DK149092B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af tripeptider eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

i 149092

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte tripeptider med formlerne H-LYS-SAR-GLN-OH og H-LYS-SAR-GLN-NH,, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

05 Det er velkendt, at mange polypeptider er blevet isoleret fra forskelligt væv og organer (herunder blodet) fra dyr. Mange af disse polypeptider har relation til legemets immunfunktion, som f.eks. de forskellige immun-globuliner, det thymiske hormon thymopoietin, og lignende. Rent faktisk har en af de foreliggende opfindere iso-10 leret og syntetiseret adskillige af disse polypeptider som beskrevet i f.eks. U.S.A. patentskrifter nr. 4.002.602 og 4.077.949 samt i adskillige videnskabelige artikler.

Indtil omkring det seneste tiår havde man ringe viden om thymus, medens man nu ved, at thymus er et af de organer, som er 15 principalt ansvarligt for immunfunktion hos pattedyr og fugle. Trods betydelig interesse for mulige funktioner hos thymus og tidlige overvejelser og forsøg vidste man indtil for nylig kun lidt om thymus' funktion. Det indses imidlertid nu, at thymus er et sammensat organ med både epiteliale (endokrine) og lymfoide (immunologiske) kompo-20 nenter, og thymus er derfor involveret i legemets immunitetsfunktio ner. Thymus består af en epitelial stroma afledt fra den tredie bran-chial-bue og lymfocytter afledt fra stamceller hidrørende fra hæmo-poietisk væv, jf. Goldstein et al., The Human Thymus, Heinemann,

London, 1969. Lymfocytter differentieres inde i thymus og forlader 25 den som modne thymus-afledte celler kaldet T-celler, der cirkulerer til blod, lymfe, milt og lymfeknuder. Induktionen af stamcelle-differentiering inde i thymus synes at medieres af sekretioner af thymus1 epiteliale celler.

Det har i nogen tid været kendt, at thymus er knyttet til lege-30 mets immunitetsegenskaber, og der har derfor været stor interesse for stoffer isoleret fra thymus. I denne henseende er der i de senere år publiceret en relativt stor mængde artikler baseret på videnskabeligt arbejde vedrørende materialer, der er til stede i kvæg-thymus. Den ene af de foreliggende opfindere har således publiceret 35 en række artikler vedrørende research inden for dette område. Relevante publikationer kan f.eks. findes i The Lancet, 20. juli 1968, p. 119-122; Triangle, Vol. II, nr. 1, p. 7-14, 1972; Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 183, p. 230-240, 1971; og 2 149092

Clinical and Experimental Immunology, Vol. 4, nr. 2, p. 181-189, 1969; Nature, Vol. 247, p. 11-14, 1974; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Vol. 71, p. 1474-1478, 1974; Cell, Vol.

5, p. 361-365 og 367-370, 1975; Lancet, Vol. 2, p. 256-259, 1975; 05 Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Vol. 72, p.

11-15, 1975; Biochemistry, Vol. 14, p. 2214-2218, 1974; Nature,

Vol. 255, p. 423-424, 1975.

En anden klasse af lymfocytter med immunfunktion er B-lymfo-cytter eller B-eeller. Disse differentieres i Bursa Fabricii i fugle og 10 af et endnu uidentificeret organ i pattedyr. T-celler og B-celler samvirker i mange immunitetsaspekter. Se f.eks. artikler af en af de foreliggende opfindere i Science, 193, 319 (23. juli, 1976) og Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vo. XLI, 5 (1977).

15 Et nonapeptid-materiale er for nylig blevet isoleret fra svine- serum af J.F. Bach et al. og identificeret som "facteur thymique serique" (FTS). Isoleringen af dette materiale og dets struktur er omhandlet i C. R. Acad. Sc. Paris, t. 283 (29. november 1976,

Series D-1605 og Nature 266, 55 (3. marts 1977). Strukturen af 20 dette nonapeptid er blevet identificeret som GLX-ALA-LYS-SER-GLN--GLY-GLY-SER-ASN, hvori "GLX" repræsenterer enten glutamin eller pyroglutaminsyre. Materialet, hvor GLX er glutamin eller pyro-glutaminsyre er blevet syntetiseret. I disse artikler beskrev Bach, at hans nonapeptid FTS selektivt differentierede T-celler (og ikke 25 B-celler) ved anvendelse af en E-roset-prøve. Bach konkluderede derfor, at hans materiale var et thymisk hormon. For nylig har en mere dybtgående undersøgelse af aktiviteten af dette nonapeptid af en af de foreliggende opfindere vist, at FTS differentierede både T-celler og B-celler og derfor mere lignede ubiquitin i aktivitet end 30 thymopoietin. Brand, Gilmour og Goldstein, Nature, 269, 597-98 (1977).

