CN112022855A - PLpro蛋白抑制剂在治疗或预防新型冠状病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PLpro蛋白抑制剂在制备治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)感染相关疾病的药物的用途，并提供包含PLpro抑制剂的用于制备治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)感染相关疾病的医药组合物。

Description

PLpro蛋白抑制剂在治疗或预防新型冠状病毒感染的药物中 的应用

技术领域

本发明涉及PLpro蛋白抑制剂在制备治疗或预防新型严重急性呼吸综 合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病的药物的用途，并提供包含 PLpro抑制剂的用于制备治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染相关疾病的医药组合物。

背景技术

冠状病毒是一类能够造成重大健康风险的正链RNA病毒。冠状病毒 在遗传学上被分为四个主要的病毒属：甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)、 乙型冠状病毒(Betacoronavirus)、丙型冠状病毒(Gammacoronavirus)和 丁型冠状病毒(Deltacoronavirus)。前两个属主要感染哺乳动物，而后两 个属主要感染鸟类。在发现新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)之前，人们已鉴定 出六种人类冠状病毒，其中包括HCoV-NL63和HCoV-229E，它们属于甲 型冠状病毒；HCoV-OC43、HCoV-HKU1、重症急性呼吸综合征(SARS) 冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)， 属于乙型冠状病毒。SARS-CoV和MERS-CoV被认为是高致病性的，而 且SARS-CoV和MERS-CoV可能由蝙蝠传播给果子狸或单峰驼，最后传 播给人类。新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2，引发新型 冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人类的冠状病毒。

新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus-2,SARS-CoV-2)导致全球大流行，引发新型冠状病 毒肺炎(COVID-19)疫情。迄今已有超过500万人感染新冠病毒，数十 万人死于病毒感染，并且感染人数还在持续增加，造成了严重的社会危害 和经济损失。目前尚未有靶向疗法，有效的治疗手段也极度缺乏。因此， 迫切需要开发针对SARS-CoV-2的新型抗病毒药物，但到目前为止，尚未 开发出被验证有效的SARS-CoV-2抗病毒药物。

硫鸟嘌呤(英文名称：Tioguanine，也称作硫代鸟嘌呤，6-硫代鸟嘌 呤，或者：6-thioguanine，缩写6-TG)，其结构式如下：

硫鸟嘌呤(6-TG)是一种已知的用于治疗急性骨髓性白血病(AML) 急性淋巴性白血病(ALL)和慢性粒细胞性白血病(CML)的化疗药物， 可口服给药。常见的副作用有骨髓抑制、肝损伤和口腔炎症等，具有硫嘌 呤甲基转移酶缺陷的人有更高的副作用风险。硫鸟嘌呤属于抗代谢物类药 物，是鸟嘌呤的类似物，可扰乱DNA和RNA合成。

在硫鸟嘌呤的诸多衍生物中，6-巯基嘌呤(英文名称：6-mercaptopurine， 缩写6-TG-5)，也是一种已知的用于治疗急性骨髓性白血病(AML)急性 淋巴性白血病(ALL)和慢性粒细胞性白血病(CML)的化疗药物。其进 入体内后代谢为硫鸟嘌呤进而发挥与其类似的作用。此外，硫鸟嘌呤的其 他衍生物均为已知化合物。

发明内容

本发明涉及PLpro蛋白抑制剂用于制备治疗或预防新冠病毒感染相关 疾病的药物的用途；在本发明的一个方面，所述PLpro蛋白抑制剂是硫鸟 嘌呤及其衍生物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、 多晶型物、溶剂合物、代谢物或同位素标记的化合物。

本发明还提供了治疗或预防新冠病毒感染相关疾病的药物组合物，其 中包含作为活性成分的PLpro蛋白抑制剂；在本发明的一个方面，所述 PLpro蛋白抑制剂是硫鸟嘌呤及其衍生物或其药学上可接受的盐、酯、立 体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或同位素标记的化 合物。

本发明还提供了一种治疗或预防新冠病毒感染相关疾病的方法，包括 向出现新冠病毒感染症状的患者、新冠病毒疑似感染者以及处于较高的新 冠病毒感染风险的人群施用有效剂量的包含作为活性成分的PLpro蛋白抑 制剂的药物组合物。

