KR20050101221A - Ｈｉｖ 복제의 억제를 위한 글리신아미드 유도체 - Google Patents

Ｈｉｖ 복제의 억제를 위한 글리신아미드 유도체 Download PDF

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KR20050101221A
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안더르스 바흐르네
마리타 호그베르그
베이민 통
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트리펩 아베
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Abstract

본 발명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 복제를 억제하는 신규의 화합물 부류 및 상기 화합물을 식별하기 위한 접근법의 발견에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드는 인간 혈청에서 HIV의 복제를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 실시태양은 HIV를 억제하는 변경된 글리신아미드 화합물을 식별하는 방법, 변경된 글리신아미드 화합물의 단리 및 합성 방법, 및 이들 화합물을 포함하는 치료 조성물을 포함한다.

Description

ＨＩＶ 복제의 억제를 위한 글리신아미드 유도체{GLYCINAMIDE DERIVATIVE FOR INHIBITING HIV REPLICATION}
인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 복제를 억제하는 새로운 부류의 화합물들이 발견되었다. HIV의 복제를 억제하는 글리신아미드의 대사산물을 식별하기 위한 다수의 방법들이 개시되어 있다. 실시태양은 변경된 글리신아미드 화합물 및 변경된 글리신아미드 화합물을 포함하는 조성물을 식별하고 합성하는 방법을 포함한다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 인간을 감염시키고 후천성 면역 결핍증(AIDS)을 일으키는 렌티바이러스에 주어지는 명칭이다. HIV는 9 개 이상의 유전자를 함유하는 복합적인 레트로바이러스이다. gag, pol 및 env로 표시하는 바이러스 구조 유전자들은 특히 바이러스 코어 단백질, 역 전사효소, 및 바이러스 외피의 바이러스 당단백질을 각각 암호화한다. 나머지 HIV 유전자들은 바이러스 복제에 관련되는 보조 유전자들이다. 상기 gag 및 env 유전자는 폴리단백질을 암호화한다, 즉 상기 유전자 각각으로부터 합성된 단백질들이 다수의 보다 작은 단백질들로 번역 후 절단된다.
HIV의 전체적인 모양은 구형이지만, 뉴클레오캡시드는 긴 치수가 약 100 ㎚이고, 넓은 유리 단부의 폭이 약 40 내지 60 ㎚이며, 좁은 단부의 폭은 약 20 ㎚인 비대칭형이다. 각각의 성숙한 비리온 내의 뉴클레오캡시드는 Gag 전구체 폴리펩티드로부터 단백질 분해에 의해 처리된 단백질에 의해 피막 형성된 바이러스 단일 가닥 RNA 게놈의 2 개 분자로 구성된다. 바이러스 암호화된 프로테아제(PR)에 의한 gag 유전자 폴리단백질 Pr55gag의 절단으로 성숙한 캡시드 단백질이 생산된다.
AIDS의 병인체로서 HIV-1이 발견된 이래로, 상기 바이러스가 질병을 일으키는 기전을 이해하는데 상당한 진보가 이루어졌다. 많은 진단 시험들이 개발된 반면, HIV 백신 요법의 진보는 주로 상기 바이러스의 이질적인 성질과 적합한 동물 모델의 부족으로 인해 늦어지고 있다(예를 들어 문헌[Martin, Nature, 345:572-573(1990)]을 참조하시오).
각종 약제들이 AIDS를 치료하고자 사용되었다. HIV 역 전사효소(RT)는 바이러스 복제에서의 그의 중대한 역할 때문에 하나의 약물 표적이나, 상기 효소를 억제하는 약물 중 다수(전부는 아니라 하더라도)는 치료제로서의 유용성이 제한된다. 이들은 쇄 종결을 유도하는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 동족체 RT 억제제(NRTI:s), 및 상기 효소를 직접 억제하는, 비-뉴클레오시드 동족체 RT 억제제(NNRTI:s)라 지칭되는 작용제이다. 뉴클레오시드 유도체, 예를 들어 아지도티미딘(AZT, 지도뷰딘(등록상표)) 및 다른 RT 억제제들은 많은 환자들이 투여를 허용할 수 없을 정도로 심각한 부작용을 일으킨다.
또 다른 약물 표적은 바이러스 성숙에 결정적인 HIV 프로테아제(PR)이다. PR은 아스파트산 프로테아제이며 합성 화합물에 의해 억제될 수 있다(예를 들어 문헌[Richards, FEBS Lett., 253:214-216(1989)]을 참조하시오). 프로테아제 억제제는 HIV의 복제를 강하게 억제하지만 연장된 치료는 대사 질환, 예를 들어 지방 이상증, 고지혈증 및 인슐린 내성과 관련되었다.
또한, HIV는 NRTI:s, NNRT:s 및 프로테아제 억제제에 대한 내성을 빠르게 나타낸다. 내성 바이러스는 또한 환자들 사이에 확산될 수 있다. 일례로, 미국에서 최근에 HIV에 감염된 개인의 1/10 내지 1/5은 이미 하나 이상의 바이러스 억제 약물에 대해 내성을 나타낸 바이러스를 갖는데, 이는 아마도 이들이 전염 시에 내성을 나타낸 바이러스를 지닌 사람에 의해 감염되었기 때문일 것이다.
지난 10 년 동안, 다수의 펩티드 아미드가 HIV의 복제를 억제하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 미국 특허 제 5,627,035; 6,258,932; 6,455,670 호; 및 미국 특허 출원 제 09/827,822; 09/938,806; 10/072,783; 10/217,933; 및 10/235,158 호를 참조하시오). 상기 펩티드 아미드는 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제와 상이한 방식으로 HIV 복제를 억제하는 듯 하며 부작용이, 있다하더라도, 거의 없다. 이러한 노력에도 불구하고, HIV 복제를 억제하는 보다 선택적인 치료제에 대한 필요성이 명백히 존재한다.
발명의 요약
효소에 의해 제조되고 합성적으로 제조된 α-하이드록시글리신아미드가 인간 혈청에서 HIV의 복제를 억제함이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 태양은 변경된 글리신아미드 화합물들로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들을 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 변경된 글리신아미드 화합물(예를 들어 대사산물 X, 알파 하이드록시글리신아미드 또는 알파HGA)이 HIV의 복제 및/또는 증식을 억제하는 약제 및 약물의 유효 성분으로서 제공된다. 변경된 글리신아미드 화합물, 예를 들어 α-하이드록시글리신아미드(알파-하이드록시-gly-NH2), α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2) 및 알파-메톡시글리신아미드(알파-MeO-gly-NH2) 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이 HIV의 복제를 억제하는데 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 제형에 통합시키기에 바람직한 유효 성분들이다.
따라서, 레트로바이러스 억제 약제 및 약물을 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 변경된 글리신아미드 화합물(예를 들어 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H 또는 I의 화합물) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공함으로써 제조할 수 있다. 레트로바이러스 억제 약제 또는 약물로의 제형화에 바람직한 화합물에는 예를 들어 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 α-하이드록시글리신아미드(화학식 C), α-퍼옥시글리신아미드 이량체(화학식 E), 디글리신아미드 에테르(화학식 F) 및 알파-메톡시글리신아미드 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이 포함된다. 본 발명에 개시된 레트로바이러스 억제 약제 및 약물을 단위 투여형(예를 들어 정제, 캡슐, 젤캡, 액체 투여형, 주사 가능한 투여형, 경피 또는 비 내 투여형)으로 제공할 수 있으며 상기 변경된 글리신아미드 화합물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 상기 약제 및 약물을 포함하는 용기(예를 들어 멸균 바이알, 격막 밀봉된 바이알, 병, 통, 주사기, 분무기, 면봉)가 또한 대량이든 개별 용량이든 간에 실시태양이며, 바람직하게는 상기 제형을 보증된 제조 과정 기준(GMP)(예를 들어 정부 규제법인, 예를 들어 연방 의약품 안전청(FDA)에 의해 승인되거나 적합한)에 따라 제조하고, 상기 용기는 상기 정부 규제당국으로부터의 상기 제형의 승인을 반영하는 표지 또는 다른 표시를 포함한다. 상기 화합물을 구조-작용 표시와 함께 또는 상기 없이 함유하는 뉴트리슈티칼이 또한 실시태양이다.
일부 실시태양은 또한 상기 레트로바이러스 억제 화합물들(예를 들어 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 대사산물 X, α-하이드록시글리신아미드(화학식 C), α-퍼옥시글리신아미드 이량체(화학식 E), 디글리신아미드 에테르(화학식 F) 및 알파-메톡시글리신아미드) 중 하나 이상에 대한 전구체 또는 전구약물을 포함한다. 상기와 같은 전구체 또는 전구약물은 예를 들어 펩티드를 함유하는 글리신아미드 또는 글리신아미드 자체(예를 들어 GPG-NH2 또는 ALGPG-NH2)를 포함한다. 이들 전구체 또는 전구약물을 상기 전구체 또는 전구약물을 변경된 글리신아미드 화합물(예를 들어 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 변경된 글리신아미드 화합물(예를 들어 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H 또는 I로 제공되는 화합물, 예를 들어 대사산물 X)로 전환시킬 수 있는 물질(예를 들어 단리되거나, 농축되거나 원료 형태의 송아지 태아 혈청, 소 혈청, 혈장 또는 젖, 말 혈청, 혈장 또는 젖, 고양이 또는 개 혈청 등의 물질을 함유하는 보조인자(들))과 함께(예를 들어 혼합물로 동시 투여, 또는 상기 전구약물의 전달 전 또는 전달 후) 제공한다. 상기와 같이, 상기 전구약물/보조인자 제형을 보증된 제조 과정 기준(GMP)(예를 들어 정부 규제법인, 예를 들어 연방 의약품 안전청(FDA)에 의해 승인되거나 적합한)에 따라 제조할 수 있으며, 상기 용기는 상기 정부 규제당국으로부터의 상기 제형의 승인을 반영하는 표지 또는 다른 표시를 포함한다. 상기 제형을 구조-작용 표시와 함께 또는 상기 없이 함유하는 뉴트리슈티칼이 또한 실시태양이다.
알파-하이드록시글리신아미드(α-하이드록시글리신아미드) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염(또한 총칭하여 "알파HGA"라 함)이 HIV의 복제를 억제하는데 사용될 수 있는 약제 및/또는 약물에 통합시키기에 바람직한 유효 성분이다. L-알파HGA(R 또는 S 이성체) 또는 D-알파HGA(R 또는 S 이성체) 또는 이들 둘 모두(R 및 S 중 하나 또는 이들 두 이성체 모두)로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들을 포함하는 약제 및 약물이 실시태양이다. 이들 조성물(예를 들어 앰풀, 캡슐, 환제, 정제, 정맥 내 용액, 경피, 비 내 용액, 및 다른 약학적으로 허용 가능한 제형)은 바람직하게는 HIV의 복제 및/또는 증식을 억제하는 양의 효소에 의해 제조된(대사산물 X) 또는 합성적으로 제조된(알파HGA) 알파 하이드록시글리신아미드를 함유하거나, 제공하거나 전달한다.
실시태양은 예를 들어 하기 화학식 A의 변경된 글리신아미드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 에스테르 또는 전구약물로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들을 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 A)
상기 식에서,
a) E는 산소, 황 및 NR7로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
b) T는 산소, 황 및 NR8로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
c) R1-R8은 각각 독립적으로 수소; 임의로 치환된 알킬; 임의로 치환된 알케닐; 임의로 치환된 알키닐; 임의로 치환된 사이클로알킬; 임의로 치환된 헤테로사이클릴; 임의로 치환된 사이클로알킬알킬; 임의로 치환된 헤테로사이클릴알킬; 임의로 치환된 아릴; 임의로 치환된 헤테로아릴; 임의로 치환된 알킬카보닐; 임의로 치환된 알콕시알킬; 및 임의로 치환된 퍼할로알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
바람직한 조성물은 하기 화학식 B의 변경된 글리신아미드 화합물 또는 그의 염으로 이루어지거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 B)
상기 식에서,
R1은 수소 원자, 저급 알킬 그룹, 저급 알케닐 그룹, 저급 알키닐 그룹, 벤질 그룹, 또는 알킬 그룹 또는 알킬 그룹과 방향족 그룹으로 치환된 실릴 그룹이고;
R2는 수소 원자 또는 아미노 보호 그룹, 또는 그의 염이다.
바람직한 조성물은 하기 화학식 C의 변경된 글리신아미드 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 에스테르 또는 전구약물로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들을 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 C)
특히 바람직한 조성물은 하기 화학식 D의 변경된 글리신아미드 염으로 이루어지거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 D)
대사산물 X 또는 알파HGA라고도 지칭되는, 화학식 C의 화합물인 α-하이드록시글리신아미드는 효소 공정에 의해 제조되었으며 양이온 교환 HPLC에 의해 단리되었고, 화학식 D의 화합물은 합성적으로 제조되었다. 일부 상황 하에서, 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 화학식 C 및 D의 화합물을 모두 "대사산물 X", "알파HGA" 또는 "변경된 글리신아미드"로서 호환적으로 지칭한다.
바람직한 조성물은 또한 하기 화학식 E 또는 화학식 F의 변경된 글리신아미드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들을 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 E)
(화학식 F)
바람직한 조성물은 또한 화학식 G의 변경된 글리신아미드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 G)
알파-메톡시글리신아미드는 또한 합성적으로 제조되었으며 상기 화합물은 알파-하이드록시글리신아미드보다 더 안정한 것으로 밝혀졌다.
실시태양은 또한 HIV의 복제를 억제하는 변경된 글리신아미드 화합물을 식별하고 단리하는 다수의 방법 및 이들 화합물을 합성하는 방법을 포함한다. 일부 실시태양은 HIV의 복제 및/또는 증식을 억제하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법에서 HIV의 복제를 억제시키는 작용제가 필요한 환자에게 상기 바이러스의 증식 또는 복제를 억제시키기에 충분한 양의 효소에 의해 제조된(대사산물 X) 또는 합성적으로 제조된 알파 하이드록시글리신아미드(알파HGA)를 제공한다. 이들 방법 중 일부에서, HIV 복제에 대한 영향을 측정한다(예를 들어 바이러스 원천 또는 그의 마커의 감소를 관찰하거나 모니터함으로써). 추가의 실시태양은 HIV 감염을 치료하고/하거나 예방하기 위한 접근법을 포함하며, 여기에서 병에 걸린 환자 또는 HIV에 걸릴 위험이 있는 사람에게 HIV의 복제를 억제시키기에 충분한 양의 변경된 글리신아미드(예를 들어 알파-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체, 디글리신아미드 에테르 또는 알파-메톡시글리신아미드)를 제공한다. 상기와 같이, 일부 실시태양에서, 상기 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 약제를 HIV 복제를 억제시키는 작용제가 필요한 환자에게 제공하고, 다른 실시태양에서 HIV 복제에 대한 영향을 측정한다(예를 들어 바이러스 원천 또는 그의 마커의 감소, 예를 들어 p24 축적 또는 역 전사효소 활성을 측정함으로써).
도 1은 글리실프롤릴글리신아미드(GPG-NH2), 사코실피롤릴글리신아미드(SAR-PG-NH2), 환상 피로글루타미닐프롤릴글리신아미드(PyrQPG-NH2), 글루타미닐프롤릴글리신아미드(QPG-NH2) 및 글리신아미드(G-NH2)의 구조를 나타낸다.
도 2는 시간의 함수로서, 인간 T-림프구(CEM, C8166, Molt4/C8, MT-4) 및 PBMC 현탁액(패널 A) 중의 또는 다수의 상이한 혈청(인간(HS), 쥐(MS), 소(BS)(패널 B)) 중의 CD26 활성을 나타낸다. 기질은 글리실프롤릴-p-니트로아닐리드(GP-pNA)이었다. 효소 활성을 400 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
도 3은 표지되지 않은 GPG-NH2의 GP-OH 및 G-NH2로의 정제된 CD26-매개된 전환을 나타낸다.
도 4는 인산염 완충 염수(PBS) 중의 5% 소 혈청(BS), PBS 중의 5% 인간 혈청(HS) 및 CEM 세포 현탁액(106 세포)에 의한 방사성 표지된 [14C]GPG-NH2의 [14C]G-NH2로의 전환을 나타낸다.
도 5는 기질로서 GP-pNA를 사용하여 PBS 중의 5% 소 혈청(BS) 및 PBS 중의 106 CEM 세포 현탁액 중의 CD26의 디펩티딜펩티다제 활성에 대한 CD26-특이적인 억제제 IlePyr의 억제 효과를 나타낸다.
도 6은 CEM 세포 배양물 중의 GPG-NH2 및 G-NH2의 HIV-1 억제 활성에 대한 CD26 억제제 IlePyr의 효과를 나타낸다.
도 7은 G-NH2를 변경된 G-NH2(대사산물 X)로 전환시키는 능력에 대한 다수의 인간 혈청 및 소 태아 혈청에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 G-NH2를 변경된 G-NH2(대사산물 X)로 전환시키는 능력에 대한 상이한 동물 혈청들에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 G-NH2의 변경된 G-NH2(대사산물 X)로의 전환을 억제시키는 상이한 농도의 글리신, L-세린-NH2, L-알라닌-NH2 또는 GPG-NH2의 능력을 평가하는 경쟁 분석의 결과를 나타낸다.
도 10은 G-NH2를 변경된 G-NH2(대사산물 X)로 전환시키는, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수득된 상이한 분획의 소 태아 혈청에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X 또는 Met-X)가 끓인 송아지 태아 혈청을 함유하는 배양물에서 HIV의 복제를 억제하지만 G-NH2는 그렇지 않은, 역 전사효소(RT) 활성 분석의 결과를 예시한다.
도 12는 5 회 투석시킨, 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X 또는 Met-X)가 끓인 송아지 태아 혈청을 함유하는 배양물에서 HIV의 복제를 억제하는, 역 전사효소(RT) 분석의 결과를 예시한다.
도 13은 다양한 농도의, 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X 또는 Met-X)의 레트로바이러스 억제 활성(IC50)을 분석한, 역 전사효소(RT) 분석의 결과를 예시한다.
도 14는 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X 또는 Met-X)가 GPG-NH2만큼 유효하게 HIV를 억제하는, p24의 축적을 모니터한 HIV 감염성 분석(송아지 태아 혈청 중의)의 결과를 나타낸다.
도 15는 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)가 GPG-NH2만큼 유효하게 HIV를 억제하는 것이 관찰된, p24의 축적을 모니터한 HIV 감염성 분석(송아지 태아 혈청 중의)의 결과를 나타낸다.
도 16은 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X 또는 Met-X) 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)가 송아지 태아 혈청(패널 A)에서 G-NH2만큼 유효하게 HIV를 억제할뿐만 아니라, 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X 또는 Met-X) 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)가 인간 혈청(패널 B)에서도 HIV 복제를 억제할 수 있는, p24의 축적을 모니터한 HIV 감염성 분석(송아지 태아 혈청(패널 A) 및 인간 혈청(패널 B) 중의)의 결과를 나타낸다.
도 17은 37 ℃에서 3 일간 배양시킨(알파HGA 37), G-NH2, 새로 희석된 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA) 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드)의 레트로바이러스 억제 활성을 비교한, 역 전사효소(RT) 분석(송아지 태아 혈청 중의)의 결과를 나타낸다.
몇몇 트리펩티드 아미드 및 글리신아미드가 HIV의 복제를 억제하는 화합물로 대사되는 전구약물임이 밝혀졌다. 이들 항바이러스제는 세포 배양물에서 매우 선택적인 억제제이다(예를 들어 GPG-NH2 및 글리신아미드 또는 "G-NH2"는 CEM 세포 배양물에서 같은 정도(50% 유효 농도: ∼30 μM)로 HIV 복제를 억제한다). 당해 분야에서는 연구의 초점을, G-NH2가 또한 HIV의 복제를 억제하므로, 트리펩티드 아미드의 글리신아미드(G-NH2)로의 전환에 맞추었다(미국 특허 출원 제 10/235,158 호를 참조하시오). 본 발명에 이르러 림프구 표면 당단백질 마커 CD26이 GPG-NH2를 G-NH2로 효율적으로 전환시켜 디펩티드 GP-OH를 방출시키며 이러한 절단은 그의 레트로바이러스 억제 활성을 발휘하는데 GPG-NH2를 필요로 하는 것으로 공지되었다.
또한, G-NH2가 HIV의 복제를 억제하는 하나 이상의 화합물(예를 들어 환상의, 하전되거나 또는 하전되지 않은 형태의 글리신아미드)로 대사되는 전구약물 자체인 것으로 밝혀졌다. G-NH2로부터 유도된 이들 대사산물들을 "변경된 글리신아미드", "글리신아미드 유도체" 또는 "대사산물 X"라 지칭한다. 크로마토그래피 분리 후에 단리된 상기 변경된 글리신아미드 피크 분획에 대한 질량 분광측정 및 핵 자기 공명(NMR) 분광측정 분석은 상기가 α-하이드록시글리신아미드("알파HGA" 또는 (C2H6N2O2) 또는(C2H7ClN2O2))를 함유함을 밝혔다. α-하이드록시글리신아미드 및 α-메톡시글리신아미드는 모두 유기 합성에 의해 제조되었다. 효소에 의해 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X) 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)는 인간 혈청에서 HIV를 유효하게 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 변경된 글리신아미드를 함유하는 약제 및 약물의 제형화는 수월하며 HIV의 복제의 억제가 필요한 환자에서 상기 복제를 억제시키기 위한 상기 화합물의 용도를 본 발명에 제공한다. 하기 섹션은 CD26이 GPG-NH2를 G-NH2로 전환시킨다는 발견을 보다 상세히 개시한다.
CD26이 GPG-NH2의 G-NH2로의 전환을 매개한다
림프구 표면 당단백질 CD26은 처음에 T-세포 활성화/분화 마커로서 개시되었다(Fox et al., J. Immunol., 132:1250-1256(1984)) 참조). CD26은 HIV의 표적 세포(즉 림프구 CEM, Molt, C8166 및 MT-4, 및 말초 혈액 단핵 세포) 상에서 풍부하게 발현되며, 또한 소, 쥐 및 인간 기원의 혈청 중에 존재한다. 상기는 디펩티딜-펩티다제 IV(DPP IV, EC3.4.14.5)와 동일한 막-결합된 펩티다제이며, N-말단에서 끝에서 두 번째 아미노산으로서 프롤린 또는 알라닌을 함유하는 펩티드에 대해 높은(독점적이지는 않지만) 선택성을 갖는다(Yaron and Naider, Biochem. Mol. Biol., 28:31-81(1993); De Meester et al., Immunol. Today, 20:367-375(1999) 및 Mentlein, Regul. Pept., 85:9-24(1999) 참조). 상기는 각종 백혈구 서브셋 상에서 발현될 뿐만 아니라 여러 유형의 상피, 내피 및 섬유아세포 상에서 발현된다(상기 동일 문헌). 용해성 형태의 CD26이 또한 존재한다. 상기는 막통과 영역 및 세포 내 꼬리가 없으며 혈장 및 뇌척수액 중에서 소량 검출된다(Yaron and Naider, Biochem., Mol. Biol., 28:31-81(1993); De Meester et al., Immunol. Today, 20:367-375(1999) 참조).
다수의 사이토카인, 조혈 성장 인자, 호르몬 및 신경펩티드들은 그들의 N-말단에 X-Pro 또는 X-Ala 동기를 함유한다(De Meester et al., Immunol. Today, 20:367-375(1999) 참조). 상기 N-말단 부근의 프롤린의 존재는 비-특이적인 단백질 분해적 분해에 대해 구조적인 보호로서 작용한다(Vanhoof et al., FASEB J., 9:736-744(1995)) 참조). 특히, 비교적 작은 펩티드들은 천연 기질(예를 들어 케모카인 RANTES(68 아미노산) 및 SDF-1α(68 아미노산), 및 글루카곤/VIP(혈관활성 장 단백질) 계열 펩티드, 예를 들어 GIP(42 아미노산) 및 GLP-2(33 아미노산))로서 작용할 수 있다(De Meester et al., Immunol. Today, 20:367-375(1999) 참조). 일부의 경우에, 상기 펩티드들은 매우 짧다(예를 들어 신경펩티드 엔도모르핀 2(4 아미노산) 및 기질 P(11 아미노산)). 단지 5 아미노산으로 이루어진 엔테로스타틴이 또한 CD26에 대한 기질인 것으로 밝혀졌다.
흥미롭게도, 일부의 경우, CD26은 상기 분자의 N-말단 부분으로부터 디펩티드 부분이 절단된 후에 천연 펩티드의 생물학적 기능들이 변경되는 것으로 나타났다(Oravecz et al., J. Exp. Med., 186:1865-1872(1997); Proost et al., J. Biol. Chem., 273:7222-7227(1998)). 실제로, 말단 절단된 RANTES(3-68)는 완전한 RANTES에 비해 HIV-1 억제 활성이 현저하게 증가되는 것으로 밝혀진 반면(Schols et al., Antiviral Res., 39:175-187(1998)); CD26에 의한 SDF-1α의 N-말단 처리는 그의 HIV-1 억제 효능을 현저하게 감소시켰다(Ohtsuki et al., FEBS Lett., 431:236-240(1998); Proost et al., FEBS Lett., 432:73-76(1998) 참조). 또한, CD26이 인간 탯줄 혈액 CD34+ 선조 세포의 SDF-1α-매개된 화학주성을 조절함이 최근에 입증되었다(Christopherson et al., J. Immunol., 169:7000-7008(2002)).
트리펩티드 글리실프롤릴글리신아미드(GPG-NH2)는 비-독성 농도에서 HIV 복제를 억제하는 것으로 밝혀졌지만(예를 들어 미국 특허 제 5,627,035 호 참조), CD26과의 관련성은 본 발표가 있을 때까지 밝혀지지 않았다. 글리실프롤릴글리신아미드는 2 내지 40 μM 범위의 매우 다양한 HIV-1 실험실 균주들과 임상적 단리물들을 차단한다. HIV p24 중에 2 개의 GPG 동기가 존재하고 바이러스 외피 단백질 gp120의 V3 루프에 하나의 GPG 동기가 존재하므로, 초기의 연구는 상기 신규의 트리펩티드 유도체에 대한 잠재적인 표적으로서 이들 바이러스 단백질에 집중하였다(Su, Ph.D. thesis at the Karolinska Institute(ISBN 91-628-4326-5), Stockholm, Sweden(2000) and Su et al., AIDS Res. Human Retrovir., 16:37-48(2000) 참조).
gp160/120의 증가된 SDS-PAGE 이동성이 고 농도의 GPG-NH2에서 관찰되었지만, GPG-NH2는 HIV의 감염 주기에서 초기 사건에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다(Su et al., J. Hum. Virol., 4:8-15(2001)). 또한, GPG-NH2와 p24 단백질과의 결합이 설명되었으며 증가된 수의 바이러스 입자들의 잘못 조립된 코어 구조들이 GPG-NH2-처리된 HIV-1-감염된 세포에서 관찰되었다(Hoglund et al., Antimicrob. Agents Chemother., 46:3597-3605(2000)). 또한, 바이러스 캡시드(p24) 형성은 상기 약물의 존재 하에서 방해되는 것으로 밝혀졌다(Hoglund et al., Antimicrob. Agents Chemother., 46:3597-3605(2000)). GPG-NH2가 새로운 기전에 의해 HIV의 복제를 억제함이 분명해졌다.
