KR0125104B1

KR0125104B1 - 신규 인간 면역 결핍 바이러스(hiv) 프로테아제 억제 화합물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0125104B1
Application number: KR1019930021298A
Authority: KR
Inventors: 고종성; 최낙현; 박지효; 윤흥식; 김성천; 최호일; 손영찬; 이창선
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 1997-12-05
Also published as: KR950011430A

Abstract

본 발명은 하기 일반식(I)로 표시되는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)의 증식을 억제하는 신규 HIV 프로테아제 억제 화합물 및 그의 제조방법, 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는, HIV 감염으로 발생되는 후천성 면역 결핍증의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

상기 식에서, A, B, R₁, R₂, R₃및 R₄는 명세서 중에서 정의한 바와 같다.

Description

신규 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제 억제 화합물 및 그의 제조방법

본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제를 억제하는 신규 화합물과 그의 제조방법, 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는, HIV 감염으로 발생되는 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

HIV-1은 에이즈 및 에이즈 증후군을 일으키는 레트로 바이러스다. 레트로 바이러스는 유전정보 물질로 RNA를 갖고 있다. 레트로 바이러스는 숙주를 감염시킨 후 역전사효소(reverse transcriptase)에 의해 바이러스 RNA로부터 이중나선 DNA를 만든다. 만들어진 이중나선 DNA는 인테그라제(integrase)에 의해 숙주의 염색체에 접목된다. 감염된 숙주는 새로운 바이러스 RNA를 만들뿐만 아니라 숙주의 효소적 기작을 이용하여 바이러스의 단백질을 만들수 있다. 생성된 다단백질(polyprotein)은 새로운 바이러스를 형성하기 위하여 변형되어져야 한다. 이러한 변형은 숙주의 효소 또는 바이러스가 갖고 있는 효소에 의해서 이루어진다. 그중 가장 중요한 효소중 하나는 프로테아제(protease)로서 이 효소는 다단백질을 바이러스 형성에 필요한 구조단백질 및 효소로 분해시키는 효소이다.

레트로 바이러스의 프로테아제 중에서 HIV 프로테아제가 가장 집중적인 연구 대상이 되어 왔다. 전술한 바와 같이, HIV는 껍질 단백질 및 필요한 효소를 만들 때 이들을 mRNA로부터 각각 합성해 내는 것이 아니고, 일단 껍질 단백질과 효소 등이 다함께 결합되어 있는 긴 형태의 다단백질 gag-단백질(P55) 또는 gag-pol 단백질(P165)을 먼저 만든 다음 이 다단백질이 자신안에 있는 프로테아제에 의하여 껍질 단백질과 역전사효소, 인테그라제 등의 바이러스 형성에 필요한 효소들로 분해되게 된다. 이 분해 과정을 담당하는 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되게 되며, 프로테아제 억제제는 이러한 원리에 기초한 것이다.

돌연변이 실험을 통하여 프로테아제 기능이 없는 바이러스는 감염성이 없다고 보고되고 있다[Kohl et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 85, 4686-4960(1988) ; and Peng et al., J. Virol, 63, 2550(1989)]. 따라서, HIV 프로테아제의 기능을 못하게 하는 억제제는 HIV 감염에 의해 발생되는 질환의 치료제로서의 가능성이 제시되어 오고 있다.

HIV 프로테아제는 99개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그의 구조는 X-선 구조 결정에 의해 결정되었다[Navia, et a1., Nature 337, 615-620(1989) ; Wlodawer, et al., Science, 245, 616-621(1989) ; and Miller, et al., Science, 246, 1149-1152(1989)]. HIV 프로테아제는 두개의 똑같은 단위체가 이량체로 존재하고 있고, 각 단위체의 분자량은 10793이다. 상기 HIV 프로테아제는 반응 부위에 아스파르테이트-트레오닌-글리신의 배열을 갖는 전형적인 아스파르틱 프로테아제이다.

HIV 프로테아제 억제제의 개발은 다른 종류의 아스파르틱 프로테아제(특히 레닌)의 억제제 개발 동향에 따르고 있다.

그 기본적인 접근 방식은 효소의 전이상태(transition state)와 유사한 화합물(transition state analogue,TSA)을 개발하여 효소의 친화도를 높임으로써 효소에 대한 결합력을 높이는데 있다. 이러한 방식으로 개발한 HIV 프로테아제 억제제는 여러 문헌에 개시되어 있다(Roberts, et al., Science 248, 358(1990) ; 유B럽 특허 공개 제0337714호 ; 제0346847호 ; 제356223호 ; 제352000호 ; 제357332호 ; 제362002호 ; 및 제361341호 ; one et al., JACS 113, 9382(1991)).

그러나, 이러한 공지의 HIV 프로테아제 억제제들은 모두 효소의 친화도를 높인 가역적 억제제이다.

이에, 본 발명자들은 전술한 전이상태를 모방한 가역적인 억제제보다 강력한 억제효과를 얻기 위하여, 전이상태와는 달리 시스-에폭사이드를 도입한 비가역적인 억제제를 개발한 바 있으며(본 출원인에 의해 1993년 6월 14일자로 출원된 대한민국 특허출원 제93-10811호 참조), 본 발명에 이르러, 시스-에폭사이드 구조에 L-아미노산이 아닌 알킬 아민을 C-말단에 도입하고, N-말단에는 비천연 아미노산인 설폰기를 포함하는 아미노산을 도입함으로써 보다 강력한 HIV 바이러스 증식 억제 효과를 갖는 신규 화합물을 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 보다 향상된 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 후천성 면역결핍증 또는 HIV 감염의 예방 또는 치료에 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따라서, 하기 일반식(I)의 시스-에폭사이드 구조를 갖는 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물이 제공된다:

상기 식에서, R_l및 R₂는 각각 독립적으로 수소원자 및 저급알킬 중에서 선택되고, R₃는 저급알킬, 방향족라디칼로 치환된 저급알킬, 아릴 및 탄소수 3 내지 8의 사이클릭 라디칼로 치환된 저급알킬중에서 선택되고, R₄는 C₁-C₄알킬이고, n은 0,1 또는 2이고, A는 하기 일반식(II)의 그룹이고,

(X) (Y)mR₅(II)

(상기 식에서, X는 -CO, -COCO-, -SO-, -SO₂- 또는 CS이며, Y는 -O-, -NH 또는 -NCH₃-이고, m은 0 또는 1이고, R₅는 사이클로헥실메틸, 벤질, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 피리딜, 피리딜메틸, 이소퀴놀리닐옥시메틸, 나프톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 벤조피라닐 및 4-옥소-4H-1-벤조피라닐로 이루어진 그룹중에서 선택된다), B는 하기 일반식(III)의 그룹이다:

(상기 식에서, Z는 O, NH 또는 -NCH₃-이고, R₆및 R₇은 각각 독립적으로 저급알킬, 방향족 라디칼로 치환된 저급알킬, 탄소수 3 내지 8의 사이클릭 라디칼, 사이클릭 라디칼로 치환된 저급알킬 및 방향족 라디칼중에서 선택된다).

