DK149091B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af peptider indeholdende 2-7 aminosyrerester, desaminodipeptider eller amider deraf med ubiquitin-lignende aktivitet eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

149091

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte peptider indeholdende 2-7 aminosyrere-ster, desaminodipeptider eller amider deraf med ubiquitin-lignende aktivitet eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

05 USA-patentskrift nr. 4.002.602 med benævnelsen "Ubiquitous

Immunopoietic Polypeptide and Methods11, hvori den ene af de foreliggende opfindere er opfinder, omhandler det langkædede polypep-tid, ubiquitin (der kaldes "Ubiquitous Immunopoietic Polypeptide).

BE patentskrift nr. 864.122 omhandler pentapeptidet med sekvensen 10 H-X-Y-Z-GLN-LYS-OH, hvori X betegner TYR eller ALA, Y betegner ASN eller ALA og Z betegner ILE eller ALA. Denne patentansøgning beskriver, at dette pentapeptid har lignende biologisk aktivitet som det langkædede polypeptid, kendt som ubiquitin. Pentapeptidet med formlen H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH (der undertiden her 15 omtales som "ubiquitin-pentapeptid"), som var den mest aktive blandt de i nævnte ansøgning beskrevne forbindelser, udviste aktivitet ved muse-testen i eksempel II deraf ved koncentrationer varierende fra 10 ng/ml til 1 pg/ml. Det var også beskrevet, at pentapeptiderne med formlen H-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-OH, H-TYR-ALA-ILE-GLN-20 LYS-OH og H-TYR-ASN-ALA-GLN-LYS-OH besad aktivitet ved kyl-linge-testen i eksempel XIV til XVI deri ved en koncentration på 0,1 pg/ml (100 ng/ml).

Der henvises til ovennævnte patentskrifter med hensyn til en omtale af anden kendt teknik og de i forbindelse med den foreliggen-25 dø opfindelse involverede biologiske processer.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer peptider med en fra de ovennævnte kendte peptider væsentligt forskellig aminosyrese-kvens, og det er derfor i sig selv overraskende, at de omhandlede forbindelser besidder ubiquitin-lignende aktivitet. Hertil kommer, at 50 de omhandlede forbindelser er mindst lige si aktive som de nævnte kendte pentapeptider, mens de for det meste har væsentligt simplere struktur. Disse peptider indebærer derfor også en væsentlig fordel med hensyn til fremstillingslethed og omkostninger. Nogle af disse hidtil ukendte peptider er også signifikant mere aktive end de nævn-35 te kendte pentapeptider.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte peptider med den i indled- 149091 2 ningen til krav 1 angivne formel eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, som har ubiquitin-lignende aktivitet ved at de inducerer differentiering af både T-prækursor-celler og B-prækursor-celler til hhv. T-celler og B-celler, og som derfor er særligt værdi-05 fulde i immunsystemet hos mennesker og dyr.

De omhandlede hidtil ukendte peptider har den almene formel:

A-B

10 hvori A betegner en gruppe udvalgt blandt desamino-GLN, GLN og (SAR)n-GLN, hvor n betegner et helt tal fra 1 til 4, og B betegner en gruppe udvalgt blandt LYS-OH, LYS-NHg og LYS-SAR-NHg. Forbindelserne, hvori A er desamino-GLN, og B er LYS-OH eller LYS-NH2, er desaminodipeptider, men kaldes i nærværende sammen-15 hæng for peptider.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man i) binder en sarcosin eller Ne-beskyttet lysin, der er beskyttet på α-aminogruppen, til en polymer-harpiks ved covalent binding, hvilken polymer er en sådan, som indeholder en 20 funktionel gruppe, hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding, ii) fjerner den a-amino-beskyttende gruppe fra aminosyrehar- a £ piksen, og om nødvendigt binder lysin, der er N - og N -beskyttet, til SAR-harpiksen og fjerner a-aminobeskyttel-25 sesgruppen fra LYS-SAR-harpiksen, iii) kobler glutamin eller desaminoglutamin, som er beskyttet pi dens eventuelle α-aminogruppe og pi dens ε-amino-gruppe, til B-aminosyre-harpiksen, og iv) når A-gruppen indeholder en eller flere sarcosyl-dele, 30 fjerner a-aminobeskyttelsesgruppen fra GLN-B-harpiksen og binder sarcosin, som er beskyttet på dens a-aminogruppe, til kæden og fjerner den a-amino-beskyttende gruppe fra sarcosyl-delen og om nødvendigt gentager denne fremgangsmåde for hver sarcosylrest, der skal kobles, og 35 v) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra det resulterende peptid med passende reagenser, og om øn- 149091 3 sket fremstiller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af produktet.