GPG-NH2 펩티드 분자 중앙의 프롤린 잔기(아미노 말단의 끝에서 두 번째 아미노산에 대응함)의 존재로 인해, GPG-NH2가 CD26/디펩티딜펩티다제 IV에 대한 기질일 수 있고 CD26 효소 활성이 상기 화합물의 레트로바이러스 억제 활성을 조절할 수 있는 것으로 생각되었다. 따라서 CD26/디펩티딜펩티다제 IV가 GPG-NH2를 G-NH2로 전환시킬 수 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였으며, 실제로 CD26은 프롤린 잔기 뒤의 GPG-NH2를 선택적이고 효율적으로 절단시켜 디펩티드 GP-OH 및 G-NH2를 방출시키는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 레트로바이러스 억제 활성을 발휘하기 위해서 상기 절단에 GPG-NH2가 필요함이 입증되었다. 하기 실시예는 이러한 발견들을 보다 상세히 개시한다.
실시예 1
초기 실험에서, 다수의 HIV-1 및 HIV-2 균주를 GPG-NH2, G-NH2 및 관련 화합물들의 억제 활성에 대한 그들의 민감도에 대해 평가하였다(표 1 및 도 1 참조). 글리실프롤릴글리신아미드(GPG-NH2), 글루타미닐프롤릴글리신아미드(Q-PG-NH2), 사코시닐프롤릴글리신아미드(Sar-PG-NH2) 및 글리신아미드(G-NH2)는 TRIPEP AB(Huddinge, Sweden)에 의해 제공된 반면; 피로글루타미닐프롤릴글리신아미드(PyrQ-PG-NH2)는 레가(Rega) 연구소에서 합성되었다. 인간 T-림프구 CEM 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Rockville, MD)으로부터 수득하였으며 RPMI-1640 배지(Gibco, Paisley, Scotland; 10% 소 태아 혈청(FBS)(BioWittaker Europe, Verviers, Belgium), 2 mM L-글루타민(Gibco) 및 0.075 M NaHCO3(Gibco)가 보충되었다)에서 배양시켰다. HIV-1(IIIB)을 갈로 박사(Dr. R.C. Gallo)와 포포비치 박사(Dr. M. Popovic)(이때 당시 국립 암 연구소, NIH, Bethesda, MD에서)로부터 얻었다. HIV-1(NL4.3)을 국립 알러지 및 감염 질환 연구소 AIDS 시약 프로그램(Bethesda, MD)으로부터 얻었다. HIV-2 단리물 ROD 및 EHO는 몽타니에 박사(Dr. L. Montagnier, Pasteur Institute, Paris, France)에 의해 제공되었다.
인간 T-림프구 CEM 세포(4.5 x 105 세포/㎖)를 새로운 세포 배양 배지에 현탁시키고 HIV-1(IIIB 및 NL4.3) 또는 HIV-2(ROD 또는 EHO)에 의해 세포 현탁액 ㎖ 당 100 CCID50(1 CCID50은 세포 배양물의 50%를 감염시키는 바이러스 용량이다)로 감염시켰다. 이어서, 100 ㎕의 상기 감염된 세포 현탁액을 미세플레이트 웰로 옮기고, 100 ㎕의 적합하게(새로 제조된) 희석된 시험 화합물(즉 2000, 400, 80, 16, 3.2 및 0.62 μM의 최종 농도)과 혼합하고, 37 ℃에서 추가 배양시켰다. 4 내지 5 일 후에, 거대 세포 형성을 상기 CEM 세포 배양물 중에서 현미경에 의해 기록하였다. 50% 유효 농도(EC50)는 상기 바이러스-감염된 CEM 세포 배양물에서 합포체 형성을 50%까지 방지하는데 필요한 화합물 농도에 해당한다.
<표 1>
흥미롭게도, GPG-NH2 및 G-NH2는 모두 상기 바이러스 억제 분석에 사용된 바이러스의 성질에 관계없이, 몰 기준으로 바이러스 복제를 억제하는데 똑같이 유효하였다. 그들의 EC50(50% 유효 농도)는 CEM 세포 배양에서 30 내지 50 μM을 차지하였다. 상기 두 화합물은 모두 1500 내지 2000 μM 정도로 높은 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다. Sar-PG-NH2 및 Q-PG-NH2가 또한, GPG-NH2 보다 더 낮은 정도이기는 하지만 HIV 복제를 억제하였다. 카복시 말단 단부에 G-NH2를 함유하지만 그의 아미노 말단 단부에는 환상 피로글루타민을 함유하는 신규의 트리펩티드(PyrQ-PG-NH2) 유도체를 합성하였다. GPG-NH2 및 다른 트리펩티드 아미드 유도체들과 대조적으로, PyrQ-PG-NH2는 세포 배양물에서 HIV 복제를 억제하는데 효과가 없음이 밝혀졌다.
이어서, CD26 디펩티딜펩티다제 활성이 정제된 CD26 및 소, 쥐 및 인간 혈청에서 및 인간 림프구 또는 말초 혈액 단핵 세포 현탁액에 대해 검출될 수 있는 것으로 확인되었다. CD26 효소 활성을 합성 기질 글리실프롤릴 p-니트로아닐리드(GP-pNA)의 글리실프롤린(GP-OH) 및 p-니트로아닐린(pNA), 황색 염료(상기의 형성은 400 ㎚에서의 흡광도의 증가에 의해 모니터될 수 있다)로의 전환에 의해 기록하였다. 대략적으로, 인산염 완충 염수(PBS) 중의 정제된 CD26(1 밀리단위/㎖), 또는 인간, 쥐 또는 소 혈청(PBS 중의 5%), 또는 PBS 중의 106 인간 림프구 CEM, C8166, Molt4/C8, MT-4 또는 말초 혈액 단핵 세포 현탁액 200 ㎕를 200 ㎕-미세적정 플레이트 웰에 가한 후에 상기 CD26 효소 활성(글리실프롤릴-파라-니트로아닐리드)(GP-pNA)을 측정하기 위한 기질을 3 mM 최종 농도로 가하였다. 글리실프롤릴-p-니트로아닐리드(GP-pNA) 및 글리실페닐알라닐-p-니트로아닐리드(GF-pNA)를 시그마 케미칼스(St. Louis, MO)로부터 수득하였다. p-니트로-아닐리드(pNA)의 방출을 GlyPro-pNA로부터 방출되는 (황색)파라-니트로아닐리드(pNA)의 양을 측정함으로써 시간의 함수로 37 ℃에서 모니터하였다. 상기 pNA 방출을 스펙트라맥스(Spectramax) 미세플레이트 분광계(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 흡광도[400 ㎚에서의 광학 밀도(OD)]의 증가에 의해 기록하였다. 상기 실험 조건 하에서, 상기 반응은 적어도 60 분 동안 1 차적으로 진행하였다. 블랭크 반응 혼합물(CD26 효소, 혈청 또는 세포가 없음)의 OD400 값을 상기 수득된 OD400 값으로부터 감하여 효소 활성의 크기로서 실제적인 OD400 값의 증가를 나타내었다.
GP-pNA는 오직 CD26에 의해서 전환되었으며 다른 디펩티딜/펩티다제의 작용에 의해서는 전환되지 않았는데, 그 이유는 세포 현탁액에 CD26의 특이적 억제제를 첨가한 결과 합성 기질 GP-pNA로부터 p-니트로아닐린의 방출이 완전히 차단되었기 때문인 것으로 밝혀졌다(하기 문헌 참조). GP-pNA가 투여된 모든 림프구 세포 현탁액(CEM, C8166, MT-4, Molt4/C8) 및 또한 PBMC는 GP-pNA를 시간 의존적인 방식으로 p-니트로아닐린으로 효율적으로 전환시켰다(도 2A 참조). CD26 활성은 CEM 세포 현탁액에서 가장 높았고 MT-4 세포 현탁액에서 가장 낮았다. 또한, 소 태아 및 쥐 혈청 및 특히 인간 혈청은 GP-pNA로부터 p-니트로아닐린을 효율적으로 방출시켰다(도 2B 참조). 따라서, 인간 T-림프구 세포 현탁액과 혈청은 모두 탁월한 CD26/디펩티딜펩티다제 효소 활성을 나타낸다. 일단 CD26 활성을 효율적으로 모니터할 수 있음이 결정되었으면, CD26이 GPG-NH2를 G-NH2로 전환시킬 수 있는지를 결정하기 위해서 실험을 수행하였다.
샘플에서, 대략 100 μM GPG-NH2를 25 단위/ℓ의 정제된 CD26에 노출시켰으며, 상기 혼합물을 실온에서 400 분 이하로 배양시켰다. 림프구 표면 당단백질 CD26/디펩티딜펩티다제 IV를 상술한 바와 같이 정제하였다(De Meester, J., Immunol. Methods, 189:99-105(1996) 참조). 상이한 시점들에서, 반응 혼합물의 분액을 회수하여 전기분무 이온 포착 질량 분광계(Esquire, Bruker, Bremen, Germany) 상에서 분석하였다. GPG-NH2 분자의 아미노 말단 단부로부터 방출 시 디펩티드 GP-OH의 출현뿐만 아니라, 상기 반응 혼합물로부터 완전한 GPG-NH2의 소멸이 측정되었으며 이를 상이한 시점들에서 전기분무 이온 포착 질량 분광 측정 분석에 의해 모니터하였다(도 3 참조). 이러한 실험 조건 하에서, CD26은 시간 의존적인 방식으로 GPG-NH2로부터 GP-OH를 방출시켰으며, 반응 4 내지 6 시간 이내에 GPG-NH2를 GP-OH 및 G-NH2로 실제로 완전히 전환시켰다. 대조적으로, CD26은 피로Q-PG-NH2로부터는 G-NH2를 방출시킬 수 없었다.
이어서, 정제된 CD26, 소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청(HS) 및 CEM 세포 현탁액에 의한 방사성 표지된 [14C]GPG-NH2의 [14C]G-NH2로의 전환을 분석하였다. 방사성 표지된 [14C]GPG-NH2(방사능 특이성: 58 mCi/밀리몰)(여기에서 방사능 표지된 탄소는 상기 트리펩티드의 카복실산 단부의 글리신의 주 쇄 탄소에 위치한다) 및 [14C]G-NH2(방사능 특이성: 56 mCi/밀리몰)(여기에서 탄소-2가 방사성 표지되었다)는 에머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)에 의해 합성되었다. 다양한 농도의 상기 [14C]GPG-NH2를 정제된 CD26, FBS, HS 및 CEM 세포 현탁액에 노출시키고 G-NH2로의 전환을 분석하였다.
하나의 실험 세트에서, 예를 들어 5 ㎖의 CEM 세포 배양물(5 x 105 세포/㎖)을 20 μM의 [14C]GPG-NH2에 24 시간 동안 노출시켰다. 이어서, 상기 세포를 1,200 rpm에서 10 분간 원심분리시키고, 세척하고, 세포 펠릿을 10 분 간 60% 빙 냉 메탄올로 처리하였다. 상기 메탄올 세포 추출물을 15,000 rpm에서 10 분간 원심분리시키고, 그 후에 상등액을 양이온 교환 파티스피어(Partisphere)-SCX 컬럼(Whattman) 상에 주입하여 GPG-NH2와 G-NH2를 분리시켰다. 하기 구배를 사용하였다: 0 내지 15 분: 등장성 완충제 A(7 mM 인산 나트륨, pH 3.5); 15 내지 40 분: 완충제 A에서 완충제 B(250 mM 인산 나트륨, pH 3.5)로의 선형 구배; 40 내지 45 분: 완충제 B로부터 완충제 A로의 선형 구배; 45 내지 55 분: 등장성 완충제 A. 이러한 용출 조건 하에서 [14C]GPG-NH2의 [14C]G-NH2로의 체류 시간은 각각 26 내지 28 분 및 14 내지 16 분이었다.
또 다른 세트의 실험에서, 1 시간의 노출 후에, 상술한 바와 같이 양이온 교환 파티스피어 SCX 컬럼 및 인산 나트륨 완충제 구배(pH 3.5)를 사용하여 HPLC에 의해 완전한 [14C]GPG-NH2의 소멸을 측정하였다. GPG-NH2는 G-NH2로부터 잘 분리되었다(체류 시간: 각각 25 내지 27 분 및 15 내지 17 분). GPG-NH2의 G-NH2로의 CD26-촉진된 전환의 Km 값은 0.183 mM인 것으로 계산되었다. HS 및 FBS와 관련된 디펩티딜펩티다제 활성에 대해 평가된 GPG-NH2의 Km 값은 도 4에 나타낸 GPG-NH2 소멸 곡선으로부터 유도되는 바와 같이, 각각 0.45 및 1.4 mM이었다. CEM 세포 현탁액에 의한 GPG-NH2 전환은 1.5 mM까지 1 차적으로 진행하였다. 오직 보다 높은 GPG-NH2 농도(예를 들어 3 및 5.4 mM)에서만, 상기 CEM 세포 현탁액에 대한 전환 곡선이 약간 평평해지기 시작하였다.
이어서, CD26에 대한 L-이소류신피롤리딘(IlePyr)의 억제 효과를 분석하였다. 이소류신피롤리딘(IlePyr)은 최근에 정제된 CD26-관련된 디펩티딜펩티다제 활성의 비교적 효능 있고 선택적인 억제제인 것으로 보고되었다(De Meester, J. Immunol. Methods, 189:99-105(1996)). 모든 효소 활성 분석을 96-웰 미세적정 플레이트(Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 수행하였다. 각각의 웰에 PBS 중의 정제된 CD26(0.2 밀리단위/200 ㎕-웰의 최종 농도) 5 ㎕, 소 태아 혈청(BS)(최종 농도: PBS 중의 5%; 56 ℃에서 30 분간 예열시킨 것) 10 ㎕, 또는 PBS 중의 1 x 106 CEM 세포, PBS 중의 적합한 농도의 IlePyr 억제제 용액(500 및 200 μM) 5 ㎕, 및 총 부피 150 ㎕에 달하는 양의 PBS를 가하였다. 50 ㎕의 기질 GP-pNA를 4 ㎎/㎖(상기 200 ㎕ 반응 혼합물 중의 최종 농도: 1 ㎎/㎖ 또는 3 mM)로 가하여 상기 반응을 개시시키고 37 ℃에서 수행하였다. CD26, BS 및 CEM 세포 현탁액과 관련된 디펩티딜펩티다제 활성에 대한 IlePyr의 50% 억제 농도를 GP-pNA의 pNA 및 GP-OH로의 효소-촉진된 가수분해를 50%까지 억제하는데 필요한 화합물의 농도로서 정의하였다.
초기 실험에서, 기질로서 GP-pNA를 사용하여 IlePyr에 의해 수행된 CEM 세포 현탁액 중의(소 태아 혈청 중의) CD26 억제를 분석하였다. 정제된 CD26을 양성 대조군으로서 포함시켰다. (도 5 참조). 억제제 IlePyr은 CEM 세포 현탁액뿐만 아니라 소 태아 혈청에 각각 110 및 99 μM의 50% 억제 농도(IC50)로 노출된 GP-NA로부터의 p-니트로아닐린의 방출을 용량 의존적으로 방지하였다. 정제된 CD26은 22 μM의 IC50 값에서 억제되었다. 따라서, 혈청 및 CEM 세포 현탁액에 노출된 억제제 IlePyr의 50% 억제 농도(IC50) 값은 정제된 CD26을 50%까지 억제시키는데 필요한 억제제 농도보다 ∼5 배 더 높았다.
이어서, GPG-NH2에 대해 관찰된 레트로바이러스 억제 활성이 트리펩티드 유도체로부터 G-NH2의 CD26-촉진된 방출과 관련이 있는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. HIV-1 감염된 CEM 세포 배양물을 비-독성 농도의 IlePyr(500 μM 및 200 μM)의 존재 하에서 상이한 농도의 GPG-NH2에 노출시켰다. 유사한 G-NH2와 IlePyr의 조합을 본 연구에 포함시켰다. 이 실험에서, CD26-특이적 억제제인 L-이소류신피롤리딘(IlePyr)을 시험 화합물 및 바이러스 감염된 세포의 첨가 전에 각각의 세포 배양물 미세플레이트에 가하였다.
200 및 500 μM의 IlePyr(EC50-35 내지 43 μM)의 존재 하에서 CEM 세포 배양물에서 그의 HIV 억제 활성을 완전히 보존하는 G-NH2와 대조적으로, GPG-NH2는 상기 특이적인 CD26 억제제의 존재 하에서 바이러스-유발된 세포변성에 대한 그의 억제 활성을 현저하게 상실하였다(도 6 참조). 가장 높은 억제제 농도(500 μM)가 보다 낮은(200 μM) 억제제 농도보다 트리펩티드 GPG-NH2의 HIV-1 억제 활성을 역전시키는데 약간 더 효율적이었다. 유사한 결과가, 세포 배양물 중에서 레트로바이러스 억제 활성을 또한 갖는 또 다른 트리펩티드 아미드 유도체인 Sar-GP-NH2에 대해 관찰되었다.
본 실시예에 제공된 결과는 GPG-NH2가 글리신아미드를 방출시키기 위해 가수분해를 필요로 하며, 그 후에 세포 배양물에서 그의 HIV 억제 활성을 발휘할 수 있음을 설명한다. 상기 데이터는 또한 GPG-NH2로부터 G-NH2의 방출이 림프구 표면 당단백질 활성화/분화 마커인 CD26의 효소 활성에 의해 유도된다는 증거를 제공한다. GPG-NH2로부터 G-NH2의 형성을 정제된 CD26, 인간 T 림프구 세포 현탁액 및 인간 및 소 혈청을 사용하여 수행하였다. 더욱이, CD26의 특이적인 억제제의 존재 하에서 Q-PG-NH2의 현저한 바이러스 억제 활성, PyrQ-PG-NH2(CD26에 의한 효소 공격에 내성이다)의 바이러스 억제 활성의 완전한 결여, 및 GPG-NH2 및 Sar-GP-NH2의 바이러스 억제 효능의 상실은 GPG-NH2가 G-NH2의 효율적인 전구약물로서 작용하며 CD26이 GPG-NH2의 G-NH2로의 전환을 촉진시킨다는 강력한 증거를 제공한다.
따라서, 막 결합된 디펩티딜 펩티다제인 림프구 표면 당단백질 CD26은 예를 들어 GPG-NH2, QPG-NH2 및 사코실프롤릴글리신아미드(SAR-PG-NH2)의 G-NH2로의 대사에 기여하는 효소인 것으로 밝혀졌다. CD26이 펩티드 아미드의 HIV의 복제를 억제하는 형태로의 대사에 기여한다는 추가의 증거를 선택적인 CD26 억제제인 L-이소류신피롤리딘(IlePyr)을 사용하는 실험으로부터 얻었으며, 여기에서 GPG-NH2 및 SAR-PG-NH2의 HIV 억제 활성의 현저한 감소가 관찰되었다. 상기 IlePyr 억제제는 그러나 HIV의 복제를 억제하는 G-NH2의 능력에는 영향을 미치지 않았다. 따라서, X-Pro-글리신아미드 함유 펩티드 아미드는 림프구 표면 당단백질인 CD26에 의해 G-NH2로 대사되는 레트로바이러스 억제 전구약물 또는 전구체이다. 하기 섹션은 글리신아미드가 HIV의 복제를 억제한다는 발견을 보다 상세히 개시한다.
글리신아미드는 HIV의 복제를 억제한다
처음에는, G-NH2가 HIV의 복제를 효율적으로 억제하지만 구조가 유사한 화합물들은 그렇지 않은 것으로 판단되었다. HIV-1 (IIIB)-감염된 CEM 세포 배양물을 다양한 농도의 G-NH2 또는 다양한 농도의 G-NH2와 유사한 구조를 갖는 화합물과 배양시키고, HIV 복제의 억제를 표준 과정을 사용하여 평가하였다. 이들 실험을 하기 실시예에 개시한다.
실시예 2
인간 T 림프구 CEM 세포(대략 4.5 x 105 세포/㎖)를 새로운 배지에 현탁시키고 HIV-1(IIIB)에 의해 세포 현탁액 ㎖ 당 대략 100 CCID50(1 CCID50은 세포 배양물의 50%를 감염시키는 바이러스 용량이다)으로 감염시켰다. 이어서, 100 ㎕의 상기 감염된 세포 현탁액을 미세적정 플레이트의 개별적인 웰(100 ㎕/웰)로 옮기고, 100 ㎕의 새로 희석된 시험 화합물(2000, 400, 80, 16, 3.2 또는 0.62 μM)과 혼합하였다. 이어서, 상기 혼합물을 37 ℃에서 배양시켰다. 4 내지 5 일 후에, 거대 세포 형성을 상기 CEM 배양물 중에서 현미경에 의해 기록하였다. 50% 유효 농도(EC50)는 상기 바이러스-감염된 CEM 세포 배양물에서 합포체 형성을 50%까지 방지하는데 필요한 화합물 농도에 해당한다.
상기 실험의 결과를 표 2에 나타낸다. 글리신아미드는 세포 배양물에서 HIV 복제를 분명히 억제하는 유일한 화합물인 것으로 밝혀졌다. G-NH2에 대한 EC50은 대략 21.3 μM인 반면, 시험된 다른 화합물들은 HIV의 억제를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 G-NH2가 HIV 복제를 억제하는 특정한 구조를 가짐을 입증하였다.
<표 2>
CEM 세포 배양물에서 HIV-1(IIIB)에 대한 화합물들의 억제 활성
EC50(μM)a
글리신아미드글리신-티오아미드환상 글리신-티오아미드L-알라닌아미드L-류신아미드L-이소류신아미드L-발린아미드L-리신아미드L-아스파라긴아미드L-Val β-나프틸아미드Ala-Pro-Gly-Trp-아미드DL-류신아미드DL-트립토판아미드L-티로신아미드D-아스파라긴L-페닐알라닌아미드L-메티오닌아미드L-쓰레오닌아미드L-아르기닌아미드L-트립토판아미드L-프롤린아미드L-아스파라긴아미드DL-페닐알라닌아미드D-류신사코신아미드L-세린아미드L-알라닌L-류신L-프롤린글리신1,3-디아미노아세톤에틸렌 디아민1,4-디아미노-2-부타논1,3-디아미노-2-하이드록시프로판DL-2,3-디아미노프로피온산글리신 메틸아미드 21.3±16.3>500>500>500>500>500>500>500>500>100>500>500>500>500>500>500>500>500>500>200>1000>1000>1000>1000>1000>1000>500>500>500>500>1000>1000->1000>1000>500
a 50% 유효 농도
후속의 분석은 G-NH2가 HIV의 특이적인 억제제임을 밝혔다. 다양한 농도의 G-NH2 및 GPG-NH2의 세포독성 및 바이러스 억제 활성을 다양한 유형의 바이러스로 감염시킨 세포 배양물에서 평가하였다. 통상적인 숙주 세포 배양, 바이러스 감염, 및 각각 상이한 유형의 세포 및 바이러스에 대한 감염성 분석을 수행하였다. 분석된 특정 유형의 바이러스의 복제를 억제하는 것으로 공지된 화합물을 대조군으로서 사용하였다.
표 3 내지 5는 이들 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 G-NH2 및 GPG-NH2가 헤르페스 단순 바이러스-1(KOS), 헤르페스 단순 바이러스-2(G), 헤르페스 단순 바이러스-1 TK- KOS ACVr, 우두 바이러스, 소 수포 구내염 바이러스, 콕삭키 바이러스 B4, 호흡기 세포 융합 바이러스, 파라인플루엔자-3 바이러스, 레오바이러스-1, 신드비스 바이러스, 및 푼타 토로 바이러스의 복제를 억제하는데 효과가 없음을 나타낸다. 이러한 결과는 G-NH2 및 GPG-NH2가 HIV의 선택적인 억제제임을 입증하였다.
<표 3>
HEL 세포 배양물에서 화합물들의 세포독성 및 바이러스 억제 활성
화합물 최소 세포독성 농도a(㎍/㎖) 최소 억제 농도b
헤르페스 단순 바이러스-1(KOS) 헤르페스 단순 바이러스-2(G) 우두 바이러스 소 수포 구내염 바이러스 헤르페스 단순 바이러스-1TK- KOS ACVr
G-NH2(μM) >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000
GPG-NH2(μM) >400 >400 >400 >400 >400 >400
BVDU(㎍/㎖) >400 0.0256 >400 0.64 400 400
리바비린(㎍/㎖) >400 48 >400 240 >400 80
ACG(㎍/㎖) >400 0.0768 0.0768 >400 >400 9.6
DHPG(㎍/㎖) >100 0.0038 0.0192 60 >400 0.48
a 정상적인 세포 형태의 현미경에 의해 검출 가능한 변경을 일으키는데 요구되는 농도b 바이러스 유발된 세포변성을 50% 까지 감소시키는데 필요한 농도
<표 4>
HeLa 세포 배양물에서 화합물들의 세포독성 및 바이러스 억제 활성
화합물 최소 세포독성 농도a(㎍/㎖) 최소 억제 농도b
소 수포 구내염 바이러스 콕삭키 바이러스B4 호흡기 세포융합 바이러스
G-NH2(μM) >2000 >2000 >2000 >2000
GPG-NH2(μM) >400 >400 >400 >400
브리뷰딘(㎍/㎖) ≥400 >400 >400 >400
(S)-DHPA(㎍/㎖) >400 240 >400 >400
리바비린(㎍/㎖) >400 9.6 48 16
a 정상적인 세포 형태의 현미경에 의해 검출 가능한 변경을 일으키는데 요구되는 농도b 바이러스 유발된 세포변성을 50% 까지 감소시키는데 필요한 농도
<표 5>
Vero 세포 배양물에서 화합물들의 세포독성 및 바이러스 억제 활성
화합물 최소 세포독성 농도a(㎍/㎖) 최소 억제 농도b
파라인플루엔자-3 바이러스 레오바이러스-1 신드비스 바이러스 콕삭키 바이러스 B4 푼타 토로 바이러스
G-NH2(μM) >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000
GPG-NH2(μM) >400 >400 >400 >400 >400 >400
BVDU(㎍/㎖) >400 >400 >400 >400 >400 >400
(S)-DHPA(㎍/㎖) >400 240 80 >400 >400 >400
리바비린(㎍/㎖) >400 48 16 >400 >400 48
a 정상적인 세포 형태의 현미경에 의해 검출 가능한 변경을 일으키는데 요구되는 농도b 바이러스 유발된 세포변성을 50% 까지 감소시키는데 필요한 농도
또한 G-NH2는 일부 동물의 혈장 및 혈청 중에 존재하는 효소 또는 보조인자(들)에 의해 HIV의 복제를 억제하는 하나 이상의 화합물(예를 들어 환상의, 하전되거나 하전되지 않은 형태의 글리신아미드)로 대사되는 전구약물 또는 전구체 자체인 것으로 밝혀졌다. 하기 섹션은 이러한 발견을 보다 상세히 개시한다.