En af de foreliggende opfindere har i en parallel U.S.A. patentansøgning nr. 960.550, indleveret 17. november 1978 med benævnelsen "New Tetrapeptides and Methods", beskrevet, at tetrapeptiderne 35 H-ALA-LYS-SER-GLN-OH og H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH,, (bl.a.) besidder samme aktivitet som FTS.

149092 3

Det har nu overraskende vist sig, at et syntetiseret tripeptid, der ligner en del af dette FTS-nonapeptid, besidder mange af nona peptidets egenskaber, som er diskuteret i ovennævnte publikationer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man 05 i) binder L-glutamin beskyttet på ot-aminogruppen til en poly merharpiks ved hjælp af covalent binding, hvilken polymer er en sådan, som indeholder en funktionel gruppe, hvortil den beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding, ii) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra L-glutamin-de- 10 len, iii) omsætter med sarcosin beskyttet på ot-aminogruppen, men ikke på α-carboxylgruppen, til kobling af sarcosin til L-glutamin-har-piksen, iv) fjerner den amino-beskyttende gruppe fra sarcosin-delen, 15 v) omsætter med lysin beskyttet på dens or-aminogruppe og på dens ε-gruppe, til kobling af sidstnævnte til sarcosin-L-glutamin-har-piksen, og vi) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra pepti-det med passende reagenser, idet man, når det ønskede polypeptid 20 har formlen H-LYS-SAR-GLN-NHg, enten anvender vandfri ammoniak i forbindelse med en vilkårlig harpiks, eller et vilkårligt passende reagens i forbindelse med en benzhydrylamin-harpiks, og om ønsket fremstiller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af produktet.

De omhandlede tripeptider fremstilles ifølge opfindelsen ved fast-25 fase-peptidsyntese som nærmere beskrevet nedenfor.

I de omhandlede tripeptider er den første og tredie aminosyrerest de samme som henholdsvis den tredie og femte rest i FTS. Den anden rest er sarcosyl. Selv om denne samme sekvens af tre aminosyre-rester findes som en del af visse af de tetrapeptider, som er omhand-30 let i den parallelle patentansøgning nr. 960.550, indleveret 17. november 1978, er det på ingen måde nærliggende, at den kortere sekvens ville besidde samme aktivitet eller rent faktisk nogen aktivitet overhovedet. Det er også helt usædvanligt, at de omhandlede tripeptider har en høj grad af styrke.

35 Det skal forstås, at den terminale carboxylsyregruppe ikke er essentiel for tripeptidets biologiske aktivitet, således som det er tilfældet for visse polypeptider. Inden for den foreliggende opfindelses rammer falder derfor også amidet af ovennævnte forbindelse.

4 149092

Dette kan kemisk symboliseres som: h2n-ch-con-ch2conh-ch-conh2 4H2}4 ^H3 (<?V2 05 NH2 CONH2 H—-LYS - SAR - GLN - NHg

Inden for opfindelsens rammer falder endvidere tilvejebringelsen af de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af tripeptiderne.

10 Som syrer, der er i stand til at danne safte med peptiderne, kan nævnes uorganiske syrer såsom saltsyre, hydrogenbromidsyre, per-chlorsyre, salpetersyre, thiocyansyre, svovlsyre, phosphorsyre, etc. og organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, 15 maleinsyre, fumarsyre, anthranilsyre, kanelsyre, naphthalensulfon-syre eller suffanilsyre, f.eks.

I den foreliggende beskrivelse er peptidernes aminosyrekompo-nenter af nemhedsgrunde identificeret ved forkortelser. Disse forkortelser er følgende: 20

Aminosyre Forkortelse

L-alanin ALA

L-asparagin ASN

L-serin SER

25 L-glutamin GLN

L-lysin LYS

Glycin GLY

Sarcosin SAR

De omhandlede tripeptider har vist sig at udvise egenskaber, 30 der ligner egenskaberne af nonapeptidet FTS isoleret fra svineblod som beskrevet i ovennævnte artikler af Bach et al. De ifølge opfindelsen tilvejebragte tripeptider udmærker sig især ved deres evne til at inducere differentieringen af T-prækursor-celler samt B-præ-kursor-celler.

35 Det har vist sig, at de her omhandlede tripeptider inducerer differentieringen af immunocyt-prækursor-celler in vitro på samme 149092 5 mide som nogen af peptiderne beskrevet af Bach· Således har de ifølge opfindelsen fremstillede tripeptider vist sig at inducere differentieringen af både T-prækursor-celler som målt ved forekomsten af det thymiske differentierings-antigen Th-1 samt B-prækursor-cel-05 ler som målt ved forekomsten af det differentierende antigen Bu-1.

Sagt på en anden måde er de omhandlede tripeptider i stand til at inducere differentiering af både Th-1 T-lymfocytter og Bu-1 B-lymfocytter.

