DK149093B

DK149093B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af pentapeptidderivater eller farmaceutisk acceptable salte deraf

Info

Publication number: DK149093B
Application number: DK155780AA
Authority: DK
Inventors: Gideon Goldstein; George Heavner
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1979-04-12
Filing date: 1980-04-11
Publication date: 1986-01-20
Also published as: IL59804A; IL59804A0; PT71087A; FI70905B; YU42665B; DK149093C; PT71087B; IE49755B1; ES8103029A1; DE3060962D1; FI801130A7; DK155780A; FI70905C; YU100480A; ES490508A0; NO801061L; IE800743L; EP0018182B1; NO149843B; CA1157466A

Description

14909 3

Den foreliggende opfindelse vedrører en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte pentapeptidderivater med biologisk evne til at inducere differentieringen af T-lymfocytter, men ikke af komplement receptor (CR+) B-lymfocytter, med den almene formel: 05 H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R' eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori X betegner LYS eller SAR, Y betegner VAL eller SAR, under den forudsætning at Y 10 er SAR, når X er LYS, og R' betegner OH eller NH2 U.S.A. patentskrift nr. 4.190.646, hvori den ene af de foreliggende opfindere er opfinder, omhandler pentapeptidet med sekvensen H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH, samt peptid-præparater, hvori forskellige grupper er substitueret på dette pentapeptids amino- el-15 ler carboxyl-terminal. Af nemheds grunde vil pentapeptidet med den ovenfor angivne sekvens i det følgende blive omtalt som "thymopoie-tin-pentapeptidet" eller "TPS". Det ovennævnte patentskrift omhandler, at thymopoietin-pentapeptidet og dets derivater har biologisk aktivitet svarende til det lang kædede polypeptid kendt som thymo- 20 poietin og beskrevet i U.S.A. patentskrifter nr. 4.002.740 og 4.077.949. Thymopoietin-pentapeptidet, der var beskrevet som den mest aktive forbindelse i patentskriftet, udviste aktivitet ved musetesten i eksempel 2 deraf ved koncentrationer varierende fra 1 ng/ml til 10 pg/ml. Den biologiske aktivitet af TP5 er også beskrevet i en 25 artikel af M.E. Weksler et al., J. Exp. Med. 148:996-1006 (1978).

Der henvises iøvrigt til det ovennævnte patentskrift vedrørende thymopoietin-pentapeptid samt artiklen med hensyn til en omtale af anden kendt teknik og de i forbindelse med den foreliggende opfindelse involverede biologiske processer.

30

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved, at man i) binder L-tyrosin, der er beskyttet på dens a-aminogruppe og hydroxylgruppe, til en polymerharpiks ved hjælp af covalent binding, hvilken polymer er en sådan, som inde-35 holder en funktionel gruppe, hvortil L-tyrosin kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding, 2 143093 H) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra L-tyrosindelen, fil) omsætter med VAL eller SAR, som er beskyttet på a-amino-gruppen og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på a-carboxylgruppen, til kobling af VAL eller SAR til 05 L-tyrosin-harpiksen-,.

iv) fjerner den ot-aminobeskyttende gruppe fra VAL- eller SAR-delen, v) omsætter med asparaginsyre, som er beskyttet pi a-amino-gruppen og den terminale carboxylgruppe, men ikke på 10 a-carboxylgruppen til kobling af sidstnævnte til VAL(eller SAR)-L-tyrosin-harpiksen, vi) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra asparagin-sy redelen, vii) omsætter med LYS eller SAR, som er beskyttet på a-amino- 15 gruppen og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på α-carboxylgruppen til kobling af sidstnævnte til ASP-VAL(eller SAR)-L-tyrosin-harpiksen, vin) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra LYS- eller SAR-delen, 20 fx) omsætter med arginin, som er beskyttet på dens a-amino- gruppe og på dens guanidinogruppe, men ikke på dens a-carboxylgruppe til kobling af sidstnævnte til LYS(eller SAR)-ASP-VAL(eljer SAR)-L-tyrosin-harpiksen, og x) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra 25 peptidet med passende reagenser, og om ønsket fremstiller farmaceutisk acceptable salte af forbindelserne.