附图说明

图1A：新冠病毒的PLpro的蛋白纯化：新冠病毒的PLpro考马斯亮 蓝染色图

图1B：新冠病毒的PLpro的蛋白纯化：PLpro蛋白的体积排阻色谱图， 蛋白以单体形式的均一状态出峰

图2：硫鸟嘌呤对新冠病毒的PLpro酶抑制活性检测：6-TG在体外对 PLpro剪切底物Ub-AMC的抑制活性

图3A和3B：硫鸟嘌呤在细胞中对新型冠状病毒抑制活性(A：48h； B：72h)

图4A和4B：硫鸟嘌呤及其衍生物对PLpro的抑制活性实验：(A) 衍生物化学结构和单浓度点的活性测试；(B)衍生物的体外对PLpro蛋白 的抑制活性IC50。

具体实施方式

由于SARS-CoV-2复制的复杂性，许多过程被认为是新型冠状病毒生 命周期必不可少的，因此提供了许多潜在的抑制病毒复制的靶标。冠状病 毒的基因组大小在26000至32000个碱基之间，包括两个大的开放阅读框 (ORF)，第一个ORF大约占整个基因组的67％，编码16种非结构蛋白 (Non-structural protein，nsp)，剩下的ORF编码辅助蛋白和结构蛋白。第 一个阅读框编码包含16个非结构蛋白的多聚蛋白，驻留在多聚蛋白中的 两种半胱氨酸蛋白酶，即木瓜蛋白酶样蛋白酶(Papain-like protease，PLpro) 和一种3C样蛋白酶(3C-like protease，3CLpro)，催化它们自身的释放以 及其他Nsps从该多聚蛋白的释放，进一步启动病毒介导的RNA复制。 PLpro在三个位置切割SARS-CoV-2 ORF1a/1ab，以释放自身(nsp3)、nsp1 和nsp2，多聚蛋白的其余部分被3CLpro切割。有研究表明PLpro除具有 在病毒肽裂解方面的重要作用外，还发挥去泛素化和去ISG15化功能，PLpro蛋白酶通过切除泛素和ISG15，从而产生宿主抗病毒天然免疫反应 负调节作用，有助于病毒对宿主免疫逃逸。因此，SARS-CoV-2的木瓜样 蛋白酶(PLpro)对于病毒复制至关重要。这种蛋白酶不仅负责将病毒多 聚蛋白加工成其功能单元，而且在帮助SARS-CoV-2逃避人类免疫系统中 也起着重要作用。据此，发明人推测抑制PLpro(SARS-CoV-2)有治疗这 种高致死率的呼吸疾病(新型冠状病毒肺炎)的潜力。

另外，发明人发现硫鸟嘌呤(6TG)能够在体外抑制PLpro(SARS-CoV-2) 的剪切活性，进一步的细胞实验也表明6-TG能够高效地抑制新冠病毒在 Vero细胞中的复制(EC50＝2.6-3.5μM，见图3)，从而作为治疗或者预 防新冠病毒感染相关疾病。

另外，发明人通过对6TG及其衍生物对靶标蛋白PLpro的抑制活性的 进一步研究，发现了6TG及其衍生物的构效关系。如图4所示，因二者6 号位的硫羰基C＝S被替换成了羰基C＝O，6-TG-4和6-TG-6没有抑制活 性，；而其他的6-TG-1/2/3/5对PLpro蛋白的均有抑制活性。由此，发明人 发现硫鸟嘌呤6号位的硫羰基对6-TG及其衍生物对靶标蛋白PLpro的抑制活性是不可或缺的。

本发明中涉及的硫鸟嘌呤及其衍生物均为是本领域公知的化合物，其 化合物本身及其合成方法均是本领域技术人员公知的。

本发明的一个方面涉及PLpro蛋白抑制剂用于制备治疗或预防新型严 重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病的药物的用途。