일부 동물의 혈장 및 혈청 중에 존재하는 보조인자(들)는 G-NH 2 를 HIV를 억제하는 대사산물로 전환시킨다
본 발명에서, 일부 동물의 혈청 및 혈장 중에 존재하는 하나 이상의 보조 인자가 G-NH2를 활성 형태("변경된 글리신아미드" 또는 대사산물 X)(이는 세포로 운반되어 HIV의 복제를 억제한다)로 대사시키는 증거를 제공한다. 따라서, G-NH2는 레트로바이러스 억제 화합물의 전구체 또는 전구약물이며, G-NH2를 상기 보조인자 또는 상기 보조인자를 함유하는 물질과 함께 투여하도록 제형화할 수 있다. 크로마토그래피 방법을 사용하여 상기 보조 인자를 단리시켰다. 상기 보조인자를 본 발명에 개시된 접근법 및 분자 생물학에 통상적인 기법을 사용하여 정제하고, 클로닝하고 서열화할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양은 혼합물로 제형화되거나 또는 G-NH2를 대사산물 X로 전환시키는 물질(예를 들어 정제되거나, 농축되거나 단리된 형태의 돼지 혈청, 혈장 또는 젖, 말 혈청, 혈장 또는 젖, 소 혈청, 혈장 또는 젖)과 함께(G-NH2의 투여 전 또는 투여 후) 투여되는 G-NH2로 대사되는 화합물(예를 들어 GPG-NH2) 또는 G-NH2를 함유하는 약학적 또는 뉴트리슈티칼 제제를 포함한다.
G-NH2의 활성 형태(변경된 글리신아미드 또는 대사산물 X)를 G-NH2를 일부 혈청 또는 혈장 중에서 배양시켜 쉽게 제조하며, 상기 변경된 글리신아미드를 하기 개시하는 크로마토그래피 방법에 의해 용이하게 단리시킨다. 본 내용 전체를 통해, 글리신아미드 대사산물(글리신아미드의 레트로바이러스 억제 활성인 형태)을 "변경된 글리신아미드", "변경된 G-NH2" 또는 "빠른 피크 글리신아미드"로서 총칭한다. 변경된 G-NH2의 예로는 비 제한적으로 α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 및 이들 화합물의 염 및/또는 유도체가 있다. 크로마토그래피 분리 후 단리된 상기 변경된 글리신아미드 피크 분획에 대한 질량 분광측정 및 핵 자기 공명(NMR) 분광측정 분석은 상기가 α-하이드록시글리신아미드를 함유함을 밝혔다. 화합물 α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2)는 α-하이드록시글리신아미드보다 더 안정할 수 있으며 α-하이드록시글리신아미드 및 α-메톡시글리신아미드는 모두 유기 합성에 의해 제조되었다. 당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 개시된 과정 및 다른 이용 가능한 합성 접근법을 사용하여 다른 변경된 글리신아미드 화합물을 쉽게 제조할 수 있다(예를 들어 1991년 10월 3일자로 출원된, 하야카와(Hayakawa) 등의 "알파-하이드록시글리신아미드 유도체 및 그의 제조"란 표제하의 JP 5097789A2를 참조하시오). 합성적으로 또는 효소에 의해 제조된 알파HGA(α-하이드록시글리신아미드)의 존재 하에서 수행된 HIV 감염성 연구는 상기 화합물이 인간 혈청에서 HIV 복제를 유효하게 억제함을 밝혔다.
변경된 G-NH2의 약제 및 약물로서의 제형화는, 상기 변경된 G-NH2가 합성적으로 제조되든 혹은 G-NH2를 혈청 중에서 배양시킴으로써 효소에 의해 생성되는 간에 수월하다. 따라서, 레트로바이러스 억제 약제 및 약물을 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 변경된 글리신아미드 화합물(예를 들어 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H 또는 I의 화합물) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공함으로써 제조할 수 있다. 레트로바이러스 억제 약제 또는 약물로의 제형화에 바람직한 화합물에는 예를 들어 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 또는 이들 둘 모두, 또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S) 또는 이들 둘 모두의 α-하이드록시글리신아미드(화학식 C), α-퍼옥시글리신아미드 이량체(화학식 E), 디글리신아미드 에테르(화학식 F) 및 알파-메톡시글리신아미드 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이 포함된다. 본 발명에 개시된 레트로바이러스 억제 약제 및 약물을 단위 투여형(예를 들어 정제, 캡슐, 젤캡, 액체 투여형, 주사 가능한 투여형, 경피 또는 비 내 투여형)으로 제공할 수 있으며 상기 변경된 글리신아미드 화합물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 상기 약제 및 약물을 포함하는 용기(예를 들어 멸균 바이알, 격막 밀봉된 바이알, 병, 통, 주사기, 분무기, 면봉)가 또한 대량이든 개별 용량이든 간에 실시태양이며, 바람직하게는 상기 제형을 보증된 제조 과정 기준(GMP)(예를 들어 정부 규제법인, 예를 들어 연방 의약품 안전청(FDA)에 의해 승인되거나 적합한)에 따라 제조하고, 상기 용기는 상기 정부 규제당국으로부터의 상기 제형의 승인을 반영하는 표지 또는 다른 표시를 포함한다. 상기 화합물을 구조-작용 표시와 함께 또는 상기 없이 함유하는 뉴트리슈티칼이 또한 실시태양이다.
일부 실시태양은 변경된 글리신아미드 화합물로 이루어지거나 또는 상기 화합물이 농축된 HIV 억제용 제제(예를 들어 상기 바이러스의 복제를 억제하는 양의, 단리되거나, 정제되거나 합성된 형태의 변경된 글리신아미드 화합물로 이루어지거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 상기를 포함하는, HIV의 억제를 위한 약제 및 약물)이다. 바람직한 실시태양은 α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드 및 이들 화합물의 유도체로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들을 포함하는 약제 또는 약물을 포함한다.
본 발명에 사용된 "농축된"이란 용어는 물질의 농도가 그의 천연 농도의 1000 배 이하(예를 들어), 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 이상임을 의미한다. 약 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%의 농축된 제제가 또한 고려된다. "단리된"이란 용어는 상기 물질을 그의 원래 환경(예를 들어 상기가 천연적으로 발생하는 경우 천연 환경)으로부터 제거할 것을 필요로 한다. "정제된"이란 용어는 절대적인 순도를 요하는 것이 아니라; 오히려 상대적인 정의로서 의도된다. 단리된 단백질을 크로마토그래피 및/또는 겔 전기영동에 의해 통상적으로 정제할 수 있다. 출발 물질 또는 천연 물질을 1 등급 이상, 바람직하게는 2 또는 3 등급, 보다 바람직하게는 4 또는 5 등급 정도로 정제하는 것이 특별히 고려된다.
하기 실시예는 상업적으로 수득된 글리신아미드를 정제하는데 사용되는 접근법을 개시한다. 상기 접근법의 태양들을 사용하여 하기 개시하는 바와 같이, 다양한 동물 혈청 중에서 배양 후에 생산된 글리신아미드의 대사산물을 정제하였다.
실시예 3
정제되지 않은 [14C]G-NH2의 제제를 양이온 교환 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분리시킬 때 2 개의 G-NH2 집단이 분해되는 것이 관찰되었다(표 6 참조). 방사성 표지된 G-NH2와 방사성 표지된 GPG-NH2의 조 제제를 양이온 교환 컬럼(예를 들어 파티스피어 SCX-와트만)을 사용하여 HPLC에 의해 분리시켰다. 하기의 구배를 사용하였다: 0 내지 15 분: 등장성 완충제 A(5 mM 인산 암모늄으로 구성됨, pH 3.5); 15 내지 40 분: 완충제 A에서 완충제 B(250 mM 인산 암모늄으로 구성됨, pH 3.5)로의 선형 구배; 40 내지 45 분: 완충제 B; 45 내지 55 분: 완충제 A로의 선형 구배; 및 55 내지 60 분: 등장성 완충제 A에서 다음 실행을 위해 컬럼을 평형화시켰다.
상기 분리 접근법에 의해, 조 [14C]GPG-NH2의 대부분은 전형적으로 26 내지 28 분(분획 26-28)에서 용출되지만, 미량의 방사성 표지된 화합물들이 20 내지 22 분(분획 20-22), 15 내지 17 분(분획 15-17), 및 2 내지 3 분(분획 2-3)에서 용출되었다. 조 [14C]G-NH2의 약 89%는 전형적으로 15 내지 17 분(분획 15-17)에서 용출되지만, 상기 조 [14C]G-NH2의 약 11%는 2 내지 3 분(분획 2-3)에서 용출된다. 미량의 조 [14C]G-NH2가 또한 분획 20-22 및 분획 5-6에서 검출되었다.
상기 완충제 및 구배를 약간 변경시켜 상기 화합물의 용출 시간을 약간 이동시켰지만, 모든 제제에서, 글리신아미드의 2 개의 주요 집단, 즉 상기 컬럼으로부터 빠르게 용출되는 첫 번째 집단(빠른 피크, 분획 2-3 또는 분획 3-4로서 지칭하거나, 방사성 표지된 G-NH2 중의 불순물, 또는 변경된 G-NH2라 칭한다) 및 상기 컬럼에 강하게 결합된 두 번째 집단(느린 피크, 분획 13-14 또는 분획 15-17 또는 G-NH2라 칭한다)이 검출되었다. 예를 들어, 변경된 G-NH2를 단리시키기 위한 또 다른 프로토콜은 또한 완충제 A(5 mM 인산 암모늄 pH 3.5) 및 완충제 B(250 mM 인산 암모늄 pH 3.5)를 사용하였다. 이들 완충제와 함께 사용된 구배는 하기와 같다: 10 분 완충제 A; 6 분 동안 완충제 B로의 선형 구배; 완충제 B에서 2 분; 이어서 6 분 동안 완충제 A로의 선형 구배; 및 6 분 동안 완충제 A에서의 평형화. 상기 접근법에 의해서, 또한 G-NH2 및 방사성 표지된 G-NH2 중의 불순물이 각각 10-11 분 및 2-3 분에서 용출되었다.
<표 6>
본 실시예에서, 상업적으로 수득된 G-NH2를 정제하기 위한 접근법을 제공한다. 상기 접근법의 변경을 사용하여 하기 개시하는 바와 같이 변경된 글리신아미드를 정제하였다. 다수의 상이한 양이온 교환 컬럼을 상기 과정을 위해 입수할 수 있으며 다수의 상이한 완충제들과 구배들을 사용할 수 있음은 물론이다. 본 발명의 내용에 따라, 당해 분야의 숙련가는 변경된 G-NH2(대사산물 X)를 단리시키기 위해 특정 유형의 양이온 교환 컬럼, FPLC 또는 HPLC, 완충제 또는 구배를 신속하게 변경시킬 수 있다. 즉, 상술한 과정의 변경은 당해 분야의 기술 내에 있으며 본 발명에 개시된 방법에 상당한다.
하기 섹션에 논의된 바와 같이, 변경된 G-NH2(분획 2-3)를 변경되지 않은 G-NH2를 다양한 혈청 또는 혈장에서 배양시킴으로써 변경되지 않은 G-NH2(분획 15-17)로부터 제조할 수 있다. 이어서 이러한 방식으로 제조된(효소에 의해 제조된) 변경된 G-NH2를 상기 접근법들 중 하나를 사용하여 단리시킬 수 있다. 구조 분석에 통상적인 기법을 사용하여, 상기 크로마토그래피 과정에 의해 단리된 변경된 G-NH2가 α-하이드록시글리신아미드를 포함함을 결정하였다.
처음에, 소 태아 혈청을 함유하는 세포 배양 배지를 95 ℃에서 30 분 동안 가열하는 경우, HIV의 복제를 억제하는 G-NH2의 능력이 상실됨을 관찰하였다. 일부 실시태양에서, 인간 T-림프구 CEM 세포(약 4.5 x 105 세포/㎖)를 새로운 배지에 현탁시키고 HIV-1(IIIB)에 의해 세포 현탁액 ㎖ 당 약 100 CCID50으로 감염시켰다. 이어서, 상기 감염된 세포에 혈청(PBS 중의 10% 소 태아 혈청) 함유 RPMI-1640 배지에 용해된 다양한 농도의 G-NH2 또는 열 불활성화된 혈청(95 ℃에서 30 분 동안 가열된 PBS 중의 10% 소 태아 혈청) 함유 RPMI-1640 배지에 용해된 다양한 농도의 G-NH2를 제공하였다. 이어서 상기 세포 재 현탁액을 37 ℃에서 배양시키고, 4 내지 5 일 후에, HIV 복제를 평가하였다. 열 불활성화된 혈청 함유 배지에서 배양시킨 G-NH2는 HIV의 복제를 억제하는 그의 능력을 상실하였음이 발견되었다. 이러한 결과는 열 불안정한 단백질이 HIV의 복제를 억제하는 변경된 G-NH2 형태로 혈청 대사된 G-NH2 중에 존재한다는 강한 증거를 제공하였다.
송아지 태아 혈청 중에 존재하는 열 불안정한 보조인자(들)가 G-NH2를 레트로바이러스 억제 활성인 형태의 글리신아미드로 전환시킬 수 있다는 발견에 따라, 상기 보조인자(들)가 인간 혈청 또는 다른 동물들의 혈청 중에 존재하는지를 결정하기 위한 실험들을 수행하였다. 하기 실시예는 이러한 실험을 보다 상세히 개시한다.
실시예 4
다수의 인간 혈청 및 소 태아 혈청을 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 그들의 능력에 대해 분석하였다. 방사성 표지된 양이온 교환 HPLC 정제된 G-NH2(실시예 3 참조)를 다양한 혈청과 함께 PBS 중의 10%의 최종 농도로 37 ℃에서 15 분, 및 1, 6, 24 또는 72 시간 동안 배양시켰다. 이어서, 방사성 표지된 변경된 G-NH2의 양을 상술한 양이온 교환 HPLC 접근법을 사용하여 평가하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. 각각 10 개의 상이한 인간 혈청 샘플은 24 시간의 배양 후에 10% 미만의 G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환율을 나타내었다. 시험된 모든 소 태아 혈청은 6 시간(6-10%) 및 24 시간(18-32%)의 배양 후에 현저한 G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환율을 나타내었다. 상기 결과는 소 태아 혈청이 G-NH2를 변경된 G-NH2로 현저하게 대사시키는 보조인자(들)를 함유하지만 인간 혈청은 그렇지 않음을 입증하였다.
이어서, 다른 동물들로부터 수득된 혈청에 대한 평가를 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 능력에 대해 분석하였다. 돼지(PS), 마우스(MS), 개(CS), 고양이(FS), 말(ES) 및 원숭이(SS)로부터 수득된 혈청을 HPLC 정제된 G-NH2와 함께 배양시켰으며 15 분, 1 시간, 6 시간 및/또는 24 시간째에 상기 혼합물의 분획을 회수하여 상술한 바와 같이 양이온 교환 HPLC에 의해 분석하였다. PBS 중에 약 10% 희석된 혈청을 사용하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 돼지, 개, 고양이, 말 및 원숭이로부터 수득된 혈청은 G-NH2를 변경된 G-NH2로 빠르게 전환시키는 반면, 마우스 혈청은 G-NH2를 불량하게 대사시킨다. 상기 데이터는 비록 다수의 동물들이 G-NH2를 변경된 G-NH2로 대사시킬 수 있지만, G-NH2를 대사시키는 보조인자(들)의 능력은 인간 및 마우스에서 진화적으로 보존되지 않았음을 나타내었다.
돼지 혈장에서 발견된 보조인자(들)를 보다 양호하게 특성화시키기 위해 다수의 실험들을 또한 수행하였다. 하나의 실험 세트에서, 돼지 혈장을 투석시키고(MW 컷 오프 10,000) 투석물을 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 능력에 대해 평가하였다. 다양한 농도의 G-NH2를 90% 돼지 혈장 또는 90% 투석된 돼지 혈장과 혼합하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양시켰다. 이어서, 상기 혼합물들의 분획을 앞서 개시한 바와 같이 양이온 교환 HPLC에 의해 분리시키고, G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환을 평가하였다. 표 7은 이러한 실험의 결과를 나타낸다. 상기 데이터는 G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환이 돼지 혈장 및 투석된 돼지 혈장 샘플 모두에서 거의 같음을 보인다. 돼지 혈장(PBS 중의 90%) 중의 보조인자(들)의 효소 활성의 포화가 1,000 μM 내지 10,000 μM G-NH2에서 일어났다. 상기 결과는 G-NH2를 변경된 G-NH2로 대사시키는 보조인자(들)가 혈장 또는 혈청에서 발견되는 단백질이라는 추가의 증거를 제공하였다.
<표 7>
투석된 돼지 혈장에 의한 G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환(24 시간)
G-NH2 농도(μM) 변경된 G-NH2로의 전환(전환율)(24 시간)
돼지 혈장a 투석된 돼지 혈장
18 99.7 99.8
100 99.7 99.8
1,000 98.7 99.8
10,000 ∼24.5 24.7
a 혈장: PBS 중의 90%
또 다른 실험 세트에서, 투석된 돼지 혈장에서 발견된 보조인자(들)의 포화를 보다 면밀히 조사하였다. 투석된 돼지 혈장(PBS 중의 90%)을 2,000 μM 내지 10,000 μM 농도의 G-NH2와 혼합하였다. 이어서, 상기 혼합물을 37 ℃에서 6 시간 동안 배양시키고 분액들을 이전과 같이 양이온 교환 HPLC에 의해 분리시켰다. 표 8에 나타낸 결과는 돼지 혈장 중의 보조인자(들)의 포화 점이 2,000 μM G-NH2 부근임을 입증하였다.
<표 8>
투석된 돼지 혈장a에 의한 G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환(6 시간)
G-NH2 농도(μM) 전환율 형성 μM
2,000 82.6 1,652
4,000 42.1 1,684
6,000 24.9 1,494
8,000 21.0 1,680
10,000 17.0 1,700
a 혈장: PBS 중의 90%
아미노산 경쟁 연구를 또한 사용하여 돼지 혈장 중에 존재하는 보조인자(들)가 G-NH2에 특이적인지를 결정하였다. 이 실험에서, PBS 중의 약 10% 돼지 혈청을 18 μM G-NH2 및 경쟁자(10 μM, 40 μM, 100 μM, 400 μM, 1000 μM, 4,000 μM, 또는 10,000 μM 글리신, 10,000 μM L-세린-NH2, 10,000 μM L-알라닌-NH2, 1000 μM, 4,000 μM, 또는 10,000 μM GPG-NH2)의 존재 하에 37 ℃에서 6 시간 동안 배양시켰다. 경쟁자가 없는 대조군을 또한 평가하였다. 이어서, G-NH2의 변경된 G-NH2로의 전환을 이전과 같이 양이온 HPLC에 의해 분석하였다. 도 9에 나타낸 결과는 돼지 혈청 중에 존재하는 보조인자(들)가 G-NH2에 특이적이지만, GPG-NH2도 또한 G-NH2 전환에 억제 효과를 갖는 것처럼 생각되는 증거를 제공하였다.
일단 몇몇 혈청들이 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시킬 수 있는 보조인자(들)를 함유하는 것이 확인되었으면, 상기 보조인자(들)를 단리시키기 위한 실험을 수행하였다. 하기 실시예는 이러한 실험을 보다 상세히 개시한다.
실시예 5
G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 보조인자(들)를 단리시키기 위해 구상된 첫 번째 실험 세트에서, 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 2000)를 사용하여 소 태아 혈청 중에 존재하는 성분들을 분리시켰다. 상기 분리는 밀리 Q 수 중에서 60 분간 수행되었으며 30 개의 분획(0.5 ㎖/분)을 수거하였다. 다양한 분획들 중의 보조인자(들)의 존재를 상기 단리된 분획의 분액을 HPLC 정제된 G-NH2와 함께 배양시킨 다음 양이온 교환 HPLC에 의해 측정된 바와 같이 변경된 G-NH2의 존재 또는 부재를 분석함으로써 확인하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 보조인자의 대부분은 상기 크기 배제 컬럼으로부터 분획 10 내지 12에서 용출되었다. 분획 10 내지 12는, 앞서 개시된 바와 같이 HPLC 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 변경된 G-NH2의 축적을 모니터함으로써 측정 시, G-NH2를 변경된 G-NH2로 효율적으로 전환시키는 것으로 밝혀졌다. 분획 10 내지 12는 또한 가열된 혈청에서 G-NH2의 HIV 억제 활성을 회복하는 것으로 밝혀졌다. 나중의 분획들에서 검출된 활성은 부분적으로 분해된 보조인자 또는 사용된 수지와 비 특이적으로 상호작용하는 보조인자의 결과일 수 있다. 상기 데이터는 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 보조인자가 단리되었음을 입증하였다. 이제 상기 보조인자를 통상적인 단백질 정제 및 분자 생물학 기법을 사용하여 정제, 서열화 및 클로닝할 수 있다.
G-NH2를 혈청과 배양시킨 후에, 변경된 G-NH2를 양이온 교환 HPLC를 사용하여, 크로마토그래피에 의해(예를 들어 실시예 3 참조) G-NH2로부터 단리시킬 수 있으며, 정제된, 변경된 G-NH2(분획 2-3) 및 정제된 G-NH2(분획 15-17)의 HIV 억제 활성을 통상적인 HIV 감염성 분석에서 비교할 수 있다. HIV 복제에 대한 변경된 글리신아미드 화합물(예를 들어 α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 및/또는 이들의 유도체)의 효과를 또한 상기 방식으로 분석할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제된, 변경된 G-NH2(분획 2-3), 정제된 G-NH2(분획 15-17), α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드 및 α-에톡시글리신아미드 또는 이들의 유도체에 대한 EC50을 앞서 개시한 HIV 감염성 분석을 사용하여 측정한다. 간단히, 인간 T 림프구 CEM 세포(약 4.5 x 105 세포/㎖)를 새로운 배지에 현탁시키고 HIV-1(IIIB)에 의해 세포 현탁액 ㎖ 당 약 100 CCID50으로 감염시켰다. 이어서 100 ㎕의 상기 감염된 세포 현탁액을 미세적정 플레이트(100 ㎕/웰)의 개별적인 웰로 옮기고 100 ㎕의 새로 희석된 변경된 G-NH2(분획 2-3), G-NH2(분획 15-17), α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 또는 이들의 유도체(예를 들어 2000, 400, 80, 16, 3.2 및 0.62 μM)와 함께 혼합한다. 이어서, 상기 혼합물을 37 ℃에서 배양시킨다. 4 내지 5 일 후에, 거대 세포 형성을 CEM 배양물에서 현미경에 의해 기록한다. 이어서 50% 유효 농도(EC50)를 측정한다.
상기 실험 세트로부터의 결과는 변경된 G-NH2(분획 2-3), α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 또는 이들의 유도체가 G-NH2(분획 15-17)에 필적하거나 또는 이보다 낮은 EC50을 가짐을 보일 것이다. 예를 들어, 변경된 G-NH2, α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 및 이들의 유도체는 대략 25 μM 이하의 EC50을 갖는 반면, G-NH2는 대략 30 μM의 EC50을 가질 것이다. 이들 실험은 G-NH2가, 바이러스 억제제의 활성 형태인 변경된 G-NH2로 대사되는 추가의 증거를 제공할 것이다.
또 다른 예로서, 열 불활성화된 혈청(95 ℃에서 30 분) 또는 인간 혈청 함유 배지에서 HIV의 복제를 억제하는 변경된 G-NH2의 능력을 비교한다. 인간 T 림프구(약 4.5 x 105 세포/㎖ CEM 세포)를 소 태아 혈청을 함유하는 새로운 배지에 현탁시키고 HIV-1(IIIB)에 의해 세포 현탁액 ㎖ 당 약 100 CCID50으로 감염시킨다. 이어서, 상기 감염된 세포를 PBS로 세척하고 95 ℃에서 30 분 동안 가열한 10% 소 태아 혈청 또는 인간 혈청을 함유하는 배지에 재 현탁시킨다. 이어서 100 ㎕의 상기 감염된 세포 현탁액을 미세적정 플레이트(100 ㎕/웰)의 개별적인 웰로 옮기고 100 ㎕의 새로 희석된, 정제된, 변경된 G-NH2(분획 2-3), α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 또는 이들의 유도체, 또는 정제된 G-NH2(분획 15-17)(예를 들어 2000, 400, 80, 16, 3.2 및 0.62 μM)와 함께 혼합한다. 이어서, 상기 혼합물을 37 ℃에서 배양시킨다. 4 내지 5 일 배양 후에, 거대 세포 형성을 상기 배양물에서 현미경에 의해 기록한다. 이어서 50% 유효 농도(EC50)를 측정한다. 상기 실험 세트로부터의 결과는 정제된, 변경된 G-NH2(분획 2-3), α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 또는 이들의 유도체가 끓인 소 태아 혈청 또는 인간 혈청 샘플에서 HIV의 복제를 효율적으로 억제하는 반면, 정제된 G-NH2(분획 15-17)는 그렇지 못함을 보일 것이다. 하기 실시예는 효소에 의해 제조된 α-하이드록시글리신아미드(대사산물 X)가 HIV의 복제를 유효하게 억제함을 설명하는 실험들을 개시한다.
실시예 6
변경된 글리신아미드를 효소에 의해 제조하고, 단리시키고, HIV의 복제를 억제하는 그의 능력에 대해 분석하였다. 투석 튜빙(분자량 컷 오프 3500 kD)을 PEST 완충제(스트렙토마이신 및 페니실린을 갖는 RPMI)와 함께 증류수 중에서 실온에서 30 분간 진탕시킨 다음 2% 중탄산 나트륨 및 1 mM EDTA 중에서 60 ℃에서 30 분간 진탕시켰다. 상기 튜빙을 PEST가 있는 증류수로 2 회 세정하였다. 그 후에, 상기 튜빙을 PEST가 있는 증류수 중에서 5 분간 비등시켰다. 비등 후에, 상기 튜빙을 PBS + PEST를 채운 비이커로 옮기고 사용 시까지 +4 ℃에서 보관하였다.
