja sulfaniilihappo.

Tässä hakemuksessa peptidien aminohappokomponenteista käytetään seuraavia lyhennyksiä:

Aminohappo Lyhennystunnus

L-alaniini ALA

L-asparagiini ASN

L-seriini SER

L-glutamiini GLN

L-leusiini LEU

L-lysiini LYS

L-treoniini THR

Glysiini GLY

Sarcosiini SAR

D-alaniini D-ALA

D-seriini D-SER

D-treoniini D-THR

D-leusiini D-LEU

allo-treoniini allo-THR

2-metyylialaniini 2-Me-ALA

li 5 67692

Ilmaisuilla "deamino-LYS" ja "dekarboksi-GLN" tarkoitetaan tässä käytettynä vastaavasti L-lysiinitähdettä, jossa O^-aminoryhmä on korvattu vedyllä, ja L-glutaxniinitähdettä, jossa pääteasemassa oleva karboksyyliryhmä on korvattu vedyllä. Näillä ryhmillä on vastaavasti kaavat: H2N- (CH2)5~CO— ja -HN-(CH2)3-CONH2.

Uusien polypeptidien on havaittu indusoivan immu-nosyytti-prekursorisolujen differentioitumista in vitro samalla tavalla kuin Bach'in kuvaamien nonapeptidien. Keksinnön mukaisten po-lypeptidien on siten havaittu indusoivan sekä T-prekursorisolujen differentioitumista, joka on mitattu kateenkorvan antigeeni Th-l:n differentiaatiosta, että B-prekursorisolujen differentiaatiota, joka on mitattu antigeeni Bu-l:n differentiaatiosta. Toisin ilmaistuna keksinnön mukaisilla polypeptideillä on kyky indusoida sekä Th-1+ T-lymfosyyttien että Bu-1+ B-lymfosyyttien differentiaatiota.

Jotta paremmin ymmärrettäisiin, miten tärkeä uusien peptidien kyky differentioida biologisia ominaisuuksia on, on huomattava, että kateenkorvan immunologisen tehtävän voidaan laajasti määriteltynä katsoa johtuvan kateenkorvan tuottamista soluista (lymfosyytit), joita nimitetään T-soluiksi. T-solujen osuus verenkierrossa olevista pienistä lymfosyyteistä on huomattava. T-solut ovat immunologisesti spesifisiä ja liittyvät suoraan soluvälitteiseen immuunivasteeseen (kuten humoraalivasteeseen) efektorisoluina. T-solut eivät kuitenkaan eritä humoraalivasta-aineita. Näitä vasta-aineita erittävät suoraan luuytimessä kateenkorvan vaikutuksesta riippumatta B-solut. Useita antigeenejä vastaan tarvitaan B-solujen lisäksi kuitenkin sopivia reaktiivisia T-soluja ennen kuin B-solut pystyvät muodostamaan vasta-aineita. T-solut ovat myös mukana immuunisysteemin säätelyssä auttajasoluina, suppressorisoluina jne.

Tämä solujen yhteistoiminnan mekanismi ei ole vielä täysin selvitetty .

Edellä olevan perusteella voitaneen sanoa, että kateenkorva on välttämätön soluimmuniteetin ja monien humoraalisten vasta-aine-vasteiden muodostumiselle sekä myös immuunisysteemin säätelylle. Nämä tulokset johtuvat ainakin osittain kateenkorvassa tapahtuvan he-matopoeettisten kantasolujen induktiivisesta differentiaatiosta T-soluiksi. Tätä induktiivista vaikutusta välittävät kateenkorvan epiteelisolujen eritteet, so. kateenkorvahormonit.

67692

Jotta ymmärrettäisiin kateenkorvan ja lymfosyyttien solusys-teemin toimintatapaa ja lymfosyyttien kulkeutumista kehossa, on korostettava, että kantasolut muodostuvat luuytimessä ja saapuvat ka-teenkorvaan verenkierron mukana. Kateenkorvassa kantasolut differen-t.ioituvat immunologisesti vaikuttaviksi T-soluiksi, jotka kulkeutuvat verivirtaan ja yhdessä B-solujen kanssa kiertävät kudoksissa, imunesteessä ja verivirrassa.

Vasta-aineita erittäviä kehon soluja (B-soluja) kehittyy myös hematopoeettisista kantasoluista, mutta niiden differentioitumista ei määrää kateenkorva. Linnuissa ne differentioituvat kateenkorvaa vastaavassa elimessä, jolle on annettu nimi Fabritiuksen bursa. Nisäkkäillä ei ole havaittu olevan vastaavaa elintä, ja on oletettu, että B-solut differentioituvat luuytimessä. Siitä johtuen niitä nimitetään luuytimestä johdetuiksi soluiksi eli B-soluiksi. Tämän dif-ferentiaation määräävät fysiologiset aineet ovat yhä täysin tuntemattomia.

