KR0122432B1

KR0122432B1 - 항 에이즈(aids) 효과를 갖는 비가역적 인간 면역 결핍 바이러스(hiv) 프로테아제 저해제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0122432B1
Application number: KR1019940013422A
Authority: KR
Inventors: 김성천; 손영찬; 최호일; 윤홍식; 박지효; 최낙현; 이창선; 고종성
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1997-11-24
Also published as: KR960000877A

Abstract

본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제 저해제 및 그의 제조방법, 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는, HIV 감염으로 발생되는 후천성 면역 결핍증의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

상기 식에서, A 및 B는 명세서중에서 정의한 바와 같다.

Description

항 에이즈(AIDS) 효과를 갖는 비가역적 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제 저해제 및 그의 제조방법

본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제를 억제하는 신규 화합물과 그의 제조방법, 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는, HIV 감염으로 발생되는 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

HIV는 유전 정보를 RNA 형태로 간직하는 레트로바이러스이다. 이 바이러스의 구조는 가장 내부에 유전정보인 RNA와 이 RNA로부터 거꾸로 DNA를 만들어 낼 수 있는 역전사효소(reverse transcriptase)가 존재하고, 이 RNA와 역전사효소는 껍질 단백질에 의해 둘러싸여 있으며, 그 바깥쪽에는 지질막이 보호막을 형성하고 있다. 이 지질막에서는 gp-120과 gp-40으로 불리우는 당단백질이 박혀 있는데, 이 gp-120이 바이러스가 T-세포를 인식하여 침투하는데 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

바이러스의 작용 기전이 복잡성을 띨수록 그에 대한 퇴치방법개발의 가능성이 높아지게 되는데, HIV의 경우도 여러 바이러스중 가장 복잡한 형태의 복제 메카니즘을 갖고 있기 때문에 여러 형태의 치료제가 개발되었다. 현재까지 가장 잘 알려진 치료제는 역전사효소 억제제이다. 역전사효소는 RNA로부터 DNA를 복제하는 효소로서, 이러한 특이성 때문에 RNA 바이러스, 즉 레트로 바이러스에서만 존재하는 효소이다. 이렇게 레트로 바이러스에만 존재한다는 점 때문에 이들 역전사효소를 억제하는 화합물이 부작용을 최소화시키면서 HIV를 무력화시킬 수 있을 것으로 기대되었으며, 이에 따라 많은 역전사효소 억제제가 개발되었다. 보로-웰컴사의 아지도티미딘(azidothymidine(AZT))과 브리스톨-마이어스 스큅사의 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 그리고 호프만 라 로슈사의 2',3'-디데옥시시토신(DDC) 및 글락소사의 D4T등이 이에 해당된다. 그러나 현재 이용되고 있는 이들 화합물들은 대부분 세포의 감염만 막아줄 뿐 이미 감염된 세포내에서의 바이러스 복제는 막지 못하기 때문에 질병을 완전히 치료하기 보다는 생명연장효과 정도만 있을 뿐이며, 혈소판 수의 감소, 골수혈구 감소 등의 부작용을 야기시키고, 이들 화합물에 내성이 생긴 바이러스도 많이 발견되고 있다.

중요한 또 다른 치료제는 HIV 프로테아제 억제제이다. HIV는 껍질 단백질과 필요한 효소를 만들 때 이들을 mRNA로부터 각각 합성해 내는 것이 아니고, 일단 껍집 단백질과 효소 등이 다 함께 결합되어 있는 긴 형태의 프로프로테인(proprotein)인 gag-단백질(P55) 또는 gag-pol 단백질(P165)을 먼저 만든 다음이 프로프로테인이 자신안에 있는 프로테아제에 의하여 껍질 단백질과 역전사효소, 인테그라제 등의 바이러스 형성에 필요한 효소들로 분해되게 된다. 이 분해 과정을 담당하는 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되게 되며, 프로테아제 억제제는 이러한 원리에 기초한 것이다. HIV 프로테아제는 99개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 두개의 똑같은 단위체가 이량체로 존재하고 있고, 각 단위체의 분자량은 10793이다. HIV 프로테아제는 반응 부위에 아스파르테이트-트레오닌-글리신의 배열을 갖는 전형적인 아스파르틱 프로테아제이다.

HIV 프로테아제 억제제의 개발은 다른 종류의 아스파르틱 프로테아제(특히 레닌)의 억제제 개발 동향에 따르고 있다.