For bedre at forstå vigtigheden af de omhandlede tripeptiders 10 differentierende biologiske egenskaber, skal det omtales, at thymus-funktion i relation til immunitet generelt kan angives som produktionen af thymus-afledte celler eller lymfocytter, der kaldes T-celler.

T-celler udgør en stor del af mængden af recirkulerende små lymfocytter. T-celler har immunologisk specificitet og er direkte involveret 15 i celle-medierede immun-reaktioner (såsom homotransplantations-reak-tioner), som effektor-celler. T-celler sekreterer imidlertid ikke humorale antistoffer. Disse antistoffer sekreteres af celler (kaldet B-celler), som afledes direkte fra benmarven uafhængigt af den thymiske indflydelse. For mange antigeners vedkommende kræver B-celler imidler-20 tid tilstedeværelsen af passende reaktive T-celler, før de kan producere antistoffer. Mekanismen af denne proces ved celle-samvirke forstås endnu ikke fuldtstændigt.

På baggrund af denne forklaring kan det operationelt siges, at thymus er nødvendig for udviklingen af cellulær immunitet og man-25 ge humorale antistof-reaktioner, og den påvirker disse systemer ved induktionen, i thymus, af differentieringen af hæmopoietiske stamceller til T-celler. Denne induktive påvirkning medieres af sekretioner af thymus' epitel-celler, dvs. af thymus-hormonerne.

Endvidere skal det til forståelse af virkningen af thymus og 30 lymfocytternes cellesystem samt lymfocytternes cirkulation i legemet, anføres at stamceller opstår i benmarven og når thymus via blodbanerne. Inde i thymus bliver stamceller differentieret til immunologisk kompetente T-celler, der migrerer til blodbanerne og sammen med B-celler cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner.

35 Legemets celler, som udskiller antistof (B-cellerne) udvikles også fra hæmopoietiske stamceller, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et med thymus ana- 6 149092 logt organ, der kaldes Bursa Fabricfi. I pattedyr har man Ikke fundet et ækvivalent organ og det antages, at B-celler differentierer i benmarven. De kaldes derfor benmarvs-afledte celler eller B-celler.

De fysiologiske stoffer, som dikterer denne differentiering, er totalt 05 ukendte.

Som anført ovenfor, er de her omhandlede tripeptider terapeutisk værdifulde i behandlingen af mennesker og dyr. Da de hidtil ukendte tripeptider er i stand til at inducere differentieringen af ,

Iymfopoietiske stamceller, som opstår i det hæmopoietiske væv, til 10 bide thymus-afledte lymfocytter (T-celler) og immunokompetente B-celler, som er i stand til at indgå i legemets immunreaktion, antages de ifølge opfindelsen tilvejebragte produkter at have multiple terapeutiske anvendelser. Da forbindelserne er i stand til at udføre visse af de angivne funktioner af thymus, har de primært anvendelse 15 inden for forskellige thymus-funktions- og immunitets-områder. Et primært anvendelsesområde er ved behandlingen af DiGeorge syndrom, en tilstand, hvor der er et medfødt fravær af thymus. Injektion af et af de omhandlede tripeptider vil som yderligere beskrevet nedenfor afhjælpe denne mangel. En anden anvendelse er ved agam-20 maglobulinæmia, der skyldes en defekt hos legemets formodede B-cel-le differentierende hormon. Injektion af et af de omhandlede tripeptider vil afhjælpe denne defekt. Da de omhandlede tripeptider er overordentlig aktive ved lave koncentrationer, er de værdifulde til at forstærke legemets kollektive immunitet ved, at de forøger tera-25 peutisk stimulering af cellulær immunitet og humoral immunitet, hvorved de bliver .værdifulde til behandling af sygdomme, der involverer kronisk infektion in vivo såsom fungale eller mycoplasma infektioner, tuberkulose, spedalskhed, akute og kroniske virale infektioner, og lignende. Endvidere antages tripeptiderne at være nyttige inden for 30 ethvert område, hvor cellulær eller humoral immunitet har betydning og især, hvor der er immunitetsmangler, såsom ved det ovennævnte DiGeorge syndrom. Endvidere har tripeptiderne på grund af deres egenskaber in vitro anvendelighed til inducering af udviklingen af overflade-antigener af T-cefler, til inducering af udviklingen af den 35 funktionelle evne til at opnå reaktion på mitogener og antigener samt celle-samvirke ved at forbedre B-cellernes evne til at producere an- s tistoffer. De har in vitro anvendelighed ved at inducere udviklingen 149092 7 af B-celler som målt ved udviklingen af overfladereceptorer for komplement. De omhandlede peptider er også nyttige til inhibering af den u kontrol lerede formering af lymfocytter, som reagerer over for ubiquitin (USA-patentskrift nr. 4.002.602). En vigtig egenskab ved 05 de omhandlede tripeptider ligger i deres in vivo evne til at genopbygge celler med T-cellernes egenskaber samt i deres in vivo evne til at genopbygge celler med B-cellernes egenskaber. De er derfor også nyttige til behandling af relative eller absolutte B-celle-mang-ler samt relative eller absolutte T-celle-mangler, uanset om disse 10 mangler skyldes mangler i vævet, som differentierer B-celier, henholdsvis i thymus eller har en helt anden årsag.