Kuten edellä esitettiin, esillä kaavojen I ja II mukaiset polypeptidit ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia ihmisten ja eläinten hoidossa. Koska uusilla polypeptideillä on kyky indusoida hematopoeettisista kudoksista peräisin olevien lymfatopoeettisten kantasolujen differentiaatiota sekä kateenkorvasta peräisin oleviksi lymfosyyteiksi (T-solut) että immunokompetenteiksi B-soluiksi, jotka pystyvät vaikuttamaan kehon immuunivasteeseen, niin uusilla yhdisteillä voidaan katsoa olevan monenlaista terapeuttista käyttöä. Ensisijaisesti, koska yhdisteet pystyvät suorittamaan tiettyjä, osoitettuja kateenkorvan funktioita, niillä on käyttöä kateenkorvan eri vaikutusaloilla ja immuuniuden alueella. Niiden ensisijainen käyttö on DiGeorge-oireyhtymän käsittelyssä, joka oireyhtymä johtuu synnynnäisestä kateenkorvan puuttumisesta.

Tämä puute on voitettavissa antamalla injektiona jotakin kaavojen I ja II mukaisista polypeptideistä, kuten jäljempänä osoitetaan. Toisena käyttönä on agammaglobulinemia, joka oletettavasti johtuu kehon B-solujen differentioitumista aiheuttavan hormonin puutoksesta. Tämä puutos voidaan korjata antamalla injektiona jotakin kaavojen I ja II mukaisista polypeptideistä. Koska polypeptidit ovat aktiivisia erittäin alhaisilla pitoisuuksilla, niitä voidaan käyttää auttamaan kehon kollektiivista immuniteettia niiden lisätessä soluvälitteisen

II

7 67692 immuniteetin ja humoraali-immuniteetin terapeuttista stimulaatiota,-joten ne ovat käyttökelpoisia kroonisten infektioiden in vivo käsittelyyn, kuten sieni- tai mykoplasmainfektioiden, tuberkuloosin, lepran, akuuttien tai kroonisten infektioiden ym. hoitoon. Lisäksi peptidejä pidetään käyttökelpoisina kaikilla sellaisilla aloilla, joissa solu- tai humoraali-immuniteetti tuo ratkaisun, ja erityisesti immuniteettihäiriöissä, kuten edellä mainitussa DiGeorge-oire-yhtymässä. Polypeptidien ominaisuudet tekevät ne lisäksi käyttökelpoisiksi in vitro, sillä ne pystyvät indusoimaan T-solujen pinta-antigeenien kehittymisen, ne indusoivat funktionaalista kykyä antigeeni- ja mitogeenivasteen saavuttamiseksi ja soluyhteistoimintaa, jolloin ne parantavat B-solujen kykyä tuottaa vasta-aineita. Niillä on in vitro käyttöä niiden indusoidessa B-solujen kehittymistä, mikä on osoitettu komplementin pinnan vastaanottokohtien kehittymisellä. Peptidejä voidaan käyttää myös ubikitiinille herkkien lymfosyyttien kontrolloimattoman tuottamisen estämiseen i(tämä on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 002 6C2). Eräs uusien polypeptidien tärkeä ominaisuus on niiden kyky in vivo elvyttää soluja, joilla on T-solujen ominaisuudet, sekä niiden kyky in vivo elvyttää soluja, joilla on B-solujen ominaisuudet. Ne ovat siten käyttökelpoisia hoidettaessa suhteellista tai absoluuttista B-soluvajavai-suutta sekä suhteellista tai absoluuttista T-soluvajavaisuutta riippumatta siitä, johtuvatko nämä vajavaisuuden kudoksen vajavaisuudesta, joka differentioi B-soluja tai kateenkorvan vajavaisuudesta tai muusta syystä.