상기 튜빙을 비등 후 20 일 째에 사용하였다. 멸균 벤치 상에서, 투석 튜빙을 멸균 및 탈이온수로 세척하였다. 대략적으로, 10 ㎖의 돼지 혈청(Promeda corp.)을 상기 튜빙에 가하였다. 상기 튜빙을 200 ㎖의 PBS-A/PEST(PEST 1 ㎖ + PBS-A 1 ℓ)를 채운 유리 비이커에 넣었다. 상기 비이커를 상기 멸균 벤치로부터 꺼내어 궤도 진탕기 상에 놓았다. 1 시간 후에, 상기 PBS-A/PEST를 200 ㎖의 새로운 PBS-A("예비 세척액")로 대체시켰다. 상기 튜빙을 상술한 바와 같이 5 회 분취량의 PBS-A로 1 시간 동안 5 회 예비 세척하였다. 상기 예비 세척 후에, 상기 혈청을 함유하는 투석 튜빙을 100 ㎖의 멸균 여과된 1 mM 글리신아미드(Bachem) 및 자기 교반 봉을 채운 멸균 유리병으로 옮겼다. 상기 글리신아미드 및 혈청을 함유하는 병을 37 ℃에서 자기 교반 플레이트 상에서 배양시켰다. 대략 48 시간 후에, 상기 투석을 멈추고, 투석 용액을 3 회 분취량(10 ㎖ + 38 ㎖ + 50 ㎖)으로 나누어 표지된 유리병으로 옮기고, 상기 병들을 밀폐시키고 -85 ℃에서 동결시켰다. 이어서 1 회 분취량의 상기 동결된 투석 용액을 동결 건조시켰다.
동결 건조 시스템(진공 오일(Heto 88900100), 밀리 Q 수, 수 정제 장치, 동결 건조기, 및 -85 ℃ 동결기)을 준비하였다. 동결된 투석 용액(1-1로부터의 38 ㎖ 분취량)을 상기 -85 ℃ 동결기로부터 동결 건조 챔버로 옮겼다. 상기 챔버 위에 뚜껑을 닫고 진공을 가동시켰다. 상기 동결 건조 공정을 대략 72 시간 후에 정지시켰다. 진공을 끄고 유리병을 상기 동결 건조 챔버로부터 회수하였다.
이어서, 동결 건조된 생성물을 HPLC에 의해 정제시켰다. 대략적으로, 2 ℓ의 0.1M KH2PO4(Merck no. 14873-250/Lot: A397373251)를 KH2PO4 27.22 g을 칭량하여 이를 물(pH ∼4.06) 2 ℓ에 용해시켜 제조하였다. 컬럼(Hypersil SCX 이온 교환 컬럼 5 um/250 x 10 ㎜(ThermoQuest 3-34087/Batch: 5/100/5580) 및 소프트웨어 D-7000 HSM을 포함하는 HPLC-시스템)을 이동상(90% 0.1M KH2PO4/10% 아세토니트릴(Scharlau AC0329/Batch: 57048))으로 5 ㎖/분으로 60 분간 평형화시켰다. UV-검출기 파장을 206 ㎚에 대해 고정시켰다. 건조된 투석 "샘플"을 물 2 ㎖(투석 출발 시에 19 mM 글리신-아미드가 존재함)에 용해시키고 주입하고 5 ㎖/분의 이동상(상기 참조)의 10 분 등장성 흐름에 대해 분석하였다(RUN-1). 상기 RUN 1에 대한 주입 부피는 대략 100 ㎕이었다.
눈금화 후에, 200 ㎕의 샘플을 9 회 더(RUN-2 → 10) 주입하고 2.5-3.1 분에서 용출되는 분획들을 0.1 분/분획으로 고정시킨 TIME-모드 수거 세트를 사용하여 각각의 흐름에 대해 수거하였다. RUN-8과 9 사이에서, KH2PO4 13.61 g을 칭량하여 이를 물 1 ℓ에 용해시킴으로써 1 ℓ의 0.1M KH2PO4를 제조하였다. RUN-2 → 10에서 수거한 상응하는 분획들을 모으고 상기 컬럼 상에 주입하였다(RUN-11 → 16). RUN-11 → 16에서, 각각의 주입물은 대략 100 ㎕를 함유하였다. 상기 분획들을 2.6 내지 2.8 분에서 수거하여 모았다. 원래 글리신아미드의 양과 수거된 피크들이 면적으로부터 측정 시 대략적으로, 1.25 ㎎의 변경된 글리신아미드(대사산물 X)를 수득하였다. 7.5 ㎖의 이동상(90% 0.1 M KH2PO4/10% 아세토니트릴)에서 모은 2.6-2.8 분 분획들을 표지된 유리 병으로 옮기고 이를 밀폐시키고 -85 ℃에서 동결시켰다. 추가로, 7.5 ㎖의 이동상을 염 대조군으로서 -85 ℃에서 동결시켰다. HPLC-분석은 모든 검출 가능한 글리신아미드(체류 시간 ∼5.9 분)가 변경된 글리신아미드(∼2.7 분)로 전환되었음을 밝혔다. 투석/정제 후에, 상기 컬럼을 40% 아세토니트릴/물로 5 ㎖/분으로 31 분 동안 세척하고 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드("대사산물 X")를 상술한 접근법을 사용하여 동결 건조시켰다.
이어서 HIV 감염성 분석을 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(MetX)를 사용하여 수행하였다. 동결건조된 MetX(1.25 ㎎)를 7.5 ㎖의 멸균 증류수(2.24 mM MetX)에 용해시켰다. 대략적으로, 3.7 ㎖의 2.24 mM MetX를 각각 4.8 ㎖의 통상적인 및 끓인 RPMI++(10% FCS 및 0.1% PEST가 보충된 RPMI-배지)와 혼합하였다. 즉, 두 몫의 8.5 ㎖의 1 mM MetX를 제조하였다. 이어서, 대략적으로 3 ㎖의 1 mM MetX를 각각 3 ㎖의 통상적인 및 끓인 RPMI++(즉, 2 x 6 ㎖의 500 uM MetX)와 혼합하였다. 이어서 대략적으로, 1 ㎖의 500 uM MetX를 각각 4 ㎖의 통상적인 및 끓인 RPMI++와 혼합하여 2 x 5 ㎖의 100 uM MetX를 수득하였다. 동결건조된 염 대조군을 용해시키고 상기 MetX와 정확히 똑같이 희석하였다. 변경되지 않은 글리신아미드의 1 mM 모액을 또한 사용하여, 또한 MetX에 대해 개시한 바와 같이 통상적인 및 끓인 RPMI++(대조군) 중의 100 μM 글리신아미드를 제조하였다.
H9 세포를 버크(Burke) 챔버의 3 개의 A-칸에서 카운트하였다(평균 1.2 x 106 세포/㎖, 상기는 3.3 ㎖ 중에 4 x 106 세포이다). 대략적으로, 4 x 106 세포(3.3 ㎖)를 2 개의 50 ㎖ 튜브에 가하였다. 이어서, 대략적으로 14.7 ㎖의 통상적인 RPMI++를 첫 번째 튜브에 가하고 대략 14.7 ㎖의 끓인 RPMI++를 두 번째 튜브에 가하였다(즉 18 ㎖ H9 세포 + 통상적인/끓인 RPMI++). 이어서 대략 2 ㎖의 바이러스 모액(SF2+H9, 제 9 일: 22/3-02 2)을 상기 세포와 배지를 함유하는(약 20 ㎖/튜브) 각각 50 ㎖의 튜브에 가하고, 상기 용액을 혼합하였다. 2 개의 바이러스/세포 혼합물을 2 개의 새로운 50 ㎖ 튜브로 나누었다(즉 10 ㎖의 세포/바이러스를 갖는 4 개의 튜브(2 개의 튜브는 통상적인 RPMI++를 갖고 2 개는 끓인 RPMI++를 가짐)). 상기 세포/바이러스 튜브를 37 ℃에서 90 분간 배양시키고 50 분 후에 혼합하였다. 상기 세포를 수거하여(1200 rpm에서 5 분) 감염을 정지시켰다. 이어서 상기 세포를 재 현탁시키고 12 개의 10 ㎖ 튜브(0.5 x 106 세포/튜브)로 옮겼다. 즉, 통상적인 RPMI++ 중에 현탁된 세포의 튜브 6 개 및 끓인 RMPI++ 중에 현탁된 세포의 튜브 6 개. 상기 세포들을 RPMI(첨가제 없음)로 세척하고 수거하였다(1500 rpm에서 5 분). 상등액을 버리고 세포를 각각 4.5 ㎖의 하기에 재 현탁시켰다:
·통상적인 RPMI+
·끓인 RPMI+
·통상적인 RPMI++ 중의 100 μM 글리신-아미드
·끓인 RPMI++ 중의 100 μM 글리신-아미드
·통상적인 RPMI++ 중의 500 μM MetX
·끓인 RPMI++ 중의 500 μM MetX
·통상적인 RPMI++ 중의 100 μM MetX
·끓인 RPMI++ 중의 100 μM MetX
·통상적인 RPMI++ 중의 500 μM 염
·끓인 RPMI++ 중의 500 μM 염
·통상적인 RPMI++ 중의 100 μM 염
·끓인 RPMI++ 중의 100 μM 염
대략적으로, 0.9 ㎖/웰의 각각의 세포 현탁액(각각 4 개의 복제물)을 하기와 같이 48-웰에 가하였다:
플레이트-1:
·통상적인 RPMI++ 중의 100 μM 글리신-아미드를 갖는 4 개의 웰
·끓인 RPMI++ 중의 100 μM 글리신-아미드를 갖는 4 개의 웰
·통상적인 RPMI++ 중의 500 μM MetX를 갖는 4 개의 웰
·끓인 RPMI++ 중의 500 μM MetX를 갖는 4 개의 웰
·통상적인 RPMI++ 중의 100 μM MetX를 갖는 4 개의 웰
·끓인 RPMI++ 중의 100 μM MetX를 갖는 4 개의 웰
플레이트-2:
·처리되지 않은 통상적인 RPMI++의 4 개의 웰
·처리되지 않은 끓인 RPMI++의 4 개의 웰
·통상적인 RPMI++ 중의 "100 μM" 염의 4 개의 웰
·끓인 RPMI++ 중의 "100 μM" 염의 4 개의 웰
·통상적인 RPMI++ 중의 "500 μM" 염의 4 개의 웰
·끓인 RPMI++ 중의 "500 μM" 염의 4 개의 웰
나머지 웰들을 멸균 증류수로 충전시켰다. 세포 배양 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 배양시켰다. 4 일 후에 배지를 교환하고, 8 일 후에 배지를 교환하고, 세포를 수거하였다. 11 일 후에, 감염을 멈추고, 세포를 10X 확대 현미경으로 관찰하고 650 ㎕의 각각의 세포 상등액을 수거하여 추가의 분석을 위해 -80 ℃에서 동결시켰다. 5 일 더 후에, 상등액을 해동시키고 통상적인 역 전사효소(RT) 활성 분석(예를 들어 Roche AMPLICOR MONITORTM) 또는 p24 정량화 분석(예를 들어 Abbott Laboratories, Chicago)에 사용하였다(미국 특허 제 6,258,932 호 및 미국 특허 출원 제 10/235,158 호 참조). 결과를 도 11 및 표 9에 나타낸다.
<표 9>
샘플 가시적인 합포체
통상적인 RPMI++ 중의 100 μM MetX 음성
끓인 RPMI++ 중의 100 μM MetX 음성
통상적인 RPMI++ 중의 500 μM MetX 음성
끓인 RPMI++ 중의 500 μM MetX 음성
통상적인 RPMI++ 중의 100 μM 글리신아미드 음성
끓인 RPMI++ 중의 100 μM 글리신아미드 양성
처리되지 않은 통상적인 RPMI 대조군 양성
처리되지 않은 끓인 RPMI 대조군 양성
통상적인 RPMI++ 중의 100 μM 염 대조군 양성
끓인 RPMI++ 중의 100 μM 염 대조군 양성
통상적인 RPMI++ 중의 500 μM 염 대조군 음성
끓인 RPMI++ 중의 500 μM 염 음성
바이러스 검사에 의하면, 변경된 글리신아미드(대사산물 X)는 끓인 송아지 태아 혈청에서 HIV의 복제 및/또는 증식을 유효하게 억제하지만 글리신아미드는 그렇지 않았다(표 9). 역 전사효소(RT) 활성 데이터(도 11)는 변경된 글리신아미드(Met-X 또는 대사산물 X)가, G-NH2는 상기 조건 하에서 HIV의 복제를 억제할 수 없었지만, 끓인 송아지 태아 혈청 샘플에서 HIV 복제를 유효하게 억제함을 입증하였다. 즉, 변경된 글리신아미드(MetX)의 바이러스 억제 활성은 송아지 태아 혈청 중에 존재하는 보조인자(들)를 필요로하지 않지만 글리신아미드는 필요로 한다. 이 데이터는 또한 상기 송아지 태아 혈청의 가열이 글리신아미드를 변경된 글리신아미드로 전환시키는 효소(보조인자(들))를 변성시켰음을 가리킨다.
또 다른 관련 실험 세트에서, 5 회 투석시킨 대사산물 X의 레트로바이러스 억제 활성을 상기 접근법에 의해 제조된 대사산물 X와 비교하였다. 간단히, HIV 감염성 분석을 상기와 같이, 상기 접근법에 의해 제조된 대사산물 X 및 5 회 투석시킨 대사산물 X와 함께 송아지 태아 혈청 중의 G-NH2를 사용하여 수행하였다. 상기 실험의 결과를 도 12에 나타낸다. 효소에 의해 생산된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X)의 표준 제제에 비해, 상기 5 회 투석된 알파-하이드록시글리신아미드(대사산물 X)의 현저한 활성 변화는 관찰되지 않았다.
상술한 효소적 접근법에 따라 수득된 변경된 글리신아미드를 질량 분광측정 및 NMR에 의해 분석하였으며, 구조 분석은 알파-하이드록시글리신아미드("알파HGA")를 밝혀냈다. 따라서, 본 실시예의 실험들은 변경된 글리신아미드(알파-하이드록시글리신아미드 또는 대사산물 X)가 G-NH2의 레트로바이러스 억제 활성에 필요한 송아지 태아 혈청 중에 존재하는 보조인자(들)의 부재 하에서 HIV의 복제를 유효하게 억제함을 입증하였다. 알파 하이드록시글리신아미드("알파HGA")를 또한 합성적으로 제조하였으며 상기는 하기 개시하는 바와 같이 보조인자(들)의 부재 하에서 HIV 복제를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
추가의 실험들에서, 대사산물 X의 50% 억제 농도(IC50)를 송아지 태아 혈청을 함유하는 세포 배양물에서 분석하였다. 하기 실시예는 이러한 실험을 보다 상세히 개시한다.
실시예 7
대략적으로, 0.1 x 106 H9 세포를 50 TCID50 HIV(SF2 바이러스)로 감염시키고 감염된 세포를 효소에 의해 제조된 다양한 농도의 대사산물 X(실시예 6)로 처리하였다. 소 태아 혈청을 분석에 포함시켰다. 세포를 10 일동안 배양시키고(새로운 배지를 배양 7 일째에 가하였다), 그 후에 상등액을 수거하여 통상적인 역 전사효소(RT) 정량 분석에 의해 분석하였다. 데이터를 도 13에 나타낸다. 결과는 HIV 복제의 유효 억제가 저 농도의 대사산물 X(예를 들어 3.9 μM 내지 15.6 μM)에서 일어나며, 농도가 15.6 μM 이상에 달하면 상기 HIV 복제의 억제가 실질적으로 완료됨을 보인다.
추가의 실험들에서, 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X)를 HIV 감염된 H9 세포(SF2 바이러스)와 배양시키고 상기 처리된 바이러스의 형태를 전자 현미경 검사에 의해 분석하였다. 양성 대조군으로서, GPG-NH2를 사용하였다(이러한 유형의 전자 현미경 검사 실험을 수행하기 위한 접근법에 대해 미국 특허 제 6,258,932 호를 참조하시오). 하기 실시예는 이러한 실험을 보다 상세히 개시한다.
실시예 8
하나의 접근법에 의해, 변경된 글리신아미드(대사산물 X)를, 정제된 G-NH2를 돼지 혈청에 대해 투석시킴으로써 효소에 의해 제조하였으며(실시예 6 참조); 이어서 상기 변경된 글리신아미드를 사용하여 HIV(SF2 바이러스) 감염된 H9 세포를 처리하고, 상기 감염된 세포를 전자 현미경 검사에 의해 분석하였다. 간단히, 투석 튜빙(3500 MW 컷 오프-Spectrum)에 돼지 혈청(Biomedia)을 채우고 상기 돼지 혈청을 RPMI 1640 완충제에 대해 각각 1 시간 동안 4 회 예비 투석시켜 3500 달톤 미만인 분자들을 제거하였다. 이어서 상기 예비 세척된 혈청을 37 ℃에서 48 시간 동안 RPMI 중의 1 mM 정제된 G-NH2에 투석시켰다. 이어서 변경된 G-NH2(대사산물 X)를 함유하는 상기 투석된 완충제를 멸균 여과하고, 분액으로 나누어 실시예 6에 개시된 바와 같이 동결시켰다.
이어서, 100 μM 대사산물 X 또는 100 μM GPG-NH2 농도를 RPMI(송아지 태아 혈청 함유) 10 ㎖ 중에 (각각) 대략 0.5 x 106 H9 세포를 함유하는 4 개의 병에 확립시켰다. 상기 샘플 중의 세포를 카운트하고 이어서 원심분리시켰다. 이어서 상기 세포를 10 ㎖의 RPMI 1640(송아지 태아 혈청 함유) 및 100 μM 대사산물 X 또는 100 μM GPG-NH2에 재 현탁시켰다. 감염되지 않은 대조군 및 처리되지 않은 대조군 샘플을 또한 상기 실험에 포함시켰다. 이어서 상기 샘플들을 37 ℃에서 5% CO2에서 밤새 배양시켰다.
이어서, 상기 샘플 중의 p24의 양을 통상적인 p24 검출 분석(미국 특허 제 6,258,932 호 참조)을 사용하여 분석하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 100 μM 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 또는 100 μM GPG-NH2는 송아지 태아 혈청의 존재 하에서 HIV 복제를 유효하게 억제한 반면; 처리되지 않은 대조용 샘플은 감지할 수 있을 정도의 HIV 복제를 나타내었다. 이러한 결과는 통상적인 역 전사효소(RT) 활성 분석에 의해 확인되었으며, 상기 분석은 처리되지 않은 대조용 샘플에서 감지할 수 있을 정도의 역 전사효소 활성을 보였으나, 100 μM 변경된 글리신아미드 또는 100 μM GPG-NH2로 처리된 샘플에서는 역 전사효소 활성이 없음을 보였다. 100 μM 변경된 글리신아미드 또는 100 μM GPG-NH2로 처리된 샘플이 억제된 바이러스를 함유하는 것으로 입증되었으며, 상기 샘플은 전자 현미경 검사에 의한 분석을 위해 보내졌다.
하나의 접근법에 의해, SF2 바이러스에 의해 감염시킨 H9 세포를 통상적인 수단에 의해 2.5% 글루타르알데히드에서 고정시킬 수 있다. 이어서 상기 고정된 세포를 1% OsO4에서 후 고정시키고 탈수시키고, 에폭시 수지에 매몰시키고, 블록들을 중합되게 한다. 바이러스 감염된 수지의 에폰 섹션들을 뉴클레오캡시드의 폭을 수용하기 위해서 대략 60 내지 80 ㎚로 얇게 만든다. 상기 섹션들을 1.0% 우라닐 아세테이트로 염색한 그리드에 고정시키고 80 kV의 가속 전압으로 자이스(Zeiss) CEM 902 현미경에서 분석하였다. 상기 현미경에는 분광계가 구비되어 있어 화질을 개선시키며 액체 질소 냉각 트랩을 분출시켜 광선 손상을 감소시킨다. 대조용 GPG-NH2 배양된 세포 및 대사산물 X 배양된 세포의 섹션들을 갖는 그리드를 다수의 맹검 연구에서 조사한다.
처리되지 않은 HIV 입자들에 대한 전자 현미경 검사는 특징적인 원뿔 모양의 뉴클레오캡시드와 상기 뉴클레오캡시드의 길이를 잡아늘인 균일하게 염색된 RNA를 둘러싸고 있는 모양을 보이는 반면; GPG-NH2 또는 대사산물 X로 처리된 HIV-1 입자를 갖는 세포는 비교적 완전한 듯 하지만 RNA가 상기 캡시드의 외부 또는 상부(넓은 단부)에 공 모양의 형태로 쌓여있는 원뿔 모양의 캡시드 구조를 갖는 HIV-1 입자를 보일 것이다. GPG-NH2 또는 대사산물 X 처리된 샘플로부터의 일부 캡시드들은 통상적인 뉴클레오캡시드를 닮은 형태가 거의 없거나 전혀 없는 기형 구조를 갖는 것이 관찰되었으며, 상기 RNA는 한쪽 단부가 상기 구조의 바깥에 또는 안쪽에 있을 수 있다.
더욱 추가의 실험에서, G-NH2, GPG-NH2, 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X0, 및 합성적으로 제조된 변경된 글리신아미드(알파HGA)의 레트로바이러스 억제 활성을 비교하였다. 하기 실시예는 이러한 실험들을 보다 상세히 개시한다.
실시예 9
HIV 감염성 분석을 선행 실시예(실시예 6 내지 8 참조)에 개시된 바와 같이, 그러나 다양한 농도의 G-NH2, GPG-NH2 및 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 및 100 μM 합성적으로 제조된 변경된 글리신아미드(알파HGA)를 사용하여, 송아지 태아 혈청의 존재 하에서 수행하였다(표 10 참조). 감염되지 않은 샘플과 처리되지 않은 샘플의 3 개의 반복 샘플들("복제물")을 또한 대조군으로서 실험에 포함시켰다. HIV 복제의 억제를 통상적인 검출 키트를 사용하여 p24의 수준을 정량분석함으로써 모니터하였다.
<표 10>
펩티드 농도 샘플
GPG-NH2 100 μM50 μM25 μM12.5 μM6.25 μM3.1 μM1.6 μM0.8 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
G-NH2 100 μM50 μM25 μM12.5 μM6.25 μM3.1 μM1.6 μM0.8 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
Met-X(투석에 의해 효소적으로 제조된 것) 100 μM50 μM25 μM12.5 μM6.25 μM3.1 μM1.6 μM0.8 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
알파HGA(Chemilia에 의해 합성적으로 제조된 것) 100 μM 3 개의 복제물
도 15는 이들 실험의 결과 중 일부를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 실험 제 11 일 째에, 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)는 송아지 태아 혈청 함유 배지에서 GPG-NH2 만큼 유효하게 HIV 복제를 억제하였다. 비슷한 결과가 제 7 일 째에도 관찰되었다. 상기 데이터는 합성적으로 제조된 알파 하이드록시글리신아미드(알파HGA)가 HIV 복제를 유효하게 억제함을 설명한다.
더욱 추가의 실험에서, 효소에 의해 및 합성적으로 제조된 알파 하이드록시글리신아미드의 레트로바이러스 억제 활성을 인간 또는 송아지 태아 혈청의 존재 하에서 비교하였다. 하기 실시예는 이들 실험을 보다 상세히 개시한다.
실시예 10
HIV 감염성 분석을 선행 실시예(실시예 6 내지 8 참조)에 개시된 바와 같이, 그러나 다양한 농도의 G-NH2, 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 및 100 μM 합성적으로 제조된 변경된 글리신아미드(알파HGA)를 사용하여, 송아지 태아 혈청의 존재 하에서 수행하였다(표 11 및 12 참조). 감염되지 않은 샘플과 처리되지 않은 샘플의 3 개의 반복 샘플들("복제물")을 또한 대조군으로서 실험에 포함시켰다.
<표 11>
인간 혈청
펩티드 농도 샘플
G-NH2 100 μM50 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
Met-X(투석에 의해 효소적으로 제조된 것) 100 μM50 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
알파HGA(Chemilia에 의해 합성적으로 제조된 것) 50 μM 3 개의 복제물
감염되지 않은 대조군 0 μM 3 개의 복제물
감염된 대조군 0 μM 3 개의 복제물
<표 12>
송아지 태아 혈청
펩티드 농도 샘플
G-NH2 100 μM50 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
Met-X(투석에 의해 효소적으로 제조된 것) 100 μM50 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
알파HGA(Chemilia에 의해 합성적으로 제조된 것) 50 μM 3 개의 복제물
감염되지 않은 대조군 0 μM 3 개의 복제물
감염된 대조군 0 μM 3 개의 복제물
이들 실험에 대한 결과를 표 13 및 14 및 도 16A 및 16B에 제공한다. 상기 데이터는 제 12 일에, 상기 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)는 송아지 태아 혈청 함유 배지에서 G-NH2 만큼 유효하게 HIV 복제를 억제하나; 오직 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 및 합성적으로 제조된 알파-하이드록시글리신아미드(알파HGA)만이 인간 혈청에서 HIV 복제를 억제할 수 있음을 보인다. 즉, G-NH2는 인간 혈청에서는 HIV 복제를 억제할 수 없었지만, 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 및 합성적으로 제조된 알파 하이드록시글리신아미드(알파HGA)는 모두 인간 혈청에서 HIV 복제를 유효하게 억제하였다. 유사한 결과가 제 7 일에 관찰되었다. 상기 데이터는 효소에 의해 제조된 변경된 글리신아미드(대사산물 X) 및 합성적으로 제조된 알파 하이드록시글리신아미드(알파HGA) 모두가 감염된 인간에서 HIV 복제의 효능 있는 억제제라는 강력한 증거를 제공한다.
<표 13>
<표 14>
또 다른 일련의 실험에서, 37 ℃에서 연장된 가열에 대한 합성적으로 제조된 알파 하이드록시글리신아미드(알파HGA)의 안정성을 분석하였다. 합성된 알파HGA(C2H7ClN2O2)의 희석된 샘플들을 37 ℃에서 여러 기간 동안 배양시키고, 이어서 상기 배양된 화합물의 레트로바이러스 억제 활성을 새로 희석시킨 알파HGA의 활성과 비교하였다. 이들 실험을 하기 실시예에서 보다 상세히 개시한다.
실시예 11
HIV 감염성 분석을 선행 실시예(실시예 6 내지 8 참조)에 개시된 바와 같이, 그러나 다양한 농도의 G-NH2, 합성적으로 제조된 변경된 글리신아미드(알파HGA), 및 37 ℃에서 3 일 동안 배양시킨 합성적으로 제조된 변경된 글리신아미드(알파HGA 37)를 사용하여, 송아지 태아 혈청의 존재 하에서 수행하였다(표 15 참조). 감염되지 않은 샘플과 처리되지 않은 샘플의 3 개의 복제물을 또한 대조군으로서 실험에 포함시켰다.