En yderligere vigtig egenskab ved de ifølge opfindelsen tilvejebragte tripeptider er at de er meget aktive i meget lave koncentrationer. Det har således vist sig, at de omhandlede tripeptider i al- 15 mindelighed er aktive i koncentrationer pi ca. 1 ng/ml, medens det foretrukne tripeptid (H-LYS-SAR-GLN-NH,,) er aktivt ved koncentrationer varierende fra ca. 100 pg/ml. Bæreren kan være enhver af de velkendte bærere til dette formåi, herunder normale saltopløsninger, fortrinsvis med en protein-fortynder, såsom okseserumalbu-20 min, for at hindre adsorptionstab til glasapparatur ved disse lave koncentrationer. De omhandlede tripeptider er i almindelighed aktive ved parenteral administrering i et område fra over ca. 1 pg/kg legemsvægt. Til behandling af DiGeorge syndrom kan tripeptiderne administreres parenteralt i en mængde på ca. 1 til ca. 100 pg/kg 25 legemsvægt. I almindelighed kan det samme område af dosismængder anvendes til behandling af de øvrige omtalte tilstande eller sygdom me.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater kombineres et af de omhandlede tripeptider, der besidder farmakologisk aktivitet, 30 eller et syreadditionssalt deraf som aktiv bestanddel i intim blanding med en farmaceutisk bærer i henhold til konventionel farmaceutisk præparationsteknik, hvilken bærer kan antage mange forskellige former i afhængighed af den til administrering ønskede præparatform, f.eks. sublingual, rektal, nasal, oral eller parenteral. Til fremstilling 35 af præparaterne på oral dosisform kan ethvert af de sædvanlige farmaceutiske medier anvendes, som f.eks. vand, glycoler, olier, alkoholer, smagsstoffer, præserveringsmidler, farvestoffer, og lignende, 8 149092 i tilfælde af orale flydende præparater, som f.eks. suspensioner, eleksirer og opløsninger, eller bærere såsom stivelser, sukkerarter, fortyndingsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, disintegreringsmidler, og lignende, i tilfælde af orale faste præpara-05 ter, som f.eks. pulvere, kapsler og tabletter. På grund af deres administreringslethed repræsenterer tabletter og kapsler den mest fordelagtige orale enhedsdosisform, i hvilket tilfælde der naturligvis anvendes faste farmaceutiske bærere. Om ønsket kan tabletter overtrækkes med sukker eller enterisk ved hjælp af standardmetoder.

10 Til parenterale præparater vil bæreren sædvanligvis omfatte sterilt vand, selvom andre bestanddele, f.eks. for at lette opløseligheden eller til præserveringsformål, kan tilsættes. Injicerbare suspensioner kan også fremstilles, i hvilket tilfælde der anvendes passende flydende bærere, suspensionsmidler, og lignende. Skønt disse præpa-15 rater er blevet beskrevet ovenfor i forbindelse med sådanne til parenteral administrering, som foretrækkes, er det klart, at orale præparater også er mulige. Til oral administrering bør polypeptidkoncentrationen i almindelighed være 100 til 1000 gange større (i mg/kg legemsvægt) end for parenteral administrering, f.eks. fra ca. 100 20 pg/kg til ca. 10 mg/kg legemsvægt.

De omhandlede tripeptider blev fremstillet under anvendelse af lignende principper som beskrevet af Nlerrifield i Journal of American Chemical Societey, 85, s. 2149-2154, 1963. Syntesen involverede den trinvise tilsætning af beskyttede aminosyrer til en voksende peptid-25 kæde, der var bundet med covalente bindinger til en fast harpikspartikel. Ved denne fremgangsmåde blev reagenser og biprodukter fjernet ved filtrering, og rensning af mellemprodukter blev elimineret.

Det almene princip ved denne fremgangsmåde beror på fastgørelse af kædens C-terminale aminosyre til en fast polymer ved hjælp af en 30 covalent binding og tilsætning af de efterfølgende aminosyrer én ad gangen på trinvis måde, indtil den ønskede sekvens er samlet. Endelig fjernes peptidet fra den faste bærer, og beskyttende grupper fjernes. Denne fremgangsmåde giver en voksende peptidekæde, som er fastgjort til en fuldstændigt uopløselig fast partikel, således at 35 den er på en bekvem form til filtrering og udvaskning for reagenser og biprodukter.