Eräänä tärkeänä piirteenä uusilla polypepti-deillä on lisäksi niiden korkea aktiivisuus erittäin alhaisilla pitoisuuksilla. On havaittu, että nämä polypeptidit ovat yleensä aktiivisia pitoisuuksina noin 1 ng/ml, ja H - LYS - SAR - GLN -NH2 on aktiivinen pitoisuuksista noin 100 pg/ml lähtien. Kantaja-aineena voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua tähän tarkoitukseen käytettyä kantaja-ainetta, kuten tavallisia suolaliuoksia, edullisesti yhdessä proteiinilaimennusaineen kanssa, kuten härän seerumial-bumiinin kanssa, jotta vältettäisiin näin alhaisilla pitoisuuksilla esiintyvä lasitavaraan adsorboitunut ainehukka. Uudet polypeptidit ovat yleensä aktiivisia parenteraalisesti annoksina yli 1^ug/kehon kg. DiGeorgen oireyhtymän hoitoon polypeptidejä 8 67692 voidaan antaa parenteraalisesti noin 1 - noin 100 ^ug/kehon kg. Yleensä myös muiden mainittujen tautien hoitoon käytetään samansuuruisia annoksia.

Farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi kaavan I mukainen polypeptidi tai sen happoadditiosuola, jolla on farmakologista aktiviteettia, sekoitetaan tavanomaisen farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa tavanomaisella farmaseuttisella lääkkeen-valmistustekniikalla. Kantaja-aine voi olla mitä erilaisin valmisteen annostusmuodosta riippuen, joka annostusmuoto on esimerkiksi sublin-guaalinen, rektaalinen, nasaalinen, oraalinen tai parenteraalinen. Valmistettaessa oraaliseen lääkeantoon tarkoitettuja nestemäisiä koostumuksia, kuten suspensioita, eliksiireijä ja liuoksia, voidaan käyttää erilaisia väliaineita, kuten vettä, glykoleja, öljyjä, alkoholeja, makuaineita, säilöntäaineita, värejä ym.; kiinteät valmisteet, kuten jauheet, kapselit ja tabletit sisältävät esim. kantaja-aineita, kuten tärkkelyksiä, sokereita, laimentimia, rakeistusaineita, liukas-tusaineita, sideaineita, hajoamista edistäviä aineita ym. Annostuksen helppouden vuoksi edullisia annosmuotoja ovat oraaliset an-nosmuodot, tabletit ja kapselit, joissa käytetään farmaseuttista kantaja-ainetta. Tabletit voidaan haluttaessa päällystää sokerilla tai enteropäällysteellä käyttäen standarditekniikkaa. Parenteraali-sissa valmisteissa kantaja-aine on tavallisesti steriili vesi, vaikka muitakin aineosia voidaan sisällyttää valmisteeseen esimerkiksi liukoisuutta parantamaan tai säilöntäaineeksi. Voidaan valmistaa myös injektoitavia suspensioita, jolloin käytetään sopivia nestemäisiä kantaja-aineita, suspendointiaineita jne. Vaikka edellä on esitetty, edullisina parenteraaliseen lääkeantoon sopivat annos-muodot, niin oraalisia lääkemuotoja voidaan tietenkin myös käyttää. Oraaliseen lääkeantoon polypeptidin pitoisuus on yleensä noin 100-1 000 -kertainen parenteraalisen lääkemuodon polypeptidipitoisuu-teen verrattuna (mg/kehon kg) eli se on esimerkiksi noin 100 ^,ug/ kg - noin 10 mg/kg.

Kaavojen I ja II mukaiset polypeptidit valmistetaan käyttäen menetelmää, jota Merrifield on kuvannut julkaisussa Journal of American Chemical Society, 85, 2149-2154. Synteesi suoritetaan lisäämällä vaiheittain suojattuja aminohappoja kasvavaan peptidiketjuun, jotka peptidit on kovalenttisesti sidottu kiinteään hartsihiukkaseen.

9 67692 Tässä menetelmässä reagenssit ja sivutuotteet poistetaan suodattamalla, ja välituotteiden puhdistusta ei tarvita. Menetelmä perustuu yleisesti ottaen ketjun C-pääteaminohapon liittämiseen kovalent-tisella sidoksella kiinteään polymeeriin ja aminohappojen liittämiseen peräkkäin yksi kerrallaan vaiheittain, kunnes haluttu sarja on koottu. Lopuksi peptidi poistetaan kiinteästä tukiaineesta ja suoja-ryhmät poistetaan. Tällä menetelmällä saadaan kasvava peptidiketju, joka on liittynyt täysin liukenemattomaan kiinteään hiukkaseen, joten se on sopivassa muodossa reagenssien ja sivutuotteiden erottamiseksi siitä suodattamalla ja pesemällä.