Det har overraskende vist sig, at de omhandlede pentapeptider er så meget som 1000 gange kraftigere end thymopoietin-pentapep-30 tidet. Da det i almindelighed ikke er muligt inden for polypeptidtek-nikken at forudsige virkningen af substitutioner i et polypeptids aktive område, er det langt fra nærliggende, at de omhandlede forbindelser besidder nogen aktivitet i det hele taget, langt mindre den kraftige styrke. Denne uforudsigelige natur påvises ved den kends-35 gerning, at det her omhandlede pentapeptid H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NHg (SAR^, SAR4-TP5 amid) viste sig at være aktivt ved 1 pg/ml i den i eksempel 2 nedenfor omtalte test.

s 3 149093

De ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede pentapeptider forekommer at være særdeles usædvanlige, idet de udviser den samme biologiske aktivitet som det langkædede naturlige peptid, thymopoietin, en del af hvilket de omhandlede pentapeptider ligner. Det antages 05 derfor, at molekylets aktivitets krav udvikles af dets stereokemi, dvs. den særlige "foldning" af molekylet. I denne henseende skal det forestås, at polypeptidbindinger ikke er stive, men flexible, således at polypeptider kan eksistere som flader, spiraler, og lignende. Som følge heraf er hele molekylet flexibelt og vil "folde" på en bestemt 10 måde. Som et led i den foreliggende opfindelse har det vist sig, at pentapeptidet "folder" på samme måde som langkædet naturligt poly-peptid og derfor udviser de samme biologiske egenskaber.

Pentapeptidernes evne til at bevare den biologiske aktivitet og naturlige foldning belyses af det forhold, at de har samme aktivitet 15 som omhandlet for thymopoietin-pentapeptidet i ovennævnte patentskrift samt selve thymopoietin.

Inden for opfindelsens rammer falder endvidere de farmaceutisk acceptable salte af pentapeptiderne.

Som syrer, der er i stand til at danne salte med pentapeptider-20 ne, kan nævnes uorganiske syrer, såsom hydrogenchloridsyre, hy-drogenbromidsyre, perchlorsyre, salpetersyre, thiocyansyre, svovlsyre eller phosphorsyre, og organiske syrer, såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, anthranilsyre, kanelsyre, 25 naphthalensulfonsyre eller sulfanilsyre.

I de ovennævnte strukturer er pentapeptidernes aminosyrekom-ponenter af nemheds grunde identificeret ved forkortelser. Disse forkortelser er følgende: 30 Aminosyre Forkortelse

L-arginin ARG

L-lysin LYS

L-asparaginsyre ASP

L-valin VAL

35 L-tyrosin TYR

Sarcosin SAR

149093 4

De omhandlede pentapeptider har vist sig at udvise egenskaber svarende til det tetradecanonapolypeptids, der er isoleret fra kvæg-thymus (thymopoietin) som omhandiet i de ovenfor omtalte U.S.A. patentskrifter. De ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebragte 05 pentapeptider udmærker sig især ved deres evne til at inducere den selektive differentiering af Thy-1+ T-celier (men ikké CR+ B-celler) i koncentrationer på 0,1 pg/ml til 10 ng/ml. Thy-1 er et differentierings alloantigen, som er til stede på T-celler, men Ikke B-celler, medens CR er en komplementreceptor, der er til stede på B-celler, 10 men ikke T-celler.

Studier af disse syntetiske pentapeptider ved induktionsprøven in vitro viste, at de havde samme induktions-specificitet som Thymopoietin II. Det vil sige, at de inducerede differentieringen af Thy-1 celler til Thy-1+ T-celler, men ikke inducerer differentieringen af 15 CR celler til CR+ B-ceiler. Selv om der er identificeret mange stoffer, som kan efterligne thymopoietin in vitro og inducere T-celledif-ferentiering ved at hæve intracelluiær cyklisk AMP, understreges det, at få stoffer er aktive ved så lav koncentration, og de her omhandlede pentapeptider er selektive ved at inducere T-celle differen-20 tiering, men ikke CR+ B-celle differentiering.

Som følge af disse egenskaber ved de omhandlede pentapeptider er de terapeutisk værdifulde ved behandlingen af mennesker og dyr, eftersom de er i stand til at inducere differentieringen af lymfopoie-tiske stamceller hidrørende fra det hæmopoietiske væv til thymus-af-25 ledte celler eller T-celler, der er i stand til at indgå i legemets immunreaktion. Som følge heraf antages de her omhandlede produkter at have talrige terapeutiske anvendelser. Da forbindelser er i stand til at udføre visse af de angivne funktioner af thymus, har de primært anvendelse inden for forskellige thymiske funktions-og immuni-30 tetsområder. Et primært anvendelsesområde er ved behandlingen af