<표 15>
펩티드 농도 샘플
αHGA 32 μM16 μM8 μM4 μM2 μM1 μM0.5 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
αHGA 37(37 ℃에서 3 일 동안 배양시킨 것) 32 μM16 μM8 μM4 μM2 μM1 μM0.5 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
G-NH2 32 μM16 μM8 μM4 μM2 μM1 μM0.5 μM 각 농도에서 3 개의 복제물
이들 실험의 결과를 도 17 및 표 16에 나타낸다. 도 17은 제 7 일에 검출된 RT 활성의 플롯을 나타낸다. 상기 RT 활성을 제 11 일에 분석한 경우 유사한 결과가 얻어졌다. 상기 데이터는 합성적으로 제조된 알파HGA가 37 ℃에서 적어도 3 일 동안의 배양에 대해 안정함을 나타낸다. 새로 희석된 알파HGA와 상기 배양된 화합물의 레트로바이러스 억제 활성에는 거의 차이가 관찰되지 않았다. 더욱이, 상기 데이터는 HIV 복제의 감지할 정도의 억제가 8 μM 이상의 농도에서 합성 알파HGA(열 처리 여부에 관계없이)에 의해 일어나며, 보다 양호한 레트로바이러스 억제 활성은 16 μM 이상의 농도에서 관찰되었고, 매우 효율적인 HIV 복제의 억제는 30 μM 이상의 농도에서 나타났음을 보인다. 흥미롭게도, 상기 분석에서 송아지 태아 혈청에 의한 G-NH2의 전환으로부터 형성된 대사산물 X(상기 G-NH2 샘플에 대한 데이터 참조)는 합성적으로 정제된 알파HGA보다 더 활성이었으며, 이는 알파HGA의 하나의 에난티오머 및/또는 이성체가 다른 것보다 더 큰 레트로바이러스 억제 활성을 갖는다는 증거를 제공한다.
<표 16>
하기 섹션은 변경된 글리신아미드를 함유하는 약제의 제조 및 HIV의 복제를 치료, 예방 및/또는 억제하기 위한 상기 조성물의 용도를 개시한다.
HIV를 억제하는 화합물
상기 논의된 바와 같이, G-NH2 및 변경된 G-NH2 이외에, G-NH2의 몇몇 유도체 및 대사산물들은 HIV 복제를 억제하며, 이들 화합물을 약제 또는 약물로 제형화시킬 수 있고, 이들을 HIV 복제를 억제하고 HIV 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용할 수 있다. 일부 약제 또는 약물은 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 에스테르 또는 전구약물로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들을 포함한다:
(화학식 A)
상기 식에서,
a) E는 산소, 황 및 NR7로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
b) T는 산소, 황 및 NR8로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
c) R1-R8은 각각 독립적으로 수소; 임의로 치환된 알킬; 임의로 치환된 알케닐; 임의로 치환된 알키닐; 임의로 치환된 사이클로알킬; 임의로 치환된 헤테로사이클릴; 임의로 치환된 사이클로알킬알킬; 임의로 치환된 헤테로사이클릴알킬; 임의로 치환된 아릴; 임의로 치환된 헤테로아릴; 임의로 치환된 알킬카보닐; 임의로 치환된 알콕시알킬; 및 임의로 치환된 퍼할로알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
따라서, "변경된 G-NH2 또는 변경된 글리신아미드 화합물"이란 용어는, 농축되거나 또는 세포로부터 단리되거나 합성적으로 제조되었든지 간에, 글리신아미드의 유도체 및 대사산물, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 화학식 A의 유도체 및 대사산물(예를 들어 α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체(NH2-gly-O-O-gly-NH2), α-메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드 및/또는 이들 화합물의 유도체)을 포함한다.
이들 화합물 중 일부를 HPLC 컬럼으로부터 추출한 후에 글리신아미드를 상술한 바와 같이 혈청 중에서 배양하고 질량 분광측정 및 핵 자기 공명(NMR) 분광 측정에 의해 확인하였다. 이들 화합물 및 유도체 또는 관련 화합물들은 하기 개시하는 바와 같이 입수할 수 있는 출발 물질들로부터 합성될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 염"이란 용어는 상기가 투여되는 유기체에 현저한 자극을 일으키지 않고 상기 화합물의 생물 활성 및 성질들을 폐기시키지 않는 화합물의 제형을 지칭한다. 약학적 염을 본 발명의 화합물을 무기 산, 예를 들어 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 반응시켜 수득할 수 있다. 약학적 염을 또한 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜 염, 예를 들어 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예를 들어 나트륨 또는 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예를 들어 칼슘 또는 마그네슘 염, 유기 염기, 예를 들어 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민의 염, 및 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 리신 등과의 염을 형성시킴으로써 수득할 수 있다.
"에스테르"란 용어는 화학식 -(R)n-COOR'를 갖는 화학 잔기를 지칭하며, 이때 R 및 R'는 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합된) 및 헤테로알리사이클릭(고리 탄소를 통해 결합된)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 n은 0 또는 1이다.
"아미드"란 용어는 화학식 -(R)n-C(O)NHR' 또는 -(R)n-NHC(O)R'를 갖는 화학 잔기를 지칭하며, 이때 R 및 R'는 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합된) 및 헤테로알리사이클릭(고리 탄소를 통해 결합된)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 n은 0 또는 1이다. 아미드는 본 발명의 분자에 결합되어, 전구약물을 형성하는 아미노산 또는 펩티드 분자일 수 있다.
본 발명의 화합물 상의 임의의 아민, 하이드록시 또는 카복실 측쇄를 에스테르화 또는 아미드화시킬 수 있다. 상기 목적을 성취하는데 사용되는 과정 및 특정한 그룹들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 참고문헌, 예를 들어[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에서 쉽게 찾을 수 있다.
"전구약물"은 생체 내에서 모 약물로 전환되는 작용제를 지칭한다. 종종 전구약물이 유용한데, 그 이유는 일부 상황 하에서 상기 전구약물이 모 약물보다 더 쉽게 투여될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 상기는 경구 투여에 의해 생체에 이용될 수 있는 반면 모 약물은 그렇지 않다. 상기 전구약물은 또한 약학 조성물 중에서 모 약물에 비해 개선된 용해도와 안정성을 가질 수 있다. 전구약물의 예로는 비 제한적으로 에스테르("전구약물")로서 투여되어 수 용해성이 이동성에는 불리한 세포막의 통과를 촉진시키는 본 발명의 화합물이 있을 수 있다(상기는 이어서 수 용해성이 유리한 세포 내에서 활성 존재인 카복실산으로 대사적으로 가수분해된다). 전구약물의 추가적인 예는 산 그룹에 결합된 짧은 펩티드(폴리아미노산)일 수 있으며, 이때 상기 펩티드는 대사되어 활성 잔기를 드러낸다. 적합한 전구약물 유도체의 선택 및 제조를 위한 통상적인 과정들이 예를 들어 문헌[Design of Prodrugs, H.Bundgaard, Elsevier, ed., 1985]에 개시되어 있다.
"방향족"이란 용어는 공액된 파이 전자 시스템을 갖는 하나 이상의 고리를 갖는 방향족 그룹을 지칭하며 카보사이클릭 아릴(예를 들어 페닐) 및 헤테로사이클릭 아릴 그룹(예를 들어 피리딘)을 모두 포함한다. 상기 용어는 모노사이클릭 또는 축합된 고리 폴리사이클릭(즉 인접한 탄소 원자쌍들을 공유하는 고리) 그룹을 포함한다. "카보사이클릭"이란 용어는 하나 이상의 공유적으로 폐쇄된 고리 구조를 함유하고 상기 고리의 주쇄를 형성하는 원자들이 모두 탄소 원자인 화합물을 지칭한다. 따라서 상기 용어는 고리 주쇄가 탄소와 다른 하나 이상의 원자를 함유한다는 점에서 카보사이클릭을 헤테로사이클릭 고리와 구분한다. "헤테로방향족"이란 용어는 하나 이상의 헤테로사이클릭 고리를 함유하는 방향족 그룹을 지칭한다.
본 발명에 사용된 "알킬"이란 용어는 지방족 탄화수소 그룹을 지칭한다. 알킬 잔기는 "포화된 알킬" 그룹일 수 있으며, 이는 상기가 임의의 알켄 또는 알킨 잔기를 함유하지 않음을 의미한다. 상기 알킬 잔기는 또한 "불포화된 알킬" 잔기일 수 있으며, 이는 상기가 하나 이상의 알켄 또는 알킨 잔기를 함유함을 의미한다. "알켄" 잔기는 2 개 이상의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합으로 이루어진 그룹을 지칭하며, "알킨" 잔기는 2 개 이상의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합으로 이루어진 그룹을 지칭한다. 상기 알킬 잔기는 포화 여부에 관계없이 분지되거나, 직쇄이거나 환상일 수 있다.
상기 알킬 그룹은 탄소수 1 내지 20일 수 있다(상기가 본 원에 나타날 때마다, "1 내지 20" 등의 수치 범위는 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭한다; 예를 들어 "탄소수 1 내지 20"은 알킬 그룹이 탄소 원자 하나, 탄소 원자 둘, 탄소 원자 셋 등 스무 개까지의 탄소 원자로 이루어질 수 있음을 의미하지만, 본 발명의 정의는 또한 수치 범위를 나타내지 않은 "알킬" 용어의 출현도 포함한다). 상기 알킬 그룹은 1 내지 10 탄서 원자를 갖는 중간 크기의 알킬일 수도 있다. 상기 알킬 그룹은 또한 탄소수 1 내지 5의 저급 알킬일 수도 있다. 본 발명 화합물의 알킬 그룹을 "C1-6 알킬" 또는 유사한 표시로 나타낼 수 있다. 단지 예로서, "C1-6 알킬"은 알킬 쇄에 하나 내지 6 개의 탄소 원자가 존재함을 가리킨다, 즉 상기 알킬 쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2 급-부틸, t-부틸, 펜틸(직쇄 또는 분지된), 및 헥실(직쇄 또는 분지된)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
상기 알킬 그룹은 치환되거나 비 치환될 수 있다. 치환되는 경우, 치환체 그룹(들)은 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 할로, 카보닐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, O-카복시, 이소시아네이토, 티오시아네이토, 이소티오시아네이토, 니트로, 실릴, 트리할로메탄설포닐, 및 아미노, 예를 들어 일- 및 이-치환된 아미노 그룹, 및 이들의 보호된 유도체들 중에서 개별적으로 및 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹(들)이다. 전형적인 알킬 그룹으로는 비 제한적으로 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3 급 부틸, 펜틸, 헥실, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 있다. 치환체가 "임의로 치환되는" 것으로서 개시되는 경우, 상기 치환체는 상기 치환체들 중 하나에 의해 치환될 수 있다.
치환체 "R"은 단독으로 숫자 표시 없이 나타나는 경우 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합된) 및 헤테로알리사이클릭(고리 탄소를 통해 결합된)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 치환체를 지칭한다.
"O-카복시" 그룹은 RC(=O)O- 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"C-카복시" 그룹은 -C(=O)OR 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"아세틸" 그룹은 -C(=O)CH3 그룹을 지칭한다.
"트리할로메탄설포닐" 그룹은 X3CS(=O)2- 그룹(이때 X는 할로겐이다)을 지칭한다.
"시아노" 그룹은 -CN 그룹을 지칭한다.
"이소시아네이토" 그룹은 -NCO 그룹을 지칭한다.
"티오시아네이토" 그룹은 -CNS 그룹을 지칭한다.
"이소티오시아네이토" 그룹은 -NCS 그룹을 지칭한다.
"설피닐" 그룹은 -S(=O)-R 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"S-설폰아미도" 그룹은 -S(=O)2NR 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"N-설폰아미도" 그룹은 RS(=O)2NH- 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"트리할로메탄설폰아미도" 그룹은 X3CS(=O)2NR- 그룹(이때 X 및 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"O-카바밀" 그룹은 -OC(=O)-NR 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"N-카바밀" 그룹은 ROC(=O)NH- 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"O-티오카바밀" 그룹은 -OC(=S)-NR 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"N-티오카바밀" 그룹은 ROC(=S)NH- 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"C-아미도" 그룹은 -C(=O)-NR2 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"N-아미도" 그룹은 RC(=O)NH- 그룹(이때 R은 본 원에 정의된 바와 같다)을 지칭한다.
"퍼할로알킬"이란 용어는 모든 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
본 발명과 관련하여 "아릴"이란 용어는 카보사이클릭 방향족 고리 또는 고리 시스템을 의미하고자 한다. 더욱이, "아릴"이란 용어는 2 개 이상의 아릴 고리 또는 하나 이상의 아릴 및 하나 이상의 C3-8-사이클로알킬이 하나 이상의 화학 결합을 공유하는 축합된 고리 시스템을 포함한다. "아릴" 고리의 일부 예로는 임의로 치환된 페닐, 나프탈레닐, 페난트레닐, 안트라세닐, 테트랄리닐, 플루오레닐, 인데닐 및 인다닐이 있다. "아릴"이란 용어는 고리 형성 탄소 원자들 중 하나를 통해 연결되고, 임의로 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 할로, 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 알킬아미도, 아실, C1-6 알콕시, C1-6 알킬, C1-6 하이드록시알킬, C1-6 아미노알킬, C1-6 알킬아미노, 알킬설페닐, 아킬설피닐, 알킬설포닐, 설파모일 또는 트리플루오로메틸 중에서 선택된 하나 이상의 치환체를 갖는 방향족, 바람직하게는 벤젠 모양의 그룹에 관한 것이다. 상기 아릴 그룹은 파라 및/또는 메타 위치에서 치환될 수 있다. 아릴 그룹의 전형적인 예로는 비 제한적으로 페닐, 3-할로페닐, 4-할로페닐, 3-하이드록시페닐, 4-하이드록시페닐, 3-아미노페닐, 4-아미노페닐, 3-메틸페닐, 4-메틸페닐, 3-메톡시페닐, 4-메톡시페닐, 4-트리플루오로메톡시페닐 3-시아노페닐, 4-시아노페닐, 디메틸페닐, 나프틸, 하이드록시나프틸, 하이드록시메틸페닐, 트리플루오로메틸페닐, 알콕시페닐, 4-모르폴린-4-일페닐, 4-피롤리딘-1-일페닐, 4-피라졸릴페닐, 4-트리아졸릴페닐 및 4-(2-옥소피롤리딘-1-일)페닐이 있다.
본 발명과 관련하여, "헤테로아릴"이란 용어는 방향족 고리 중의 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 황, 인 및 산소를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 치환된 헤테로사이클릭 방향족 그룹을 의미하고자 한다.
더욱 또한, 본 발명과 관련하여, "헤테로아릴"이란 용어는 하나 이상의 아릴 고리 및 하나 이상의 헤테로아릴 고리, 2 개 이상의 헤테로아릴 고리, 하나 이상의 헤테로아릴 고리 및 하나 이상의 헤테로사이클릴 고리, 또는 하나 이상의 헤테로아릴 고리 및 하나 이상의 C3-8 사이클로알킬 고리가 하나 이상의 화학 결합을 공유하는 축합된 고리 시스템을 포함한다.
"헤테로아릴"이란 용어는 산소 원자 또는 황 원자 또는 4 개 이상의 질소 원자, 또는 하나의 산소 또는 황 원자와 2 개 이하의 질소 원자의 조합을 또한 함유하는 방향족의 C3-8 환상 그룹, 및 이들의 치환된, 및 바람직하게는 고리 형성 탄소 원자들 중 하나를 통해 연결된, 벤조- 및 피리도-축합된 유도체에 관한 것으로 이해된다. 헤테로아릴 그룹은 할로, 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 알킬아미도, 아실, C1-6-알콕시, C1-6-알킬, C1-6-하이드록시알킬, C1-6-아미노알킬, C1-6-알킬아미노, 알킬설페닐, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 설파모일 또는 트리플루오로메틸 중에서 선택된 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 헤테로아릴 그룹은 0, 1 또는 2 개의 치환체(이들은 서로 동일하거나 상이할 수 있으며 상기 목록 중에서 선택된다)를 갖는 5- 및 6-원 방향족 헤테로사이클릭 시스템일 수 있다. 헤테로아릴 그룹의 전형적인 예로는 비 제한적으로 푸란, 벤조푸란, 티오펜, 벤조티오펜, 피롤, 피리딘, 인돌, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 이속사졸, 벤즈이속사졸, 티아졸, 벤조티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 피라졸, 인다졸, 테트라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 피리다진, 피리미딘, 퓨린 및 피라진(이들은 모두 바람직하다)뿐만 아니라, 푸라잔, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 트리아졸, 벤조트리아졸, 프테리딘, 페녹사졸, 옥사디아졸, 벤조피라졸, 퀴놀리진, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린 및 퀴녹살린의 비 치환 및 일- 또는 이-치환된 유도체가 있다. 일부 실시태양에서, 상기 치환체는 할로, 하이드록시, 시아노, O-C1-6-알킬, C1-6-알킬, 하이드록시-C1-6-알킬, 아미노-C1-6-알킬이다.
본 발명과 관련하여, "알킬" 및 "C1-6-알킬"이란 용어는 가장 긴 쇄가 하나 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지된 포화 탄화수소 쇄, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2 급-부틸, 3 급-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실을 의미하고자 한다. 알킬 쇄는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로사이클릴"이란 용어는 탄소 원자가 하나 내지 3 개의 헤테로 원자와 함께 고리를 구성하는 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8-원 고리를 의미하고자 한다. 헤테로사이클릴은 상기와 같은 방식으로 위치해 있는, 그러나 방향족 π-전자 시스템은 발생하지 않는 하나 이상의 불포화 결합을 임의로 함유할 수 있다. 상기 헤테로원자는 산소, 황 및 질소 중에서 독립적으로 선택된다.
헤테로사이클릴은 하나 이상의 카보닐 또는 티오카보닐 작용기를 추가로 함유하여, 상기 정의가 옥소-시스템 및 티오-시스템, 예를 들어 락탐, 락톤, 환상 이미드, 환상 티오이미드, 환상 카바메이트 등을 포함하도록 만들 수 있다.
헤테로사이클릴 고리는 아릴 고리에 임의로 또한 축합되어, 상기 정의가 이환상 구조를 포함하도록 할 수 있다. 바람직한 상기와 같은 축합된 헤테로사이클릴 그룹은 임의로 치환된 벤젠 고리와 하나의 결합을 공유한다. 벤조 축합된 헤테로사이클릴 그룹의 예로는 비 제한적으로 벤즈이미다졸리디논, 테트라하이드로퀴놀린 및 메틸렌디옥시벤젠 고리 구조가 있다.
"헤테로사이클릴"의 일부 예로는 비 제한적으로 테트라하이드로티오피란, 4H-피란, 테트라하이드로피란, 피페리딘, 1,3-디옥신, 1,3-디옥산, 1,4-디옥신, 1,4-디옥산, 피페라진, 1,3-옥사티안, 1,4-옥사틴, 1,4-옥사티안, 테트라하이드로-1,4-티아진, 2H-1,2-옥사진, 말레이미드, 숙신이미드, 바비투르산, 티오바비투르산, 디옥소피페라진, 하이단토인, 디하이드로우라실, 모르폴린, 트리옥산, 헥사하이드로-1,3,5-트리아진, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로푸란, 피롤린, 피롤리딘, 피롤리돈, 피롤리디온, 피라졸린, 피라졸리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 1,3-디옥솔, 1,3-디옥솔란, 1,3-디티올, 1,3-디티올란, 이속사졸린, 이속사졸리딘, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 옥사졸리디논, 티아졸린, 티아졸리딘 및 1,3-옥사티올란이 있다. 헤테로사이클에 대한 결합은 헤테로원자의 위치에서 또는 상기 헤테로사이클 중의 탄소 원자를 통해, 또는 벤조 축합된 유도체의 경우 벤젠 모양 고리의 탄소를 통해 있을 수 있다.
"(헤테로사이클릴)C1-6-알킬"이란 용어는 치환체로서, 알킬을 통해 연결된 헤테로사이클릴 그룹으로서 이해되며, 이들은 각각 본 발명에 정의된 바와 같다. (헤테로사이클릴)C1-6-알킬 그룹의 헤테로사이클릴 그룹은 치환되거나 비 치환될 수 있다. "(헤테로사이클릴)C1-6-알킬"이란 용어는 전형적으로 알킬 쇄의 말단 위치에서 헤테로사이클릴 그룹에 의해 1 회 이상 치환된 알킬 쇄를 의미하고자 한다.
본 발명과 관련하여, "C2-8-알케닐"이란 용어는 탄소수 2 내지 8을 갖고 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 선형 또는 분지된 탄화수소 그룹을 의미하고자 한다. C2-8-알케닐 그룹의 일부 예로는 알릴, 호모-알릴, 비닐, 크로틸, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐 및 옥테닐이 있다. 하나 이상의 이중 결합을 갖는 C2-8-알케닐 그룹의 일부 예로는 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐, 헵타디에닐, 헵타트리에틸 및 옥타트리에닐 그룹뿐만 아니라 이들의 분지된 형태들이 있다. 상기 불포화(이중 결합)의 위치는 상기 탄소 쇄를 따라 임의의 위치일 수 있다.
본 발명과 관련하여 "C2-8-알키닐"이란 용어는 탄소수 2 내지 8을 갖고 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 선형 또는 분지된 탄화수소 그룹을 의미하고자 한다. C2-8-알키닐 그룹의 일부 예로는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐 및 옥티닐 그룹뿐만 아니라 이들의 분지된 형태들이 있다. 상기 불포화(이중 결합)의 위치는 상기 탄소 쇄를 따라 임의의 위치일 수 있다. "C2-8-알키닐"이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 디-인 또는 엔디-인이도록 하나 이상의 결합이 불포화될 수 도 있다.
본 발명과 관련하여 "C3-8-사이클로알킬"이란 용어는 탄소 원자들만을 포함하는 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 및 8-원 고리를 포함하고자 한다. C3-8-사이클로알킬은 상기와 같은 방식으로 위치해 있는, 그러나 방향족 π-전자 시스템은 발생하지 않는 하나 이상의 불포화 결합을 임의로 함유할 수 있다.
바람직한 "C3-8-사이클로알킬"의 일부 예는 카보사이클 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로펜타디엔, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 1,3-사이클로헥사디엔, 1,4-사이클로헥사디엔, 사이클로헵탄, 사이클로헵텐이다.
"(아릴)C1-6-알킬"이란 용어는 치환체로서, C1-6-알킬을 통해 연결된 아릴 그룹을 의미하고자 하며, 이들은 각각 본 발명에 정의된 바와 같다. (아릴)C1-6-알킬의 아릴 그룹은 치환되거나 비 치환될 수 있다. 예로서 벤질, 치환된 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필 및 나프틸알킬이 있다.
"(사이클로알킬)C1-6-알킬"이란 용어는 치환체로서 알킬을 통해 연결된 사이클로알킬 그룹을 의미하고자 하며, 이들은 각각 본 발명에 정의된 바와 같다.
본 발명에 사용 시, "O-C1-6-알킬"이란 용어는 C1-6-알킬옥시 또는 알콕시, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, 2 급-부톡시, 3 급-부톡시, 펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시 및 헥실옥시를 의미하고자 한다.
"할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 즉 용어 "C1-6-알킬", "아릴", "헤테로아릴", "헤테로사이클릴", "C3-8-사이클로알킬", "헤테로사이클릴(C1-6-알킬)", "(사이클로알킬)알킬", "O-C1-6-알킬", "C2-8-알케닐" 및 "C2-8-알키닐"과 관련하여, "임의로 치환된"이란 용어는 해당 그룹이 1 회 또는 수회, 예를 들어 1 내지 5 회, 또는 1 내지 3 회, 또는 1 내지 2 회, C1-6-알킬, C1-6-알콕시, 옥소(이는 토오토머성 에놀 형태로 존재할 수 있다), 카복실, 아미노, 하이드록시(이는 에놀 시스템 중에 존재하는 경우 토오토머성 케토 형태로 존재할 수 있다), 니트로, 알킬설포닐, 알킬설페닐, 알킬설피닐, C1-6-알콕시카보닐, C1-6--알킬카보닐, 포르밀, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노; 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬카보닐아미노, C1-6-알킬하이드록시이미노, 시아노, 구아니디노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, C1-6-알킬설포닐옥시, 디할로겐-C1-6-알킬, 트리할로겐-C1-6-알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴 및 할로 중에서 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 치환될 수 있음을 의미하고자 한다. 일반적으로, 상기 치환체들은 추가로 임의로 치환될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 치환체가 "임의로 치환되는" 것으로 생각되는 경우, 상기 치환체는 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 할로, 카보닐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, O-카복시, 이소시아네이토, 티오시아네이토, 이소티오시아네이토, 니트로, 실릴, 트리할로메탄설포닐, 및 아미노, 예를 들어 일- 및 이-치환된 아미노 그룹, 및 이들의 보호된 유도체들 중에서 개별적으로 및 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹(들)에 의해 치환될 수 있는 그룹임을 의미한다. 상기 치환체들의 보호 유도체를 형성할 수 있는 보호 그룹들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 상기 그린과 우츠(Greene and Wuts) 등의 참고문헌에서 찾을 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 화학식 A의 화합물에서 E는 산소이다. 일부 실시태양에서 T가 또한 산소이다.
일부 실시태양에서, "헤테로사이클릴"이란 용어는 테트라하이드로티오피란, 4H-피란, 테트라하이드로피란, 피페리딘, 1,3-디옥신, 1,3-디옥산, 1,4-디옥신, 1,4-디옥산, 피페라진, 1,3-옥사티안, 1,4-옥사틴, 1,4-옥사티안, 테트라하이드로-1,4-티아진, 2H-1,2-옥사진, 말레이미드, 숙신이미드, 바비투르산, 티오바비투르산, 디옥소피페라진, 하이단토인, 디하이드로우라실, 모르폴린, 트리옥산, 헥사하이드로-1,3,5-트리아진, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로푸란, 피롤린, 피롤리딘, 피롤리돈, 피롤리디온, 피라졸린, 피라졸리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 1,3-디옥솔, 1,3-디옥솔란, 1,3-디티올, 1,3-디티올란, 이속사졸린, 이속사졸리딘, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 옥사졸리디논, 티아졸린, 티아졸리딘 및 1,3-옥사티올란으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 치환체를 지칭한다.
몇몇 실시태양에서, "헤테로아릴"이란 용어는 푸란, 벤조푸란, 티오펜, 벤조티오펜, 피롤, 피리딘, 인돌, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 이속사졸, 벤즈이속사졸, 티아졸, 벤조티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 피라졸, 인다졸, 테트라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 피리다진, 피리미딘, 퓨린, 피라진, 푸라잔, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 트리아졸, 벤조트리아졸, 프테리딘, 페녹사졸, 옥사디아졸, 벤조피라졸, 퀴놀리진, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린 및 퀴녹살린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 치환체를 지칭한다.
일부 실시태양에서, "아릴"이란 용어는 페닐, 나프탈레닐, 페난트레닐, 안트라세닐, 테트랄리닐, 플루오레닐, 인데닐 및 인다닐로 이루어진 그룹 중에서 선택된 치환체를 지칭한다.