本发明的另一个方面涉及硫鸟嘌呤及其衍生物或其药学上可接受的盐、 酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或同位素标 记的化合物用于制备治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染相关疾病的药物的用途，其中所述硫鸟嘌呤及其衍 生物具有式I、式II或式III的结构，

其中：

R₁、R₂、R₃以及R₄每次出现时各自独立地选自H、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基以及C_3-6环烷基；

R₅以及R₆每次出现时各自独立地选自H、卤素、-OH、-COOH、-CN、 -NO₂、-N(R)₂、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基、-W-C_1-6烷基、-C_1-6亚烷基-W-R、 -W-C_1-6亚烷基-W’-R、-W-C_2-6烯基、-C_2-6亚烯基-W-R、-W-C_2-6亚烯基-W’-R 和C_3-6环烷基，其中所述亚烷基和亚烯基任选地进一步被一个或多个W间 隔；

W和W’每次出现时各自独立地选择O、C(＝O)、C(＝O)O、NR、NC(＝O)、 N(S＝O)、NS(＝O)₂、S、S＝O和S(＝O)₂；

R每次出现时各自独立地选自H、C_1-6烷基和C_3-6环烷基；

R₆以及R₇每次出现时各自独立地选自包括各种立体异构体的核糖残基 或脱氧核糖残基。

在一种具体的实施方式中，硫鸟嘌呤及其衍生物为：6-硫代-2-羟基嘌呤、 6-硫代鸟嘌呤核苷、2,6-二巯基嘌呤、6-巯基嘌呤或硫鸟嘌呤。其结构式如 下：

本发明的另一个方面提供治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状 病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病的医药组合物，这些医药组合物包含 PLpro蛋白抑制。

本发明的另一个方面提供治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状 病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病的医药组合物，这些医药组合物包含 本发明涉及的硫鸟嘌呤及其衍生物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构 体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或同位素标记的化合物。

在一种优选的实施方式中，硫鸟嘌呤及其衍生物选自6-硫代-2-羟基嘌 呤、6-硫代鸟嘌呤核苷、2,6-二巯基嘌呤、6-巯基嘌呤或硫鸟嘌呤；特别优 选为6-硫代鸟嘌呤核苷或硫鸟嘌呤。

除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含 义与本领域技术人员通常所理解的相同。本文中使用的技术指在本领域中 通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员理解的技术的变化或等同 技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员可以理解，但仍然阐 述以下定义以更好地解释本发明。

如本文中所使用，术语“亚烷基”表示饱和二价烃基，优选表示具有1、 2、3、4、5或6个碳原子的饱和二价烃基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基 或亚丁基。

如本文中所使用，术语“亚烯基”表示包含一个或多个双键的二价烃基， 其优选具有2、3、4、5或6个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基或亚烯 丙基。当本发明的化合物含有亚烯基时，所述化合物可以纯E(异侧 (entgegen))形式、纯Z(同侧(zusammen))形式或其任意混合物形式存在。

如本文中所使用，术语“烷基”定义为直链或支链饱和脂肪族烃。在一 些实施方案中，烷基具有1至12个，例如1至6个碳原子。例如，如本 文中所使用，术语“C_1-6烷基”指1至6个碳原子的线性或支化的基团(例如 甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊 基或正己基)，其任选地被1或多个(诸如1至3个)适合的取代基如卤素取 代(此时该基团被称作“卤代烷基”)(例如CF₃、C₂F₅、CHF₂、CH₂F、CH₂CF₃、 CH₂Cl或-CH₂CH₂CF₃等)。术语“C_1-4烷基”指1至4个碳原子的线性或支化 的脂肪族烃链(即甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基 或叔丁基)。

如本文中所使用，术语“环烷基”指饱和或不饱和的非芳族单环或多环 (诸如双环)烃环(例如单环，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚 基、环辛基、环壬基，或双环，包括螺环、稠合或桥连系统(诸如双环[1.1.1] 戊基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或双环[5.2.0]壬基、十氢化萘基等)， 其任选地被1或多个(诸如1至3个)适合的取代基取代。所述环烷基具有 3至15个碳原子。例如，术语“C3-6环烷基”指3至6个成环碳原子的饱和或不饱和的非芳族单环或多环(诸如双环)烃环(例如环丙基、环丁基、环 戊基或环己基)，其任选地被1或多个(诸如1至3个)适合的取代基取代， 例如甲基取代的环丙基。