U9092 9

Aminosyrerne kan fastgøres til enhver egnet polymer, der blot skal være let adskilleiig fra de uomsatte reagenser. Polymeren kan være uopløselig i de anvendte opløsningsmidler eller kan være opløselig i visse opløsningsmidler og uopløselige i andre. Polymeren bør 05 have en stabil fysisk form, som tillader let filtrering. Den skal indeholde en funktionel gruppe, hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding. Forskellige uopløselige polymere, som er egnede til dette formål, er f.eks. cellulose, polyvinylalkohol, polymethacrylat og sulfoneret polystyren, men ved 10 syntesen ifølge den foreliggende opfindelse anvendtes sædvanligvis en chlormethyleret copolymer af styren og divinylbenzen. Polymere, som er opløselige i organiske opløsningsmidler, men uopløselige i vandige opløsningsmidler, kan også anvendes. En sådan polymer er en polyethylenglycol med en molekylvægt på ca. 20.000, der er opløse-15 lig i methylenchlorid, men uopløselig i vand. Anvendelsen af denne polymer ved peptidsyntese er beskrevet i F. Bayer og M. Mutter,

Nature, 237, 512 (1972) samt de deri angivne referencer.

De forskellige funktionelle grupper på aminosyren, som var aktive, men som ikke skulle indgå i reaktionerne, beskyttedes under 20 hele reaktionen ved hjælp af konventionelle beskyttende grupper som anvendt inden for polypeptidteknikken. Således beskyttedes den funktionelle gruppe på lysin med beskyttende grupper, der kunne fjernes ved sekvensens afslutning uden ugunstigt at påvirke det endelige polypeptidprodukt. I syntesen anvendtes ninhydrintesten 25 til bestemmelse af, om koblingen var komplet. Såfremt der ikke påvistes komplet kobling, gentoges koblingen med den samme beskyttede aminosyre før afbeskyttelse.

Den C-terminale aminosyre kan fastgøres til polymeren på en række velkendte måder. Resumeer af fremgangsmåder til fastgørelse 30 til halomethylharpikser er givet i Horiki, et al., Chem. Letters, s.

165-168 (1978) og Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) samt de deri anførte referencer. Såfremt der skal fremstilles et C-terminalt amid, kan en af to veje anvendes. Enten kan den i henhold til Mer-rifield-teknikken fremstillede peptid-harpiks spaltes under anven-35 delse af vandfri ammoniak, eller en benzhydrylamin-harpiks kan anvendes. Spaltning fra sidstnævnte harpiks med hydrogenfluorid giver det amiderede tripeptid. Anvendelse af en benzhydrylamin- 149092 10 -harpiks er f.eks. vist i J. Rivier, et al., J. Med. Chem., 16, s.

545-549 (1973).

Den almene fremgangsmåde til fremstilling af det ikke amiderede tripeptid involverede først esterificering af L-glutamin, beskyttet 05 på dens α-aminogruppe, til chlormethylharpiksen ved hjælp af CsHCOg-metoden, (f.eks. som omtalt i den ovenfor nævnte Gisin-artikel).

Den beskyttende gruppe på α-aminogruppen af glutamin-aminosyren (f.eks. t-BOC, dvs. t-butyioxycarbonyl) fjernedes dernæst. Den koblede aminosyre-harpiks filtreredes dernæst, vaskedes og neutra-10 liseredes. Den resulterende koblede aminosyre-harpiks med den frie aminogruppe omsattes dernæst med en beskyttet sarcosin, fortrinsvis α-t-BOC-sarcosin til kobling af sarcosinen. Et egnet koblingsmiddel, såsom dicyclohexylcarbodiimid, kan anvendes. Reaktionerne gentoges derpå med beskyttet L-lysin, indtil det komplette molekyle var 15 fremstillet. Sekvensen af reaktioner udførtes som følger:

Harpiks

a-R2-G!n-OH

a-Rg-GIn-harpiks 20 Fjern a-amino beskyttende gruppe H-GIn-harpiks

0i-R2-Sar-OH

a-Rg-Sar-GIn-harpiks 25 Fjern a-amino beskyttende gruppe H-Sar-GIn-harpiks f1

a-R2-Lys-OH

30 R-, a-R2-Lys-Sar-Gln-harpiks

Fjern alle beskyttende grupper og harpiks H-Lys-Sar-GIn-OH 35 11 1ASO 9 2 I ovenstående reaktionssekvens betegner en beskyttende gruppe på den reaktionsdygtige sidekæde på lysinaminosyren, og R2 er en beskyttende gruppe på α-aminogruppen. Fortrinsvis betegner i ovenstående tripeptid-harpiks mellemprodukt, R^ en beskyttende 05 gruppe, såsom 2,6-dichlorbenzyloxycarbonyl, og betegner t-bu-tyloxycarbonyl. Harpiksen er en vilkårlig blandt de ovenfor omtalte harpikser, som kan anvendes til fremgangsmåden.