그 기본적인 접근 방식은 효소의 전이상태(transition state)와 유사한 화합물(transition state analogue,TSA)을 개발하여 효소의 친화도를 높이므로써 효소에 대한 결합력을 높이는데 있다. 이러한 방식으로 개발한 HIV 프로테아제 억제제는 여러 문헌에 개시되어 있다. (Robert, et al., Science 248, 358(1990); 유럽 특허출원 공고 제0337714호; 제0346847호; 제356223호; 제352000호; 제357332호; 제362002호; 및 제361341호; Bone et al., JACS 113, 9382(1991)).

그러나, 이러한 공지의 HIV 프로테아제 억제제들은 모두 효소의 친화도를 높인 가역적 억제제이다.

이에, 본 발명자들은 전술한 전이상태를 모방한 가역적인 억제제보다 강력한 억제효과를 얻기 위하여, 전이상태와는 달리 시스-에폭사이드 그룹을 도입한 비가역적인 억제제를 개발한 바 있으며(본 출원인에 의해 1993년 6월 14일자로 출원된 대한민국 특허출원 제93-10811호 참조) 본 발명에 이르러, 시스-에폭사이드 구조에 L-아미노산이 아닌 D-아미노산으로부터 제조된 작용화된 아민 유도체를 C-말단에 도입하므로써 보다 강력한 항에이즈 효과를 갖는 신규 화합물을 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 비가역적으로 인간 면역 결핍 바이러스 프로테아제를 억제하는 신규 화합물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 후천성 면역결핍증 또는 HIV 감염의 예방 또는 치료에 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따라서, 작용화된 아민 유도체가 도입된 시스-에폭사이드 구조를 갖는 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물이 제공된다 :

상기 식에서, A는 하기 일반식(Ⅱa) 또는 (Ⅱb)의 작용화된 아실이고,

(상기에서, R₂는 저급 알킬 및 아미드로 치환된 저급 알킬중에서 선택되고, R₃는 저급 알킬시, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알콕시 및 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼중에서 선택되며, R₄및 R₅는 각각 독립적으로 수소 및 저급 알킬중에서 선택되고, n은 0 또는 1이다), B는 하기 일반식(Ⅲa) 또는 (Ⅲb)의 그룹이다 :

(상기에서, R₆은 아미노산 잔기 및 저급 알킬중에서 선택되고, R₇은 저급 알킬, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬, 저급 알킬시 및 방향족 라디칼중에서 선택되며, R₈은 저급 알킬, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬 및 방향족 라디칼중에서 선택된다).

본 명세서에서 사용된 용어 저급알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미하며, 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼은 모노 또는 디사이클릭 방향족 라디칼에 1 내지 2개의 질소원자가 포함되어 있는 것으로, 예를 들면 피리딘 및 퀴놀린을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 아미노산에 관한 약어들은 아미노산 및 펩타이드에 대한 생화학적 명명법에 관한 IUPAC-IUB 합동회의에 따른 것이다[Eur. J. Biochem. 1984, 158, 9-31].

본 발명에 따른 화합물들은 또한 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 화합물, 부분 입체이성체 혼합물 및 개개의 부분 입체이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 형태의 이성체는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 바람직한 화합물은 A가 2-퀴놀린카보닐-아스파라지닐 또는 N-벤질옥시카보닐-(β-메탄설포닐)발리닐이고, B가 (4R)-5-메틸-3-온-4-헥실아미노인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.

본 발명에 따른 바람직한 부류의 화합물의 대표적인 예는 다음과 같다 :

본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물은 하기 반응식 1에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

상기 식들에서, A 및 B는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 반응식 1에 따르면 상기 일반식(가)의 화합물을 상기 일반식(나)의 화합물과 커플링 반응시켜서 상기 일반식(다)의 화합물을 얻은 다음, 이 화합물을 에폭사이드화 반응시켜서 일반식(라)의 화합물을 얻는다. 다음에는 화합물(라)로부터 벤질옥시카보닐 보호그룹을 제거한 뒤 상기 일반식(마)의 화합물과 커플링 반응시켜 목적하는 일반식(Ⅰ)의 화합물을 얻는다.

상기 에폭사이드화 반응은 메타클로로퍼벤조산을 사용하여 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.