如本文中所使用，术语“卤代”或“卤素”基团定义为包括F、Cl、Br或 I。

术语“取代”指所指定的原子上的一个或多个(例如1个、2个、3个或 4个)氢被所选择的基团代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的 正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物。所选的替代基团数量是当这 种组合形成稳定的化合物时才允许的。

如果取代基被描述为“独立地选自”，则各取代基可与另一(其他)取代 基相同或不同。

除非指明，否则如本文中所使用，取代基的连接点可来自取代基的任 意适宜位置。

本发明还包括所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其与本发明 的化合物相同，除了一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质 量数不同于在自然界中占优势的原子质量或质量数的原子替代。适合包含 入本发明的化合物中的同位素的实例包括(但不限于)氢的同位素(例如氘 (D，²H)、氚(T，³H))；碳的同位素(例如¹¹C、¹³C及¹⁴C)；氯的同位素(例 如³⁶Cl)；氟的同位素(例如¹⁸F)；碘的同位素(例如¹²³I及¹²⁵I)；氮的同位素(例如¹³N及¹⁵N)；氧的同位素(例如¹⁵O、¹⁷O及¹⁸O)；磷的同位素(例如³²P)； 及硫的同位素(例如³⁵S)。某些同位素标记的本发明的化合物可用于药物和 /或底物组织分布研究(例如分析)中。本发明的药学上可接受的溶剂合物包 括其中结晶溶剂可被同位素取代的那些，例如，D₂O、丙酮-d6或DMSO-d6。

术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具 有一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)不对称中心的化合物中，其可 产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对 映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。类似地，本 发明的化合物可以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合 物(通常称作互变异构体)存在。互变异构体的代表性实例包括酮-烯醇互变异构体、苯酚-酮互变异构体、亚硝基-肟互变异构体、亚胺-烯胺互变异构 体等。例如，二氢嘧啶基团在溶液中可以下列互变异构形式平衡存在：要 理解，本申请的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的异构体或其 混合物。

本发明涵盖本发明化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为 单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。

还应当理解，本发明的化合物可以游离形式存在用于治疗，或适当时， 以其药学上可接受的衍生物形式存在。在本发明中，药学上可接受的衍生 物包括但不限于，药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、代谢物、同位素标 记的化合物或前药，在将它们向需要其的患者给药后，能够直接或间接提 供本发明的化合物或其代谢物或残余物。因此，当在本文中提及“本发明 的化合物”时，也意在涵盖化合物的上述各种衍生物形式。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。

适合的酸加成盐由形成药学可接受盐的酸来形成，包括适当的无机酸 和有机酸。实例包括天冬氨酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐 /硫酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、 氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲基硫 酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈 酸盐及其它类似的盐。

适合的碱加成盐由形成药学可接受盐的碱来形成，包括适当的无机碱 和有机碱。实例包括铝盐、精氨酸盐、胆碱盐、二乙胺盐、赖氨酸盐、镁 盐、葡甲胺盐、钾盐及其它类似的盐。

适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。用于制备本发明的化 合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。

如本文中所使用，术语“酯”意指衍生自本申请中各个通式化合物的酯， 其包括生理上可水解的酯，可在生理条件下水解以释放游离酸或醇形式的 本发明的化合物。本发明的化合物本身也可以是酯。

本发明的化合物可以溶剂合物(例如：水合物)的形式存在，其中本发 明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如 水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比 存在。

在本发明的范围内还包括本发明的化合物的代谢物，即在给药本发明 的化合物时体内形成的物质。这样的产物可由例如被给药的化合物的氧化、 还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、酶解等产生。因此，本发明包括 本发明的化合物的代谢物，包括通过使本发明的化合物与哺乳动物接触足 以产生其代谢产物的时间的方法制得的化合物。