다른 실시태양들에서, "사이클로알킬"이란 용어는 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로펜타디엔, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 1,3-사이클로헥사디엔, 1,4-사이클로헥사디엔, 사이클로헵탄, 사이클로헵텐으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 치환체를 지칭한다.
화학식 A 화합물의 일부 실시태양은 R1이 수소; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C3-8 사이클로알킬; C3-8 헤테로사이클릴; 사이클로알킬(C1-6)알킬; 헤테로사이클릴(C1-6)알킬; 아릴; 헤테로아릴; (C1-6)알킬카보닐; (C1-6)알콕시(C1-6)알킬; 및 퍼할로(C1-6)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것들을 포함한다. 이들 실시태양들 중 일부에서, 상기 나타낸 다양한 치환체들의 알킬 그룹은 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, 2 급-부틸 및 3 급-부틸로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
그러나 일부 실시태양에서, R1은 수소이다.
일부 실시태양에서, R2는 수소; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C3-8 사이클로알킬; C3-8 헤테로사이클릴; 사이클로알킬(C1-6)알킬; 헤테로사이클릴(C1-6)알킬; 아릴; 헤테로아릴; (C1-6)알킬카보닐; (C1-6)알콕시(C1-6)알킬; 및 퍼할로(C1-6)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이들 실시태양들 중 일부에서, 상기 나타낸 다양한 치환체들의 알킬 그룹은 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, 2 급-부틸 및 3 급-부틸로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
그러나 일부 실시태양에서, R2는 수소이다.
일부 실시태양에서, R3-R6은 각각 독립적으로 수소; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C3-8 사이클로알킬; C3-8 헤테로사이클릴; 사이클로알킬(C1-6)알킬; 헤테로사이클릴(C1-6)알킬; 아릴; 헤테로아릴; (C1-6)알킬카보닐; (C1-6)알콕시(C1-6)알킬; 및 퍼할로(C1-6)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이들 실시태양들 중 일부에서, 상기 나타낸 다양한 치환체들의 알킬 그룹은 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, 2 급-부틸 및 3 급-부틸로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
그러나 일부 실시태양에서, R3-R6은 수소이다.
추가의 실시태양에서, R7 및 R8은 각각 독립적으로 수소 및 C1-6 알킬 중에서 선택된다. 이들 실시태양들 중 일부에서, R7 및 R8은 수소이다.
바람직한 약제 또는 약물은 하기 화학식 C의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 에스테르 또는 전구약물로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들을 포함한다:
(화학식 C)
상기 화합물을 본 원에 개시된 바와 같이(실시예 6 참조), 변경되지 않은 G-NH2를 보조인자 함유 혈청 중에서 배양시킨 후에 양이온 교환 HPLC를 사용하여 단리시켰다. 화학식 C의 화합물을 그의 NMR 스펙트럼을 사용하여 상술한 크로마토그래피 단리 후에 변경된 G-NH2(대사산물 X)로서 확인하였다.
상기 분석은 이중 표지된, 즉 13C/15N 샘플을 토대로 하였다. 1H NMR 스펙트럼은 7.65 및 7.15 ppm에 위치한 2 개의 넓은 NH-아미드 신호와 5.21 ppm에 집중된 CH-양자 이중선(J=163 Hz)으로 이루어졌다. 상기 3 개 신호 모두의 강도 비는 1:1:1에 가까웠다. 수 용매 신호의 예비 포화 없이 취한 스펙트럼에서, ∼7.4 ppm에서 잉여 NH3 + 그룹 신호를 관찰할 수 있었다. 이는 글리신 메틸렌 그룹 중의 하나의 양자가 전기음성 치환체에 의해 치환되어, 원래의 글리신 아미드에 비해 1H NMR 스펙트럼에서 현저한 다운필드 이동을 일으킴을 나타낸다.
13C NMR 스펙트럼은 2 개의 동일 강도 신호를 나타내었다, 즉 177.6 ppm에서 13C=O(J=62 Hz)에 대해 이중선 및 89.0 ppm에서 지방족 탄소 신호에 대해 8 중선(3 개의 상이한 커플링 상수, J=7.1; 62 및 163 Hz를 갖는다). J=163 Hz는 하나의 결합 13C-1H 커플링이고, J=62 Hz는 하나의 결합 13C-13C 커플링인 반면, 세 번째 커플링 7.1 Hz는 하나의 결합 15N-13C 커플링과 일치하였다. 모든 가능한 2 개의 결합 커플링은 이론적인 고찰로부터 기대되는 바와 같이, 제로에 가까웠다. 1H-13C 및 13C-13C 커플링 모두는 비교적 넓으며, 이는 글리신 지방족 탄소에서의 강한 전기음성 치환체의 도입과 일치하였다. 화학 이동 예견에 대한 기존의 추가적인 안을 사용하여 상기 지방족 탄소의 13C 화학 이동에 대한 분석으로부터 같은 결론이 나왔다.
15N-1H HSQC 스펙트럼은 ∼20 ppm에 위치한 15N 표지된 아민으로부터의 강한 신호와 ∼105 ppm에서 표지되지 않은 아미드 질소로부터의 약한 신호로 이루어졌다. 이들은 NH3 + 및 CONH2 질소 공명에 대해 예상되는 전형적인 값이다. 이중 표지된 샘플에 대한 총 측정 시간은 ∼10 시간이었다.
따라서, 1H와 13C 스펙트럼간에 최상의 일치는 화학식 C 화합물의 구조로부터 얻어졌다. 따라서, 바람직한 실시태양은 화학식 C의 화합물 및 그의 유도체, 특히 하이드록실 그룹이 메톡시, 에톡시 또는 알콕시로 치환된 유도체로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나(예를 들어 에난티오머들 중 어느 하나(L 또는 D) 및/또는 이성체들 중 어느 하나(R 또는 S)의 화학식 C의 화합물이 농축되거나 상기 화합물을 함유하는 단리된 제제) 또는 이들을 포함하는 약제 및 약물을 포함한다.
추가의 바람직한 실시태양은 하기 화학식 E에 나타낸 구조를 갖는 α-퍼옥시글리신아미드(NH2-gly-O-O-gly-NH2) 또는 하기 화학식 F에 나타낸 구조를 갖는 디글리신아미드 에테르(NH2-gly-O-gly-NH2)로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들을 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 E)
(화학식 F)
바람직한 조성물은 또한 하기 화학식 G에 나타낸 구조를 는 알파-메톡시글리신아미드(알파-MeO-gly-NH2)로 이루어지거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 약제 및 약물을 포함한다:
(화학식 G)
변경된 글리신아미드를 합성하기 위한 다양한 접근법들이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 1991년 10월 3일자로 출원된, 하야카와(Hayakawa) 등의 "알파-하이드록시글리신아미드 유도체 및 그의 제조"란 표제하의 JP 5097789A2를 참조하시오). 하나의 접근법에 의해, 하기 화학식 B로 나타내는 α-하이드록시글리신아미드 유도체 또는 그의 염을 제조한다:
(화학식 B)
(상기 식에서,
R1은 수소 원자, 저급 알킬 그룹, 저급 알케닐 그룹, 저급 알키닐 그룹, 벤질 그룹, 또는 알킬 그룹 또는 알킬 그룹과 방향족 그룹으로 치환된 실릴 그룹이고;
R2는 수소 원자 또는 아미노 보호 그룹, 또는 그의 염이다).
또 다른 접근법에 의해, 하기 화학식 H로 나타내는 α-하이드록시글리신아미드 유도체 또는 그의 염을 용매 중의 암모니아로 처리하고, 아미노 보호 그룹을 경우에 따라 제거하고, 수득된 화합물을 경우에 따라 그의 염으로 추가로 전환시킨다:
(화학식 H)
(상기 식에서,
R1 및 R2는 화학식 B에 정의된 바와 같고;
R3은 수소 원자 또는 카복실 보호 그룹, 또는 그의 염이다).
본 원에 개시된 바람직한 실시태양들 중 일부에 따라, 인용 기호 R1로 나타내는 저급 알킬 그룹은 탄소수 6 이하, 바람직하게는 4 이하의 알킬 그룹이다. 상기와 같은 그룹의 예로는 메틸 그룹, 에틸 그룹, n-프로필 그룹, 이소프로필 그룹, n-부틸 그룹, 이소부틸 그룹, 3 급-부틸 그룹, 분지될 수도 있는 펜틸 그룹 및 분지될 수도 있는 헥실 그룹이 있다.
인용 기호 R1로 나타내는 저급 알케닐 그룹은 탄소수 6 이하, 바람직하게는 4 이하의 알케닐 그룹이다. 상기와 같은 그룹의 예로는 에테닐 그룹, 알릴 그룹, 및 임의의 위치에 이중 결합을 갖는 부테닐 그룹이 있다. 인용 기호 R1로 나타내는 저급 알키닐 그룹은 탄소수 6 이하, 바람직하게는 4 이하의 알키닐 그룹이다. 상기와 같은 그룹의 예로는 에티닐 그룹 등이 있다.
인용 기호 R1으로 나타내는, 저급 알킬 그룹에 의해 치환된 실릴 그룹은 하나 내지 3 개의 저급 알킬 그룹으로 치환된 실릴 그룹이다. 이 경우에 사용된 저급 알킬 치환체들은 상기 R1을 참고로 하여 개시한 저급 알킬 그룹들 중 임의의 치환체 또는 이들의 조합이다. 저급 알킬 그룹으로 치환된 실릴 그룹은 바람직하게는 3 급-부틸디메틸실릴 그룹이다. 알킬 및 방향족 그룹으로 치환된 실릴 그룹은 상술한 알킬 그룹 및 페닐 그룹으로 치환된 실릴 그룹, 예를 들어 3 급-부틸디페닐실릴 그룹이다.
아미노산 또는 펩티드 화학 분야에 사용된 보호 그룹을 R2로 나타내는 아미노 보호 그룹으로서 사용할 수 있다. 상기와 같은 그룹의 예로는 옥시카보닐 유형의 보호 그룹, 예를 들어 벤질옥시카보닐(Cbz-), p-메톡시벤질옥시카보닐[Z(OMe)-], 3 급-부톡시카보닐(Boc-), 또는 2-비페닐이소프로폭시카보닐(Bpoc-) 등; 아실 보호 그룹, 예를 들어 HCO-, 프탈레이트 그룹(Pht-) 또는 o-니트로페닐티오 그룹(Nps-) 등; 및 알킬 보호 그룹, 예를 들어 트리페닐메틸 그룹(Trt-) 등이 있다.
본 원에 개시된 실시태양들 중 일부에 따른 α-하이드록시글리신아미드 유도체의 염은 산 부가염, 예를 들어 무기 염, 예르 들어 하이드로할라이드, 예를 들어 하이드로플루오라이드, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 니트레이트, 설페이트, 또는 포스페이트, 또는 유기산 염, 예를 들어 푸마레이트, 아세테이트 등이다.
화학식 C로 나타내는 화합물들을 하기 화학식 H로 나타내는 α-하이드록시글리신 유도체를 용매 중에서 암모니아로 처리하고 임의로 아미노 보호 그룹을 제거함으로써 제조할 수 있다:
(화학식 H)
(상기 식에서,
R1 및 R2는 화학식 B에 정의된 바와 같고;
R3은 수소 원자 또는 카복실 보호 그룹, 또는 그의 염이다).
카보닐 보호 그룹 R3은 암모니아 처리에 의해 아미노 그룹으로 치환될 수 있는 통상적인 카복시 보호 그룹이다. 상기와 같은 그룹의 예로는 저급 알킬옥시 그룹, 예를 들어 메톡시 그룹(-OMe), 에톡시 그룹(-OEt), 벤질옥시 그룹(-OBzl), 또는 3 급-부톡시 그룹(-OtBu), 또는 아릴옥시 그룹, 예를 들어 p-니트로페녹시 그룹(-ONp) 등이 있다.
통상적인 유기 용매, 예를 들어 저급 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 에테르, 예를 들어 메틸 에틸 에테르, 디에틸 에테르, 이소프로필 에테르 등을 상기 반응을 위한 용매로서 사용할 수 있다. 상기 반응을 화학식 H로 나타낸 화합물을 상기 언급한 용매 중에 용해시키고 감압, 통상적인 압력 또는 증가된 압력 하에 예를 들어 -78 내지 40 ℃, 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 예를 들어 실온에서 암모니아를 취입시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 반응은 R2가 아미노 보호 그룹인 화합물 B를 수득할 수 있게 한다. 상기 화합물로부터 아미노 보호 그룹 R2를 제거하여 R2가 수소인 화합물 B를 수득하기 위해서, 통상적인 탈보호 처리를 상기 아미노 보호 그룹 R2의 유형에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 보호 그룹 R2가 벤질옥시카보닐, P-메톡시벤질옥시카보닐 등인 경우, 수소화 촉매, 예를 들어 팔라듐/탄소 등의 존재 하에서 수소 기체로 처리함으로써 탈보호를 수행할 수 있다. 더욱 또한, 보호 그룹 R2가 3 급-부톡시카보닐인 경우, 탈보호를 염산-디옥산을 사용하여 수행할 수 있다. 화합물 B의 염을 예를 들어 상술한 탈보호 처리를 염산과 같은 산의 존재 하에서 수행함으로써 제조할 수 있다.
R1이 수소 원자가 아닌 화학식 H에 따른 화합물을 예를 들어 하기 2 가지 방법에 의해 제조할 수 있다. 첫 번째 방법의 경우, 상기 화합물을 수소 이외의 R1을 R1이 수소인 화학식 H의 화합물들 중 한 화합물에 도입시킴으로써 제조할 수 있다. 수소 이외의 그룹 R1의 도입은 상기 그룹의 각각의 작용성 유도체, 예를 들어 할로겐 유도체를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어 저급 알킬 치환된 실릴 그룹을 도입시키기 위해서, 실릴 그룹의 할라이드를 사용할 수 있다, 예를 들어 3 급-부틸디메틸실릴 클로라이드를 3 급-부톡시디메틸실릴 그룹의 도입을 위해 사용할 수 있다. 이러한 반응을 디메틸포름아미드와 같은 용매 중에서 0 내지 30 ℃의 온도에서 수행할 수 있다.
더욱 또한, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐 그룹을 도입시키기 위해서, 알켄 또는 알킬 각각의 할로겐 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 산화 은 등의 촉매의 존재 하에서 알릴 요오다이드와 같은 알릴 할라이드를 사용하여 알릴 그룹을 도입시킬 수 있다. 상기 반응을 디메틸포름아미드와 같은 용매 중에서 -10 내지 50 ℃, 바람직하게는 0 내지 25 ℃의 온도에서 수행할 수 있다.
R1이 수소가 아닌 화학식 H의 화합물을 제조하기 위한 다른 방법의 경우, R1 및 R2가 모두 수소 원자인 화학식 H의 화합물을 용매로서 저급 알콜, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 염화 티오닐로 처리한다. 이 경우에, R1 및 R2가 저급 알콜 용매에 상응하는 동일한 저급 알킬 그룹인 화학식 H의 화합물을 수득할 수 있다. 상기 반응을 -10 내지 40 ℃, 바람직하게는 0 내지 25 ℃의 온도에서 수행할 수 있다.
R1이 수소인 화학식 H의 화합물을 예를 들어 하기 2 가지 방법에 의해 제조할 수 있다. 첫 번째 방법의 경우, 상기 화합물을 글리세르알데히드 CHO-COOH를 아미노 보호 그룹 R2로 보호된 아민 R2NH2와 반응시켜 수득할 수 있다. 이 반응은 아세톤, 에테르 등의 용매 중에서 20 내지 75 ℃의 온도에서, 예를 들어 필립 등(PhilipX, Masciantonio et al.)에게 허여된 미국 특허 제 3,668,121 호 및 문헌[Stanlen D. Young et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 1933(1989)]에 개시된 방법에 의해 수행할 수 있다. 이 경우, R1 및 R3이 모두 수소 원자인 화학식 H의 화합물을 수득할 수 있다.
R1이 수소인 화학식 H의 화합물을 제조하기 위한 다른 방법의 경우, 하기 화학식 I의 화합물을 아미노 보호 그룹 R2로 보호된 아민 R2NH2와 반응시킨다:
(화학식 I)
(상기 식에서,
R3은 화학식 H에 대해 개시한 바와 같이 정의되고,
R4는 저급 알킬 그룹이다).
이 반응을 20 내지 80 ℃의 온도, 예를 들어 사용된 용매의 환류 온도에서 테트라하이드로푸란 등의 용매 중에서 수행할 수 있다. 저급 알킬 그룹 R4는 저급 알킬 그룹 R1으로서 정의된다. 하기 실시예는 이들 합성적 접근법 중 일부를 보다 상세히 개시한다.
실시예 12
12-1
α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르(4.11 g, 20 밀리몰) 및 이미다졸을 실온에서 DMF에 용해시키고 0 ℃의 온도로 냉각시킨다. 이어서 염소화된 3 급-부틸디메틸실릴을 상기 온도에서 상기 용액에 가하고 상기 성분들을 10 분간 교반한다. 상기 용액을 다시 실온으로 만들고 계속해서 1 시간 동안 교반한다. 이어서, 포화된 염수를 가하고 에틸 아세테이트를 사용하여 추출을 수행한다. 유기 층을 무수 황산 마그네슘에 의해 건조시키고 용매를 증발시킨다.
이어서 수득되 유성 물질을 에탄올(50 ㎖)에 용해시키고, 과잉의 암모니아를 0 ℃의 온도에서 상기 용액에 취입시킨다. 이어서, 상기 과잉의 암모니아를 감압 하에서 제거하고 에탄올을 증류시킨다. 상기와 같이 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시키고 α-3 급-부틸디메틸실릴옥시-N-3 급-부톡시카보닐글리신아미드(6.10 g, 정량적)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: 1HNMR δ(CDCl3) 0.16(s, 3H), 0.21(s, 3H), 0.92(s, 9H), 5.46(d, 1H, J=9 Hz), 5.63(d, 1H, J=9 Hz), 6.22-6.82(br, 2H).
12-2
상기 12-1에서 출발 물질인 α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르를 하기와 같은 방식으로 제조한다: 3 급-부틸 카바메이트(2.83 g, 23.6 밀리몰) 및 글리옥실산 모노하이드레이트(2.02 g, 21.5 밀리몰)를 아세톤(50 ㎖)에 용해시키고 밤새 환류시킨다. 이어서 상기 용액을 0 ℃의 온도로 냉각시키고 이 온도에서 과잉의 디아조메탄-에테르 용액으로 처리한다.
이어서 포화된 염수를 가하고, 클로로포름을 사용하여 추출을 수행하고, 유기 층을 무수 황산 마그네슘에 의해 건조시키고 용매를 증류시킨다. 상기와 같이 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시키고 α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르(2.56 g, 58%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: 1HNMR δ(CDCl3) 1.46(s, 9H), 1.65(br s, 1H), 3.84(s, 3H), 5.27-5.52(br, 1H), 5.59-5.90(br, 1H), IR(NaCl) 1755(s), 1690(s), 1528(s) ㎝-1.
12-3
상기 12-1에서 출발 물질인 α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르를 12-2 이외의 방법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 3 급-부틸 카바메이트(11.35 g, 95.0 밀리몰) 및 1-하이드록시-1-메톡시아세트산 메틸 에스테르(14.35 g, 119.5 밀리몰)를 무수 THF(50 ㎖)에 용해시키고 밤새 환류시킨다. 이어서 상기 온도를 실온으로 복귀시키고, 이어서 1-하이드록시-1-메톡시아세트산 메틸 에스테르(1.15 g, 9.6 밀리몰)를 가하고 상기 성분들을 8 시간 동안 추가로 환류시킨다. 반응 액체를 온도가 실온으로 복귀될 때까지 정치시키고 이어서 용매를 증류시킨다. 상기와 같이 수득된 조 생성물을 클로로포름-헥산 용액으로부터 재결정화시키고, 순수한 α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르(16.42 g, 84%)를 수득한다.
실시예 13
상기 12-2 또는 12-3에서 수득한 α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르(1.21 g, 5.9 밀리몰)를 DMF(10 ㎖)에 용해시키고 이어서 산화 은(1.04 g, 4.5 밀리몰) 및 요오드화 벤젠(1.99 g, 9.1 밀리몰)을 실온에서 가한다. 상기 성분들을 실온에서 밤새 교반하고, 침전물을 여과하고, 물을 모액에 가하고, 에틸 아세테이트로 추출을 수행한다. 추출된 용액을 무수 황산 마그네슘에 의해 건조시키고, 이어서 용매를 증발시키고 조 정제를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행한다.
상기와 같이 수득된 유성 물질을 에탄올(50 ㎖)에 용해시키고, 과잉의 암모니아를 0 ℃의 온도에서 상기 용액에 취입시킨다. 이어서, 상기 과잉의 암모니아를 감압 하에서 제거하고 에탄올을 증류시킨다. 상기와 같이 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시키고 α-벤질옥시-N-3 급-부톡시카보닐글리신아미드(0.397 g, 22%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: m.p. 115-120 ℃, 1HNMR δ(CDCl3) 1.44(s, 9H), 4.61(d, 1H, J=11.3 Hz), 4.79(d, 1H, J=11.3 Hz), 5.4(d, 1H, J=9.0 Hz), 5.75(brd, 1H, J=9.0 Hz), 6.00(br, 1H), 6.52(br, 1H), 7.35(s, 5H), IR(NaCl) 1698(s), 1664(s), 1502(s), 732(m), 695(m) ㎝-1. (C14H20O4N2)에 대한 원소 분석 값: 계산치 C: 59.99, H: 7.19, N: 9.99 실측치 C: 59.94, H: 7.33, N: 10.28.
실시예 14
상기 12-2 또는 12-3에서 제조된 α-하이드록시-N-3 급-부톡시카보닐글리신 메틸 에스테르(2.07 g, 10.1 밀리몰)를 DMF(20 ㎖)에 용해시키고 이어서 산화 은(1.39 g, 6.0 밀리몰) 및 요오드화 알릴(1.2 ㎖, 12.9 밀리몰)을 실온에서 가한다. 상기 성분들을 실온에서 밤새 교반하고, 침전물을 여과하고, 물을 모액에 가하고, 에틸 아세테이트로 추출을 수행한다. 추출된 용액을 무수 황산 마그네슘에 의해 건조시키고, 이어서 용매를 증발시키고 티오황산 나트륨의 수용액을 가한 다음, 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 반응 부산물로서 요오드를 제거한다.
상기와 같이 수득된 유성 물질을 에탄올에 용해시키고, 과잉의 암모니아를 0 ℃의 온도에서 상기 용액에 취입시킨다. 이어서, 상기 과잉의 암모니아를 감압 하에서 제거하고 용매를 증류시킨다. 상기와 같이 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 α-알릴옥시-N-3 급-부톡시카보닐글리신아미드(0.625 g, 27%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: 1HNMR δ(CDCl3) 1.45(s, 9H), 4.14(dd, 2H, J=7.2, 1.8 Hz), 5.11-5.56(m, 3H), 5.70-6.20(m, 2H), 6.33-7.01(m, 2H). IR(CDCI3) 2975(w), 1705(s, br), 1498(m), 990(sh.w) ㎝-1.
실시예 15
15-1
α-하이드록시-N-벤질옥시카보닐글리신(4.44 g, 19.7 밀리몰)을 메탄올(20 ㎖)에 용해시킨다. 염화 티오닐(2.9 ㎖, 40.0 밀리몰)을 0 ℃에서 상기 용액에 적가하고 상기 온도에서 계속해서 30 분간 교반하고 이어서 실온에서 2 시간 동안 교반한다. 이어서 용매를 증발시키고 수득된 조 생성물을 메탄올(50 ㎖)에 용해시킨다. 상기 용액을 0 ℃로 냉각시키고, 과잉의 암모니아를 상기 중에 취입한다.
반응의 종료 시에, 과잉의 암모니아를 감압 하에서 제거하고, 용매를 증발시키고 수득된 백색 결정을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 α-메톡시-N-벤질옥시카보닐글리신아미드(3.42 g, 73%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: m.p. 110-112 ℃, 1HNMR δ(CDCl3) 3.44(s, 3H), 5.16(s, 2H), 5.31(d, 1H, J=8.8 Hz), 5.45-5.98(br, 2H), 6.28-6.68(br, 1H), 7.36(s, 5H), IR(NaCl) 1680(s, br), 1540(s), 1520(s), 860(m), 700(m) ㎝-1. (C11H14O4N2)에 대한 원소 분석 값: 계산치 C: 55.46, H: 5.92, N: 11.76 실측치 C: 55.70, H: 5.94, N: 11.58.
15-2
상기 12-4에서 출발 물질인 α-하이드록시-N-벤질옥시카보닐글리신을 하기와 같은 방식으로 제조한다. 벤질 카바메이트(30.24 g, 0.2 몰) 및 글리옥실산 모노하이드레이트(20.26 g, 0.22 몰)를 디에틸 에테르(200 ㎖)에 용해시키고 상기 용액을 실온에서 밤새 교반한다. 생성된 결정을 여과하고 이어서 에테르로 세척하여 순수한 α-하이드록시-N-벤질옥시카보닐글리신(33.78 g, 75%)을 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: m.p. 200-205 ℃, 1HNMR δ(CD3OD) 5.12(s, 2H), 5.40(s, 1H), 7.34(s, 5H).
실시예 16
상기 15-2에 따라 제조된 α-하이드록시-N-벤질옥시카보닐글리신(2.26 g, 10.0 밀리몰)을 에탄올(20 ㎖)에 용해시킨다. 염화 티오닐(2 ㎖, 27.4 밀리몰)을 -10 ℃의 온도에서 상기 용액에 적가하고 실온에서 밤새 계속 교반한다. 이어서 용매를 증발시키고, 상기와 같이 수득된 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 α-에톡시-N-벤질옥시카보닐글리신 에틸 에스테르(2.81 g, 정량적)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: m.p. 66-68 ℃, 1HNMR δ(CDCl3) 1.22(t, 3H, J=7.2 Hz), 1.30(t, 3H, J=7.2 Hz), 3.70(q, 2H, J=7.2 Hz), 4.24(q, 2H, J=7.2 Hz), 5.15(s, 2H), 5.33(d, 1H, J=9.7 Hz), 5.93(brd, 1H, J=9.7 Hz), 7.35(s, 5H). IR(NaCl) 1740(s), 1700(s), 1540(s), 760(m), 700(m) ㎝-1. (C14H19O5N)에 대한 원소 분석 값: 계산치 C: 59.78, H: 6.81, N: 4.98 실측치 C: 60.03, H: 6.88, N: 4.89.