또한, 상기 커플링 반응에는 커플링 시약으로서 예를 들면, 디사이클로 헥실 카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산 클로라이드(BOP-Cl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA)등을 사용할 수 있으며, 이들로만 한정되는 것이 아니다. 달리, 일반식(가)의 카복실산을 산 할라이드 또는 기타 활성 에스테르 유도체로 전환시킨 후 커플링 반응시킬 수도 있다. 상기 산 할라이드 유도체로는 산 클로라이드가 포함되며, 활성 에스테르 유도체는 아민과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하게 하거나 알콜과의 커플링 반응에 의해 에스테르 결합을 형성하도록 하기 위해 카복실산 그룹을 활성화시키는데 통상적으로 사용되는 것들로서, 예를 들면, 메톡시카보닐클로라이드, 이소부톡시카보닐 클로라이드 등과 같은 알킬시 카보닐하라이드와, 커플링 시약으로부터 유도된 카복실산 무수물, N-하이드록시벤조트리아졸 유도된 에스테르, N-하이드록시프탈이미드 유도된 에스테르, N-하이드록시숙신이미드 유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2',3'-디카복스이미드 유도된 에스테르, 2,4,5-트리클로로페놀 유도된 에스테르 등이 포함되나, 이들로만 제한되는 것은 아니다.

벤질옥시카보닐 이탈 반응 역시 통상의 방법으로, 예를 들면 Pd/C 촉매 존재하에서 수소가압하에 반응시켜 제거할 수 있다.

한편, 일반식(가)의 화합물은 하기 반응식 2에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다.

상기 식들에서, X는 할로겐원자, 예를 들면 Br 또는 I이다.

상기 반응식 2는 시스-β,γ-올레핀 산의 제조방법으로서는 논문[Keinan et al., Tetrahedron 47, 4631-4638(1991); and Corey ＆ Shimaji, J. Am. Chem. S oc. 105, 1662-1664(1983)]에 기술되어 있는 방법에 의거한 공정이다. 목적하는 일반식(가)의 화합물을 합성하기 위해, 상기 논문에 기재된 방법에 따라 K₂CO₃를 사용하여 일반식(사)의 L-N-벤질옥시카보닐-페닐알라닌알과의 비티그 반응에 의해 상기 일반식(가)의 시스-β,γ-올레핀을 제조할 경우 70 내지 80℃의 고온에서 반응시켜야 하므로 페닐알라닌알쪽에 라세미화가 일어나게 된다. 본 발명에서는 칼륨 헥사메틸디실라잔(KHMDS)을 염기로 사용하여 -78℃에서 반응을 시키므로써 라세미화를 막을 수 있었다. 또한, 상기 논문에 기재된 방법에 따라 상기 일반식(아)의 오르토에스테르를 산처리하여 상기 일반식(자)의 화합물을 만든 후 염기 처리하여 보호 그룹을 제거하는 경우에는 β,γ-올레핀산에서 α,β-올레핀산으로 50% 이상 전환되어 목적 화합물의 수율이 매우 낮아질 뿐 아니라 이의 분리에도 어려움이 따르기 때문에, 본 발명에서는 일반식(아) 화합물의 오르토에스테르를 산촉매의 존재하에 t-부탄올을 용매로 하여 용매의 환류온도로 가열 교반하므로써 α,β-올레핀산으로 전환되지 않은 화합물(가)를 80 내지 90% 수율로 얻을 수 있다.

본 발명에서 일반식(Ⅲa) 또는(Ⅲb)의 그룹을 제공하는 작용화된 아민은 하기 반응식(3) 및 (4)에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

상기 반응식 3은 문헌[Weinreb et al., Tetrahedron Lett. 22, 3815(1981)]에 기술된 방법에 따라 D-발린으로부터 제조된 N,O-디메틸아미드를 그리나르 반응 및 환원 반응에 의해 원하는 일반식(Ⅲa)의 알콜을 포함하는 작용화된 아민을 제조하는 과정이다.

하기 반응식 4는 상기와 같이 N,O-디메틸아미드로부터 그리나르 반응 및 탈보호 반응에 의해 원하는 일반식(Ⅲb)의 케톤을 포함하는 작용화된 아민의 제조과정을 나타낸다.

하기 반응식 5는 작용화된 아민을 보호 그룹으로 보호하는 공정을 나타낸 것으로, 치환된 시스테인의 티올그룹을 염기하에서 알킬화시킨 후 벤질옥시 카보닐 그룹으로 아민을 보호시킬 수 있다.

본 발명의 화합물은 숙주에게 부여될 총 일일용량이 체중 1kg당 100내지 600mg으로서, 한번에 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있으며, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를 들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 수화제 또는 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 용매에는 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에탄올 등이 있다.

경구투여용 고체 투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제 ,산제 및 입제가 가능하지만, 화합물 특성을 고려할 때 캅셀제가 특히 바람직하며, 정제로 할 경우에는 장피제로 제조하는 것이 유용하다. 고체 투여 형태에는 활성 화합물을 수크로오즈, 락토오즈 또는 스타치와 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 희석제외의 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 하나이상의 다른 항 AIDS제, 면역조절제 등과 병행하여 투여할 수도 있다.