新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病以 发热、干咳、乏力为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和 腹泻等症状。个别患者影像学肺炎表现严重，但却缺乏临床症状。重症患 者多在发病1周后(但也有患者在发病20d以后，甚至在病程中2次发病 时)出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者可快速进展为ARDS、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。 值得注意的是，重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。

本发明还提供药物组合物，其包含预防或治疗有效量的本发明的化合 物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶 剂合物、代谢物、同位素标记的化合物。在一种实施方式中，所述药物组 合物进一步包含一种或多种非PLpro蛋白抑制剂。例如，用于预防或治疗 病毒性疾病的其它治疗剂。在一种实施方式中，所述药物组合物还包括药 学上可接受的载体

本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅 剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和 /或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/ 风险比相应的其它问题或并发症。

在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限 于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油， 例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内 给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作 为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、 乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、 滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可 以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标 准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、 碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)中所述。

本发明的药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它 们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、 肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局 部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。对于这些给药途径，可以采用适 合的剂型给药。

所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、 乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可 注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。

如本文中所使用的术语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所 治疗病症的一或多种症状的化合物的量。可调整给药方案以提供最佳所需 响应。例如，可以单次给药，可随时间施用数个分剂量，或可根据治疗情 况按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随病况的类型及严重性而变 化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体 的给药方案应是根据个体需要判断来随时间调整。

所给药的本发明的化合物的量会取决于所治疗的个体、病症或病况的 严重程度、给药的频率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有 效剂量在每日每kg体重约0.01至约400mg，例如约0.02至约200mg/kg/ 日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.7mg/日至约 28000mg/日，例如约1.4mg/日至约14000mg/日。在一些情况下，不高于 前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引 起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分 成数个较小剂量以在一整天中给药。

本发明的化合物在药物组合物中的含量或用量可以是约0.01mg至约 10000mg，适合地是0.1-5000mg，优选0.5-3000mg，更优选1-1500mg， 特别优选1-500mg，例如1.5mg、2mg、4mg、10mg、25mg、100mg、200mg 等。

除非另外说明，否则如本文中所使用，术语“治疗”意指逆转、减轻、 抑制这样的术语所应用的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种 症状的进展，或预防这样的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种 症状。

实施例1：PLpro蛋白质诱导表达与纯化

将PLpro原核表达质粒(表达后的PLpro蛋白氨基酸序列参见SEQ ID NO.1)转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，并在LB培养基中生长， 在37℃生长直到OD600为0.6-0.8时。添加0.5mM IPTG诱导蛋白质表 达并加入1mM氯化锌(ZnCl₂)，然后大肠杆菌在18℃过夜生长。离心收 集后，用50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10mM Imidazole、2mM DTT 以及pH＝8.5的缓冲液重新悬浮细胞沉淀，通过超声波进行破碎，并在 18000rpm下离心，取上清液。用His-TRAPTM色谱柱纯化，最后用缓冲 液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mMImidazole、1mM DTT，pH 7.4) 洗出，进一步在凝胶色谱柱上进一步纯化(Superdex 20016/60，GE)，SEC 缓冲液为20mM Tris-HCl、100mM NaCl、1mMDTT，其pH7.4。纯化后 的PLpro蛋白浓缩到5-10毫克/毫升，储存用于结晶。新型冠状病毒的PLpro 蛋白纯化结果请见图1A和图1B，图1A中示出了与新型冠状病毒分子量 相符合的条带处出现了明显且唯一的染色带；图1B示出PLpro蛋白以单 体的形式均一状态出峰。

实施例2：体外实验测定硫鸟嘌呤(6-TG)抑制PLpro蛋白的活性(IC50)

反应体系为50μL，其中PLpro浓度为30nM、底物Ub-AMC(Boston Biochem)浓度为250nM、反应缓冲液为50mM Hepes(pH＝7.5)、0.01％ Trixton X-100、0.1mg/ml BSA和2mMDTT。加入梯度浓度(100、50、 25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78μM)的抑制剂硫鸟嘌呤(6-TG)，然 后使用酶标仪测量荧光发射强度(激发：340nm；发射：430nm)，根据荧 光强度计算硫鸟嘌呤(6-TG)抑制PLpro酶的活性(IC50)，抑制曲线使 用GraphPad Prism进行拟合。拟合结果请见图2.