실시예 17
상기 15-2에 따라 제조된 α-하이드록시-N-벤질옥시카보닐글리신(2.26 g, 10.0 밀리몰)을 이소프로필 알콜(20 ㎖)에 용해시킨다. 염화 티오닐(2 ㎖, 27.4 밀리몰)을 -10 ℃의 온도에서 상기 용액에 적가하고 실온에서 밤새 계속 교반한다. 이어서 용매를 증발시키고, 상기와 같이 수득된 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 α-이소프로폭시-N-벤질옥시카보닐글리신 에틸 에스테르(3.10 g, 정량적)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: 1HNMR δ(CDCl3) 1.16-1.37(m, 12H), 3.87-4.22(m, 1H), 4.57-5.20(m, 1H), 5.14(s, 2H), 5.33(d, 1H, J=9.7 Hz), 5.93(brd, 1H, J=9.7 Hz), 7.35(s, 5H). IR(순) 1728(s,br), 1508(m), 740(m) ㎝-1.
실시예 18
실시예 16에 따라 제조된 α-에톡시-N-벤질옥시카보닐글리신 에틸 에스테르(2.29 g, 8.1 밀리몰)를 에탄올(80 ㎖)에 용해시키고 0 ℃로 냉각시킨다. 이어서 과잉의 암모니아를 상기 온도에서 상기 용액에 취입한다. 반응의 종료 시에, 과잉의 암모니아를 감압 하에서 제거하고, 용매를 증발시키고, 상기와 같이 수득된 백색 결정을 헥산-에틸 아세테이트 혼합된 용액으로 세척하여 순수한 α-에톡시-N-벤질옥시카보닐글리신아미드(1.51 g, 77%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: m.p. 119-121 ℃, 1HNMR δ(CDCl3) 1.23(t, 3H, J=7.1 Hz), 3.50-3.90(m, 2H), 5.14(s, 2H), 5.37(d, 1H, J=9.0 Hz), 5.65-5.96(br, 2H), 6.41-6.71(br, 1H), 7.35(s, 5H). IR(NaCl) 1680(s), 1664(s), 1542(m), 1524(m), 760(w), 740(w), 700(m) ㎝-1. (C12H16O4N2)에 대한 원소 분석 값: 계산치 C: 57.13, H: 6.39, N: 11.10 실측치 C: 57.09, H: 6.34, N: 11.37.
실시예 19
실시예 16에 따라 제조된 α-이소프로폭시-N-벤질옥시카보닐글리신 이소프로필 에스테르(2.48 g, 8.0 밀리몰)를 에탄올(40 ㎖)에 용해시키고 0 ℃로 냉각시킨다. 이어서 과잉의 암모니아를 상기 온도에서 5 시간 동안 상기 용액에 취입하고 암모니아 포화된 상태에서 2 일 동안 교반을 추가로 수행한다. 반응의 종료 시에, 과잉의 암모니아를 감압 하에서 제거하고, 용매를 증류시키고, 상기와 같이 수득된 백색 결정을 헥산-에틸 아세테이트 혼합된 용액으로 세척하여 순수한 α-이소프로폭시-N-벤질옥시카보닐글리신아미드(1.64 g, 77%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: m.p. 111-113 ℃, 1HNMR δ(CDCl3) 1.18(d, 3H, J=4.4 Hz), 1.25(d, 3H, J=4.4 Hz), 3.81-4.20(m, 1H), 5.15(s, 2H), 5.44(d, 1H, J=9.0 Hz), 5.53-5.86(br, 2H), 6.37-6.73(br, 1H), 7.35(s, 5H). IR(NaCl) 1668(s), 1660(s), 1538(m), 1530(m), 760(w), 740(w), 700(m) ㎝-1. (C13H18O4N2)에 대한 원소 분석 값: 계산치 C: 58.63, H: 6.81, N: 10.52 실측치 C: 58.60, H: 6.82, N: 10.54.
실시예 20
실시예 12의 (12-1)에 따라 제조된 α-3 급-부틸디메틸실릴옥시-N-3 급-부톡시카보닐글리신아미드(5.08 g, 16.7 밀리몰)를 디옥산(10 ㎖)에 용해시키고 0 ℃로 냉각시킨다. 이어서 4N 염산-디옥산 용액(17 ㎖)을 가하고 이 온도에서 1 시간 동안 교반을 수행한다.
상기 반응을 종료시키기 위해서, 4N 염산-디옥산 용액을 추가로 가하고, 온도를 실온으로 상승시키고 1 시간 동안 교반을 수행한다. 이어서 디에틸 에테르를 상기 용액에 가하고, 가능한 한 많은 양의 생성물을 침전시키고, 여과하고 에테르로 세척한다. 이어서 상기 침전물을 감압 하에서 건조시켜 순수한 α-하이드록시글리신아미드 하이드로클로라이드(1.86 g, 88%)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: 1HNMR δ(DMSO-d6) 4.99(br sd, 1H), 7.62-8.03(br, 2H), 8.32-8.85(br, 3H), IR(KBr) 1686(s), 1581(m), 1546(m), 1477(s), 843(m) ㎝-1.
실시예 21
실시예 15(15-1)에 따라 제조된 α-메톡시-N-벤질옥시카보닐글리신아미드(0.24 g, 1.0 밀리몰)를 메탄올에 용해시키고, 12N 염산(0.1 ㎖) 및 팔라듐-탄소(50 ㎎)를 실온에서 상기 용액에 가하고, 수소 분위기 하에서 30 분간 교반을 수행한다. 이어서 상기 팔라듐-탄소를 여과하고 모액의 용매를 증발시켜 α-메톡시글리신아미드 하이드로클로라이드(0.14 g, 정량적)를 수득한다. 예상되는 프로파일은 하기를 포함한다: 1HNMR δ(CD3OD) 3.35(s, 3H), 5.01(s, 1H), 13CNMR δ(CD3OD) 42.1, 84.3(d, J=159.8 Hz), 170.3. 하기 실시예는 약제 또는 약물로 제형화하기 위해 α-하이드록시-글리신아미드 하이드로클로라이드를 합성하는데 사용되는 접근법을 개시한다.
실시예 22
22.1 메틸 글리옥실레이트 헤미아세탈
메탄올(35 ㎖) 중의 글리옥실산 모노하이드레이트(7.0 g, 76 밀리몰)의 용액을 밤새 환류시켰다. 이어서 상기 용액을 포화된 NaHCO3로 중화시키고 증발시켰다. 상기 잔사를 CH2Cl2에 용해시키고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 증발시켜 조 오일 3.23 g(40.0%)을 수득하고 이를 추가의 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
22.2 메틸 N-3 급-부톡시카보닐-α-하이드록시글리시네이트
톨루엔(45 ㎖) 중의 메틸 글리옥실레이트 헤미아세탈(2.0 g, 18.9 밀리몰) 및 3 급-부틸 카바메이트(2.0 g, 17.18 밀리몰)의 용액을 밤새 환류시켰다. 증발시켜 오일을 수득하였다. 상기 조 오일을 용출제로서 EtOAc/헥탄 1/9에서 2/8을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 순수한 분획들은 0.6 g의 유성 생성물을 제공하였으며, 이어서 이를 디에틸 에테르/헵탄에 의해 결정화시켰다. 수율은 0.39 g(10.1%)이었다. 관찰된 NMR 스펙트럼은 하기와 같다:
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 5.74(br s, 1H), 5.44(br s, 1H), 3.84(s, 3H), 1.46(s, 9H).
13C NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 170.3, 154.7, 78.6, 72.8, 51.9, 28.1.
22.3 N-3 급-부톡시카보닐-α-하이드록시글리신아미드
메틸 N-3 급-부톡시카보닐-α-하이드록시글리시네이트(0.34 g, 1.66 밀리몰)를 메탄올(4 ㎖) 중의 7N NH3에 용해시켰다. 상기 용액을 실온에서 밤새 교반하고, 증발시키고 이어서 아세토니트릴로 2 회 동시 증발시켰다. 상기 생성물을 용출제로서 EtOAc/헵탄 3/7 내지 5/5를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 수율은 0.1 g(31.7%)이었다. 관찰된 NMR 스펙트럼은 하기와 같다:
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 7.28(br d, 2H), 6.20(d, 1H), 5.09(t, 1H), 1.39(s, 9H).
13C NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 171.7, 155.0, 78.3, 73.4, 28.2.
22.4 α-하이드록시글리신아미드 하이드로클로라이드
N-3 급-부톡시카보닐-α-하이드록시글리신아미드(40 ㎎, 0.2 밀리몰)를 디옥산(1.5 ㎖)에 용해시켰다. 디옥산(0.5 ㎖) 중의 4N HCl을 0 ℃에서 상기 용액에 가하였다. 냉각 욕을 제거하고 상기 용액을 실온에서 40 분 동안 교반하였다. 디에틸 에테르를 가하고 상기 용액을 교반하였다. 에테르를 경사분리시키고 잔사를 증발시켰다. 수율은 대략 ∼40 ㎎이었다. 관찰된 NMR 스펙트럼은 하기와 같다:
1H NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 8.5-7.1(m, 5H), 4.85(s, 1H).
13C NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 173.1, 87.4.
하기 실시예는 α-메톡시-글리신아미드를 제조하는데 사용되는 접근법을 개시한다.
실시예 23
23-1 메틸 N-(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시카보닐 )-α- 메톡시글리시네이트
글리옥실산 모노하이드레이트(276 ㎎, 3 밀리몰) 및 9H-플루오렌-9-일메틸 카바메이트(320 ㎎, 1.33 밀리몰)를 무수 디에틸에테르(10 ㎖)에 용해시켰다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔사를 메탄올(20 ㎖)에 용해시키고 1 방울의 황산을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 일 교반하였다. 포화된 NaHCO3(100 ㎖)을 상기 혼합물에 가하고 상기를 에틸 아세테이트로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 증발시켰다. 잔사를 실리카겔 컬럼 상에서 정제시켜 표제 화합물 250 ㎎(55%)을 수득하였다. 관찰된 NMR 스펙트럼은 하기와 같다:
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 7.76(d, 2H), 7.59(d, 2H), 7.40(t, 2H), 7.31(t, 2H), 5.90(br d, 1H), 5.35(d, 1H), 4.46(m, 2H), 4.24(t, 1H), 3.82(s, 3H), 3.43(s, 3H).
13C NMR(300 MHz, CDCl3) δ 143.6, 143.5, 141.2, 127.7, 127.1, 124.9, 120.0, 80.5, 67.2, 56.2, 52.9.
23-2 α-메톡시글리신아미드
메틸 N-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐)-α-메톡시글리시네이트(240 ㎎, 0.7 밀리몰)를 메탄올(20 ㎖) 중의 3N NH3으로 실온에서 밤새 처리하였다. 메탄올을 증발에 의해 제거하였다. 고체를 THF(30 ㎖)에 용해시키고 모르폴린(305 ㎎, 3.5 밀리몰)을 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 생성물을 실리카겔 컬럼 상에서 정제시켜 표제 화합물 5 ㎎(6%)을 수득하였다. 관찰된 NMR 스펙트럼은 하기와 같다:
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 4.40(br s, 1H), 3.35(s, 3H).
본 원에 개시된 변경된 글리신아미드 화합물은 상기 화합물과 HIV의 상호작용을 연구하기 위한 생물 공학적 도구로서, 또한 HIV에 이미 감염된 환자의 치료를 위한 약제 또는 약물로서, 또는 HIV 감염을 피하기 위한 예방 제제로서 사용하기에 적합하다. 본 원에 개시된 방법에 의해 수득할 수 있는 보조인자(들)(단독으로 또는 G-NH2 또는 G-NH2 함유 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2와 함께 또는 상기와의 조합으로)가 또한 생물 공학적 도구로서 및 HIV 감염의 치료 및 예방을 위한 약제로서 사용하기에 적합하다. 하나의 접근법으로, 예를 들어 전구약물 요법이 고려되며, 여기에서 G-NH2 또는 G-NH2 함유 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2를 상기 요법이 필요한 환자에게 제공하며 보조인자를 동시 투여에 의해 제공한다. 한편으로, G-NH2 또는 G-NH2 함유 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2 및 보조인자를 약제(예를 들어 G-NH2 또는 G-NH2 함유 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2 및 보조인자를 포함하는 약학 조성물)로 배합시킬 수 있다. 이러한 성질로, 보조인자 및/또는 G-NH2 및/또는 GPG-NH2 및/또는 다른 글리신아미드 함유 펩티드들을, 예를 들어 시간 방출 또는 장기 치료를 목적으로 하는 경우 전구약물로서 투여할 수 있다.
누구든지 예방약으로서 상기 HIV 억제 조성물로 치료될 수 있지만, 가장 적합한 환자는 바이러스 감염의 위험성이 있는 사람들이다. 이러한 환자로는 비 제한적으로 노인, 만성 질환자, 동성애자, 매춘부, 정맥 내 약물 사용자, 혈우병 환자, 어린이, 및 환자나 생물 샘플과 접촉하는 의료 종사자들이 있다.
변경된 G-NH2(예를 들어 대사산물 X 또는 알파HGA)를 포함하는 약물을 제조 및 사용하는 방법이 또한 본 발명의 실시태양이다. 본 원에 개시된 방법에 의해 수득할 수 있는 상기 변경된 G-NH2를 통상적인 생약 조제술에 따라 가공하여 환자, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물에게 투여하기 위한 약물을 제조할 수 있다. 상기 변경된 G-NH2를 변경 없이 및 변경시켜 약품에 혼입시킬 수 있다. 더욱이, 다양한 경로에 의해 변경된 G-NH2를 전달하는 약제 또는 치료제의 제조가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 원에 개시된 변경된 G-NH2를 통상적인 부형제, 즉 펩티드 작용제와 유해하게 반응하지 않는 비 경구, 장(예를 들어 경구) 또는 국소 적용에 적합한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로 사용할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체로는 비 제한적으로 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예를 들어 락토오즈, 아밀로즈 또는 전분, 스테아르산 마그네슘, 활석, 사이알릭산, 점성 파라핀, 향료 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리쓰리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈 등이 있다. 상기 약학 제제를 멸균시킬 수 있으며 경우에 따라 상기 변경된 G-NH2와 유해하게 반응하지 않는 보조제, 예를 들어 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압을 조절하기 위한 염, 완충제, 착색제, 풍미제 및/또는 방향성 물질 등과 혼합할 수 있다.
일부 실시태양에서, 변경된 G-NH2를 포함하는 약제를 보다 양호한 바이러스 반응을 성취하기 위해서, 바이러스 감염, 예를 들어 HIV 감염을 억제하는 다른 작용제와 함께 제형화하거나 투여한다. 현재 4 개의 상이한 부류의 약물이 인간에서 HIV-1 감염의 바이러스 억제 치료에 임상적으로 사용 중이다. 이들은 (i) 뉴클레오시드 류 역 전사효소 억제제(NRTI), 예를 들어 지도뷰딘, 라미뷰딘, 스타뷰딘, 디다노신, 아바카비어, 및 잘시타빈; (ii) 뉴클레오티드 류 역 전사효소 억제제, 예를 들어 테노포비어; (iii) 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 예를 들어 에파비렌츠, 네비라핀 및 델라비르딘; 및 (iv) 프로테아제 억제제, 예를 들어 인디나비어, 넬피나비어, 리토나비어, 사퀴나비어 및 암프레나비어이다. 2, 3 또는 4 개의 상이한 부류의 약물을 변경된 G-NH2의 투여와 함께 동시에 사용함으로써, 상기 상이한 부류의 약물과 변경된 G-NH2를 극복하는 다수의 돌연변이들이 동일한 바이러스 입자에서 나타날 가능성이 적기 때문에 HIV가 내성을 덜 나타낼 듯 하다.
따라서 변경된 G-NH2를 포함하는 약제를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 용량 및 방법에 의해 뉴클레오시드 류 역 전사효소 억제제, 뉴클레오티드 류 역 전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제와 함께 제형화하거나 제공하는 것이 바람직하다. 변경된 G-NH2 및 뉴클레오시드 류 역 전사효소 억제제, 뉴클레오티드 류 역 전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제를 포함하는 약제를 상기 변경된 G-NH2의 전달, 유지 또는 안정성을 돕는 다른 성분들을 함유하도록 제형화할 수 있다.
특정한 변경된 G-NH2 제형의 유효 투여량 및 투여 방법은 환자 개인 및 질병의 단계뿐만 아니라 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다른 인자들을 근거로 변할 수 있다. 상기와 같은 화합물의 치료 효능 및 독성을 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해, 예를 들어 ED50 및 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 측정할 수 있다. 독성 대 치료 효과의 용량 비는 치료 지수이며, LD50/ED50의 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 인간에 사용하기 위한 범위의 투여량을 제형화하는데 사용한다. 상기와 같은 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 유도하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 투여량은 사용되는 투여 형, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변한다.
정확한 투여량은 치료되는 환자를 고려하여 주치의에 의해 선택된다. 투여량 및 투여를 충분한 수준의 활성 잔기를 제공하거나 목적하는 효과를 유지시키기 위해 조절한다. 고려될 수 있는 추가적인 인자에는 질병 상태의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이요법, 투여 시간 및 회수, 약물 조합(들), 반응 민감도, 및 치료 허용성/반응성이 포함된다. 단기간 작용하는 약학 조성물은 매일 투여되는 반면 장기적으로 작용하는 약학 조성물은 매 2 일, 3 내지 4 일, 매주 또는 2 주에 한번 투여된다. 특정 제형의 반감기 및 제거 속도에 따라, 본 발명의 약학 조성물을 하루에 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 그 이상 투여한다.
통상적인 투여량은 투여 경로에 따라, 대략적으로 1 내지 100,000 ㎍, 총 약 20 g 이하의 용량까지 다양할 수 있다. 바람직한 투여량으로는 250 ㎍, 500 ㎍, 1 ㎎, 50 ㎎, 100 ㎎, 150 ㎎, 200 ㎎, 250 ㎎, 300 ㎎, 350 ㎎, 400 ㎎, 450 ㎎, 500 ㎎, 550 ㎎, 600 ㎎, 650 ㎎, 700 ㎎, 750 ㎎, 800 ㎎, 850 ㎎, 900 ㎎, 1 g, 1.1 g, 1.2 g, 1.3 g, 1.4 g, 1.5 g, 1.6 g, 1.7 g, 1.8 g, 1.9 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g, 10 g, 11 g, 12 g, 13 g, 14 g, 15 g, 16 g, 17 g, 18 g, 19 g 및 20 g이 있다. 또한, 변경된 G-NH2의 농도는 국소 형태로 상기 약제를 투여하는 실시태양에서 매우 높을 수 있다. 펩티드 작용제의 몰 농도를 일부 실시태양의 경우 사용할 수 있다. 국소 투여 및/또는 의료 장비 코팅용으로 바람직한 농도 범위는 100:M 내지 800 mM이다. 이들 실시태양의 바람직한 농도 범위는 500:M 내지 500 mM이다. 예를 들어, 국소 적용 및/또는 의료 장비 코팅용으로 사용하기에 바람직한 농도로는 500 μM, 550 μM, 600 μM, 650 μM, 700 μM, 750 μM, 800 μM, 850 μM, 900 μM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 475 mM, 및 500 mM이 있다. 특정한 투여량 및 전달 방법에 대한 지침이 문헌 및 하기에 제공되어 있다. (예를 들어 미국 특허 제 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 호를 참조하시오).
보다 구체적으로, 상기 변경된 G-NH2의 투여량은 적합한 바이러스 방출의 억제 및/또는 HIV 복제의 억제를 포함한 바람직한 효과를 획득하기에 충분한 변경된 G-NH2를 제공하는 것이다. 따라서, 변경된 G-NH2의 용량은 바람직하게는 대략적으로 0.1 nM 내지 500 mM의 조직 또는 혈액 농도 또는 이들 둘 모두의 농도를 생성시킨다. 바람직한 용량은 약 0.1 nM 내지 800 μM의 조직 또는 혈액 농도 또는 이들 둘 모두의 농도를 생성시킨다. 바람직한 용량은 약 10 nM 내지 약 300:M의 조직 또는 혈액 농도 또는 이들 둘 모두의 농도를 생성시킨다. 바람직한 용량은 예를 들어 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 40 nM, 45 nM, 50 nM, 55 nM, 60 nM, 65 nM, 70 nM, 75 nM, 80 nM, 85 nM, 90 nM, 95 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM, 및 300 μM의 조직 또는 혈액 농도 또는 이들 둘 모두의 농도를 성취하는데 필요한 변경된 G-NH2의 양이다. 800 μM 이상의 조직 농도를 생성시키는 용량은 바람직하지는 않지만 상기를 일부 실시태양의 경우 사용할 수 있다. 변경된 G-NH2의 일정한 주입을 또한 혈중 수준에 의해 측정 시 조직 중에서 안정한 농도를 유지시키기 위해 제공할 수 있다.
변경된 G-NH2의 투여 경로에는 비 제한적으로 국소, 경피, 비 경구, 위장, 기관지 경우 및 폐포 경유가 포함된다. 국소 투여를 변경된 G-NH2를 함유하는 국소적으로 적용되는 크림, 젤, 린스 등을 통해 수행한다. 경피 투여를 변경된 G-NH2가 피부를 관통하여 혈류로 들어가도록 할 수 있는 국소적으로 적용되는 크림, 젤, 린스 등의 적용에 의해 성취한다. 비 경구 투여 경로에는 비 제한적으로 전기 또는 직접 주입, 예를 들어 중심 정맥선 내로의 직접적인 주입, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 또는 피하 주입 등이 포함된다. 위장 투여 경로로는 비 제한적으로 섭취 및 직장 경로가 있다. 기관지 경유 및 폐포 경유 투여 경로에는 비 제한적으로 입 또는 코를 통한 흡입이 있다.
국소 적용에 적합한 변경된 G-NH2 함유 화합물의 조성물에는 비 제한적으로 생리학적으로 허용 가능한 이식물, 연고, 크림, 린스 및 젤이 포함된다. 상기 화합물이 적어도 최소로 가용성인 임의의 액체, 젤 또는 고체의 약학적으로 허용 가능한 베이스가 본 발명의 국소 용도에 적합하다. 국소 적용 조성물은 성교 중에 HIV의 전염을 예방하는데 특히 유용하다. 상기와 같은 용도에 적합한 조성물로는 비 제한적으로 질 또는 항문 좌약, 크림, 젤리, 윤활제, 오일 및 관주액이 있다.
경피 투여에 적합한 변경된 G-NH2의 조성물은 비 제한적으로 피부에 직접 적용되거나 보호성 담체, 예를 들어 경피 장치("경피 패치")에 혼입되는 약학적으로 허용 가능한 현탁제, 오일, 크림 및 연고를 포함한다. 적합한 크림, 연고 등의 예를 예를 들어 문헌[the Physician's Desk Reference]에서 찾을 수 있으며, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 경피 장치의 예는 예를 들어 키넨(Chinen) 등에게 1989년 4 월 4 일자로 허여된 미국 특허 제 4,818,540 호에 개시되어 있다.
비 경구 투여에 적합한 변경된 G-NH2의 조성물은 비 제한적으로 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 용액을 포함한다. 상기와 같은 용액으로는 비 제한적으로 상기 변경된 G-NH2의 중심 정맥 선 내로의 주입, 정맥 내, 근육 내, 복강 내 또는 피하 주입용의 염수 및 인산염 완충 염수가 있다.
기관지 경유 및 폐포 경유 투여에 적합한 변경된 G-NH2의 조성물은 비 제한적으로 다양한 유형의 흡입용 에어로졸을 포함한다. 예를 들어, 펜타미딘을 에어로졸을 통해 AIDS 환자에게 비 내 투여하여 뉴모시스티스 카리니에 의한 폐렴을 예방한다. 상기 변경된 G-NH2의 기관지 경유 및 폐포 경유 투여에 적합한 장치, 예를 들어 비 제한적으로 분무기 및 기화기가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 현재 입수할 수 있는 많은 형태의 분무기 및 기화기들을 변경된 G-NH2의 전달을 위해 쉽게 개조할 수 있다.
위장 투여에 적합한 상기 변경된 G-NH2의 조성물은 비 제한적으로, 약학적으로 허용 가능한 분말, 환제, 향낭, 또는 섭취용 액체 및 직장 투여용 좌약을 포함한다. HIV 감염의 가장 통상적인 경로 및 사용 용이성으로 인해, 위장 투여, 특히 경구 투여가 바람직하다. 위장 투여용 약제를 예를 들어 캡슐, 환제, 또는 정제 형태로 제형화하며, 여기에서 유효 성분인 변경된 글리신아미드(예를 들어 α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체, 디글리신아미드 에테르 또는 α-메톡시글리신아미드)는 HIV 복제를 억제하기에 유효한 양으로 존재한다.
상기 변경된 G-NH2는 또한 HIV 감염의 예방이 중요한 상황에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 의료 직원들은 HIV 양성일 수 있고 분비물과 체액이 HIV 바이러스를 함유하는 환자들에게 항상 노출되어 있다. 또한, 상기 변경된 G-NH2를 HIV의 전염을 방지하기 위해서 성교 중에 사용하기 위한 바이러스 억제 조성물로 제형화할 수 있다. 상기와 같은 조성물은 당해 분야에 공지되어 있으며 또한 모닥(Modak) 등의 1990년 5월 3일자 국제 출원 PCT 공보 제 WO90/04390 호에 개시되어 있다.
본 발명의 실시태양은 또한 장갑, 시트, 및 작업 표면 등의 바이러스 전염에 대비하는 의료 장치의 코팅을 포함한다. 한편으로, 상기 변경된 G-NH2를 중합체성 의료 장치에 스며들게 할 수 있다. 특히 바람직한 것은 의료용 장갑 및 콘돔용 코팅제이다. 의료 장치에 사용하기에 적합한 코팅제는 상기 펩티드를 함유하는 분말에 의해, 또는 상기 펩티드 작용제가 현탁되어 있는 중합체성 코팅제에 의해 제공될 수 있다. 코팅제 또는 장치에 적합한 중합체성 물질은 생리학적으로 허용 가능하고 상기를 통해 치료 유효량의 상기 변경된 G-NH2가 확산될 수 있는 것이다. 적합한 중합체로는 비 제한적으로 폴리우레탄, 폴리메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 셀룰로즈 아세테이트, 실리콘 탄성 중합체, 콜라겐, 실크 등이 있다. 상기와 같은 코팅제들은 예를 들어 1986년 9월 16일자로 폭스(Fox) 등에게 허여된 미국 특허 제 4,621,337 호에 개시되어 있다. 따라서, HIV 복제를 억제하는 약제의 제조 방법은 변경된 G-NH2를 제공하고 상기 약제를 상술한 바와 같이 인간을 포함한 환자에게 전달하기 위해 제형화함을 포함한다.