Peptiderne, hvori A betegner en gruppe udvalgt blandt desamino-GLN og GLN, har væsentligt simplere struktur og er væsentligt lettere 05 at fremstille end de før nævnte kendte pentapeptider, eftersom disse materialer blot er dipeptider eller tripeptider. Peptiderne, hvori A er en gruppe udvalgt blandt desamino-GLN og (SAR)n-GLN, hvori n er 2, 3 eller 4 og B er udvalgt fra gruppen bestående af LYS-OH og LYS-NHg, er væsentligt mere aktive end de før nævnte pentapep-10 tider, idet de udviser aktivitet ved den nedenfor beskrevne kyllinge--induktionsprøve ved koncentrationer fra ca. 10 femptogram (fg)/ml til ca. 100 ng/ml. Disse peptider er derfor indtil 10 millioner gange mere kraftige end de før nævnte pentapeptider. Da visse af disse mere kraftige peptider også har meget simpel struktur, forener de i 15 væsentlig grad forøget styrke med forholdsmæssig lettere og mere økonomisk fremstilling.

Inden for opfindelsens rammer falder endvidere fremstillingen af de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af peptiderne. Som syrer, der er i stand til at danne salte med peptiderne, kan nævnes 20 uorganiske syrer såsom saltsyre, hydrogenbromidsyre, perchlorsyre, salpetersyre, thiocyansyre, svovlsyre, fosforsyre, etc. og organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumar-syre, anthranilsyre, kanelsyre, naphthalensulfonsyre eller sulfanilsyre, 25 fx.

I de ovennævnte strukturer er peptidernes aminosyrekomponen-ter af nemhedsgrunde identificeret ved forkortelser. Disse forkortelser er følgende: 30 Aminosyre Forkortelse

L-glutamin GLU

L-alanin ALA

L-lysin LYS

L-tyrosin TYR

35 L-asparagin ASN

L-isoleucin ILE

Sarcosin SAR

149091 4

Udtrykket "desamino-GLN" refererer til en L-glutamin-rest, hvori «-aminogruppen er erstattet af hydrogen, d.v.s. med formlen h2noc-(ch2)3-co-.

De omhandlede peptider indeholder dipeptiddelen -GLN-LYS-05 enten i sig selv eller i kombination med fra én til fem sarcosin-radi-kaler, idet nogle forbindelser mangler α-aminogruppen i en N-terminal glutamylrest. Disse peptider har vist sig at udvise lignende egenskaber som det i USA-patentskrift nr. 4.002.602 omhandlede 74 aminosyrer lange polypeptid, ubiquitin. Peptiderne fremstillet ifølge 10 den foreliggende opfindelse udmærker sig især ved deres evne til at inducere den selektive differentiering af T-prækursor-celler og B-prækursor-celler i så små som femptogram/ml koncentrationer. Udover den overraskende kraftige ubiquitin-lignende aktivitet er det overraskende, at dette dipeptid-fragment, enten alene eller i kombi-15 nation med fra én til fem rester af den ikke naturlige aminosyre sar-cosin besidder nogen aktivitet overhovedet. Betydningen af den foreliggende opfindelse ligger i den enestående kombination af peptidets ekstreme simpelhed og overvældende styrke. Således har den mindst kraftige af de omhandlede peptider (H-GLN-LYS-NHg) den samme 20 styrke som thymopoietin-pentapeptidet, men er blot et dipeptid. Det mest kraftige af de omhandlede peptider (H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NHg) et omkring 10 millioner gange mere kraftigt end thymopoietin-pentapeptidet. De her omhandlede peptider har således i koncentrationer så lave som 10 femptogram/ml vist sig at inducere differentie-25 ringen af både T-prækursor-celler målt ved forekomsten af de thy-miske differentierings-antigener TL og THY-I (Θ), og B-prækursor-cefier som målt ved forekomsten af receptorer for komplement, et distinktivt tegn pi B-celler.