본 명세서에서 사용된 용어 ''저급알킬''은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 아미노산에 관한 약어들은 아미노산 및 펩타이드에 대한 생화학적 명명법에 관한 IUPAC-1UB 합동회의에 따른 것이다[Eur. J. Biochem. 158, 9-31(1984)].

본 발명에 따른 화합물들은 또한 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 화합물, 부분 입체이성체 혼합물 및 개개의 부분 입체이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 형태의 이성체는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 바람직한 화합물은 R_l및 R₂가 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이고, R₃가 이소부틸, 사이클로펜틸메틸, 사이클로헥실메틸 또는 벤질이며, R₄가 수소, 메틸 또는 에틸이고, R₅가 사이클로헥실메틸, 벤질, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 피리딜, 피리딜메틸, 이소퀴놀리닐옥시메틸, 나프톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 벤조피라닐 또는 4-옥소-4H-1-벤조피라닐이며, R₆및 R₇이 각각 독립적으로 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 벤질, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로프로필메틸 또는 페닐인 일반식(I)이 화합물이다.

본 발명에 따른 바람직한 부류의 화합물의 대표적인 예는 다음과 같다.

[ 표 1]

발명에 따른 일반식(I)의 화합물은 하기 반응도식 1에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

[반응도식 1]

상기 식들에서, A, B, R₁, R₂, R₃및 R₄는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 반응도식 1에 따르면 상기 일반식(가)의 화합물을 일반식(나)의 화합물과 커플링 반응시킨 후 mCPBA(메타클로로퍼벤조산)으로 산화반응시켜 상기 일반식(다)의 화합물을 얻은 다음, 이 화합물로부터 벤질옥시카보닐 보호그룹을 제거하여 상기 일반식(라)의 화합물을 얻는다. 이어서, 화합물(라)와 (마)를 커플링 반응시킨 후 상기와 같이 산화반응시켜 일반식(바)의 화합물을 얻는다. 다음에는 화합물(바)로부터 벤질옥시카보닐보호 그룹을 제거하여 일반식(사)의 화합물을 수득한 뒤 상기 일반식(아) 또는 (자)의 화합물과 커플링 반응시켜 목적하는 일반식(I)의 화합물을 얻는다.

또한, 상기 커플링 반응에는 커플링 시약으로서 예를 들면, 디사이클로 헥실 카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산 클로라이드(BOP-CI), 디페닐포스포릴아지드(DPPA)등을 사용할 수 있으며, 이들로만 한정되는 것이 아니다.

달리, 일반식(가)의 카복실산을 산 하라이드 또는 기타 활성 에스테르 유도체로 전환시킨 후 커플링 반응시킬수도 있다. 상기 산 할라이드 유도체로는 산 클로라이드가 포함되며, 활성 에스테르 유도체는 아민과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하게 하거나 알콜과의 커플링 반응에 의해 에스테르 결합을 형성하도록 하기 위해 카복실산 그룹을 활성화시키는데 통상적으로 사용되는 것들로서, 예를 들면, 메톡시카보닐클로라이드, 이소부톡시카보닐 클로라이드 등과 같은 알콕시 카보닐할라이드와, 커플링 시약으로부터 유도된 카복실산 무수물, N-하이드록시벤조트리아졸 유도된 에스테르, N-하이드록시프탈이미드 유도된 에스테르, N-하이드록시숙신이미드 유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2',3'-디카복스아미드 유도된 에스테르, 2,4,5-트리클로로페놀 유도된 에스테르 등이 포함되나, 이들로만 제한되는 것은 아니다.

벤질옥시카보닐 이탈 반응 역시 통상의 방법으로, 예를 들면 Pd/C 촉매 존재하에 수소가압하에 반응시켜 제거할 수 있다.

한편, 일반식(가)의 화합물은 하기 반응도식 2에 도시된 바와같이 제조될 수 있다.

[반응도식 2]

상기 식들에서, X는 할로겐원자, 예를 들면 Br 또는 I이다.

상기 반응도식 2는 시스-β,γ-올레핀 산의 제조방법으로서 논문[Keinan et al., Tetrahedron 47,4631-4638(1991) ; and Corey Shimaji, J. Am. Chem. Soc., 105, 1662-1664(1983)]에 기술되어 있는 방법에 의거한 공정이다. 목적하는 일반식(가)의 화합물을 합성하기 위해, 상기 논문에 기재된 방법에 따라 K₂CO₃를 사용하여 일반식(카)의 L-N-벤질옥시카보닐-R₃치환된 알데하이드와의 비티그 반응에 의해 상기 일반식(가)의 시스-β,γ-올레핀을 제조할 경우 70 내지 80℃의 고온에서 반응시켜야 하므로 R₃치환된 알데하이드쪽에 라세미화가 일어나게 된다. 본 발명에서는 칼륨 헥사메틸디실라잔(KHMDS)을 염기로 사용하여 -78℃에서 반응을 시킴으로써 라세미화를 막을 수 있었다. 또한, 상기 논문에 기재된 방법에 따라 상기 일반식(타)의 오르토에스테르를 산처리하여 상기 일반식(파)의 화합물을 만든 후 염기 처리하여 보호 그룹을 제거하는 경우에는 β,γ-올레핀산에서 α,γ-올레핀산으로 50% 이상 전환되어 목적 화합물의 수율이 매우 낮아질 뿐 아니라 이의 분리에도 어려움이 따르기 때문에, 본 발명에서는 일반식(타) 화합물의 오트로에스테르를 산촉매의 존재하에 t-부탄올을 용매로 하여 용매의 환류온도로 가열 교반함으로써 α,β-올레핀산으로 전환되지 않은 화합물(가)를 80 내지 90% 수율로 얻을 수 있다.