DiGeorge syndrom, en tilstand hvor der er et medfødt fravær af thymus. Injektion af pentapeptiderne vil afhjælpe denne mangel. Som følge af pentapeptidernes biologiske egenskaber, hvor de er ekstremt aktive ved lave koncentrationer, betragtes de som værdifulde til at 35 assistere ved legemets kollektive immunitet ved, at de vil forøge eller assistere med terapeutisk stimulering af cellulær immunitet, hvorved de bliver værdifulde til behandling af sygdomme, der involverer kro- 5 149093 nisk infektion in vivo, såsom fungale eller mycoplasma infektioner, turberkulose, spedalskhed, akutte og kroniske virale infektioner, og lignende. Endvidere antages forbindelserne at være nyttige inden for ethvert område, hvor cellulær immunitet har betydning, og især 05 hvor der er immunitetsmangler, såsom ved det ovennævnte DiGeorge syndrom. Endvidere kan forbindelserne, hvor der er et overskud af antistofproduktion på grund af ubalancerede T-celler og B-celler korrigere denne tilstand ved at stimulere T-celle produktion. De kan derfor være af terapeutisk anvendelse ved visse autoimmunsygdomme, 10 hvor skadelige antistoffer er til stede, f.eks. systemisk lupus erythematosus. Endvidere har pentapeptiderne på grund af disse egenskaber in vitro anvendelighed ved at inducere udviklingen af overflade antigener af T-celler, ved at inducere udviklingen af den funktionelle evne til at opnå reaktion på mitogener og antigener, samt 15 celle-samvirke ved at forbedre B-cellernes evne til at producere antistoffer. Pentapeptiderne er også værdifulde til inhibering af den u kontrol lerede formering af lymfocytter.

En vigtig egenskab ved pentapeptiderne er deres in vivo evne til at genopbygge celler med T-cellernes egenskaber. Pentapeptider-20 ne er derfor aktive inden for mange områder som følge af deres evne til at forøge legemets immunreaktion. Da de omhandlede pentapeptider påvirker neuromuskulær transmission, vil meget høje doser af peptiderne være værdifulde til behandling af sygdomme med for høj neuromuskulær transmission, såsom spasticitet.

25 En yderligere vigtig egenskab ved de omhandlede pentapeptider er, at de er særdeles aktive i meget lave koncentrationer varierende fra 0,1 pg/ml. Bæreren kan være enhver af de velkendte bærere til dette formål, herunder normale saltopløsninger, fortrinsvis med en protein-fortynder, såsom kvægserumalbumin, for at hindre adsorp-30 tionstab til glasapparatur ved disse lave koncentrationer. De omhandlede pentapeptider er parenteralt aktive ved ca. 1 ng/kg legemsvægt.

Til behandling af DiGeorge syndrom kan pentapeptiderne administreres i en mængde på ca. 0,1 til 10 ng/kg legemsvægt. I almindelighed kan det samme område af dosismængder anvendes til behandling af 35 de øvrige omtalte tilstande eller sygdomme.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater kombineres et penta-peptid med formel (I) eller et syreadditionssalt deraf som aktiv be- 149093 6 standdel i intim blanding med en farmaceutisk bærer i henhold til konventionel farmaceutisk præparationsteknik, hvilken'bærer kan antage mange forskellige former i afhængighed af den til administrering ønskede præparatform, f.eks. sublingual, rektat, nasal, oral 05 eller parenteral. Til fremstilling af præparaterne på oral dosisform kan ethvert af de sædvanlige farmaceutiske medier anvendes, som f.eks. vand, glycoler, olier, alkoholer, smagsstoffer, præserveringsmidler og farvestoffer, i tilfælde af orale flydende præparater, som f.eks. suspensioner, eleksirer og opløsninger, eller bærere såsom 10 stivelser, sukkerarter, fortyndingsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler og disintegreringsmidler, i tilfælde af orale faste præparater, som f.eks. pulvere, kapsler og tabletter. På grund af deres administreringslethed repræsenterer tabletter og kapsler den mest fordelagtige orale enhedsdosisform, i hvilket tilfælde der natur-15 ligvis anvendes faste farmaceutiske bærere. Om ønsket kan tabletter overtrækkes med sukker eller enterisk ved hjælp af standardmetoder.

Til parenterale præparater vil bæreren sædvanligvis omfatte sterilt vand, selvom andre bestanddele, f.eks. for at lette opløseligheden eller til præserveringsformål, kan tilsættes. Injicerbare suspensioner 20 kan også fremstilles, i hvilket tilfælde der anvendes passende flydende bærere, suspensionsmidler, og lignende. De parenterale farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen bør formuleres således, at de administrerer de omhandlede polypeptider i en mængde pi fra ca.

0,1 til ca. 100 ng/kg legemsvægt. De orale præparater bør administre-25 re ca. 100 til 1000 gange den parenterale administreringsdosis, dvs. fra ca. 10 ng/kg til ca. 100 pg/kg legemsvægt. I overensstemmelse hermed bør de parenterale præparater pr. dosisenhed indeholde fra ca. 5 ng til ca. 5 pg, medens orale præparater pr. dosisenhed bør indeholde fra ca. 500 hg til ca. 5 mg et af de omhandlede pentapep-30 tider.