HIV 감염의 치료 및 예방을 위한 본 발명의 화합물의 제제는 상술한 것으로 제한되는 것이 아니며, HIV 감염의 치료 및 예방에 필요한 본 발명의 화합물의 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

이와 같은 본 발명을 제조예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 하기의 실시예는 본 발명에 따른 신규 화합물의 제조 방법에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[제조예 1]

단계 1 : (S)-2-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-1-페닐-3-메틸-1-부탄온의 제조

N-벤질옥시카보닐-N'-메톡시-N'-메틸-D-발린아미드 2.94g(10밀리몰)을 40ml의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시킨 후 20ml(40밀리몰)의 2M 페닐마그네슘 클로라이드 테트라하이드로푸란 용액을 0℃에서 가하였다. 12시간 후에, 물을 0℃에서 가하여 반응을 종결시킨 후 용매를 감압증류하여 제거한 다음, 메틸렌 클로라이드 200ml를 가하여 희석하고 암모늄 클로라이드 용액(3×200ml)으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 감압증류한 다음 컬럼크로마토그래피를 실시하여 (헥산 : 에틸아세테이트=9 : 1) 표제 화합물 2.61g(수율 84%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.74(d,3H), 1.04(d,3H), 2.18(m,1H), 5.12(s,2H), 5.33(m,1H), 5.84(d,1H), 7.15-7.59(m,10H)

단계 2 : (1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-2-아미노-3-메틸 부탄의 제조

상기 단계(1)의 생성물 1.56g(5밀리몰)을 30ml의 메탄올에 용해시킨 후 10% Pd/C을 10%의 중량비로 혼합하여 수소 조건(고무풍선)에서 36시간동안 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트에 통과시켜 무기촉매를 제거한 후 용매를 감압증류하여 표제 화합물 0.78g(수율 87%)를 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.86(d,3H), 0.94(d,3H), 1.74(m,1H), 2.76(dd,1H), 4.59(d,1H), 7.08-7.14(m,5H)

[제조예 2]

단계 1 : (R)-4-아미노-5-메틸-3-헥산온의 제조

N-t-부톡시카보닐-N'-메톡시-N'-메틸-D-발린아미드 2.46g(10밀리몰)을 40ml의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시킨 후 15ml(30밀리몰)의 2M 페닐마그네슘 브로마이드 테트라하이드로푸란 용액을 0℃에서 가하였다. 12시간후에 물을 0℃에서 가하여 반응을 종결시킨 후 용매를 감압증류하여 제거한 다음, 메틸렌 클로라이드 200ml를 가하여 희석하고 암모늄 클로라이드 용액(3×200ml)으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 감압증류한 다음 컬럼크로마토그래피를 실시하여(헥산 : 에틸아세테이트=9 : 1)표제 화합물 1.69g(수율 74%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.89(d,3H), 0.99(d,3H), 1.11(t,3H), 1.43(s,9H), 2.13(m,1H), 2.46(m,2H), 4.13(m,1H), 5.11(d,1H)

단계 2 : (R)-4-아미노-5-메틸-3-헥산온의 제조

상기 생성물을 디클로로메탄 50ml에 용해시킨 후 50ml의 트리플루오로아세트산을 가한 다음 상온에서 12시간동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거하고 1.81g(수율 95%)의 표제 화합물을 트리플루오로아세트산의 염으로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃+D₂O)δ 0.96(d,3H), 1.09-1.14(m,6H), 2.29-2.38(m,3H), 4.11(m,1H)

[제조예 3]

단계 1 : N-벤질옥시카보닐-β-(S-메틸)-L-발린의 제조

β-머캅토-L-발린 8.9g(0.06몰)을 디옥산 120ml와 물 40ml의 혼합물에 첨가하고, 0℃로 냉각시킨 다음 6N 수산화나트륨 수용액 20ml을 첨가해 용해시킨다. 이 용액에 요오드메탄 9.24g(0.066몰)을 가하고 플라스크의 마개를 막은 다음 0℃에서 3시간 및 이어서 상온에서 2시간동안 반응시킨다. 상기 메틸화 반응물을 0℃로 냉각시키고 6N 수산화나트륨 수용액 15ml와 벤질클로로포르메이트 10.20g(0.09몰)을 천천히 가했다. 반응물을 0℃에서 1시간 및 이어서 상온에서 2시간 교반한 후 반응을 종결하였다. 반응종결 후 용매를 감압증류하여 제거한 후 미반응 벤질클로로포르메이트를 제거하기 위해 20ml의 물과 에테르를 첨가한 후 유기층을 제거한다. 수용액층에 에틸 아세테이트 60ml를 첨가하고 6N 염산으로 pH를 3이하로 낮춘다. 유기층을 분리한 후 무수 MgSO₄상에서 건조시키고, 용매를 감압증류하고 표제 화합물 14.25g(수율 80%)을 얻었다.