본 발명에서 일반식(III)의 그룹을 제공하는 작용화된 아민은 하기 반응도식 3 또는 4에 도시된 바와같이 제조할 수 있다.

[반응도식 3]

[반응식 4]

상기 식에서, R₆, R₇및 X는 상기 정의한 바와 같다.

상기 반응도식 3은 알킬니트릴로부터 그리나르 반응과 NaBH₄을 사용한 환원 반응에 의해 원하는 일반식(III)의 작용화된 아민을 제조하는 과정이다. 이 제조과정은 생성물이 라세미체로 형성되기 때문에 t-부톡시카보닐-페닐알라닌을 커플링시킨 후 보호그룹인 t-부톡시카보닐 보호그룹을 제거하고 컬럼크로마토그래피를 실시하여 두개의 부분입체이성체를 분리한 후 에드만법에 의해 각각의 이성체를 분리하였다.

반응도식 4는 작용화된 아민(III)중 R⁶이 이소프로필로 고정되어 있는 것을 광학적으로 순수하게 제조하는 과정이다. 반응도식 4에서는, t-부톡시카보닐로 보호된 일반식(하)의 L- 또는 D-아미노산과 메톡시메틸 아민을 커플링한 후 그리나르 반응에 의해 일반식(까)의 화합물을 얻는다. 화합물(까)에서 화합물(따)합성시 라세미화를 막기위해 칼륨 헥사메틸디실라잔(KHMDS)을 염기로 하여 -20℃에서 비티그 반응시켰다. 화합물(따)를 수소화시킨 후 탈보호 반응을 통하여 일반식(빠)로 표시되는 아민을 합성할 수 있다.

상기 반응도식 1에서 사용된 일반식(마)의 화합물은 하기 반응도식 5와 같이 제조할 수 있다.

[반응도식 5]

상기 식에서, R₄는 저급알킬이고, X는 할로겐 원자, 예를들면 Br 또는 I이다.

상기 반응도식 5는 치환된 시스테인을 염기하에서 티올그룹을 메틸화시킨 후 벤질 옥시카보닐 클로라이드로 아민을 보호하는 공정을 나타낸다.

본 발명의 화합물은 숙주에게 부여될 총 일일용량이 체중 1kg당 100 내지 600mg으로서, 한번에 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있으며, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 수화제 또는 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 용매에는 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에탄올등이 있다.

경구투여용 고체 투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 가능하지만, 화합물 특성을 고려할 때 캅셀제가 특히 바람직하며, 정제로 할 경우에는 장피제로 제조하는 것이 유용하다. 고체 투여 형태에는 활성화합물을 수크로오즈, 락토오즈 또는 스타치와 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 회석제외의 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 하나이상의 다른 항 AIDS제, 면역조절제등과 병행하여 투여할 수도 있다.

HIV 감염의 치료 및 예방을 위한 본 발명의 화합물의 제제는 상술한 것으로 제한되는 것이 아니며, HIV 감염의 치료 및 예방에 필요한 본 발명의 화합물의 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

이와 같은 본 발명을 제조예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 하기의 실시예는 본 발명에 따른 신규 화합물의 제조 방법에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[제조예 1]

단계 1 : N-벤질옥시카보닐-β-(S-메틸)-L-발린의 제조

β-머캅토-L-발린 8.9g(0.06몰)을 디옥산 120ml 및 물 40ml에 가하고 0℃로 냉각시킨 다음 6N 수산화나트륨 수용액 20ml를 첨가해 용해시켰다. 생성된 용액에 요오드메탄 9.24g(0.066몰)을 가하고 플라스크 마개를 막은 다음 0℃로 3시간 및 이어서 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 메틸화 반응물을 0℃로 냉각시키고 6N 수산화나트륨 수용액 10ml와 벤질클로로포르메이트 10.20g(0.09몰)을 천천히 가했다. 반응물을 0℃에서 1시간 및 이어서 5℃에서 2시간 교반한 후 반응을 종결시켰다. 반응종결후 용매를 감압증류하여 제거한 후 미반응 벤질클로로포르메이트를 제거하기 위해 20ml 물과 에테르를 가한 다음 유기층을 제거하였다. 수용액층에 에틸 아세테이트 60ml를 가하고 6N 염산으로 pH를 3 이하로 낮추었다. 유기층을 분리한 후 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 용매를 감압증류하여 표제화합물 14.25g(수율 80%)을 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD)1.2(S,6H), 2.1(S,3H), 4.3(d,1H), 5.1(S,2H), 7.1(m,5H)

단계 2 : N-벤질옥시카보닐-β-메탄설포닐-L-발린의 제조

30ml의 메탄올에 상기 단계 1의 생성물 2.97g(0.01몰)을 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 상기 메탄올 용액에 옥손 18.42g(0.03몰)을 가하여 3시간 반응시켰다. 반응 종료후 용매를 감압 증류하여 제거한 다음 에틸아세테이트 60ml와 물 20ml를 가하였다. 유기층을 분리한 후 무수 Na₂SO₄상에서 건조시키고 용매를 감압증류하여 표제화합물 2.73g(수율 83%)을 얻었다.

¹H NMR(DMSO)2.8(S,3H), 3.4(m,2H), 4.6(m,1H), 5.1(S,2H), 5.3(d,1H), 7.2(m,5H), 8.6(bs,1H).

[제조예 2]

단계 1 : 2-메틸-3-S- 부톡시카보닐아미노-4-페닐-1-부텐의 제조

메틸트리페닐 포스핀 브로마이드 5.7g(0.012몰)을 40ml의 무수 톨루엔에 용해시킨 후 -20℃로 냉각시키고, 질소 대기하에서 0.5N 카륨헥사메틸 디실라진 용액 22ml(0.011몰)을 서서히 가하였다. 0℃에서 30분간 교반한 후 반응온도를 -20℃로 저하시켰다. 남(Nahm)의 방법[Tetrahedron Letter, 54, 3815(1981)]에 의해 합성된 S-3-부톡시카보닐아미노-4-페닐-2-부타논 2.63g(0.01몰)을 서서히 가하였다. 같은 온도에서 30분간 반응시킨 다음 반응물의 온도를 상온으로 서서히 상승시킨 후 3시간 동안 교반하였다. 반응종결 후 용매를 감압증류에 의해 제거하고 컬럼크로마토그래피(용출제 : 에틸아세테이트 헥산=10:90)를 실시하여 표제화합뭍 2.2g(84%)을 얻었다.