Når det sidste mellemprodukt er fremstillet, spaltes peptidharpiksen til fjernelse af de beskyttende grupper R^ og R2 derpå samt 10 harpiksen. De beskyttende grupper og harpiks fjernes på konventionel måde, f.eks. ved behandling med vandfri hydrogenfluorid, og det resulterende frie peptid udvindes dernæst.

Som anført ovenfor er det ved udøvelsen af fremgangsmåden nødvendigt at beskytte eller blokere aminogrupperne for at kontrol-15 lere reaktionen og opnå de ønskede produkter. Egnede aminobeskyt-tende grupper, som kan anvendes, omfatter saltdannelse til beskyttelse af stærkt basiske aminogrupper, eller urethan-beskyttende substitutter, såsom 4-methoxybenzyloxycarbonyl og t-butyloxycarbo-nyl. Det foretrækkes at anvende t-butyloxycarbonyl (BOC) eller 20 t-amyloxycarbonyl (AOC) til beskyttelse af α-aminogruppen i de aminosyrer, som undergår reaktion ved molekylets carboxylende, eftersom BOC og AOC (t-amyloxycarbonyl) som beskyttende grupper.let fjernes efter en sådan reaktion og inden det efterfølgende trin (hvor en sådan ct-aminogruppe selv undergår reaktion) ved relativ mild 25 indvirkning af syrer, (f.eks. trifluoreddikesyre), hvilken behandling ikke iøvrigt påvirker grupper, som anvendes til at beskytte andre reaktive sidekæder. Det vil således kunne forstås, at a-amino-grupperne kan beskyttes ved omsætning med ethvert materiale, der vil beskytte aminogrupperne for den eller de efterfølgende reaktio-30 ner, men som senere kan fjernes under betingelser, som ikke iøvrigt vil påvirke molekylet. Eksempler på sådanne materialer er organiske carboxylsyre- eller carbonsyrederivater, der vil acylere amino-gruppen.

I almindelighed kan enhver af aminogrupperne beskyttes ved 35 omsætning med en forbindelse indeholdende en gruppe med formlen 12 149092

O

V°'c' hvori Rg betegner enhver sidan gruppe, som vil hindre aminogrup-05 pen i at indgå efterfølgende koblingsreaktioner, og som kan fjernes uden ødelæggelse af molekylet. Således kan Rg være en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe, som kan være umættet, fortrinsvis med 1-10 carbonatomer, og fortrinsvis halogen- eller cyano-substitueret, aryi, fortrinsvis med 6-15 carbonatomer, cycloalkyl, fortrinsvis med 10 5-8 carbonatomer, aralkyl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, alka- ryl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, eller heterocyclyl, f.eks. isonicotinyl. Aryl-, aralkyl- og alkarylgrupperne kan også være yderligere substitueret, såsom med en eller flere alkylgrupper med 1 til ca. 4 carbonatomer. Foretrukne grupper for R^ omfatter t-butyl, 15 t-amyl, toly!, xylyl og benzyl. Særligt foretrukne specifikke amino-beskyttende grupper omfatter benzyloxycarbonyl, substitueret ben-zyloxycarbonyl, hvori phenyl ringen er substitueret med et eller flere halogener, f.eks. Cl eller Br, nitro, lavere-alkoxy, f.eks. methoxy eller lavere-alkyl, t-butyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, cyclohe-20 xyloxycarbonyl, vinyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, biphenyl-isopropoxycarbonyl, og lignende. Andre beskyttende grupper, som kan anvendes, omfatter isonicotinyloxycarbonyl, phthaloyl, p-tolyl-sulfonyl, formyl, og lignende.

Ved udførelse af den almene fremgangsmåde ifølge opfindelsen 25 opbygges tripeptidet ved omsætning af den frie α-aminogruppe med en forbindelse, som besidder beskyttede aminogrupper. Til omsætning eller kobling bliver forbindelsen, som skal fastgøres, aktiveret ved sin carboxylgruppe, således at carboxylgruppen dernæst kan reagere med den frie α-aminogruppe på den fastgjorte peptid kæde.

30 For at opnå aktivering kan carboxylgruppen omdannes til enhver reaktiv gruppe, såsom en ester, et anhydrid, et azid, et syrechlo-rid, eller lignende. Alternativt kan et passende koblingsreagens tilsættes under reaktionen. Egnede koblingsreagenser er omhandlet, f.eks. i Bodanszky et al., Peptide Synthesis, Interscience, 2. udga-35 ve, 1976, kapitel 5, herunder carbodiimider (f.eks. dicyclohexylcar-bodiimid), carbonyldiimidizol, og lignende.