De omhandlede pentapeptider blev fremstillet under anvendelse af lignende principper som beskrevet af Merrifield i Journal of American Chemical Societey, 85, s. 2149-2154, 1963. Syntesen involverede den trinvise tilsætning af beskyttede aminosyrer til en voksende pep-35 tidkæde, der var bundet med covalente bindinger til en fast harpikspartikel. Ved denne fremgangsmåde blev reagenser og biprodukter fjernet ved filtrering, og rekrystallisation af mellemprodukter blev 7 149093 elimineret. Det almene princip ved denne fremgangsmåde beror på fastgørelse af kædens C-terminale aminosyre til en fast polymer ved hjælp af en covalent binding og tilsætning af de efterfølgende aminosyrer én ad gangen på trinvis måde, indtil den ønskede sekvens er 05 samlet. Endelig fjernes peptidet fra den faste bærer, og beskyttende grupper fjernes. Denne fremgangsmåde giver en voksende peptidkæde, som er fastgjort til en fuldstændigt uopløselig fast partikel, således at den er på en bekvem form til filtrering og udvaskning for reagenser og biprodukter.

10 Aminosyrerne kan fastgøres til enhver egnet polymer, der blot skal være let adskillelig fra de uomsatte reagenser. Polymeren kan være uopløselig i de anvendte opløsningsmidler eller kan være opløselig i visse opløsningsmidler og uopløselige i andre. Polymeren bør have en stabil fysisk form, som tillader let filtrering. Den skal inde-15 holde en funktionel gruppe, hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding. Forskellige uopløselige polymere, som er egnede til dette formål, er f.eks. cellulose, polyvinylalkohol, polymethacrylat og sulfoneret polystyren, men ved syntesen ifølge den foreliggende opfindelse kan f.eks. anvendes en 20 chlormethyleret copolymer af styren og divinylbenzen. Polymere, som er opløselige i organiske opløsningsmidler, men uopløselige i vandige opløsningsmidler, kan også anvendes. En sådan polymer er en poly-ethylenglycol med en molekylvægt på ca. 20.000, der er opløselig i methylenchlorid, men uopløselig i vand. Anvendelsen af denne polymer 25 ved peptidsyntese er beskrevet i F. Bayer og M. Mutter, Nature, 237, 512 (1972) samt de deri angivne referencer.

De forskellige funktionelle grupper på aminosyresidekæderne, som var aktive, men som ikke skulle indgå i reaktionerne, beskyttedes under hele reaktionen ved hjælp af konventionelle beskyttende 30 grupper som anvendt inden for polypeptidteknikken. Således beskyttedes den funktionelle gruppe pi lysin med beskyttende grupper, der kunne fjernes ved sekvensens afslutning uden ugunstigt at påvirke det endelige polypeptidprodukt. I syntesen anvendtes ninhy-drin til bestemmelse af, om koblingen var komplet. Såfremt der ikke 35 påvistes komplet kobling, gentoges koblingen.

Den C-terminale aminosyre kan fastgøres til polymeren på en række velkendte måder. Resumeer af fremgangsmåder til fastgørelse

V

8 149093 til halomethylharpikser er givet i Horiki, et al., Chem. Letters, s.

165-168 (1978) og Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) samt de deri anførte referencer. Såfremt der skal fremstilles et C-terminalt amid, kan en af to veje anvendes. Enten kan den i henhold til Mer-05 rifield-teknikken fremstillede peptid-harpiks spaltes fra harpiksen under anvendelse af vandfri ammoniak, eller en benzhydrylamin-har-piks kan anvendes. Spaltning fra sidstnævnte harpiks med hydrogenfluorid giver det C-terminale amid-peptid. Anvendelse af en benz-hydrylamin-harpiks er f.eks. vist i J. Rivier, et al., J. Med. Chem., 10 16, s. 545-549 (1973).

Den almene fremgangsmåde til fremstilling af C-terminal carbo-xyl-peptider involverede først esterificering af L-tyrosin, beskyttet på dens amino- og hydroxylgruppe, til chlormethylharpiksen ved hjælp af CsHCOg-metoden ifølge Gisin. Den beskyttende gruppe på 15 ci-aminogruppen af tyrosin (f.eks. t-BOC, dvs. t-butyloxycarbonyl) fjernedes dernæst uden påvirkning af andre beskyttende grupper.