实施例3：P3实验室测试硫鸟嘌呤(6-TG)对新冠病毒的抑制活性

(1)化合物细胞毒性试验：

将1×10⁴的Vero细胞(来源于：VERO细胞来自中国科学院上海生科 院细胞资源中心)接种在96孔板中，设立三个复孔，37度生长20-24小 时，去除培养基，加入100μL含有不同浓度化合物(100、50、25、12.5、 6.25、3.125、1.56、0μM)的新培养基生长72小时，以DMSO为对照， 使用MTS/CCK8试剂(上述试剂购自：北京索莱宝科技有限公司，货号 CK04-500T)，测定细胞活性，计算化合物的细胞毒性(CC50)。

(2)化合物抑制病毒活性试验：

将1×10⁴Vero细胞接种在96孔板中，设立三个复孔，37度生长20-24 小时，将不同浓度的候选化合物(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、 0μM)提前预处理1小时，然后使用SARS-CoV-2深圳临床分离株 BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020，按照感染复数MOI＝0.01感染靶细胞， 孵育2小时后，随后去除病毒-化合物混合物，加入新的含有候选化合物(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0μM)的培养基，继续培养 48小时，以DMSO处理作为阴性对照。.提取上清培养基中的病毒RNA， 进行反转录获得转录本。将含有COVID-19病毒的S基因(其对应的核苷 酸序列参见SEQ ID NO.2)的线性化质粒进行体外转录，用于制作标准曲 线，定量病毒的拷贝数。引物及探针信息：TaqMan primers for COVID-19 virus：5‘TCCTGGTGATTCTTCTTCAGG-3’和 5‘-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGC-3’和COVID-19病毒探针 5’-FAM-AGCTGCAGCACCAGCTGTCCA-BHQ1-3’。数据分析，获得候选 化合物抑制病毒复制数据等。处理数据后得到的6-TG在体外对PLpro剪 切底物Ub-AMC的在48小时及72小时的抑制活性数据请见图3。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学深圳研究院

深圳市第三人民医院

<120> PLpro蛋白抑制剂在治疗或预防新型冠状病毒感染的药物中的应用

<130> I2020TC4591CB

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2

<400> 1

Glu Val Arg Thr Ile Lys Val Phe Thr Thr Val Asp Asn Ile Asn Leu

1 5 10 15

His Thr Gln Val Val Asp Met Ser Met Thr Tyr Gly Gln Gln Phe Gly

20 25 30

Pro Thr Tyr Leu Asp Gly Ala Asp Val Thr Lys Ile Lys Pro His Asn

35 40 45

Ser His Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Val Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu

50 55 60

Arg Val Glu Ala Phe Glu Tyr Tyr His Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu

65 70 75 80

Gly Arg Tyr Met Ser Ala Leu Asn His Thr Lys Lys Trp Lys Tyr Pro

85 90 95

Gln Val Asn Gly Leu Thr Ser Ile Lys Trp Ala Asp Asn Asn Cys Tyr

100 105 110

Leu Ala Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gln Gln Ile Glu Leu Lys Phe Asn