149092 13

Det skal endvidere forstås, at aminosyredelene under disse reaktioner indeholder bide aminogrupper og carboxylgrupper, og sædvanligvis indgår den ene gruppe i reaktionen, medens den anden er beskyttet. Før koblingstrinet fjernes den beskyttende gruppe på 05 det fastgjorte peptids a- eller terminale aminogruppe under betingelser, som ikke i væsentlig grad vil påvirke andre beskyttende grupper, f.eks. pi lysin-molekylets ε-amino. Den foretrukne fremgangsmåde til udførelse af dette trin er mild acidolyse, såsom ved omsætning ved stuetemperatur med trifluoreddikesyre.

10 Som det vil kunne indses, resulterer den ovenfor beskrevne række procestrin i fremstillingen af tripeptidet med formlen (II) som følger: II H-LYS-SAR-GLN-OH 15

Amidet af dette peptid fremstilles som beskrevet ovenfor, men enten ved anvendelse af en benzhydrylaminharpiks i stedet for den anvendte chlormethylharpiks eller ved anvendelse af vandfri ammoniak til fraspaltning af chlormethylharpiks og beskyttelsesgrupper.

20 Renheden og identiteten af de omhandlede peptider blev bestemt ved hjælp af velkendte metoder, som f.eks. tyndtlagskromatografi, elektroforese, aminosyreanalyse, og lignende.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, hvor alle dele er vægtdele, med mindre andet er anført.

25

Eksempel 1

Til fremstilling af de omhandlede tripeptider indkøbtes følgende materialer i handelen: ot-BOC-L-glutamin 30 a-BOC-e-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin oi-BOC-sarcosin.

I disse reagenser betyder BOC t-butyloxycarbonyl. Reagenser af "Sequenal" kvalitet til aminosyresekvensbestemmelser, dicyclohe-xyl-carbodiimid, ninhydrin og harpiksen indkøbtes i handelen. Den 35 anvendte harpiks var en polystyren-divinylbenzen-harpiks, 200-400 mesh størrelse, indeholdende 1% divinylbenzen og 0,75 mM chlorid pr. g harpiks.

14 149092

Ti! fremstilling af polypeptidet esterificeredes a-BOC-L-glutamin til chlormethyleret harpiks ved hjælp af den ovenfor omtalte CsHCOg-metode ifølge Gisin. Den resulterende a-BOC-L-glutaminharpiks indeholdt 0,4-0,5 millimol aminosyre pr. g harpiks. Under anvendelse 05 af et "Schwarz/'Mann" automatisk peptid-synteseapparat anvendtes følgende program til kobling af hver beskyttet aminosyre til a-BOC-glutaminharpiksen: I. Der forvaskes med 40% trifluoreddikesyre (TFA) i CHgClg, én gang, 1,5 minutter.

10 2. Der afbeskyttes med 40% TFA i CHgClg, én gang, 20 mi nutter.

3. Der vaskes med CHCI3, én gang, 1,5 minutter.

4. Der vaskes med EtOH, én gang, 1,5 minutter.

5. Der vaskes med CHgClg/ to gange, 1,5 minutter.

15 6. Der forvaskes med 10% Et^N i CF^CIg, én gang, 1,5 mi nutter.

7. Der neutraliseres med 10% Et3N i CHgClg, én gang, 10 minutter.

8. Der vaskes med tre gange, 1,5 minutter.

20 9. Der tilsættes BOC-beskyttet aminosyre (5 molar overskud) i dimethylformamid (DMF) og (1:9 vol/vol).

10. Der tilsættes DCC i CHgClg (0,5M 5 molar overskud), reaktionstid indtil 2 timer.

II. Der vaskes med Cf^Clg, to gange, 1,5 minutter.

25 Derefter kobledes den næste a-BOC-aminosyre på tilsvarende måde til den afbeskyttede a-aminogruppe på peptid-harpiksen under anvendelse af ækvivalente mængder dicyclohexylcarbodiimid. Efter hver koblingsreaktion testedes en portion af harpiksen med ninhydrin, og såfremt testen var positiv, antoges koblingen at være ufuldstændig 30 og gentoges med den samme beskyttede aminosyre. Som resultat af rækken af koblingsreaktioner blev tripeptid-harpiks-mellemproduktet fremstillet.