Den koblede aminosyre-harpiks filtreredes dernæst, vaskedes og neutraliseredes. Den resulterende koblede aminosyre-harpiks med den frie aminogruppe omsattes dernæst f. eks. med beskyttet L-valin, 20 fortrinsvis cr-t-BOC-L-valin til kobling af L-valinen til aminosyre-har-piksen. Reaktionerne gentoges derpå med beskyttet L-asparaginsyre, sarcosin eller Jysin og L-arginin, indtil det komplette molekyle var fremstillet. Denne fremgangsmåde anvendtes til dannelse af det basale pentapeptidderivat. Sekvensen af reaktioner til fremstilling af det 25 aktive pentapeptidderivat kan udføres som følger: 9 149093

Harpiks R3

oi-BOC-Tyr-OH

JrR3 05 a-BOC-Tyr-harpiks

Fjern a-amino beskyttende gruppe R3 R 4 H-Tyr-harpiks

10 0i-BOC-L-Val-OH

R3 a-BOC-Val-Tyr-harpiks

Fjern a-amino beskyttende gruppe

15 f I

H-Val-Tyr-harpiks R2

a-BOC-Asp-OH

R2 v R3 l i 20 a-BOC-Asp-Val-Tyr-harpiks

Fjern a-amino beskyttende gruppe 2 3

R ,,R

I I

H-Asp-Val-Tyr-harpiks

25 a-BOC-Sar-OH

2 3

R v R

I ^ I

a-BOC-Sar-Asp-Val-Tyr-harpiks Fjern a-amino beskyttende gruppe 30 R2 R3

I * I

H-Sar-Asp-Val-Tyr-harpiks R1 i

a-AOC-Arg-OH

1 2 3

R' , R R

or I * I I

35 a-AOC-Arg-Sar-Asp-Val-Tyr-harpiks

Fjern alle beskyttende grupper og harpiks H-Arg-Sar-Asp-Val-Tyr-OH

149093 10 12 3 I ovenstående reaktionssekvens betegner R , R og R beskyttende grupper pi de reaktionsdygtige grupper på aminosyresidekæ-derne, som ikke påvirkes eller fjernes, når den α-amino beskyttende gruppe fjernes for at tillade yderligere omsætning. Fortrinsvis be-05 tegner i ovenstående pentapeptid-harpiks mellemprodukt, udtrykket R tosyl (Tos), R betegner benzyl (Bzl), og R betegner bromben-zyloxycarbonyl. Harpiksen er en vilkårlig blandt de ovenfor omtalte harpikser, som kan anvendes ved fremgangsmåden til fremstilling af et C-terminalt carboxylpeptid.

10 Peptidharpiksen spaltes for at frigøre peptidet fra harpiksen, 12 3 og beskyttende grupper R , R og R , og t-AOC samtidigt, til dannelse af pentapeptid-slutproduktet. De beskyttende grupper og harpiks fraspaltedes på konventionel måde, f.eks. ved behandling med vandfri hydrogenfluorid, og peptidet udvandtes.

15 Som anført ovenfor er det ved udøvelsen af fremgangsmåden nødvendigt at beskytte eller blokere aminogrupperne for at kontrollere reaktionen og opnå de ønskede produkter. Egnede aminobeskyt-tende grupper, som kan anvendes, omfatter saltdannelse til beskyttelse af stærkt basiske aminogrupper, eller urethan-beskyttende sub-20 stitutter, såsom 4-methoxybenzyloxycarbonyl og t-butyloxycarbonyl.

Det foretrækkes at anvende t-butyloxycarbonyl (t-BOC) eller t-amyl-oxycarbonyl (t-AOC) til beskyttelse af a-aminogruppen i de aminosyrer, som undergår reaktion ved molekylets carboxylende, eftersom de BOC- og AOC-beskyttende grupper let fjernes efter en sådan 25 reaktion og inden det efterfølgende trin (hvor en sådan a-aminogrup-pe selv undergår reaktion) ved relativ mild indvirkning af syrer, (f.eks. trifluoreddikesyre). Denne behandling påvirker iøvrigt ikke de beskyttende grupper på sidekæderne. Det vil således kunne forstås, at α-aminogruppen kan beskyttes ved omsætning med ethvert 30 materiale, der vil beskytte aminogruppen for den eller de efterfølgende reaktioner, men som senere kan fjernes under betingelser, som ikke iøvrigt vil påvirke molekylet. Eksempler på sådanne materialer er organiske carboxylsyre- eller carbonsyrederivater, der vil acylere aminogruppen.