^lH NMR(CDCl₃)1.37(s,9H), 1.77(s,3H), 2.65-2.95(m,3H), 4.27(br,1H), 4.51(b,1H), 4.80(d,2H), 7.19-7.33(m,5H).

단계 2 : (S)-2-아미노-3-메틸-1-페닐 부탄의 제조

2-메틸-3-S-부톡시카보닐아미노-4-페닐-1-부텐 2.61g(0.01몰)을 30ml 메탄올에 녹여 100mg의 10% 탄소상 팔라듐을 가한후 1기압의 수소조건(고무풍선)에서 3시간 교반하였다. 반응용액을 셀라이트에 통과시켜 무기금속을 제거한후 반응용매를 제거하였다. 상기 반응 생성물에 20ml의 디클로로메탄올과 10ml의 트리클로로아세트산을 가하고 2시간 동안 교반하였다. 반응후 용매를 제거하고 에틸 아세테이트 30ml와 10ml의 1N 탄산수소칼륨을 첨가한 후 유기층을 분리해 낸다. 분리된 유기층을 무수 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 용매를 제거하여 표제화합물 1.43g(수율 87%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.98(t,6H), 1.65(m,1H), 2.39(m,1H), 2.82(m,2H), 7.l9-7.33(m,5H)

[제조예 3]

단계 1 : 2-아미노-3-메틸-1-페닐부탄 하이드로클로라이드의 제조

50ml의 무수 THF(테트라하이드로푸란)로 희석한 이소부틸니트릴 13.8g(0.2몰)에 20M 벤질 마그네슘 클로라이드 110ml(0.22몰)을 상온에서 가한 후 1시간 동안 환류하고 상온으로 냉각시켰다. 200ml의 메탄올과 11.4g(0.3몰)의 NaBH₄를 가한 다음 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 1N 염산을 가하여 pH를 약 11로 맞춘다. 클로로포름으로 추출한 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음 메탄올성 염산을 가하고 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄 : 메탄올=10 : 1)를 실시하여 표제 화합물 37.5g(수율 94%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)1.08(m,6H), 1.96(m,1H), 2.90-3.16(m,2H), 3.37(m,1H), 7.15-7.31(m,5H), 8.36(b,3H).

단계 2 : L-(N-t-부톡시카보닐)-페닐알라닌일-2-(1-페닐-3-메틸-부틸)아미드의 제조

N-t-부톡시 카보닐 페닐알라닌 26.5g(0.1몰)에 EDC와 HOBT를 각각 1.5당량씩 가하고 DMF 130ml 및 트리에틸아민 15ml를 가하여 용해시킨 다음 제조예 1의 생성물 20g(0.1몰)을 0℃에서 가하고 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 증류하여 제거한 후 에틸아세테이트에 용해시키고 1N 염산과 NaHCO₃포화용액으로 세척한 후 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 용매를 제거하여 37.7g(수율 92%)의 표제 화합물을 얻었다.

단계 3 : L-페닐알라닌일-2-(1-페닐-3-메틸-부틸)아미드의 제조

제조예 2의 생성물 20.5g(0.05몰)을 디클로로메탄 30ml와 트리플루오로아세트산 15ml에 용해시키고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 용매를 감압 증류하여 제거하고 에틸아세테이트를 사용해 컬럼크로마토그래피를 실시하여 2개의 이성체를 분리하였다. Rf가 0.50인 이성체가 8.0g, Rf가 0.45인 이성체가 7.4g 생성되었다. 전체 수율은 99%이다.

¹H NMR(CDCl₃)

① Rf=0.50 ; 0.93(m,6H), 1.80(m,1H), 2.22(m,1H), 2.63(m,1H), 2.85(m,1H), 3.05(m,1H), 3.51(m,1H), 4.111(m,1H), 7.10-7.34(m,10H)

② Rf=0.45 ; 0.91(m,6H), 1.79(m,1H), 2.65-2.70(m,2H), 2.83(m,1H), 3.18(m,1H), 3.44(m,1H), 4.08(m,1H), 7.10-7.32(m,10H).

단계 4 : 2-아미노-3-메틸-1-페닐-부탄의 제조

상기 단계 3의 각각의 이성체 1.46g(4.7밀리몰)을 무수 디클로로메탄 50ml에 용해시키고 페닐이소티오시아네이트 0.66ml(5.5밀리몰)를 상온에서 가한 후 2시간 동안 환류하였다. 상온으로 냉각시킨 후 트리플루오로아세트산 10ml를 가하고 60℃에서 40분간 환류한 다음 용매를 감압 증류하여 제거하였다. 생성물을 20ml의 물에 녹인후 에테르로 세척하고 NaOH로 pH를 약 11로 맞춘 후 클로로포름으로 추출하여 표제화합물의 각각의 이성체를 수율 82 내지 85%로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 0.94(m,6H), 1.11(bs,2H), l.65(m,1H), 2.39(m,1H), 2.82(m,2H), 7.l6-7.32(m,5H).

[α]_D① -38.1(c=0.12,디클로로메탄)

② +38.1(c=0.12,디클로로메탄)

[제조예 4]

단계 1 : 5-L-(N-벤질옥시카보닐)아미노-6-페닐-헥스-3-(시스)-엔일-4'-메틸-2',6',7'-트리옥사-비사이클로[2',2',2']옥세탄의 제조

케이난등의 방법[Keinan et al ; Tetrahedron 26, 4631-4638(1991)]에 따라 합성된 1-[2-트리페닐포스포늄-메틸)-4'-메틸-2',6',7'-트리옥사-비사이클로[2',2',2']옥세탄 브로마이드 60.89g(0.12몰)을 400ml의 테트라하이드로푸란에 용해시키고 -78℃에서 교반시킨 후 220ml의 칼륨헥사메틸 디실라잔 0.5M 용액(0.11몰)을 가하고 1시간 동안 -78℃에서 유지시켜 상기 용액에 20분간 서서히 가한 후 -78℃에서 1시간 및 이어서 상온에서 1시간 교반하고 물을 가하여 반응을 종결시켰다. 반응용매를 제거한후 에틸 아세테이트에 용해시키고, NaHCO₃포화용액 및 물로 세척한 다음 유기층을 무수 NaSO₄로 건조시키고 컬럼크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 : 트리에틸아민=70 : 30 : 5)를 실시하여 36.5g(84% 수율)의 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.8(s,3H), 2.2-3.0(m,4H), 3.9(s,6H), 4.6(m,1H), 4.8(br,1H), 5.05(s,2H), 5.4-5.6(m,2H), 7.1=7.5(m,10H)