For at lette forståelsen af den overraskende styrke af de om-30 handlede peptider gives følgende tabel for måleenheder.

Måleenhed (forkortelse) Vægt i gram -3 milligram (mg) 10 *6 mikrogram (pg) 10 -9 35 nanogram (ng) 10 -12 picogram (pg) 10 femptogram (fg) 10 -15 149091 5

Blandt de omhandlede peptider foretrækkes sådanne, hvori A er udvalgt fra gruppen bestående af desamino-GLN og H-(SAR)n~GLN, hvor n er 2, 3 eller 4 og B er udvalgt fra gruppen bestående af LYS-OH og LYS-NHg- Disse foretrukne peptider udviser aktivitet 05 ved koncentrationer i intervallet fra 10 fg/ml til ca. 100 ng/ml.

Peptidsekvensen GLN-LYS-SAR-NHg kan kemisk vises som: H2N-<j:H-CONH-CjH-CON-CH2-CONH2 ΐΗ2 (CH2)4CH3 10 CH0 NH, I 2 2 CONHg H - GLN - LYS - SAR - NHg 15 Blandt de omhandlede peptider foretrækkes endvidere sådanne, som har formlen (desamino-GLN)-LYS-C, hvori C er udvalgt fra gruppen bestående af OH og NHg. Disse foretrukne desaminodipeptider forener overvældende styrke med ekstrem simpelhed i struktur og fremstillingslethed. Disse foretrukne desaminodipeptider er af en så 20 simpel struktur, at de kan krystalliseres, i modsætning til større peptider, der i almindelighed ikke kan. Disse desaminodipeptiders evne til at krystallisere er en overordentlig væsentlig faktor ved simplificeringen af rensningen deraf.

For bedre at forstå vigtigheden af de omhandlede peptiders dif-25 ferentierende biologiske egenskaber, skal det omtales, at thymus' -funktion i relation til immunitet generelt kan angives som produktionen af thymus-afledte celler (lymfocyter), der kaldes T-celler. T-cel-ler udgør en stor del af mængden af recirkulerende små lymfocyter.

T-celler har immunologisk specificitet og er direkte involveret i celle-30 medierede immun-reaktioner (såsom homotransplantations-reaktioner), som effektor-celler. T-celler sekreterer imidlertid ikke humorale antistoffer. Disse antistoffer sekreteres af celler (kaldet B-celler), som afledes direkte fra benmarven uafhængigt af den thymiske indflydelse.

For mange antigeners vedkommende kræver B-celler imidlertid tilstede-35 værelsen af passende reaktive T-celler før de kan producere antistoffer. T-celler er også involveret i regulering af immunsystemet som hjælpe-celler, suppressor-celler etc. Mekanismen af denne proces ved celle-samvirke forstis endnu ikke fuldstændigt.

149091 6 På baggrund af denne forklaring kan det operationelt siges, at thymus er nødvendig for udviklingen af cellulær immunitet og mange humorale antistof-reaktioner samt for regulering af immunsystemet.

Disse resultater opnås i det mindste delvis ved induktionen, i thy-05 mus, af differentieringen af haemopoietiske stam-celler til T-celler.

Denne induktive påvirkning medieres af sekretioner af thymus' epi-thel-celler, dvs. af thymus-hormonerne.

Endvidere skal det til forståelse af virkningen af thymus og lymfocyternes cellesystem samt lymfocyternes cirkulation i legemet, 10 anføres at stamceller opstår i benmarven og når thymus via blodbanerne. Inde i thymus bliver stamceller differentieret til immunologisk kompetente T-celler, der migrerer til blodbanerne og sammen med B-celler cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner.

Legemets celler, som udskiller antistof (B-cellerne) udvikles 15 også fra haemopoietiske stamceller, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et med thymus analogt organ, der kaldes Bursa Fabricii. I pattedyr har man ikke fundet et ækvivalent organ og det antages, at B-celler differentierer i benmarven. De kaldes derfor benmarvs-afledte celler eller B-celler.