Aminohapot voidaan liittää mihin tahansa sopivaan polymeeriin, joka on helposti erotettavissa reagoimattomista reagensseista. Polymeeri voi olla liukenematon käytettyihin liuottimiin tai liukeneva tiettyihin liuottimiin ja liukenematon toisiin. Polymeerillä tulisi olla pysyvä fysikaalinen muoto suodatuksen helpottamiseksi. Siinä tulee olla funktionaalinen ryhmä, johon ensimmäinen suojattu aminohappo liitetään lujasti kovalenttisella sidoksella. Erilaisia tähän tarkoitukseen sopivia polymeerejä ovat esimerkiksi selluloosa, poly-vinyylialkoholi, polymetakrylaatti ja sulfonoitu polystyreeni. Synteesissä käytetään kuitenkin yleensä kloo- rimetyloitua styreenidivinyylibentseenikopolymeeria. Voidaan myös käyttää polymeerejä, jotka liukenevat orgaanisiin liuottimiin, mutta ovat liukenemattomia vesipitoisiin liuottimiin. Yksi tällainen polymeeri on polyetyleeniglykoli, jonka molekyylipaino on noin 20 000, ja joka on liukoinen metyleenikloridiin ja liukenematon veteen. Tämän polymeerin käyttöä peptidisynteesiin ovat kuvanneet F. Bayer ja M. Mutter julkaisussa Nature, 237, 512 (1972), kirjallisuusviittei-neen.

Aminohapon erilaiset funktionaaliset ryhmät, jotka ovat aktiivisia, mutta joiden ei ole tarkoitus joutua reaktioihin, suojataan tavanomaisin suojaryhmin, joita polypeptidien reaktioissa käytetään. Lysiinin funktionaalinen ryhmä suojataan siten suojaryhmäl-lä, joka voidaan poistaa reaktiosarjän päätyttyä ja jolla ei ole haitallista vaikutusta lopputuotteeseen. Synteesissä voidaan todeta ninhydriinireaktiolla, onko liittymisreaktio ollut täydellinen. Jollei liittyminen ole täydellinen, suoritetaan sama liittymisreaktio saman suojatun aminohapon kanssa ennen suojaryhmän poistamista.

10 67692 C-päätteiset aminohapot voidaan kiinnittää polymeeriin monin hyvin tunnetuin menetelmin. Kiinnittämismenetelmiä halogeenimetyy-lihartseihin on kuvattu seuraavissa julkaisuissa Horiki et ai.,

Chem. Letters, s. 165-168 (1978) ja Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973), sekä niissä esitetyissä kirjallisuusviitteissä. Valmistettaessa C-päätteisiä amideja voidaan käyttää seuraavia menetelmiä. Peptidihartsi, joka on valmistettu Merrifield-teknii-kalla, pilkotaan vedettömällä ammoniakilla, tai voidaan käyttää bentshydryyliamiinihartsia. Viimeksi mainitusta hartsista peptidi lohkaistaan fluorivedyllä, jolloin saadaan C-päätteinen amidipepti-di. Bentshydryyliamiinihartsin käyttöä ovat kuvanneet esimerkiksi J. Rivier et ai., J. Med. Chem. 16, s. 545-549 (1973).

Yleisessä menetelmässä C-päätteisten hartsien karboksyylipep-tidien valmistamiseksi esteröidään aluksi L-glutamiini, jonka amino-ryhmät on suojattu, sen kiinnittämiseksi kloorimetyylihartsiin CsHCO^-menetelmällä, joka on kuvattu edellä mainitussa Gisin'in artikkelissa. Glutamiiniaminohapon OG-aminosuojaryhmä (esim. t-BOC, so. tert-butyylioksikarbonyyli) poistetaan sitten siten, ettei vaikuteta muihin suojaryhmiin. Yhteen liitetty aminohappo-hartsi suodatetaan, pestään ja neutraloidaan. Saatu aminohappo-hartsi, jossa on vapaa aminoryhmä, saatetaan sitten sarkosiinin liittämiseksi reagoimaan suojatun sarkosiinin, edullisesti Ot-t-BOC-sarkosiinin kanssa. Voidaan käyttää sopivaa kytkentäainetta, kuten disykloheksyylikarbo-di-imidiä. Reaktiot toistetaan sitten suojatun L-lysiinin kanssa, kunnes on saatu täydellinen molekyyli. Reaktiosarjaa voidaan kuvata seuraavasti:

II

11 67692

Hartsi

OC-T^-Gln-OH

V * Ä-R2~Gln-hartsi ^ <Xraminosuojaryhmän poisto H-Gln-hartsi

| 0C-Ro-Sar-0H

ν' 2 0(-T2-Sar-Gln-hartsi <x- aminosuojaryhmän poisto s/ H-Sar-Gln-hartsi

R± 4/ 0<-R2-Lys-OH

OC-R2~Lys-Sar-Gln-hartsi I Kaikkien suojaryhmien ja hartsien poisto

H-Lys-Sar-Gln-OH

Edellä olevassa reaktiosarjassa R^ lysiiniaminohapon reaktiivisen sivuketjun suojaryhmä, johon Of-aminoryhmän suojaryhmän poistaminen ei vaikuta, jolloin 0(-aminoryhmä voidaan saattaa edelleen reagoimaan, ja R2 on QC-aminoryhmän suojaryhmä. Edellä olevassa välituotteessa, tripeptidi-hartsissa, suojaryhmä R^ on esimerkiksi 2,6-diklooribentsyylioksikarbonyyli ja R2 on esimerkiksi tert-butyyliok-sikarbonyyli. Hartsi voi olla mikä tahansa edellä mainituista tällaiseen reaktioon sopivista hartseista.

Viimeisen välituotteen valmistuksen jälkeen peptidihartsista poistetaan suojaryhmät R^ ja R2 ja hartsi. Ne poistetaan tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi käsittelemällä vedettömällä fluori-vedyllä, jolloin saadaan vapaa peptidi.

Kuten edellä korostettiin, menetelmän suorituksessa on välttämätöntä reaktion kontrolloimiseksi suojata aminoryhmät, jotta saataisiin haluttuja tuotteita. Voimakkaasti emäksisen aminoryhmän kanssa käytettäviksi sopivia aminosuojaryhmiä ovat esimerkiksi suolan muodostavat ryhmät tai uretaanisubstituentit, kuten bentsyylioksi-karbonyyli tai tert-butyylioksikarbonyyli. Edullisesti käytetään tert-butyylioksikarbonyyliä (t-BOC) tai tert-amyylioksikarbonyyliä (AOC) aminohappojen 0(-aminoryhmän suojaamiseen aminohappomolekyylin karboksyyliryhmän reaktion aikana, sillä BOC- ja AOC-suojaryhmät voidaan helposti poistaa ennen seuraavaa reaktiovaihetta (jossa täi- 12 67692 lainen OC-aminoryhmä itse reagoi) käsittelemällä suhteellisen lievissä reaktio-olosuhteissa hapolla (esimerkiksi trifluorietikkahapolla) , joka käsittely ei muulla tavoin vaikuta muiden reaktiivisten sivu-ketjujen suojaamiseen käytettyihin ryhmiin. oC-aminoryhmät voidaan siten suojata minkä tahansa sellaisen yhdisteen avulla, joka suojaa aminoryhmät seuraavassa reaktiossa tai seuraavissa reaktioissa, mutta joka voidaan myöhemmin poistaa olosuhteissa, jotka eivät muuten vaikuta molekyyliin. Esimerkkejä tällaisista yhdisteistä ovat orgaanisten karboksyylihappojen tai hiilihapon johdannaiset, joiden avulla aminoryhmä voidaan asyloida.

Yleisesti aminoryhmät voidaan suojata reaktiossa yhdisteen kanssa, joka sisältää kaavan 0 r3-o-£- mukaisen ryhmän, jossa on ryhmittymä, joka voidaan helposti poistaa ilman molekyylin hajoamista. R^ voi olla suora tai haarautunut, mahdollisesti tyydyttymätön, edullisesti 1-10 hiiliatomia sisältävä alkyyli, joka on edullisesti halogeeni- tai syaanisubstituoitu, edullisesti 6-15 hiiliatomia sisältävä aryyli, edullisesti 5-8 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli, edullisesti 7-18 hiiliatomia sisältävä aralkyyli, edullisesti 7-18 hiiliatomia sisältävä alkaryyli tai heterosyklinen ryhmä, kuten isonikotinyyli. Aryyli-, aralkyyli- ja alkaryyliryhmät voivat lisäksi olla substituoituja esimerkiksi yhdellä tai useammalla 1-4 hiiliatomia sisältävällä alkyyliryhmällä. Ryhmä R^ on edullisesti tert-butyyli, tert-amyyli, fenyyli, tolyyli, ksylyyli tai bentsyyli. Erityisen edullisia aminosuojaryhmiä ovat bentsyylioksikarbonyyli, substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, jonka fenyylirenkaassa on yksi tai useampi halogeeni, kuten Cl tai Br, nitro, alempialkoksi, esim. metoksi, tai alempialkyyli* tert-butyy-lioksikarbonyyli, tert-amyylioksikarbonyyli, sykloheksyylioksikar-bonyyli, vinyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli, bifenyy- li-isopropoksikarbonyyli jne. Muita käytettävissä sopivia suoja-ryhmiä ovat esimerkiksi isonikotinyylikarbonyyli, ftaloyyli, p-to-lyylisulfonyyli, formyyli jne.