[]_D=+25.2(c=0.50,메탄올)

단계 2 : 5-L-(N-벤질옥시카보닐)아미노-6-페닐-헥스-3-(시스) -엔-1-카보닐산의 제조

상기 단계 1에서 얻은 화합물 2.5g(6밀리몰)을 1% 미만의 진한 염산을 함유하는 t-부탄올과 물의 혼합용액에 녹여 반응용매의 환류온도로 약 20시간 교반한 뒤, 반응용매를 증류 감압하여 제거하고 K₂CO₃용액을 가하여 pH 9 이상으로 맞춘후 에틸아세테이트로 세척하였다. 수용액층의 pH를 2로 맞춘후 에틸아세테이트로 추출하여 무수 MgSO₄로 건조하고 유기용매를 제거하여 l.62g(80% 수율)의 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)2.7-3.3(m,4H), 4.6(m,1H), 4.8(br,1H), 5.05(s,2H), 5.4(t,1H), 5.6(m,1H), 7.1-7.3(m,l0H)

MS(FAB,m/e) 340(M+1)

[실시예 1]

[(5S)-[N-(2-퀴놀린카보닐)-β-메탄설포닐-L-알라닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드(1)의 제조

단계 1 : [(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-3-(시스)-엔-6-페닐-1-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드의 제조

3.39g(10밀리몰)의 제조예 4에서 얻어진 생성물, 각각 15당량의 EDC 및 HOBT을 혼합한 후 40ml의 디메틸 포름아미드에 용해시켜 생성된 용액에 (S)-2-아미노-3-메틸-1-페닐부단 1.63g(10밀리몰)을 0℃에서 가하고 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거한 후 에틸아세테이트에 용해시키고 유기층을 1N 염산과 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조하고 감압증류하여 용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트 : 헥산=1:1)를 실시하여 표제 화합물 3.8g(수율 87.5%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.85-1.01(m,6H), 1.78(m,1H), 2.42-3.25(m,6H), 4.05(m,1H), 4.58(m,1H), 4.95(bs,1H), 5.08(s,2H), 5.35(m,1H), 5.58(m,1H), 7.09-7.41(m,16H).

단계 2 : [(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드의 제조

상기 단계 1의 생성물 3.60g(7밀리몰)을 100ml의 디클로로메탄에 용해시키고 2.5당량의 메타클로로퍼옥시벤조산을 가한 후 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 10% Na₂S₂O₃용액을 넣어 30분간 교반한 후 유기층을 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고 유기용매를 제거하여 표제화합물 3.0g(83%)을 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃)0.83-0.99(m,6H), 1.77(m,1H), 2.61-3.24(m,8H), 3.74(m,1H), 4.11(m,1H), 4.95(m,1H), 5.10(s,2H), 7.21-7.50(m,15H).

단계 3 : [[(5S)-[[(N-(벤질옥시카보닐)-β-메탄설포닐-L-알라닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드의 제조

상기 단계 2의 생성물 315mg(0.6밀리몰)을 20ml의 메탄올에 녹이고 약 10중량%의 10% 탄소상 팔라듐을 혼합하여 1기압 H₂조건(고무풍선)에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 셀라이트에 통과시켜 탄소상 팔라듐을 제거한 후 감압증류하여 반응용매를 제거하였다. 198mg(0.5밀리몰)의 N-벤질옥시카보닐-β-메탄설포닐-L-알라닌, 각각 1.5당량의 EDC 및 HOBT을 DMF에 용해시키고 상기에서 얻은 아민을 0℃에서 가한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 감압증류하여 유기용매를 제거하고 디클로로메탄에 용해시킨 후 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조한 후 용매를 제거하였다. 용매제거 후 10ml의 디클로로메탄올을 넣은 후 5당량의 메타클로로퍼옥시 벤조산을 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 10% Na₂S₂O₃수용액을 가하여 30분간 교반후 유기층을 포화 NaHCO₃수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고 감압 증류에 의해 유기용매를 제거한 다음 5ml의 에틸아세테이트 : 헥산(v/v=50/50)을 통해 여과하여 표제 생성물 292mg(수율 75%)을 얻었다.

¹H NMR(DMSO) 1.85(t,6H), 2.65(m,2H), 2.0(m,1H), 2.25(m,1H), 2.50-3.30(m,9H), 3.68(b,1H), 3.43(b,1H), 5.07(s,2H), 7.0-7.5(m,15H), 7.73(m,2H), 8.41(b,1H).

단계 4 : [(5S)-[N-(2-퀴놀린카보닐)-β-메탄설포닐-L-알라닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드(1)의 제조

상기 단계 3의 생성물 260mg(0.4밀리몰)을 20ml의 메탄올에 용해시키고 약 10중량%의 10% 탄소상 팔라듐을 혼합하여 1기압 H₂조건(고무풍선)에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트에 통과시켜 탄소상 팔라듐을 제거한 후 반응용매를 감압증류에 의해 제거하였다. 696mg(0.4밀리몰)의 2-퀴놀린카복실산, 각각 1.5당량의 EDC 및 HOBT를 DMF에 용해시키고 상온에서 얻은 아민을 0℃에서 가한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 감압증류하여 유기용매를 제거하고 메틸렌 클로라이드에 용해시킨 후 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgS0₄로 건조시킨 후 용매를 제거하고 컬럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트)를 실시하여 표제생성물 184mg(수율 70%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) 0.8(m,6H), 1.8(m,1H), 2.1(m,2H), 2.6-3.6(m,11H), 4.1(m,2H), 5.0(m,1H), 6.4(d,1H), 7.1-7.5 (m,11H) ,7.5-8.4 (m,6H), 9.3(d,1H).