Denne peptid-harpiks spaltedes, og de beskyttende grupper fjernedes i et "Kel-F" spaltningsapparat (Peninsula Laboratories, 35 Inc.) under anvendelse af 10 ml vandfri hydrogenfluorid pr. g harpiks ved 0°C i 60 minutter med 5 ml anisol pr. g peptid-harpiks som skyllemiddel. Efter inddampning i vakuum til tørhed vaskedes rema- 149092 15 nensen med vandfri ether. Det rå peptid opløstes i 10% vandig eddikesyre og filtreredes. Harpiksen vaskedes også med 10% vandig eddikesyre, og de forenede filtrater opsamledes og lyofiliseredes til dannelse af det rå peptid. Det rå peptid rensedes ved modstrøms-05 -fordeling under anvendelse af n-butanol:eddikesyre:vand (4:1:5) som fordelingsfase til frembringelse af det rene peptid. Det resulterende polypeptid blev bestemt at have følgende sekvens:

H-LYS-SAR-GLN-OH

10

Ovennævnte fremgangsmåde gentoges, men under anvendelse af en benzyhydrylamin-harpiks, en a-BOC-L-glutamin-O-nitrophenylester . i stedet for a-BOC-L-glutaminen og kobling af denne ester til harpiksen uden brug af DCC til fremstilling af følgende tripeptid-amid: 15 h-lys-sar-gln-nh2

Til identifikation af tripeptid-amidet anvendtes tyndtlagskroma-tografi og elektroforese. Aminosyresammensætningen bestemtes ved 20 anvendelse af en aminosyre-analysator. Tyndtlagskromatografi foretoges på 20 pg prøver på silicagel (kieselgel, 5 x 20 cm) under anvendelse af 1:1:1:1 n-butanol:eddikesyre:ethylacetat:vand som elue-ringsmiddel (R^) og på cellulose "6064'' (Eastman, 20 x 20 cm) under anvendelse af 15:10:3:12 n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand som 25 elueringsmiddel (Rf ). Rf-værdierne med hensyn til H-ARG-LYS-ASP- T i T 2 -VAL-TYR-OH var R^ = 0,50 og Rf = 0,58. Ninhydrin anvendtes som et spray-reagens. Elektroforese foretoges på en 100 pg prøve på Whitman nr. 3 papir (5,7 x 55 cm) under anvendelse af pH 5,6 pyridin-acetatpuffer ved en spænding på 1000 volt i 1,0 time. Pep-30 tid-amidet havde en mobilitet på 1,93 mod katoden med hensyn til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH. Ninhydrin anvendtes som et språy--reagens. Peptid-amidet var 98% rent baseret på elektroforese.

Eksempel 2 35 Til bestemmelse af aktiviteten og egenskaberne af det i eksem pel 1 fremstillede tripeptid-amid anvendtes følgende kyllinge-induk-tionsprøve. Denne prøve er beskrevet mere detaljeret i Brand, et 16 149092 al., Science, 193, 319-321 (23. juli 1976) og de deri indeholdte referencer.

Benmarv fra nyudklækkede kyllinger udvalgtes som kilde for inducerbare celler, fordi det mangler et væsentligt antal Bu-1+- el-05 ler Th-1+-celler. Opsamlede celler fra femur og tibiotarsus af fem nyudklækkede kyllinger af stamme SC (Hy-linie) fraktioneredes ved ultracentrifugering på en femlags diskontinuert kvægserum albumin (BSA) gradient. Celler fra de to lettere lag forenedes, vaskedes og suspenderedes for inkubation ved en koncentration på 5 x 10 celler 10 pr. ml med den passende koncentration af test-polypeptid i "RPMI 1630" medium tilsat 15 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansul-fonsyre (hepes), 5% y-globulin-fri føtal kalveserum, deoxyribonuclease (14-18 enheder pr. ml), heparin (5 enheder pr. ml), penicillin (100 enheder pr. ml) og streptomycin (100 pg pr. ml). Kontroldyr inku-15 beredes med BSA (1 pg pr. ml) eller medium alene. Efter inkubation testedes cellerne ved cytotoxicitetsprøven under anvendelse kylling C1 og marsvin C2 til C9 komplement-fraktioner som beskrevet i den nævnte artikel. Mængden af Bu-1+- eller Th-1+-celler i hvert lag beregnedes som et cytotoxicitets-index, 100 (a-b)/a, hvor a og b 20 angiver de procentuelle mængder af levende celler i henholdsvis komplement-kontrol og testpræparat. Den procentuelle mængde af inducerede celler opnåedes ved at subtrahere middelværdierne ved kontrolinkubationerne uden inducerende midler (sædvanligvis 1-3%) fra de tilsvarende værdier for testinduktionerne.

25 Virkningsspecificiteten af test-polypeptidet og dets lighed med ubiquitin påvistes ved inhibering af induktionen af Bu-1+ B-ceiler og Th-1+ T-celler ved hjælp af test-polypeptidet efter tilsætning af ubiquitin i en koncentration på 100 pg/ml. Denne høje dosis af ubiquitin inaktiverer ubiquitin-receptorerne og hindrer således induk-30 tion af celler ved hjælp af ethvert middel, der virker gennem disse receptorer.

Som resultat af denne prøve fandt man, at det amiderede tri-peptid fra eksempel 1 udviste biologisk aktivitet svarende til aktiviteten af ubiquitin ved at inducere differentieringen af både Th-1 + 35 T- og Bu-1+ B-lymfocytter i en koncentration på 100 pg/ml.