20 De fysiologiske stoffer, som dikterer denne differentiering, er totalt ukendte.

Som anført ovenfor, er de her omhandlede peptider terapeutisk værdifulde ved behandlingen af mennesker og dyr. Da de hidtil ukendte peptider er i stand til at inducere differentieringen af lymfopoieti-25 ske stamceller, som opstår i det haemopoietiske væv, til både thymus-afledte lymfocyter (T-celler) og immunokompetente B-celler, som er i stand til at indgå i legemets immunreaktion, antages de ifølge opfindelsen tilvejebragte produkter at have multiple terapeutiske anvendelser. Da forbindelserne er i stand til at udføre visse af de angiv-30 ne funktioner af thymus, har de primært anvendelse inden for forskellige thymus-funktions- og immunitets-områder. Et primært anvendelsesområde er ved behandlingen af DiGeorge syndrom, en tilstand, hvor der er et medfødt fravær af thymus. Injektion af poly-peptiderne vil afhjælpe denne mangel. En anden anvendelse er ved 35 agammaglobulinæmia, der skyldes en defekt hos legemets formodede B-celle differentierende hormon. Injektion af polypeptiderne vil afhjælpe denne defekt. Da peptiderne er aktive ved meget lave kon- 149091 7 centrationer, er de værdifulde til at assistere ved legemets kollektive immunitet ved at de forøger eller assisterer med terapeutisk stimulering af cellulær immunitet og humoral immunitet, hvorved de bliver værdifulde til behandling af sygdomme, der involverer kronisk 05 infektion in vivo såsom fungale eller mycoplasma infektioner, tuberkulose, spedalskhed, akute og kroniske virale infektioner o.I. Endvidere antages peptiderne at være nyttige inden for ethvert område, hvor cellulær eller humoral immunitet har betydning og især, hvor der er immunitetsmangler såsom ved det ovennævnte DiGeorge syn-10 drom. Endvidere har peptiderne på grund af deres egenskaber in vitro anvendelighed til inducering af udviklingen af overflade-antigener af T-celler, til inducering af udviklingen af den funktionelte evne til at opnå reaktion på mitogener og antigener samt celle-samvirke ved at forbedre B-cellernes evne til at producere antistoffer. De 15 har in vitro anvendelighed ved at inducere udviklingen af B-celler som målt ved udviklingen af overfladereceptorer for komplement. Peptiderne er også nyttige til inhibering af den u kontrol lerede formering af lymfocyter, som reagerer over for ubiquitin (USA-patentskrift nr. 4.002.602). En vigtig egenskab ved peptiderne ligger i deres in 20 vivo evne til at genopbygge celler med T-cellernes egenskaber samt i deres in vivo evne til at genopbygge celler med B-cellernes egenskaber. De er derfor også nyttige til behandling af relative eller absolute B-celle-mangler samt relative eller absolute T-celle-mangler, uanset om disse mangler skyldes mangler i vævet, som differentierer 25 B-celler, hhv. i thymus eller har en helt anden årsag.

En yderligere vigtig egenskab ved de ifølge opfindelsen tilvejebragte peptider er at de er meget aktive i meget lave koncentrationer.

Det har således vist sig, at peptiderne i almindelighed er aktive i koncentrationer fra ca. 10 pg/ml til 10 ng/ml og de foretrukne pep-30 tider er aktive ved koncentrationer varierende fra ca. 10 fg/ml.