MS(FAB,m/e) 655(M+1)

[실시예 2 내지 3]

상기 실시예 1에서와 유사한 방법으로 반응을 실시하여 하기 표 2에 열거한 화합물(2) 및 (3)을 각각 수득했다.

[실시예 4]

[[(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)-β-메탄설포닐-L-발리닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-에톡시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드(4)의 제조

단계 1 : [[(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)-β-(S-메틸-1-발리닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드의 제조

상기 실시예 1, 단계 2의 생성물 2.63g(5밀리몰)을 100ml의 메탄올에 용해시키고 약 10중량%의 10% 탄소상 팔라듐을 혼합하여 1기압의 H₂조건(고무풍선)에서 3시간 동안 반응하였다. 반응용액을 셀라이트에 통과시켜 무기금속을 제거한 후 반응용매를 제거하였다. 1.49g(5밀리몰)의 제조예 1의 생성물, 각각 1.5당량의 EDC 및 HOBT를 50ml의 DMF에 용해시키고 상기에서 얻은 아민을 0℃에서 가한후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 감압증류하여 유기용매를 제거하고 디클로로메탄에 용해시킨 후 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고 컬럼크로마토그래피를 실시하여 표제생성물(수율 75%)을 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD)0.8(m,6H), 1.5-2.2(m,12H), 2.6-3.4(m,4H),14.0(m,2H), 4.5(d,1H), 5.1(s,2H), 7.2-7.5(m,15H).

단계 2 : [[(5S)-[(N-벤질옥시카보닐-β-메탄설포닐-L-발리닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]-부틸]아미드(4)의 제조

상기 단계 1의 생성물 1.93g(3밀리몰)을 100ml의 디클로로메탄에 용해시키고 5당량의 메타클로로퍼옥시벤조산을 가하여 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 10% Na₂S₂O₃용액을 가하고 30분간 교반한 후 유기층을 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고 유기용매를 제거하여 표제화합물(수율 85%)을 얻었다.

^lH NMR(CDCl₃)0.8(dd,6H), 1.6-2.2(m,9H), 2.7-3.4(m,7H), 4.0(m,2H), 4.5(d,1H), 5.1(s,2H), 7.1-7.6(m,15H).

MS(FAB,m/e) 678(M+1)

[실시예 5 내지 6]

상기 실시예 4에서와 유사한 방법으로 반응을 실시하여 하기 표 2에 열거한 화합물(5) 및 (6)을 각각 수득하였다.

[실시예 7]

[(5S)-N-(2-퀴놀린카보닐)-β-메탄설포닐-L-발리닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-에톡시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드(7)의 제조

상기 실시예 4의 생성물 339mg(0.5밀리몰)을 10ml의 메탄올에 용해시키고 약 10중량%의 10% 탄소상 팔라듐을 혼합하여 상압 H₂조건(고무풍선)에서 3시간 동안 교반하였다. 반응용액을 셀라이트에 통과시켜 무기금속을 제거한 후 반응용매를 제거하였다. 0.5밀리몰의 2-퀴놀린카복실산, 각각 1.5당량의 EDC 및 HOBT를 5ml의 DMF에 용해시키고, 상기에서 얻은 아민을 0℃에서 가한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 감압증류하여 유기용매를 제거하고 디클로로메탄에 용해시킨 후 NaHCO₃포화용액으로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄로 건조하고 컬럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트)하여 표제생성물(수율 80%)을 얻었다.

¹H NMRpCD₃OD)0.9(m,6H), 1.5-2.2(m,9H), 2.6-3.3(m,9H), 4.1(m,2H), 4.7(d,1H), 5.6(br,1H), 6.8(bs,1H), 7.1-7.4(m,10H), 7.6-8.4(m,6H), 9.2(bs,1H)

MS(FAB,m/e) 699(M+1)

[실시예 8 내지 9]

상기 실시예 7에서와 유사한 방법으로 반응을 실시하여 하기 표 2에 열거한 화합물(8) 및 (9)를 수득하였다.

[실시예 10]

[(5S)-[[N-(2-피리딜메톡시)카보닐]-β-메탄설포닐-L-발리닐일]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드(10)의 제조

단계 1 : 2-피리딜메틸-N-숙신이미딜카보네이트의 제조

2-피리딜카비놀 24.5mg(0.23밀리몰), 트리에틸아민 68.1mg(0.68밀리몰)을 무수 아세토니트릴 용매에 용해시킨 후 상온에서 디숙신이미딜카보네이트 75.9gmg(0.3밀리몰)을 적가하였다. 3시간 동안 교반한 뒤 반응용매를 감압조건에서 제거하고 에틸아세테이트용매로 희석하여 포화 NaHCO₃용액 및 염수로 세척한 후, 무수 MgS0₄로 건조시키고 용매를 감압조건에서 제거한다.

¹H NMR(CDCl₃)2.7(s,4H), 5.4(s,2H), 7.6(t,1H), 7.8(t,1H), 8.8(m,2H).

단계 2 : [(5S)-[[N-(2-피리딜메톡시)카보닐]-β-메탄설포닐-L-발리닐일]아미노-[(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드(10)의 제조

상기 실시예 4에서 얻은 화합물 10lmg(0.15밀리몰)을 상기 실시예 7의 방법으로 벤질옥시카보닐그룹을 제거하고 트리에틸아민 68.1mg(0.68밀리몰)과 상기 단계 1에서 얻은 2-피리딜메틸 N-숙신이미딜카보네이트를 무수 디클로로메탄 용매에 용해시켜 상온에서 20시간 이상 교반하였다. NaHCO₃포화용액으로 세척하고 유기층을 MgS0₄상에서 건조한 뒤 유기용매를 제거하고 컬럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트)하여 표제생성물 50.8mg(수율 50%)을 얻었다.

^lH NMR(CDCl₃)0.9(m,6H), 1.5-2.1(m,9H), 2.6-3.3(m,9H), 4.1(m,2H), 4.7(d,1H), 5.2(bs,3H), 5.6(br,1H), 6.8(br,1H), 7.1-7.4(m,12H), 7.7(d,1H), 8.7(m,1H).

MS(FAB,m/e) 631(M+1)

[실시예 11 내지 18]

상기 실시예 10에서와 유사한 방법으르 활성화된 카보네이트와 아민과의 반응을 실시하여 하기 표 2에서 열거한 화합물(11) 내지 (18)을 수득하였다.