35 I almindelighed kan enhver af aminogrupperne beskyttes ved omsætning med en forbindelse indeholdende en gruppe med formlen 11 149093 o hvori betegner enhver sådan gruppe, som vil hindre aminogrup-05 pen i at indgå efterfølgende koblingsreaktioner, og som kan fjernes uden ødelæggelse af molekylet. Således kan være en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe, som kan være umættet, fortrinsvis med 1-10 carbonatomer, og fortrinsvis halogen- eller cyano-substitueret, aryl, fortrinsvis med 6-15 carbonatomer, cycloalkyl, fortrinsvis med 10 5-8 carbonatomer, aralkyl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, aika- ryl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, eller heterocyclyl, f.eks. isonicotinyl. Aryl-, aralkyl- og alkarylgrupperne kan også være yderligere substitueret, såsom med en eller flere alkylgrupper med 4 1 til ca. 4 carbonatomer. Foretrukne grupper for R omfatter t-bu-15 tyl, t-amyl, tolyl, xylyl og benzyl. Særligt foretrukne specifikke aminobeskyttende grupper omfatter benzyloxycarbonyl, substitueret benzyloxycarbonyl, hvori phenylringen er substitueret med et eller flere halogener, f.eks. Cl eller Br, nitro, lavere-alkoxy, f.eks. me-thoxy eller lavere-alkyl, t-butyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, cy-20 clohexyloxycarbonyl, vinyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl eller biphenylisopropoxycarbonyl. Andre beskyttende grupper, som kan anvendes, omfatter f. eks. isonicotinyloxycarbonyl, phthaloyl, p-to-lylsulfonyl og formyl.

Ved udførelse af den almene fremgangsmåde ifølge opfindelsen 25 opbygges peptidet ved omsætning af den frie α-aminogruppe med en forbindelse, som indeholder en blokeret α-aminogruppe. Til omsætning eller kobling bliver forbindelsen, som skal fastgøres, aktiveret ved sin carboxylgruppe, således at carboxylgruppen dernæst kan reagere med den frie α-aminogruppe på peptidkæden. For at opnå 30 aktivering kan carboxylgruppen omdannes til enhver reaktiv gruppe, såsom en ester, et anhydrid, et azid eller et syrechlorid. Alternativt kan et passende koblingsreagens tilsættes under reaktionen.

Egnede koblingsreagenser er omhandlet, f.eks. i Bodanszky et al.,

Peptide Synthesis, Interscience, 2. udgave, 1976, kapitel 5, herun-35 der carbodiimider (f.eks. dicyclohexylcarbodiimid) og carbonyldiimi-dazol.

149093 12

Det skal endvidere forstis, at aminosyredelene under disse reaktioner indeholder både aminogrupper og carboxylgrupper, og sædvanligvis indgår den ene gruppe i reaktionen, medens den anden er beskyttet. Før koblingstrinet fjernes den beskyttende gruppe på 05 det til harpiksen fastgjorte peptids or- eller terminale aminogruppe under betingelser, som ikke i væsentlig grad vil påvirke andre beskyttende grupper, f.eks. gruppen på tyrosin-molekylets hydroxy-gruppe. Den foretrukne fremgangsmåde til udførelse af dette trin er mild syrehydrolyse, såsom ved omsætning ved stuetemperatur med 10 trifluoreddikesyre.

Som det vil kunne indses, resulterer den ovenfor beskrevne række procestrin i fremstillingen af det specifikke pentapeptid med følgende formel:

15 IV. H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH

De ønskede pentapeptidamider kan også fremstilles som beskrevet ovenfor, men ved anvendelse af en benzhydrylaminharpiks i stedet for chlormethylharpiksen og kobling af C-terminal aminosyren 20 dertil ved hjælp af et passende koblingsmiddel, såsom dicyclohexyl-carbodiimid (DCC).

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, hvor alle dele er vægtdele, med mindre andet er anført.

Eksempel 1 25 Til fremstilling af H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH indkøbtes føl gende materialer i handelen: or-AOC-N-Tos-L-arginin oi-BOC-sarcosin.

ot-BOC-O-benzyl-L-asparaginsyre 30 a-BOC-L-valin a-BOC-O-brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin.

I disse reagenser betyder BOC t-butyloxycarbonyl, AOC betyder t-amyloxycarbonyl, og Tos betyder tosyl. Reagenser af "Sequenal" kvalitet til aminosyresekvensbestemmelser, dicyclohexyl-35 -carbodiimid, ninhydrin og harpiksen indkøbtes i handelen. Den anvendte harpiks var en polystyren-divinylbenzen-harpiks, 200-400 mesh størrelse, indeholdende 1% divinylbenzen og Q,75 mM chlorid pr. g harpiks.

13 149093

Til fremstilling af pentapeptidet esterificeredes cr-BOC-O-brom-benzyloxycarbonyl-L-tyrosin til chlormethyleret harpiks ved hjælp af CsHCOg-metoden ifølge den ovenfor omtalte Gisin-artikel. Den resulterende bekyttede aminosyreharpiks indeholdt 0,4-0,5 millimol amino- 05 syre pr. g harpiks. Under anvendelse af et "Schwarz/Mann" automatisk peptid-synteseapparat anvendtes følgende program til kobling af hver BOC-beskyttet aminosyre til BOC-aminosyreharpiksen: I. Der forvaskes med 40% trifluoreddikesyre (TFA) i CF^CIg, én gang, 1,5 minutter.