HIV 복제를 억제하는 화합물의 식별 방법을 또한 제공한다. 하나의 방법에 의해, 예를 들어 G-NH2를 혈청, 혈장 또는 세포 추출물과 변경된 G-NH2를 대사하기에 충분한 기간 동안 배양하고, 상기 변경된 G-NH2를 양이온 교환 HPLC에 의해 단리시킴으로써 HIV 억제 약제에 통합시키기 위한 화합물을 식별한다. 바람직하게는, 인간 혈청, 돼지 혈청, 소 혈청, 고양이 혈청, 개 혈청, 말 혈청, 원숭이 혈청 또는 돼지 혈청이 사용된다. 상기 접근법에 의해 변경된 G-NH2가 상기 컬럼으로부터 빠르게 용출되는 반면, 반응되지 않은 G-NH2는 상당히 더 긴 기간 동안 상기 컬럼 상에서 유지된다. 변경된 G-NH2의 단리를 상술한 바와 같이 상기 단리된 화합물의 존재 하에서 HIV 감염성 연구를 수행함으로써 추가로 확인할 수 있다. 유사하게, α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체, 디글리신아미드 에테르, 메톡시글리신아미드, α-에톡시글리신아미드, 및 이들 화합물의 유도체와 관련된 합성 화합물들을 본 발명에 제공된 HIV 감염성 연구를 사용하여 선별할 수 있다. 상기 단리된 변경된 G-NH2의 순도 또는 상기 합성 변경된 글리신아미드의 구조에 따라, 상기 화합물의 ED50은 1 μM 미만 내지 30 μM 미만이다. 즉, 순수한 변경된 G-NH2의 ED50은 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 21 μM, 22 μM, 23 μM, 24 μM, 25 μM, 26 μM, 27 μM, 28 μM, 29 μM 또는 30 μM 미만이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 방법에 의해 식별된 변경된 G-NH2를 약제에 통합시킨다. 더욱 또한, 뉴클레오시드 류 역 전사효소 억제제, 뉴클레오티드 류 역 전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바이러스 억제 화합물을 상기 약제에 제공함으로써 상기 방법을 보충할 수 있다. 또한, 담체를 상기 약제에 통합시킴으로써 상기 방법을 보충할 수 있다.
상기 변경된 G-NH2를 HIV의 억제를 분석하기 위한 연구 도구로서 사용할 수 있지만, 바람직하게는 변경된 G-NH2를 환자에서 HIV 복제 및 감염을 억제하는데 사용한다. 하나의 방법에 의해, 예를 들어 HIV에 의해 감염될 위험이 있거나 이미 HIV에 의해 감염된 환자를 식별하고 상기 환자에게 변경된 G-NH2를 제공한다. 추가의 방법에 의해, 상기 환자에게 변경된 G-NH2를 제공하고, HIV 복제 또는 감염에 대한 효과를 측정한다(예를 들어 생물학적 샘플 중의 p24 또는 역 전사효소 활성의 양을 분석함으로써).
변경된 글리신아미드는 통상적인 뉴클레오시드 류 억제제 및 프로테아제 억제제와 상이한 기전에 의해 HIV의 복제를 억제하는 것으로 생각된다(미국 특허 제 6258932; 6455670; 6537967 호 참조). 따라서, 변경된 글리신아미드를 함유하는 약제를 수용하기에 바람직한 환자는 뉴클레오시드 류 억제제 및 프로테아제 억제제에 대해 내성을 나타낸 HIV 감염된 개인이다.
하나의 접근법에 의해, 9 명의 HIV 감염된 환자에게 상이한 양의 변경된 글리신아미드(예를 들어 알파-하이드록시글리신아미드, 알파-퍼옥시글리신아미드 이량체, 디글리신아미드 에테르 또는 알파-메톡시글리신아미드)를 제공하고 HIV 복제의 억제를 분석한다. 3 명의 개인을 포함하는 그룹 I에게 1.0 g의 변경된 글리신아미드를 캡슐 형태로 하루에 3 회 제공하는 반면; 3 명의 개인을 포함하는 그룹 II에게는 1.5 g의 변경된 글리신아미드를 캡슐 형태로 하루에 3 회 제공하고; 3 명의 개인을 포함하는 그룹 III에게는 2.0 g의 변경된 글리신아미드를 캡슐 형태로 하루 종일 제공한다. HIV RNA의 양을 검출하는 통상적인 기법(예를 들어 Roche AMPLICOR MONITORTM)에 의해 바이러스 원천의 감소를 매일 모니터한다. HIV RNA의 검출 량의 감소가 가리키는 바와 같이, 바이러스 원천의 감소가 관찰될 것이다.
상기 방법들을 뉴클레오시드 류 역 전사효소 억제제, 뉴클레오티드 류 역 전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바이러스 억제 치료제의 투여로 보충시킬 수 있다. 더욱이, 상기 방법들에 사용된 변경된 G-NH2를 지지체에 결합시키거나 또는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제 중에서 투여할 수 있다.
본 발명을 명확성과 이해를 목적으로 일부 상세히 개시하였지만, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 진정한 범위로부터 이탈됨 없이 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화들을 수행할 수 있음을 알 것이다.

Claims (81)

  1. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 복제를 억제하는 작용제가 필요한 환자를 식별하는 단계와;
    상기 환자에게 상기 HIV의 복제를 억제하기에 충분한 양의 변형된 글리신아미드를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV의 복제를 억제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형된 글리신아미드가 양이온 교환 분리된 글리신아미드의 빠른 피크 중에 존재하는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 글리신아미드를 분리 전에 혈청, 혈장 또는 세포 추출물과 배양시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 혈청은 소, 개, 고양이, 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 혈장이 소, 개, 고양이 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. HIV의 복제를 억제하기에 충분한 양의 변형된 글리신아미드 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제.
  7. 글리신아미드를 제공하는 단계와;
    빠른 피크를 분석하기에 충분한 시간 동안 양이온 교환 컬럼 상에서 상기 글리신아미드를 분리시키는 단계와;
    HIV의 복제를 억제하는 분자를 포함하도록 상기 빠른 피크를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV의 복제를 억제하는 분자의 분리방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 글리신아미드를 분리 전에 혈청 또는 혈장과 배양시키는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 혈청은 소, 개, 고양이, 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 혈장은 소, 개, 고양이 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  11. 제 7 항의 방법에 의해 수득할 수 있는, HIV의 복제를 억제하는 분자를 포함하는 약제.
  12. 글리신아미드를 제공하는 단계와;
    빠른 피크를 분석하기에 충분한 시간 동안 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 글리신아미드를 분리시키는 단계와;
    상기 크로마토그래피 후에 상기 빠른 피크를 수득하는 단계와;
    상기 HIV의 복제를 억제하는, 상기 빠른 피크 중에 존재하는 분자의 능력을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 HIV의 복제를 억제하는 분자를 식별하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 글리신아미드를 분리 전에 혈청 또는 혈장과 배양시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 혈청은 소, 개, 고양이, 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 혈장은 소, 개, 고양이 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항의 방법에 의해 식별된 HIV의 복제를 억제하는 분자.
  17. 보조인자의 공급원을 제공하는 단계와;
    상기 보조인자의 공급원을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리시키는 단계와;
    글리신아미드를 변형된 글리신아미드로 전환시키는 상기 분리된 보조인자 공급원의 능력을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 글리신아미드를 변형된 글리신아미드로 전환시키는 보조인자의 식별 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 보조인자의 공급원은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 혈청은 소, 개, 고양이, 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 혈장은 소, 개, 고양이 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항의 방법에 의해 식별된 보조인자.
  22. 제 17 항에 있어서,
    HIV를 억제하는 분리된 보조인자 공급원의 능력을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서,
    G-NH2를 변형된 G-NH2로 전환시키는 분리된 보조인자 공급원의 능력을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 보조인자의 공급원을 제공하는 단계와;
    상기 보조인자의 공급원을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리시키는 단계와;
    G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키거나, 또는 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 열 불활성화된 혈청의 능력을 복원시키거나, 또는 열 불활성화된 혈청에서 HIV의 복제를 억제하는 G-NH2의 능력을 복원시키는 상기 분리된 보조인자 공급원의 분획을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 글리신아미드를 변형된 글리신아미드로 전환시키는 보조인자를 분리시키는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 보조인자의 공급원은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 혈청은 소, 개, 고양이, 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    상기 혈장은 소, 개, 고양이 말, 원숭이 및 돼지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 보조인자.
  29. 제 24 항에 있어서,
    분리된 보조인자 공급원의 분획이 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24 항에 있어서,
    상기 분리된 보조인자 공급원의 분획이 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 열 불활성화된 혈청의 능력을 복원시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 26 항에 있어서,
    상기 분리된 보조인자 공급원의 분획이 G-NH2를 변경된 G-NH2로 전환시키는 열 불활성화된 혈청의 능력을 복원시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 26 항에 있어서,
    상기 분리된 보조인자 공급원의 분획이 열 불활성화된 혈청에서 HIV의 복제를 억제하는 G-NH2의 능력을 복원시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 유효 성분으로서, 다른 유효 성분들과 함께 또는 이들 없이, 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하는 약제 또는 약물로, 상기 화합물은 HIV 복제를 억제하기에 유효한 양으로 존재하는 약제 또는 약물:
    (화학식 A)
    상기 식에서,
    a) E는 산소, 황 및 NR7로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    b) T는 산소, 황 및 NR8로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    c) R1-R8은 각각 독립적으로 수소; 임의로 치환된 알킬; 임의로 치환된 알케닐; 임의로 치환된 알키닐; 임의로 치환된 사이클로알킬; 임의로 치환된 헤테로사이클릴; 임의로 치환된 사이클로알킬알킬; 임의로 치환된 헤테로사이클릴알킬; 임의로 치환된 아릴; 임의로 치환된 헤테로아릴; 임의로 치환된 알킬카보닐; 임의로 치환된 알콕시알킬; 및 임의로 치환된 퍼할로알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
  34. 제 33 항에 있어서,
    E는 산소인 약제 또는 약물.
  35. 제 33 항에 있어서,
    T는 산소인 약제 또는 약물.
  36. 제 33 항에 있어서,
    상기 헤테로사이클릴은, 테트라하이드로티오피란, 4H-피란, 테트라하이드로피란, 피페리딘, 1,3-디옥신, 1,3-디옥산, 1,4-디옥신, 1,4-디옥산, 피페라진, 1,3-옥사티안, 1,4-옥사틴, 1,4-옥사티안, 테트라하이드로-1,4-티아진, 2H-1,2-옥사진, 말레이미드, 숙신이미드, 바비투르산, 티오바비투르산, 디옥소피페라진, 하이단토인, 디하이드로우라실, 모르폴린, 트리옥산, 헥사하이드로-1,3,5-트리아진, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로푸란, 피롤린, 피롤리딘, 피롤리돈, 피롤리디온, 피라졸린, 피라졸리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 1,3-디옥솔, 1,3-디옥솔란, 1,3-디티올, 1,3-디티올란, 이속사졸린, 이속사졸리딘, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 옥사졸리디논, 티아졸린, 티아졸리딘 및 1,3-옥사티올란으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  37. 제 33 항에 있어서,
    상기 헤테로아릴은 푸란, 벤조푸란, 티오펜, 벤조티오펜, 피롤, 피리딘, 인돌, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 이속사졸, 벤즈이속사졸, 티아졸, 벤조티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 피라졸, 인다졸, 테트라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 피리다진, 피리미딘, 퓨린, 피라진, 푸라잔, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 트리아졸, 벤조트리아졸, 프테리딘, 페녹사졸, 옥사디아졸, 벤조피라졸, 퀴놀리진, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린 및 퀴녹살린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  38. 제 33 항에 있어서,
    상기 아릴은, 페닐, 나프탈레닐, 페난트레닐, 안트라세닐, 테트랄리닐, 플루오레닐, 인데닐 및 인다닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  39. 제 33 항에 있어서,
    상기 사이클로알킬은, 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로펜타디엔, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 1,3-사이클로헥사디엔, 1,4-사이클로헥사디엔, 사이클로헵탄, 사이클로헵텐으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  40. 제 33 항에 있어서,
    R1은, 수소; C1 -6 알킬; C2 -6 알케닐; C2 -6 알키닐; C3 -8 사이클로알킬; C3 -8 헤테로사이클릴; 사이클로알킬(C1-6)알킬; 헤테로사이클릴(C1-6)알킬; 아릴; 헤테로아릴; (C1-6)알킬카보닐; (C1 -6)알콕시(C1 -6)알킬; 및 퍼할로(C1-6)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 알킬은, 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, 2 급-부틸 및 3 급-부틸로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  42. 제 40 항에 있어서,
    R1이 수소인 약제 또는 약물.
  43. 제 33 항에 있어서,
    R2가 수소; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C3-8 사이클로알킬; C3-8 헤테로사이클릴; 사이클로알킬(C1-6)알킬; 헤테로사이클릴(C1-6)알킬; 아릴; 헤테로아릴; (C1-6)알킬카보닐; (C1-6)알콕시(C1-6)알킬; 및 퍼할로(C1-6)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  44. 제 43 항에 있어서,
    알킬이 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, 2 급-부틸 및 3 급-부틸로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  45. 제 43 항에 있어서,
    R2가 수소인 약제 또는 약물.
  46. 제 33 항에 있어서,
    R3-R6이 각각 독립적으로 수소; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C3-8 사이클로알킬; C3-8 헤테로사이클릴; 사이클로알킬(C1-6)알킬; 헤테로사이클릴(C1-6)알킬; 아릴; 헤테로아릴; (C1-6)알킬카보닐; (C1-6)알콕시(C1-6)알킬; 및 퍼할로(C1-6)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 알킬은, 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, 2 급-부틸 및 3 급-부틸로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  48. 제 46 항에 있어서,
    R3-R6이 수소인 약제 또는 약물.
  49. 제 33 항에 있어서,
    R7 및 R8이 각각 독립적으로 수소 및 C1-6 알킬 중에서 선택되는 약제 또는 약물.
  50. 제 49 항에 있어서,
    R7 및 R8이 수소인 약제 또는 약물.
  51. 유효 성분으로서, 다른 유효 성분들과 함께 또는 이들 없이, HIV 복제를 억제하기에 유효한 양의 하기 화학식 B의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하는 약제 또는 약물:
    (화학식 B)
    상기 식에서,
    R1은 수소 원자, 저급 알킬 그룹, 저급 알케닐 그룹, 저급 알키닐 그룹, 벤질 그룹, 또는 알킬 그룹 또는 알킬 그룹과 방향족 그룹으로 치환된 실릴 그룹이고;
    R2는 수소 원자 또는 아미노 보호 그룹, 또는 그의 염이다.
  52. 유효 성분으로서, 다른 유효 성분들과 함께 또는 이들 없이, HIV 복제를 억제하기에 유효한 양의 하기 화학식 C의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하는 약제 또는 약물:
    (화학식 C)
  53. 유효 성분으로서, 다른 유효 성분들과 함께 또는 이들 없이, HIV 복제를 억제하기에 유효한 양의 하기 화학식 G의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하는 약제 또는 약물:
    (화학식 G)
  54. 제 33 항 및 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 약제 또는 약물을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV의 복제를 억제하는 방법.
  55. HIV의 복제를 억제하는 작용제가 필요한 환자를 식별하는 단계와;
    상기 환자에게 제 33 항 및 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 약제 또는 약물을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV의 복제를 억제하는 방법.
  56. HIV 감염의 치료가 필요한 환자를 식별하는 단계와;
    상기 환자에게 제 33 항 및 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 약제 또는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 HIV에 감염된 환자에서 HIV의 복제를 억제하는 방법.
  57. HIV에 감염된 환자에게 제 33 항 및 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 약제 또는 약물을 투여하는 단계와;
    상기 HIV 복제의 억제를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 HIV에 감염된 환자에서 HIV의 복제를 억제하는 방법.
  58. α-하이드록시글리신아미드, α-퍼옥시글리신아미드 이량체, 디글리신아미드 에테르, α-메톡시글리신아미드 또는 α-에톡시글리신아미드를 포함하는 약제.
  59. 제 58 항에 있어서,
    α-하이드록시글리신아미드를 포함하는 약제.
  60. 제 58 항에 있어서,
    α-퍼옥시글리신아미드 이량체를 포함하는 약제.
  61. 제 58 항에 있어서,
    디글리신아미드 에테르를 포함하는 약제.
  62. 제 58 항에 있어서,
    α-메톡시글리신아미드를 포함하는 약제.
  63. 제 58 항에 있어서,
    α-에톡시글리신아미드를 포함하는 약제.
  64. HIV 복제를 억제하기 위한 α-하이드록시글리신아미드의 사용방법.
  65. HIV의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 α-하이드록시글리신아미드의 사용방법.
  66. HIV 복제를 억제하기 위한 α-퍼옥시글리신아미드의 사용방법.
  67. HIV의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 α-퍼옥시글리신아미드의 사용방법.
  68. HIV 복제를 억제하기 위한 디글리신아미드 에테르의 사용방법.
  69. HIV의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 디글리신아미드 에테르의 사용방법.
  70. HIV 복제를 억제하기 위한 α-메톡시글리신아미드의 사용방법.
  71. HIV의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 α-메톡시글리신아미드의 사용방법.
  72. HIV 복제를 억제하기 위한 α-에톡시글리신아미드의 사용방법.
  73. HIV의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 α-에톡시글리신아미드의 사용방법.
  74. 유효 성분으로서, 다른 유효 성분들과 함께 또는 이들 없이, HIV 복제를 억제하기에 유효한 양의 하기 화학식 E의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하는 약제 또는 약물:
    (화학식 E)
  75. 유효 성분으로서, 다른 유효 성분들과 함께 또는 이들 없이, HIV 복제를 억제하기에 유효한 양의 하기 화학식 F의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르를 포함하는 약제 또는 약물:
    (화학식 F)
  76. 제 74 항 또는 제 75 항의 약제를 제공함을 포함하는, HIV의 복제를 억제하는 방법.
  77. HIV의 복제를 억제하는 작용제가 필요한 환자를 식별하는 단계와;
    상기 환자에게 제 74 항 또는 제 75 항의 약제를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV의 복제를 억제하는 방법.
  78. HIV 감염의 치료가 필요한 환자를 식별하는 단계와;
    상기 환자에게 제 74 항 또는 제 75 항의 약제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 HIV에 감염된 환자에서 HIV의 복제를 억제하는 방법.
  79. HIV에 감염된 환자에게 제 74 항 또는 제 75 항의 약제를 투여하는 단계와;
    상기 HIV 복제의 억제를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 HIV에 감염된 환자에서 HIV의 복제를 억제하는 방법.
  80. 글리옥실산 모노하이드레이트를 메탄올 중에서 반응시킴으로써 메틸 글리옥실레이트 헤미아세탈을 제조하는 단계와;
    상기 메틸 글리옥실레이트 헤미아세탈을 3 급 부틸 카바메이트와 반응시켜 메틸 N-3 급 부톡시카보닐-α-하이드록시글리시네이트를 수득하는 단계와
    상기 메틸 N-3 급 부톡시카보닐-α-하이드록시글리시네이트를 암모니아와 반응시켜 N-3 급 부톡시카보닐-α-하이드록시글리신아미드를 수득하고; 상기 N-3 급 부톡시카보닐-α-하이드록시글리신아미드를 염산 및 디옥산 중에서 반응시켜 α-하이드록시글리신아미드 하이드로클로라이드를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, α-하이드록시글리신아미드 하이드로클로라이드의 제조 방법.
  81. 글리옥실산 모노하이드레이트와 9H-플루오렌-9-일메틸 카바메이트를 반응시켜 메틸 N-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐)-α-메톡시글리시네이트를 제조하는 단계와;
    상기 메틸 N-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐)-α-메톡시글리시네이트를 암모니아 및 모르폴린과 반응시켜 α-메톡시글리신아미드를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, α-메톡시글리신아미드의 제조 방법.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050096319A1 (en) * 2003-02-21 2005-05-05 Balzarini Jan M.R. Identification of compounds that inhibit replication of human immunodeficiency virus
EP1603546A1 (en) * 2003-02-21 2005-12-14 Tripep AB Glycinamide derivative for inhibiting hiv replication
GB0310593D0 (en) * 2003-05-08 2003-06-11 Leuven K U Res & Dev Peptidic prodrugs
TWI457136B (zh) 2005-04-04 2014-10-21 Tibotec Pharm Ltd Ｈｉｖ-感染之預防
WO2013036676A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 New York Blood Center, Inc. Hiv inhibitors
CA2853024C (en) 2011-11-11 2017-08-22 Pfizer Inc. 2-thiopyrimidinones
US10137107B2 (en) 2014-09-19 2018-11-27 New York Blood Center, Inc. Substituted phenylpyrrolecarboxamides with therapeutic activity in HIV
CN104402821A (zh) * 2014-12-04 2015-03-11 贾正平 具有抗缺氧损伤活性的氮氧自由基类化合物及其制备和应用
BR112017022340A2 (pt) 2015-05-05 2018-07-10 Pfizer 2-tiopirimidinonas

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US91086A (en) * 1869-06-08 Improved furniture-caster
US232804A (en) * 1880-10-05 Alonzo t
US166694A (en) * 1875-08-17 Improvement in horse hay-forks
US1063727A (en) * 1912-07-31 1913-06-03 William J Pierce Bed-caster.
GB1160955A (en) * 1965-10-11 1969-08-13 Agfa Gevaert Nv New Light-Developable Photographic Material and Recording Process
US4215112A (en) * 1979-03-14 1980-07-29 Ortho Pharmaceutical Corporation Tripeptides and methods
US4658013A (en) * 1981-07-28 1987-04-14 Sterling Drug Inc. Analgesic and/or opiate antagonist tripeptide amides and processes for preparation and compositions thereof
CS231228B1 (en) * 1982-10-01 1984-10-15 Evzen Kasafirek Biologically effective tri and tetrapeptide alkylamide derivatives and their processing method
JPS60243017A (ja) * 1984-05-16 1985-12-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗けいれん組成物
US4818540A (en) * 1985-02-25 1989-04-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal fertility control system and process
US4612337A (en) * 1985-05-30 1986-09-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for preparing infection-resistant materials
US4833148A (en) * 1987-04-09 1989-05-23 Washington University Method of using alkenyl- or alkynyl-substituted thiobarbiturates to reduce neurotoxic injury
US4857538A (en) * 1987-11-30 1989-08-15 The Research Foundation Of State University Of New York New compounds for the study and treatment of microfilament organization in cells
US4950647A (en) * 1988-10-04 1990-08-21 Nucleic Acid Research Institute T cell immunopotentiator
US5336758A (en) * 1990-03-09 1994-08-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Peptides stimulating cytotoxic T cells immune to HIV RT
DE4014655A1 (de) * 1990-05-08 1991-11-14 Behringwerke Ag Peptidamide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende mittel als fibrin/thrombin-gerinnungsinhibitoren
US5627035A (en) * 1990-08-22 1997-05-06 Syntello Vaccine Development Ab Peptides that block human immunodeficiency virus and methods of use thereof
US5346989A (en) * 1990-08-22 1994-09-13 Syntello Vaccine Development Kb Peptides for use in induction of T cell activation against HIV-1
BR9105902A (pt) * 1990-09-11 1994-06-28 Seikagaku Kogyo Co Ltd Novo polipeptídeo
GB9024129D0 (en) * 1990-11-06 1990-12-19 Thrombosis Research Trust Inhibitors and substrates of thrombin
HUT61036A (en) * 1991-05-02 1992-11-30 Seikagaku Kogyo Co Ltd Process for producing new polypeptides capable of linking to lipopolysaccharides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredients
JP3266311B2 (ja) * 1991-05-02 2002-03-18 生化学工業株式会社 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤
EP0584238A1 (en) * 1991-05-17 1994-03-02 Chiron Corporation INHIBITOR OF NF-$g(k)B TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR AND USES THEREOF
JPH0597789A (ja) * 1991-10-03 1993-04-20 Nippon Chibagaigii Kk α−ヒドロキシグリシンアミド誘導体及びその製造方法
AU682340B2 (en) * 1993-01-28 1997-10-02 Regents Of The University Of California, The TATA-binding protein associated factors, nucleic acids encoding TAFs, and methods of use
US5856122A (en) * 1993-08-24 1999-01-05 University Of Alberta Modification of pertussis toxin
FR2710340B1 (fr) * 1993-09-22 1995-12-15 D Hinterland Lucien Dussourd Dérivés peptidiques de l'alpha-MSH et leur application .
US5470951A (en) * 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
EP0677061B1 (en) * 1993-10-14 1999-03-03 Seikagaku Corporation Polypeptides and anti-hiv agents prepared therefrom
US5744368A (en) * 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
DE4431317A1 (de) * 1994-09-02 1996-03-07 Biotechnolog Forschung Gmbh Schutz- bzw. Ankergruppen und deren Verwendung
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
ES2175083T3 (es) * 1995-03-14 2002-11-16 Praecis Pharm Inc Moduladores de la agregacion de amiloides.
US5770620A (en) * 1995-06-19 1998-06-23 Ontogen Corporation Aryl acrylic acid derivatives useful as protein tyrosine phosphatase inhibitors
CA2179935C (en) * 1995-06-30 2010-09-07 Ryohei Kato Novel dipeptide compound or pharmaceutically acceptable salt thereof and medical use thereof
US5872210A (en) * 1995-10-05 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transframe peptide inhibitor of viral protease
US5830910A (en) * 1995-10-23 1998-11-03 University Of Kentucky Research Foundation Cytochalasins useful in providing protection against nerve cell injury associated with neurodegenerative disorders
US5843904A (en) * 1995-12-20 1998-12-01 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1βconverting enzyme
CA2250075C (en) * 1996-03-29 2008-06-10 The Trustees Of Boston University Methods for diagnosing and treating alzheimer's disease
US5886025A (en) * 1997-03-06 1999-03-23 Baylor University Anti-mitotic agents which inhibit tubulin polymerization
US5843995A (en) * 1997-07-07 1998-12-01 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of HIV-1 replication using oligocarbamate derivatives
US6184210B1 (en) * 1997-10-10 2001-02-06 Cytovia, Inc. Dipeptide apoptosis inhibitors and the use thereof
US6258932B1 (en) * 1999-08-09 2001-07-10 Tripep Ab Peptides that block viral infectivity and methods of use thereof
DE10027025A1 (de) * 2000-05-31 2001-12-06 Merck Patent Gmbh Clycinamide
US6455670B1 (en) * 2001-09-06 2002-09-24 Tripep Ab Pentamer peptide amide, ALGPG-NH2, that inhibits viral infectivity and methods of use thereof
WO2003024995A1 (en) * 2001-09-19 2003-03-27 Tripep Ab Molecules that block viral infectivity and methods of use thereof
AU2002350217A1 (en) * 2001-12-04 2003-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Glycinamides as factor xa inhibitors
EP1603546A1 (en) * 2003-02-21 2005-12-14 Tripep AB Glycinamide derivative for inhibiting hiv replication
US20050096319A1 (en) * 2003-02-21 2005-05-05 Balzarini Jan M.R. Identification of compounds that inhibit replication of human immunodeficiency virus

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