[실시예 19 내지 30]

상기 실시예 7과 유사한 방법으로 각 카복실산과 아민의 커플링 반응을 실시하여 하기 표 2에서 열거한 화합물(19) 내지 (30)을 수득한다.

[표2]

HIV 프로테아제의 억제 효능분석

본 발명의 화합물들의 HIV 프로테아제에 대한 억제 효능을 확인하기 위해 하기의 방법을 사용하였다. 먼저 반응기질이 없는 상태에서 상기 효소와 본 발명의 실시예 1 내지 27에서 제조된 각각의 화합물을 섞은 뒤(배양전 용액), 반응용액의 일부를 취하여 과량의 반응기질이 있는 용액(분석 용액)에 가하여 효소 활성의 감소정도를 남아있는 활성의 정도로서 측정하였다. 배양전 용액은 50mM 아세트산 나트륨, pH 0.5, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM 에틸 디아민 테트라아세테이트(EDTA), 0.75M 황산 암모늄, 0.1% NP 40과 여러 농도의 실시예 1 내지 27의 화합물이 포함되어 있다. 억제 반응은 26nM의 HIV-1 프로테아제를 가함으로써 개시하였다. 일정시간마다 10μL를 취하여, 상기와 동일한 완충용액에 100μM의 반응기질이 포함되어 있는 80μL의 용액에 가하여 남아있는 효소 활성을 검정하였다. 이때, 반응기질로는 H-His-Lys-Ala-Arg-Va1-Leu-Phe-(p-니트로)-Glu-Ala-Nle-Ser-NH₂의 1l개 아미노산으로 이루어진 올리고 펩타이드를 사용하였으며, 이 기질은 HIV 프로테아제에 의해 (p-니트로)-Phe과 Leu 사이의 아미드 결합이 끊어지게 된다. 반응속도(p-니트로)-Phe과 280nm에서의 강한 흡광도를 이용하여, 반응전의 기질과 반응후의 생성물을 HPLC로 분리하여 생성물의 상대적 양을 측정함으로써 결정하였다. 시간에 따른 효소호라성의 감소량을 구하고 감소량의 자연로그값(In)을 시간에 대하여 그래프로 나타낸 직선의 기울기로부터 K_obs를 구하였다. 억제상수는하기 식에 의해 구하였다.

상기 식은 억제제 농도가 효소의 농도보다 월등히 높을 경우에(정상 상태 조건) 적용이 가능하다. 그러나, 억제제 농도가 고활성이어서 억제제와 효소의 농도가 충분하지 못할 경우에는 상기 식보다는 E+1(E : 유리 효소 농도, I : 유리 억제제 농도, EI : 마이클-멘텐(Michaelis-Menten) 복합체 농도, EI' : 효소와 억제제의 고유 결합물 농도)의 식을 사용하여 정상상태 가정을 하지 않은 각 시간마다 살아있는 효소의 상대적 농도 E/(E+EI+EI')의 값을 KINSIM/FITSIM 프로그램(Willams and Morrison ; Zimmerle and Frieden)에 입력하여 계산함으로써 억제상수 k₁와 k_ina및 2차 억제상수(second order rate constant)인 k_ina/K_I를 구하였다.

억제상수의 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

항바이러스 활성 및 세포독성 측정

항바이러스 효과는 신키티움 형성 조사와 역전사 효소 검정조사를 하여 바이러스 복제를 50%로 저지하는 농도(IC₅₀)를 결정하였다.

1×10⁵세포의 H9과 Sup T1 세포주를 24웰 평판에 넣고 여러 농도의 본 발명의 화합물을 가하였다. 여기에 HIV-1 접종원을 200TCID₅₀(200t배의 50% 세포감염 농도, issue culture infectious dose)을 넣고 rpmi-1640 배지를 가한 후 37℃에서 배양하였다. Sup T1의 경우에는 3 내지 9일 후 신키티움이 형성된 갯수를 조사하였다. H9의 경우 3일 간격으로 배양액의 3/4을 같은 농도의 새 배양액으로 바꾸어 주었다. 9일 후 배양액 6ml를 취해 1000rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상등액 5ml를 취해 2.5ml의 30% PEG(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 6000 내지 약 8000)와 0.4M NaCl을 가하고 0℃에서 하룻밤 정도 방치하여 바이러스를 침전시켰다. 2000rpm으로 45분간 원심 분리하여 상등액은 버리고, 침전물을 20㎕ 역전사효소 현탁완충액을 가하여 희석시켜서 에펜도르프 관에 넣어 -70℃로 사용시까지 보관한다. 현탁 완충액의 조성은50mM 트리스 완충액(Sigma), pH 7.5, 1mM 디티오트레이톨, 20% 글리세롤, 0.25M KC1과 트리톤 X-100 0.25%가 포함되어 있다. 상기 현탁액을 드라이아이스에서 2분간 얼렸다가 2분간 37℃에서 녹이는 과정을 세번 반복한 후 4℃에서 원심분리하여 상등액을 사용하여 역전사효소 검정한다. 역전사효소 검정용액에는 상기 바이러스 현탁액 10㎕, 10㎕의 250mM 트리스 완충액, pH 7.5, 37.5mM MgCl₂0.25% 트리톤 X-100 용액, 1.2㎕의 200mM 디티오트레이톨, 5㎕의 100μM 올리고(dT)-폴리(A)(베링거 만하임(BoeringerMannheim)), 12-18올리고머),³H이 포함된 TTP(티민트리포스페이트) 1㎕(1μCi). 및 23.6㎕의 물을 혼합하여 사용하였다. 1시간후 상기 용액들을 왓트만 DEB1 여과지에 부은 후 2×SSC 완충용액에 넣는다. 2×SSC 완충용액으로 3번 세척한 후(1회에 10분 정도 소요), 95%의 메탄올로 10초간 2회 세척한다. 여과지를 알루미늄 호일에 넣고 적외선 전구로 말린 후 액체 섬광 계수기로 정량한다.