10 2. Der afbeskyttes med 40% TFA i CHgCI2, én gang, 20 mi nutter.

3. Der vaskes med CHCIg, én gang, 1,5 minutter.

4. Der vaskes med EtOH, én gang, 1,5 minutter.

5. Der vaskes med CH2CI2, to gange, 1,5 minutter.

15 6. Der forvaskes med 10% Et^N i CH2CI2, én gang, 1,5 mi nutter.

7. Der neutraliseres med 10% Et^N i CH2CI2, én gang, 10 minutter.

8. Der vaskes med CHgClg, tre gange, 1,5 minutter.

20 9. Der tilsættes BOC-beskyttet aminosyre (5 molar overskud) i dimethylformamid (DMF) og CH2CI2 (1:9 vol/vol).

10. Der tilsættes DCC i CHgClg (0,5M 5 molar overskud), ré-aktionstid indtil 2 timer.

II. Der vaskes med CHgClg, to gange, 1,5 minutter.

25 Derefter kobledes de øvrige a-BOC- eller α-AOC-aminosyrer på tilsvarende mide til den afbeskyttede α-aminogruppe på peptid-harpiksen i korrekt rækkefølge til dannelse af det ønskede pentapeptid under anvendelse af ækvivalente mængder dicyclohexylcarbodiimid.

Efter hver koblingsreaktion testedes en portion af harpiksen med 30 ninhydrin, og såfremt testen var positiv, antoges koblingen at være ufuldstændig og gentoges med den samme beskyttede aminosyre. Som resultat af rækken af koblingsreaktioner fremstilledes følgende penta-peptid-harpiks: 35 Tos Bzl Brz 1 I 1 a-AOC-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-harpiks 149093 14 hvori AOC betyder amyloxycarbonyl, Tos betyder tosyl, Bzl betyder benzyl, og Brz betyder brombenzyloxycarbonyl.

Denne peptid-harpiks spaltedes, og de beskyttende grupper fjernedes i et "Kel-F" spaltningsapparat (Peninsula Laboratories, 05 Inc.) under anvendelse af 10 ml vandfri hydrogenfluorid pr. g harpiks ved 0°C i 60 minutter med 5 ml anisol pr. g peptid-harpiks som skyllemiddel. Efter inddampning i vakuum til tørhed vaskedes remanensen med vandfri ether. Det ri peptid opløstes i 10% vandig eddikesyre og filtreredes. Harpiksen vaskedes med 10% vandig eddike-10 syre, og de forenede filtrater opsamledes og lyofiliseredes til dannelse af det rå pentapeptid. Det rå pentapeptid rensedes ved mod-strøms-fordeling under anvendelse af n-butanol:eddikesyre:vand (4:1:5) som fordelingsfase til frembringelse af det rene pentapeptid.

Det resulterende pentapeptid har følgende sekvens: 15

V. H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH

Til identifikation anvendtes tyndtlagskromatografi og elektro-forese. Aminosyresammensætningen bestemtes ved anvendelse af en 20 aminosyre-analysator.

Tyndtlagskromatografi foretoges på 20 pg prøver på silicagel (kieselgel, 5 x 20 cm) under anvendelse af 1:1:1:1 n-butanol:eddi-kesyre:ethylacetat:vand som opløsningsmiddelsystem (R^ ) og på cellulose "6064" (Eastman ®, 20 x 20 cm) under anvendelse af 15:10:3:12 25 n-butanoI:pyridin:eddikesyre:vand som opløsningsmiddelsystem (Rf2). Rf-værdierne med hensyn til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH r - i 2 var R^ = 1,84 og R^ = 1,11. Ninhydrin anvendtes som et sprayreagens.

Elektroforese foretoges på en 100 pg prøve pi Whitman nr. 3 30 papir (5,7 x 55 cm) under anvendelse af pH 5,6 pyridin-acetatpuf-fer ved en spænding pi 1000 volt i 1,0 time. Pentapeptidet havde en mobilitet på 0,29 mod katoden med hensyn til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH. Ninhydrin og "Pauly"-spray-reagenser anvendtes.

35 Eksempel 2

Til bestemmelse af aktiviteten og egenskaberne af pentapeptidet fra eksempel 1 foretoges bestemmelser på 5-6 uger gamle raske "nu/nu" 15 149093 mus af begge køn, hvilke mus opfostredes pi en BALB/c baggrund (thymocytter udtrykkende Thy-1,2 overfladeantigen) og holdtes under konventionelle betingelser. For antisera, fremstilledes anti Thy- 1,2 sera i Thy-1 type mus.