¹H NMR(CD₃OH)δ 1.2(s,6H), 2.1(s,3H), 4.3(d,1H), 5.1(s,2H), 7.1(m,5H)

단계 2 : N-벤질옥시카보닐-β-메탄설포닐-L-발린의 제조

30ml의 메탄올에 제조예 3, 단계(1)의 생성물 2.97g(0.01몰)을 용해시킨 후 생성된 용액을 냉각시킨다. 상기 메탄올 용액에 옥손 18.42g(0.03몰)을 가하여 3시간동안 반응시킨다. 반응 종료후 용매를 감압증류하여 제거한 다음 에틸아세테이트 60ml와 물 20ml를 가한다. 유기층을 분리한 후 무수 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 감압증류하여 표제 화합물 2.73g(수율 83%)을 얻었다.

¹H NMR(DMSO)δ 2.8(s,3H), 3.4(m,2H), 4.6(m,1H), 5.1(s,2H), 5.3(d,1H), 7.2(m,5H), 8.6(br,1H)

[제조예 4]

단계 1 : 5-L-(N-벤질옥시카보닐)아미노-6-페닐-헥스-3-(시스)-엔일-4'-메틸-2',6',7',-트리옥사-비사이클로[2',2',2']옥세탄의 제조

케이난 등의 방법(Keinan et al., Tetrahedron 26, 4631-4638(1991))에 따라 합성된 1-(2-트리페닐포스포늄-메틸)-4'-메틸-2',6',7'-트리옥사-비사이클로[2',2',2']옥세탄 브로마이드 60.89g(0.12몰)을 400ml의 테트라하이드로푸란에 용해시키고 -78℃에서 교반한 후 220ml(0.11몰)의 칼륨 헥사메틸 디실라잔 0.5M용액을 가하여 1시간동안 -78℃에서 교반한다. L-(N-벤질옥시카보닐)페닐알라닌알 30g(0.106몰)을 테트라하이드로푸란 150㎖에 용해시켜 -78℃에서 유지시킨 후 상기 용액에 20분에 걸쳐서 천천히 가한 후 -78℃에서 1시간 및 이어서 상온에서 1시간 교반하고 물을 가하여 반응을 종결시킨다. 반응 용매를 제거한 후 에틸아세테이트에 용해시키고 NaHCO₃포화용액과 물로 세척하고, 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시키고 컬럼크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 : 트리에틸아민=70 : 30 : 5)를 실시하여 36.5g(84% 수율)의 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.8(s,3H), 2.2-3.0(m,4H), 3.9(s,6H), 4.6(m,1H), 4.8(br,1H), 5.05(s,2H), 5.4-5.6(m,2H), 7.1-7.5(m,10H)

[a]_D=+25.2(C=0.50, 메탄올)

단계 2 : (S)-5-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-6-페닐-헥스-3-(시스)-엔-1-카본산의 제조

제조예 3의 단계(1)에서 얻은 화합물 2.5g(6밀리몰)을 1% 미만의 진한 염산을 포함하는 t-부탄올과 물의 혼합용액에 용해시켜 반응용매의 환류온도에서 약 20시간 교반한 뒤, 반응용매를 증류 감압하여 제거하고 K₂CO₃용액을 가하여 pH를 9 이상으로 조정하고 에틸아세테이트로 세척하였다. 수용액층을 pH 2로 맞춘 다음 에틸아세테이트로 추출하여 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 유기 용매를 제거하여 1.62g(80% 수율)의 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 2.7-3.3(m,4H), 4.6(m,1H), 4.8(br,1H), 5.05(s,2H), 5.4(t,1H), 5.6(m,1H), 7.1-7.5(m,10H)

Mass(FAB,m/e) 340(M+1)

[실시예 1]

[[(5S)-[N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라지닐]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일]-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드의 제조

단계 1 : [(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-3-(시스)-엔-6-페닐-1-헥사노일]-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드의 제조