항 AIDS제의 최대 허용치를 결정하기 위한 세포 독성을 검사하기 위해, H9 세포 또는 Sup T1 세포에 0.1μM 내지 100μM 범위의 화합물을 가한 후 rpmi-1640 배지에서 37℃로 배양하고, 3일 간격으로 배양액을 바꾸어 주면서 세포의 증식 정도를 트리판 블루다이 익스크루전 방법(Trypan blue dye exclusion technique)으로 혈구계산판에서 2주간 관찰한 후 세포독성 CT₅₀을 결정하였다. 측정된 항세균 활성 및 세포독성의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

* kina/K₁가 10⁹이상일 경우 KINSIM/FITSIM으로 정확한 값을 구하는데 한계가 있음[Willams, J. W. and Morrson. J.F.(1979) Methods, Enzymol. 63, 437-466 ; Zimmerle, C.T. and Frieden, C.(1989)Biochem. J., 258, 381-387].

Claims

하기 일반식(I)의 시스-에폭사이드 구조를 갖는 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물 :

상기 식에서, R₁및 R₂는 각각 독립적으로 수소원자 및 저급알킬 중에서 선택되고, R₃는 저급알킬, 방향족 라디칼로 치환된 저급알킬, 아릴 및 탄소수 3 내지 8의 사이클릭 알킬중에서 선택되고, R₄는 C₁-C₄알킬이고, n은 0, 1 또는 2이고, A는 하기 일반식(II)의 그룹이고,

(X) (Y)mR₅(II)

(상기 식에서, X는 -CO, -COCO-, -SO-, -SO₂- 또는 CS이며, Y는 -O- , -NH 또는 -NCH₃-이고, m은 0 또는 1이고, R₅는 사이클로헥실메틸, 벤질, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 피리딜, 피리딜메틸, 이소퀴놀리닐옥시메틸, 나프톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 벤조피라닐 및 4-옥소-4H-1-벤조피라닐로 이루어진 그룹중에서 선택된다), B는 하기 일반식(III)의 그룹이다:

(상기 식에서, Z는 O, NH 또는 -NCH₃-이고, R₆및 R₇은 각각 독립적으로 저급알킬 방향족 라디칼로 치환된 저급알킬, 탄소수 3 내지 8의 사이클릭 알킬로 치환된 저급알킬 및 방향족 라디칼중에서 선택된다).
제1항에 있어서, R₁및 R₂가 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이고, R₃가 이소부틸, 사이클로펜틸메틸, 사이클로헥실메틸 또는 벤질이며, R₄가 수소, 메틸 또는 에틸이고, R₅가 사이클로헥실메틸, 벤질, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌린, 피리딜, 피리딜메틸, 이소퀴놀리닐옥시메틸, 나프톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 벤조피라닐 또는 4-옥소-4H-1-벤조피라닐이며, R₆및 R₇이 각각 독립적으로 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로프로필메틸 또는 페닐인 화합물.
제1항에 있어서, {(5S)-[N-(2-퀴놀린 카보닐)-(β-메탄설포닐)-L-알라닌일]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드, {(5S)-[N-(2-퀴놀린 카보닐)-(β-메탄설포닐) -L-알라닌일]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[N-(2-퀴놀린 카보닐)-(β-메탄설포닐)-L-알라닌일]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드, {(5S)-[N-벤질옥시카보닐)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드, {(5S)-[N-벤질옥시카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(l-페닐-2-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[N-벤질옥시카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-[디(이소프로필)메틸]아미드,{(5S)-[N-(2-퀴놀린카보닐)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드, {(5S)-[N-(2-퀴놀린 카보닐)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-2-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[N-(2-퀴놀린 카보닐)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드, {(5S)-[N-(2-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드}, {(5S)-[N-(2-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)프로필]아미드}, {(5S)-[N-(2-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드, {(5S)-[N-(3-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드,{(5S)-[N-(3-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[N-(3-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-[디(이소프로필)메틸]아미드, {(5S)-[N-(4-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드,{(5S)-[N-(4-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[N-(4-피리딜메톡시)카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-[디(이소프로필)메틸]아미드,{(5S)-[(N-(1-피놀리딘)아세틸-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드, {(5S)-[(N-(l-피놀리딘)아세틸-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-2-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[(N-(1-피놀리딘)아세틸-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드,{(5S)-[(N-아세틸)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드, {(5S)-[(N-아세틸)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2S)-[(1-페닐-2-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[(N-아세틸)-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드,{(5S)-[N-(4-옥소-4H-1-벤조피란-2-카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아미드, {(5S)-[N-(4-옥소-4H-l-벤조피란-2-카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)프로필]아미드, {(5S)-[N-(4-옥소-4H-1-벤조피란-2-카보닐-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드, {(5S)-[N-(5-이소퀴놀리닐옥시)아세틸-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)메틸]아미드, {(5S)-[N-(5-이소퀴놀리닐옥시)아세틸-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-3-메틸)부틸]아이드, 및 {(5S)-[N-(5-이소퀴놀리닐옥시)아세틸-(β-메탄설포닐)-L-발리닐]아미노}-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[(1-페닐-2-메틸)프로필]아미드, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물.
하기 일반식(가)의 화합물을 하기 일반식(나)의 화합물과 커플링 반응시킨 후 산화시켜 하기 일반식(다) 화합물을 얻고; 이 일반식(다)의 화합물로부터 벤질옥시카보닐 보호그룹을 제거한 뒤, 하기 일반식(마) 화합물과 커플링 반응시킨 후 산화시켜 하기 일반식(바)의 화합물을 얻고; 이 화합물(마)로부터 벤질옥시카보닐 보호그룹을 제거한 뒤 하기 일반식(아) 또는 (자)의 화합물과 커플링 반응시킴을 포함하는, 제1항의 일반식(I) 화합물의 제조방법.

상기 식에서, A, B, R_l, R₂, R₃및 R₄는 제1항에서 정의한 바와 같다.
하기 일반식(차)의 화합물을 -78℃에서 칼륨 헥사메틸디실라잔(KHMDS)의 존재하에, 하기 일반식(카)의 화합물과 반응시켜 하기 일반식(타)의 화합물을 수득한 다음, 이를 산 촉매 존재하에, t-부탄올중에서 용매의 환류온도로 가열하여 하기 일반식(가) 화합물을 제조하는 방법.

상기 식에서, X는 할로겐 원자, 예를 들면 Br 또는 1이고, R₃는 제1항에서 정의한 바와 같다.
제1항에 따른 화합물의 치료 효과량과 약제학적으로 허용가능한 담체, 분산제, 수화제, 불활성 희석제, 부형제 및 윤활제중에서 선택된 1종 이상의 보조제를 함유하는 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 조성물.