+ + 05 Til induktion in vitro af Thy-1 T-celier eller CR B-celle dif ferentiering foretoges induktionen af thymocyt differentiering fra prothymocytter in vitro som beskrevet af Komuro og Boyse (Lancet, 2, 740, 1973) under anvendelse af tilvejebringelsen af Thy-1,2 som tegn på T-celle differentiering. Induktionen CR+ B-celle differenti-10 ering fra CR B-celle prækursorer in vitro foretoges under tilsvarende betingelser under anvendelse som prøvekriterium af evnen af CR+ B-celler til at binde fåre-erythrocytter belagt med subaggluti-nerende mængder af kanin-antistof og non-lytisk komplement. Miltcelle populationer fra sunde nu/nu mus fraktioneret på diskontinu-15 erte kvægserumalbumin-gradienter anvendtes som kilde for begge prækursor-typer (Thy-1 og CR ), fordi de har fa eller ingen Thy-1 T-celler og lavt antal CR+ celler.

Som resultat af denne bestemmelse blev det fundet, at pentapep-tidet udviste en virkningsselektivitet svarende til Thymopoietin ll's 20 ved at inducere differentieringen af T-lymfocytter, men ikke af komplement receptorer (CR+) B-lymfocytter. Pentapeptidet inducerede differentiering af Thy-1+ T-celler i koncentrationer varierende fra 1 pg/ml til 10 ng/ml. Det inducerede ikke differentiering af CR+ B-celler i de samme koncentrationer.

25

Eksempel 3

Under anvendelse af fremgangsmåden i eksempel 1 og under anvendelse af ækvivalente mængder egnede aminosyrer (passende beskyttet) fremstilledes følgende pentapeptider (benzhydrylharpiks 30 anvendtes til at fremstille "B"):

A. H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-OH

B. h-arg-sar-asp-sar-tyr-nh2 C. H-ARG-LYS-ASP-SAR-TYR-OH 35 I koncentrationer varierende fra 1 pg/ml til 10 ng/ml inducerer disse pentapeptider differentiering af Thy-1+T-celler, men ikke af CR+ B-celler.

Claims

149093 Sekvensen af disse peptider bestemtes ved et aminosyreanalyse-apparat. Tyndtlagskromatografi og elektroforese af B og C under samme betingelser som i eksempel 1 gav følgende information. 05 Peptid Rf2 Mobilitet mod _ _ _ katode_ B 1,76 0,95 1,03 C 0,80 0,78 0,97 10

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af pentapeptidderiva- 15 ter med biologisk evne til at inducere differentieringen af T-lymfocyt-ter, men ikke af komplement receptor (CR+) B-lymfocytter, med den almene formel: H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R' 20 eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori X betegner LYS eller SAR, Y betegner VAL eller SAR, under den forudsætning at Y er SAR, når X er LYS, og R' betegner OH eller NHg, KENDETEGNET ved, at man 25 i) binder L-tyrosin, der er beskyttet på dens a-aminogruppe og hydroxylgruppe, til en polymerharpiks ved hjælp af covalent binding, hvilken polymer er en sådan, som indeholder en funktionel gruppe, hvortil L-tyrosin kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding, 30 ii) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra L-tyrosindelen, ii?) omsætter med VAL eller SAR, som er beskyttet på a-amino-gruppen og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på of-carboxylgruppen, til kobling af VAL eller SAR til L-tyrosin-harpiksen, 35 iv) fjerner den a-aminobeskyttende gruppe fra VAL- eller SAR-delen, 149093 v) omsætter med asparaginsyre, som er beskyttet pi or-amino-gruppen og den terminale carboxylgruppe, men ikke på a-carboxylgruppen til kobling af sidstnævnte til VAL(eller SAR)-L-ty rosin-harpiksen, 05 vi) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra asparagin- sy redelen, vii) omsætter med LYS eller SAR, som er beskyttet på a-amino-gruppen og eventuelle andre reaktive grupper, men ikke på α-carboxylgruppen til kobling af sidstnævnte til ASP-

10 VAL(eller SAR)-L-tyrosin-harpiksen, vii i) fjerner den α-amino beskyttende gruppe fra LYS- eller SAR-delen, ix) omsætter med arginin, som er beskyttet på dens a-amino-gruppe og pi dens guanidinogruppe, men ikke på dens 15 a-carboxylgruppe til kobling af sidstnævnte til LYS(eller SAR)-ASP-VAL(eller SAR)-L-tyrosin-harpiksen, og x) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra peptidet med passende reagenser, og om ønsket fremstiller farmaceutisk acceptable salte af forbindel- 20 serne.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af et pentapep-tid med følgende sekvens:

25 H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2 KENDETEGNET ved, at man anvender en benzhydrylaminharpiks i trin i), en SAR-aminosyre i trin iii), og en SAR-aminosyre i trin vii). 30

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af et pentapep-tid med følgende sekvens: H-ARG-SAR-ASP-VAL-TYR-OH