0.33g(1밀리몰)의 제조예 4에서 얻어진 생성물에 각각 1.5당량의 EDC, HOBT 및 트리에틸아민을 혼합한 후 20ml의 디메틸포름아미드에 용해시킨 다음 제조예 1에서 얻어진 생성물 0.179g(1밀리몰)을 0℃에서 가하고 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거한 후 에틸아세테이트에 용해시키고 1N염산과 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 감압증류하여 제거한 후 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트 : 헥산=1 : 1)를 표제 화합물 0.44g(수율 87.5%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.95(d,3H), 1.03(d,3H), 1.61(br,1H), 1.74(m,1H), 2.54(m,1H), 2.77(m,2H), 3.32(m,1H), 4.03(m,1H), 4.49-4.62(m,2H), 4.91(s,2H), 4.95(br,1H), 5.32(m,1H), 5.43(m,1H), 6.74(d,1H), 7.04-7.37(m,15H)

단계 2 : [(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일]-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드의 제조

상기 단계 1의 생성물 350mg(0.7밀리몰)을 20ml의 디클로로메탄에 용해시키고 3당량의 메타클로로퍼옥시벤조산을 가한 후 상온에서 24시간동안 교반하였다. 30ml의 10% Na₂S₂O₃용액을 첨가하고 30분간 교반한 후 유기층을 NaHCO₃포화 용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 유기 용매를 제거하여 표제 화합물 295mg(수율 82%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.88(d,3H), 0.95(d,3H), 1.29(s,1H), 1.72(m,1H), 2.62-3.29(m,6H), 3.71(m,1H), 4.10(m,1H), 4.81(d,1H), 5.05(d,2H), 5.16(d,1H), 5.95(d,1H), 7.05-7.39(m,15H)

단계 3: [[(5S)-[N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라지닐]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일]-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드의 제조

상기 단계 2의 생성물 257mg(0.5밀리몰)을 20ml의 메탄올에 용해시킨 후 10% Pd/C 10중량%를 혼합하여 수소(풍선) 조건에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트에 통과시켜 무기촉매를 제거한 후 반응용매를 감압증류하여 제거하였다. 144mg(0.5밀리몰)의 N-(2-퀴놀린카보닐)아스파라진, 각각 1.5당량의 EDC, HOBT 및 트리에틸아민을 10ml의 디메틸포름아미드에 용해시킨 다음 상기에서 얻은 아민을 0℃에서 첨가하고 상온에서 3시간동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거한 후 에틸아세테이트에 용해시키고 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 유기 용매를 감압증류하여 제거한 후 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄 : 메탄올=20 : 1)를 실시하여 표제 화합물 153mg(수율 47%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.86(d,3H), 0.95(d,3H), 1.74(m,1H), 1.81(s,1H), 2.54-3.12(m,7H), 3.31(m,2H), 4.05-4.17(m,2H), 4.82(d,1H), 4.99(m,1H), 5.56(br,1H), 5.69(d,1H), 6.13(br,1H), 6.54(d,1H), 7.08-8.35(m,16H), 9.28(d,1H)

[실시예 2]

[(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)-β-메탄설포닐-L-발리닐]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일]-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드의 제조

상기 실시예 1, 단계 2의 생성물 2.57g(5밀리몰)을 50ml 메탄올에 용해시킨 후 10% Pd/C 10중량%를 혼합하여 수소(풍선)조건에서 3시간동안 교반하였다. 반응용액을 셀라이트에 통과시켜 무기촉매를 제거한 후 반응용매를 감압증류하여 제거하였다. 1.49g(5밀리몰)의 제조예 3, 단계 2의 표제 화합물, 각각 1.5당량의 EDC, HOBT 및 트리에틸아민을 50ml의 디메틸포름아미드에 용해시킨 다음 상기에서 얻은 아민올 0℃에서 가한 후 상온에서 3시간동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거한 후 디클로로메탄에 용해시키고 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 감압증류하여 제거한 후, 20ml의 디클로로메탄과 5당량의 메타클로로퍼옥시벤조산을 넣고 상온에서 2시간동안 교반하였다. 10% Na₂S₂O₃용액을 가하고 30분간 교반한 후 유기층을 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 유기용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피를 실시하여(헥산 : 에틸아세테이트=3 : 7) 표제화합물 1.80g(수율 52%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)δ 0.86(d,3H), 0.95(d,3H), 1.74(m,1H), 1.81(s,1H), 2.54-3.12(m,7H), 3.31(m,1H), 4.05-4.17(m,2H), 4.82(d,1H), 4.99(m,1H), 5.56(br,1H), 5.69(d,1H), 6.13(br,1H), 6.54(d,1H), 7.08-8.35(m,16H), 9.28(d,1H)

FAB MS(M+1) 694

[실시예 3 내지 7]

실시예 1과 유사한 방법으로 반응을 실시하여 하기 표 1에 열거한 화합물들을 수득하였다.