Menetelmässä peptidin rakennetaan saattamalla vapaa οΛ.-aminoryhmä reagoimaan yhdisteen kanssa, 13 67692 jossa on suojattuja aminoryhmiä. Reaktion eli kytkennän suorittamiseksi liitettävän yhdisteen karboksyyliryhmä aktivoidaan, jolloin se voi reagoida peptidiket jun vapaan CC-amino ryhmän kanssa. Karbok-syyliryhmän aktivoimiseksi se voidaan muuttaa reaktiiviseksi ryhmäksi, kuten esteriksi, anhydridiksi, atsidiksi, happokloridiksi jne. Vaihtoehtoisesti reaktiossa voidaan käyttää sopivaa kytkentä-reagenssia. Sopivia kytkentäreagensseja on esitetty esimerkiksi teoksessa: Bodanszky et ai., Peptide Synthesis, Interscience, toinen painos, 1976, luku 5. Niistä voidaan mainita karbodi-imidit (esim disykloheksyylikarbodi-imidi), karbonyylidi-imidatsolit jne.

On huomattava, että näiden reaktioiden aikana aminohapporyh-mät sisältävät sekä aminoryhmiä että karboksyyliryhmiä, joista tavallisesti toinen ryhmä reagoi ja toinen on suojattuna. Ennen kyt-kentävaihetta liitetyn peptidin tai pääteaminoryhmän suojaryhmä poistetaan olosuhteissa, jotka eivät olennaisesti vaikuta muihin suojaryhmiin, esimerkiksi lysiinimolekyylin C-aminoryhmän suojaryh-mään. Edullisesti tämä suoritetaan lievissä olosuhteissa happokäsit-telyllä, esimerkiksi käsittelemällä huoneen lämpötilassa trifluori-etikkahapolla.

Edellä kuvatussa reaktiosarjassa saadaan tripeptidi, jolla on kaava

H-LYS-SAR-GLN-OH I

Kaavan I mukaisen tripeptidin amidointi voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla.

Vastaavia C-terminaaliamidipeptidejä voidaan myös valmistaa edellä kuvatulla menetelmällä käyttämällä kuitenkin siinä käytetyn kloorimetyylihartsin sijasta bentshydryyliamiinihartsia.

14 67692

Vaikka uusien peptidien valmistuksessa on käytetty Merrifield'in kiinteätaasitekniikkaa, niin on käsitettävä, että voidaan käyttää myös klassisia menetelmiä, joita ovat kuvanneet esimerkiksi Bodanszky et ai. Peptide Synthesis, Interscience, toinen painos, 1976.

Valmistettu peptidit indentifioitiin ja niiden aminohapposekvenssit ja niiden puhtaus määritettiin hyvin tunnetuilla menetelmillä, kuten ohutkerroskromatografiällä, elektroforeesilla, aminohappoanalyysillä ym.

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä. Esimerkissä ja koko selityksessä osat tarkoittavat paino-osia, jollei muuta ilmoiteta.

ESIMERKKI I

Keksinnön mukaisen polypeptidin valmistuksessa käytettiin seuraavia kaupallisesti saatavia tuotteita: C^-BOC-L-glutamiini e^-BOC- £-2-klooribentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini cf\-BOC-sarkosiini BOC merkitsee näissä reagensseissa tert-butyylioksikarbo-nyyliä. Aminohapposarjän määritykseen käytettävät " Sequenal "-reagenssit, disykloheksyylikarbodi-imidi, ninhydriini ja hartsi olivat kaupallisia tuotteita. Käytetty hartsi oli polystyreeni-divinyylibentseenihartsi (raekoko 200-400 mesh), joka sisälsi 1 % divinyylibentseeniä ja 0,75 mmol kloridia hartsi-g:aa kohti.

Il 67692

Polypeptidin valmistuksessa 0(-BOC-L-glutamiini liitettiin es-teröimällä edellä esitetyllä Gisin'in CsHCO^-menetelmällä kloorime-tyloituun hartsiin. Saatu Of-BOC-L-glutamiinihartsi sisälsi 0,4 - 0,5 mmol aminohappoa hartsi-g:aa kohti. Laitteella Schwarz/Mann Automatic Peptide Synthesizer suoritettiin seuraava ohjelma kunkin suojatun aminohapon kytkemiseksi -BOC-aminohappo-hartsiin: 1. Esipesu 40-%:isella trifluorietikkahapolla (TFA) CHCl2:ssa, 1 x, 1,5 min.