115 120 125

Pro Pro Ala Leu Gln Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ala

130 135 140

Ala Asn Phe Cys Ala Leu Ile Leu Ala Tyr Cys Asn Lys Thr Val Gly

145 150 155 160

Glu Leu Gly Asp Val Arg Glu Thr Met Ser Tyr Leu Phe Gln His Ala

165 170 175

Asn Leu Asp Ser Cys Lys Arg Val Leu Asn Val Val Cys Lys Thr Cys

180 185 190

Gly Gln Gln Gln Thr Thr Leu Lys Gly Val Glu Ala Val Met Tyr Met

195 200 205

Gly Thr Leu Ser Tyr Glu Gln Phe Lys Lys Gly Val Gln Ile Pro Cys

210 215 220

Thr Cys Gly Lys Gln Ala Thr Lys Tyr Leu Val Gln Gln Glu Ser Pro

225 230 235 240

Phe Val Met Met Ser Ala Pro Pro Ala Gln Tyr Glu Leu Lys His Gly

245 250 255

Thr Phe Thr Cys Ala Ser Glu Tyr Thr Gly Asn Tyr Gln Cys Gly His

260 265 270

Tyr Lys His Ile Thr Ser Lys Glu Thr Leu Tyr Cys Ile Asp Gly Ala

275 280 285

Leu Leu Thr Lys Ser Ser Glu Tyr Lys Gly Pro Ile Thr Asp Val Phe

290 295 300

Tyr Lys Glu Asn Ser Tyr Thr Thr Thr Ile Lys Ala Ala

305 310 315

<210> 2

<211> 3822

<212> DNA

<213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2

<400> 2

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

Claims (9)

1.PLpro蛋白抑制剂在制备用于治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病的药物的用途。

2.权利要求1所述的用途，所述PLpro蛋白抑制剂是硫鸟嘌呤及其衍生物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或同位素标记的化合物，其中所述硫鸟嘌呤及其衍生物具有式I、式II或式III的结构，

其中：

R₁、R₂、R₃以及R₄每次出现时各自独立地选自H、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基以及C_3-6环烷基；

R₅以及R₆每次出现时各自独立地选自H、卤素、-OH、-COOH、-CN、-NO₂、-N(R)₂、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基、-W-C_1-6烷基、-C_1-6亚烷基-W-R、-W-C_1-6亚烷基-W’-R、-W-C_2-6烯基、-C_2-6亚烯基-W-R、-W-C_2-6亚烯基-W’-R和C_3-6环烷基，其中所述亚烷基和亚烯基任选地进一步被一个或多个W间隔；

W和W’每次出现时各自独立地选择O、C(＝O)、C(＝O)O、NR、NC(＝O)、N(S＝O)、NS(＝O)₂、S、S＝O和S(＝O)₂；

R每次出现时各自独立地选自H、C_1-6烷基和C_3-6环烷基；

R₆以及R₇每次出现时各自独立地选自包括各种立体异构体的核糖残基或脱氧核糖残基。

3.权利要求2所述的用途，其中所述硫鸟嘌呤及其衍生物为：6-硫代-2-羟基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤核苷、2,6-二巯基嘌呤、6-巯基嘌呤或硫鸟嘌呤。

4.权利要求2所述的用途，其中所述硫鸟嘌呤及其衍生物为：6-硫代鸟嘌呤核苷或硫鸟嘌呤。

5.一种治疗或预防新型严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关疾病的药物组合物，其特征在于，包括一种或多种PLpro蛋白抑制剂作为活性成分。

6.权利要求5所述的药物组合物，所述PLpro蛋白抑制剂是硫鸟嘌呤及其衍生物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或同位素标记的化合物，其中所述硫鸟嘌呤及其衍生物具有式I、式II或式III的结构，

其中：

R₁、R₂、R₃以及R₄每次出现时各自独立地选自H、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基以及C_3-6环烷基；

R₅以及R₆每次出现时各自独立地选自H、卤素、-OH、-COOH、-CN、-NO₂、-N(R)₂、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基、-W-C_1-6烷基、-C_1-6亚烷基-W-R、-W-C_1-6亚烷基-W’-R、-W-C_2-6烯基、-C_2-6亚烯基-W-R、-W-C_2-6亚烯基-W’-R和C_3-6环烷基，其中所述亚烷基和亚烯基任选地进一步被一个或多个W间隔；

W和W’每次出现时各自独立地选择O、C(＝O)、C(＝O)O、NR、NC(＝O)、N(S＝O)、NS(＝O)₂、S、S＝O和S(＝O)₂；

R每次出现时各自独立地选自H、C_1-6烷基和C_3-6环烷基；

R₆以及R₇每次出现时各自独立地选自包括各种立体异构体的核糖残基或脱氧核糖残基。

7.权利要求5或6所述的药物组合物，进一步包含一种或多种非PLpro蛋白抑制剂。

8.权利要求5或6所述的药物组合物，还包括药学上可接受的载体。

9.权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。

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