HIV 프로테아제의 억제 효능분석

본 발명의 화합물들의 HIV 프로테아제에 대한 억제 효능을 확인하기 위해 하기의 방법을 사용하였다.

먼저 반응기질이 없는 상태에서 상기 효소와 본 발명의 실시예 1 내지 7에서 제조된 화합물을 섞은 뒤(배양전 용액), 반응용액의 일부를 취하여 과량의 반응기질이 있는 용액(분석 용액)에 가하여 효소 활성의 감소정도를 남아있는 활성의 정도로서 측정하였다. 배양전 용액은 50mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM 에틸 디아민 테트라 아세테이트(EDTA), 0.75M 황산 암모늄, 0.1% NP 40과 여러 농도의 실시예 1 내지 7의 화합물이 포함되어 있다. 억제 반응은 2.6mM의 HIV-1 프로테아제를 가하므로서 개시하였다. 일정시간마다 10㎕를 취하여, 상기와 동일한 완충용액에 100μM의 반응기질이 포함되어 있는 80㎕의 용액에 가하여 남아있는 효소 활성을 검정하였다. 이때, 반응기질로는 H-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-(p-니트로)-Phe-Glu-ala-Nle-Ser-NH의 11개 아미노산으로 이루어진 올리고펩타이드를 사용하였으며, 이 기질은 HIV 프로테아제에 의해 (p-니트로)-Phe과 Leu 사이의 아미드 결합이 끊어지게 된다. 반응속도는 (p-니트로)-Phe의 280nm에서의 강한 흡광도를 이용하여, 반응전의 기질과 반응후의 생성물을 HPLC로 분리하여 생성물의 상대적 양을 측정하므로서 결정하였다. 시간에 따른 효소활성의 감소량을 구하고 감소량의 자연로그값(1n)을 시간에 대하여 그래프로 나타냄으로써 그래프의 기울기로부터 k를 구하였다. 억제상수는 하기 식에 의해 구하였다.

억제 효능이 뛰어나서 억제제의 농도를 효소의 농도보다 월등히 높은 조건(정상상태 속도)에서 실험할 수 없는 경우에는 상기 식을 사용하지 않았다. 0.1의 프로테아제 농도에서 1당량의 본 발명의 화합물과 충분한 시간(30분) 반응시킨 후 잔류 활성 측정(active site titration)결과 1개의 효소를 불활성화시키는데 1개의 화합물이 필요한 것으로(1 : 1 stoichiometry) 밝혀져 이로부터 제시되는 식 :

로부터 정상상태 가정을 하지 않은 각 시간마다 살아있는 효소의 상대적 농도([E]/[E]+[EI]+[EI'])의 값을 KINSIM/FITSIM 프로그램에 입력하여 계산하므로서 억제상수 K₁와 k_ina그리고 2차 억제상수(second order rate constant)인 k_ina/K₁를 구하였다.

억제상수의 결과는 표 2에 나타내었다.

항바이러스 활성 및 세포독성 측정

항바이러스 효과는 신키티움 형성조사와 역전사 효소 검정조사를 하여 바이러스 복제를 50%로 저지하는 농도(IC)를 결정하였다.

1×10세포의 H9과 Sup T1 세포주를 24웰 평판에 넣고 여러 농도의 본 발명의 화합물을 가하였다. 여기에 HIV-1 접종원을 200TCID(200배의 50% 세포감염농도, tissue culture infectious dose)을 넣고 rpmi-1640 배지를 가한 후 37℃에서 배양하였다. Sup T1의 경우에는 3 내지 9일 후 신키티움이 형성된 갯수를 조사하였다. H9의 경우 3일 간격으로 배양액의 3/4을 같은 농도의 새 배양액으로 바꾸어 주었다. 9일후 배양액 6mL를 취해 1000rpm으로 10분동안 원심분리한 후 상등액 5mL를 취해 2.5mL의 30% PEG(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 6000 내지 약 8000)와 0.4M NaCl을 가하고 0℃에서 하룻밤 정도 방치하여 바이러스를 침전시켰다. 2000rpm으로 45분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 침전물을 20ml의 역전사효소 현탁완충액을 가하여 희석시켜서 에펜도르프 관에 넣어 -70℃로 사용시까지 보관한다. 현탁 완충액의 조성은 50mM 트리스 완충액(Sigma), pH 7.5, 1mM 디티오트레이톨, 20% 글리세롤, 0.25M KCl과 트리톤 X-100 0.25%가 포함되어 있다. 상기 현탁액을 드라이아이스에서 2분간 얼렸다가 2분간 37℃에서 녹이는 과정을 세번 반복한 후 4℃에서 원심분리하여 상등액을 사용하여 역전사효소 검정한다. 역전사효소 검정 용액에는 상기 바이러스 현탁액 10μl, 10μl의 250mM 트리스 완충액, pH 7.5, 37.5mM MgCl, 0.25% 트리톤 X-100 용액, 1.2μl의 200mM 디티오트레이톨, 5μl의 100μM 올리고(dT)-폴리(A)(베링거만하임(Boeringer Mannheim), 12-18올리고머),H이 포함된 TTP(티민트리포스페이트) 1㎕(1μCi), 및 23.6μl의 물을 혼합하여 사용하였다. 1시간후 상기 용액들을 왓트만 DEBl 여과지에 부은 후 2×SSC 완충용액에 넣는다. 2×SSC 완충용액으로 3회 세척한 후(1회에 10분정도 소요), 95%의 에탄올로 10초간 2회 세척한다. 여과지를 알루미늄 호일에 넣고 적외선 전구로 말린 후 액체 섬광 계수기로 정량한다.