2. Suojaryhmän poisto 40-%:isella TFA:11a CH2Cl2:ssa, 1 x, 20 min.

3. Pesu CHCl^zlla, 1 x, 1,5 min.

4. Pesu EtOHrlla, 1 x, 1,5 min.

5. Pesu CH2Cl2:lla, 2 x, 1,5 min.

6. Esipesu 10-%:isella Et^Nillä CH2Cl2:ssa, 1 x, 10 min.

7. Neutralointi 10-%:isella Et^Nrllä CH2Cl2:ssa, 1 x, 10 min.

8. Pesu CH2Cl2:lla, 3 x, 1,5 min.

9. BOC-suojatun aminohapon lisäys (5 mol ylimäärin) dimetyy-liformamidissa (DMF) ja CH2Cl2:ssa (1:9 vol/vol).

10. DCC:n lisäys CH2Cl2:ssa (0,5-m, 5 mol ylimäärin) reaktioaika aina kahteen tuntiin asti.

11. Pesu CH2Cl2:lla, 2 x, 1,5 min.

Tämän jälkeen toiset Q(-BOC-aminohapot kytkettiin samalla tavalla käyttäen ekvivalenttisia määriä disykloheksyylikarbodi-imidiä oikeassa järjestyksessä peptidi-hartsin Of-aminoryhmään, josta suoja-ryhmä oli poistettu, jolloin saatiin keksinnön mukainen polypepti-di. Kunkin kytkentäreaktion jälkeen hartsinäytteestä kokeiltiin nin-nvdriinillä kytkennän täydellisyyttä. Jos ninhydriinireaktio oli positiivinen, niin kytkentä oli epätäydellinen ja toistettiin käyttäen samaa suojattua aminohappoa. Useamman kytkentäreaktion tuloksena saatiin välituote, tripeptidi-hartsi.

Tämä peptidi-hartsi pilkottiin ja suojaryhmät poistettiin Kel-F-pilkkomislaitteessa (Pininsula Laboratories, Ind.) käyttäen 10 ml vedetöntä fluorivetyä yhtä hartsi-grammaa kohti 0°C:ssa 60 16 67692 minuutin aikana anisolin läsnäollessa (5 ml/peptidi-hartsi-g) sivutuotteita sitovana aineena. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin tyhjössä, ja jäännös pestiin vedettömällä eetterillä. Raakapeptidi liuotettiin 10-%:iseen etikkahapon vesiliuokseen ja suodatettiin. Hartsi pestiin myös 10-%:isella etikkahapon vesiliuoksella, ja yhdistetyt suodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin raakapeptidi.

Se puhdistettiin vastavirtajakautumalla käyttäen partitiofaasina n-butanoli:etikkahappo:vesi-seosta (4:1:5), jolloin saatiin puhdas peptidi. Saadun polypeptidin kaavaksi määritettiin seuraava:

H-LYS-SAR-GLN-OH

Edellä oleva menetelmä toistettiin käyttäen kuitenkin bents-hydryyliamiinihartsia ja CX-BOC-L-glutamiinin sijasta 0(-B0C-L-glu-tamiini-O-nitrofenyyliesteriä ja suorittamalla esterin kytkentä hartsiin ilman DCC:tä, jolloin saatiin seuraava tripeptidiamidi: h-lys-sar-gln-nh2

Tripeptidiamidin identifiointiin käytettiin ohutkerroskro-matografiaa ja elektroforeesia. Aminohappokoostumus määritettiin aminihappoanalysoijalla. Ohutkerroskromatografia suoritettiin 20 ^ug:n näytteillä silikageelillä (Kieselgel, 5 x 20 cm) käyttäen eluenttina n-butanoli:etikkahappo:etyy1iasetaatti:vesi-seosta 1:1:1:1 (Rf^) ja selluloosa 6064:llä (Eastman, 20 x 20 cm) käyttäen eluenttina n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi-seosta 15:10:3:12 (Rf2). Rf-arvot H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH:n suhteen olivat R^ = 0,50 ja R^2 = 0,58. Sumutusreagenssina käytettiin ninhydriiniä. Elektroforeesi suoritettiin 100 ^ug:n näytteellä Whatman nro 3 paperilla (5,7 x 55 cm) pH-arvossa 5,6 käyttäen pyridiini-asetaatti-puskuria ja 1 000 V jännitettä yhden tunnin aikana. Peptidiamidin liikkuvuus katodia kohti suhteessa H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH:n liikkuvuuteen oli 1,93. Sumutusreagenssina käytettiin ninhydriiniä. Elektroforeesimäärityksen mukaan peptidiamidi oli 98-%:isen puhdasta.

Esimerkissä valmistetun tripeptidiamidin aktiivisuuden ja ominaisuuksien määrittämiseen käytettiin seuraavaa kananpoika-in- 17 67692 duktiokoetta. Tämä koe on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa: Brand et ai., Science, 193, 319-321 (23.7.1976) ja sen kirjallisuusviitteet .

Indusoitavien solujen lähteeksi valittiin soluja vastakuoriutuneiden kananpoikien luuytimestä, koska siitä puuttuu huomattavasti Bu-1+- ja Th-l+-soluja. Viiden vastakuoriutuneen SC (Hy-Line) -kannan kananpojan reisi- ja sääri-nilkkaluista saadut yhdistetyt solut fraktioitiin ultrasentrifugissa viisikerroksisella epäjatkuvalla häränseerumialbumiini-(BSA)-gradientilla. Kahden kevyimmän kerroksen solut yhdistettiin, pestiin ja inkubointia varten suspendoi-tiin pitoisuutena 5 x 10^ solua/ml kokeiltavan polypeptidin sopivan pitoisuuden kanssa RPMI-väliaineeseen, joka sisälsi lisänä 15 mM Hepes'ia, 5 % 'V-globuliinivapaata vasikan sikiöseerumia, deoksiri-bonukleaasia (14-18 yksikköä/ml), hepariinia (5 yksikköä/ml), penisilliiniä (100 yksikköä/ml) ja streptomysiiniä (100 ^.ug)ml) . Vertai-lunäytteitä inkuboitiin pelkästään BSA:n (1 ^ug/ml) tai väliaineen kanssa. Inkuboinnin jälkeen soluja kokeiltiin sytotoksisuus-kokees- sa käyttäen kananpojan Cl- ja marsun C2-C9-komplementtifraktioita + + viitejulkaisussa kuvatulla tavalla. Bu-1 - tai Th-1 -solujen osuudesta kussakin kerroksessa laskettiin sytotoksisuuskerroin, 100 (a-b)/a, jossa a on komplementtikontrollin ja b koevalmisteen elinvoimaisten solujen prosenttiosuus. Indusoitujen solujen prosenttimäärä saatiin vähentämällä kontrolli-inkubointien (joissa ei käytetty indusointiaineita, jota tavallisesti käytetiin 1-3 %) keskiarvo-tulokset koeindusointien keskiarvotuloksista.

Polypeptidin vaikutuksen spesifisyys ja sen samankaltaisuus ubikitiinin kanssa osoitettiin Bu-1+ B-solujen ja Th-1+ T-solujen induktion estymisellä koepolypeptidillä lisättäessä ubikitiinia väkevyytenä 100 yug/ml. Tämä suuri ubikitiini-annos inaktivoi ubikitii-ni-reseptorit ja estää siten solujen induktion näiden reseptorien kautta vaikuttavilla aineilla.

Tästä kokeesta saatiin tulokseksi, että esimerkissä valmistetulla amidoidulla tripeptidillä oli ubikitiininkaltainen aktiivisuus sen indusoidessa sekä Th-1+ T- ja Bu-1+ B-lymfosyyttien diffe-rentioitumista pitoisuutena 100 pg/ml.

Claims (2)

18 67692

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavojen I ja II mukaisten peptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, H-LYS-SAR-GLN-OH (I) H-LYS~SAR-GLN-NH2 (II) tunnettu siitä, että a) L-glutamiini, jonka ^-aminoryhmä on suojattu, liitetään kovalenttisella sidoksella polymeerihartsiin, joka sisältää funktionaalisen ryhmän, johon ensimmäinen suojattu aminohappo voidaan liittää lujasti kovalenttisella sidoksella, b) L-glutamiinin cL -aminosuojaryhmä poistetaan, c) SAR-aminohappo, jonka &C -aminoryhmä ja mahdolliset muut reaktiiviset ryhmät on suojattu, mutta jonka -karboksyyliryhmä ei ole suojattu, liitetään L-glutamiini-hartsiin, d) SAR-aminohapon aminosuojaryhmä poistetaan, e) LYS-aminohappo, jonka ck. -aminoryhmä ja £. -aminoryhmä on suojattu, liitetään SAR-aminohappo-L-glutamiini-hartsiin, ja f) peptidistä poistetaan sopivilla reagensseilla hartsi ja kaikki suojaryhmät, ja haluttaessa saatu tuote muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä polypeptidin H—LY S-SAR-GLN-NH 2 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään bentshydryyliamiinihartsia ja vaiheessa a) L-glutamiini-O-nitrofenyyliesteriä.