항 AIDS제의 최대 허용치를 결정하기 위한 세포 독성을 검사하기 위해, H9 세포 또는 Sup T1 세포에 0.1μM 내지 100μM 범위의 화합물을 가한 후 rpmi-1640 배지에서 37℃로 배양하고, 3일 간격으로 배양액을 바꾸어 주면서 세포의 증식 정도를 트리판 블루 다이 익스크루전 방법(Trypan blue dye exclusion technique)으로 혈구계산판에서 2주간 관찰한 후 세포독성 CT을 결정하였다. 측정된 항세균 활성 및 세포독성의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

Claims

시스-에폭사이드 구조를 갖는 하기 일반식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물 :

상기 식에서, A는 하기 일반식(IIa) 또는 (IIb)의 작용화된 아실이고,

(상기에서, R₂는 저급 알킬 및 아미드로 치환된 저급알킬중에서 선택되고, R₃는 저급 알킬시, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬시 및 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼중에서 선택되며, R₄및 R₅는 각각 독립적으로 수소 및 저급 알킬중에서 선택되고, n은 0 또는 1이다), B는 하기 일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 작용화된 아민 그룹이다 :

(상기에서, R₆은 아미노산 잔기 및 저급 알킬중에서 선택되고, R₇은 저급 알킬, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬, 저급 알킬시 및 방향족 라디칼중에서 선택되며, R₈은 저급 알킬, 방향족 라디칼로 치환된 저급 알킬 및 방향족 라디칼중에서 선택된다).
제1항에 있어서, [(5S)-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라지닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드, [(5S)-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라지닐}아미노]-(4R,3S)-에톡시-6-페닐-헥사노일]-[D-발리닐메틸에스테르]]아미드, [(5S)-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라지닐}아미노]-(4R,3S)-에톡시-6-페닐-헥사노일]-[[(4R)-5-메틸-3-온-4-헥실]아미노]아미드, [(5S)-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라지닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[(5R)-2,6-디메틸-4-온-5-헵틸]아미노]아미드, [(5S)-[{N-(벤질옥시카보닐)-β-메탄설포닐-L-발리닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐-3-메틸-2-부틸]아미노]아미드, [(5S)-[{N-벤질옥시카보닐)-β-메탄설포닐-L-알라닌일}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[[(4R)-5-메틸-3-온-4-헥실]아미노]아미드, 및 [(5S)-[{N-벤질옥시카보닐)-β-메탄설포닐-L-발라닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[[(4R)-5-메틸-3-온-4-헥실]아미노]아미드, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물중에서 선택된 화합물.
하기 일반식(가)의 화합물을 하기 일반식(나)의 화합물과 커플링 반응시켜서 하기 일반식(다)의 화합물을 수득하고; 이 일반식(다)의 화합물을 에폭사이드화 반응시켜서 하기 일반식(라)의 화합물을 얻고; 이 일반식(라)의 화합물로부터 벤질옥시카보닐 보호그룹을 제거한 뒤, 하기 일반식(마)의 화합물과 커플링 반응시킴을 포함하는, 제1항에 따른 일반식(I)의 화합물의 제조방법.

상기 식에서, A 및 B는 청구범위 제1항에서 정의한 바와 같다.
제1항에 따른 화합물의 치료 효과량과 약제학적으로 허용가능한 담체, 분산제, 수화제, 불활성 희석제, 부형제 및 윤활제중에서 선택된 1종 이상의 보조제를 함유하는 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 위한 조성물.