Bæreren kan være enhver af de velkendte bærere til dette formål, herunder normale saltopløsninger, fortrinsvis med en protein-fortynder såsom okseserumalbumin for at hindre adsorptionstab til glasapparatur ved disse lave koncentrationer. De omhandlede peptider 35 er i almindelighed aktive i et område fra over ca. 1 ng/kg legemsvægt og de foretrukne peptider er aktive fra ca. 10 pg/kg. Til behandling af DiGeorge syndrom kan peptiderne administreres i en mængde på ca. 1 til ca. 100 ng/kg legemsvægt. I almindelighed kan 149091 8 det samme område af dosismængder anvendes til behandling af de øvrige omtalte tilstande eller sygdomme. Uanset at den foregående omtale har vedrørt parenteral administrering, skal det forstås, at oral administrering også er mulig i dosismængder, der i almindelighed 05 er ca. 100 til 1000 gange større end ved injektion. Andre velkendte administrationsveje, fx. sublinguale, rektale, nasale, etc. kan også anvendes.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater kombineres et peptid med formel I eller et syreadditionssalt deraf som aktiv bestanddel i 10 intim blanding med en farmaceutisk bærer iht. konventionel farmaceutisk præparationsteknik, hvilken bærer kan antage mange forskellige former i afhængighed af den til administrering ønskede præparatform, fx. sublingual, rektal, nasal, oral eller parenteral. Til fremstilling af præparaterne på oral dosisform kan ethvert af de sædvanlige far-15 maceutiske medier anvendes, som fx. vand, glykoler, olier, alkoholer, smagsstoffer, præserveringsmidler, farvestoffer o.I. i tilfælde af orale flydende præparater som fx. suspensioner, eleksirer og opløsninger, eller bærere såsom stivelser, sukkerarter, fortyndingsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, disintegreringsmidler 20 o.I. i tilfælde af orale faste præparater som fx. pulvere, kapsler og tabletter. P.g.a. deres administreringslethed repræsenterer tabletter og kapsler den mest fordelagtige orale enhedsdosisform, i hvilket tilfælde der naturligvis anvendes faste farmaceutiske bærere. Om ønsket kan tabletter overtrækkes med sukker eller enterisk ved hjælp 25 af standardmetoder. Til parenterale præparater vil bæreren sædvanligvis omfatte sterilt vand, selvom andre bestanddele, fx. for at lette opiøseligheden eller til præserveringsformål, kan tilsættes. Injicerba-re suspensioner kan også fremstilles, i hvilket tilfælde der anvendes passende flydende bærere, suspensionsmidler o.I. De parenterale 30 farmaceutiske præparater bør udformes til administrering af de omhandlede peptider i en mængde på ca. 10 pg/kg til ca. 100 ng/kg legemsvægt. De orale præparater bør kunne administreres ca. 100 til 1000 gange dosen for parenteral administrering, dvs. fra ca. 1 ng/kg til ca. 100 pg/kg legemsvægt. Følgelig bør de parenterale præ-35 parater per dosisenhed indeholde fra ca. 500 pg til ca. 5 pg, mens de orale præparater per enhedsdosis bør indeholde fra ca. 50 ng til ca. 5 mg af det omhandlede peptid.

149091 9

De omhandlede peptider blev fremstillet under anvendelse af lignende principper som beskrevet af Merrifield i Journal of American Chemical Society, 85, s. 2149-2154, 1963. Syntesen involverede den trinvise tilsætning af beskyttede aminosyrer til en voksende peptid-05 kæde, der var bundet med covalente bindinger til en fast harpikspartikel. Ved denne fremgangsmåde blev reagenser og biprodukter fjernet ved filtrering og rensning af mellemprodukter blev elimineret.

Det almene princip ved denne fremgangsmåde beror på fastgørelse af kædens C-terminale aminosyre til en fast polymer ved hjælp af en 10 covalent binding og tilsætning af de efterfølgende aminosyrer én ad gangen på trinvis måde indtil den ønskede sekvens er samlet. Endelig fjernes peptidet fra den faste bærer og beskyttende grupper fjernes. Denne fremgangsmåde giver en voksende peptid kæde, som er fastgjort til en fuldstændig uopløselig fast partikel, således at 15 den er på en bekvem form til filtrering og udvaskning for reagenser og biprodukter.

Aminosyrerne kan fastgøres til enhver egnet polymer, der blot skal være let adskillelig fra de uomsatte reagenser. Polymeren kan være uopløselig i de anvendte opløsningsmidler eller kan være opløse-20 lig i visse opløsningsmidler og uopløselig i andre. Polymeren bør have en stabil fysisk form, som tillader let filtrering. Den skal indeholde en funktionel gruppe, hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding. Forskellige uopløselige polymere, som er egnede til dette formål, er fx. cellulose, 25 polyvinylalkohol, polymethacrylat og sulfoneret polystyren, men ved syntesen ifølge den foreliggende opfindelse anvendtes en chlormethy-leret copolymer af styren og divinylbenzen. Polymere, som er opløselige i organiske opløsningsmidler, men uopløselige i vandige opløsningsmidler, kan også anvendes. En sådan polymer er en polyethy-30 len/ glycol med en molekylvægt på ca. 20.000, der er opløselig i me-thylenchlorid, men uopløselig i vand. Anvendelsen af denne polymer ved peptidsyntese er beskrevet i F. Bayer og M. Mutter, Nature, 237, 512 (1972) samt de deri angivne referencer.

De forskellige funktionelle grupper på aminosyren, som var ak-35 tive, men som ikke skulle indgå i reaktionerne, beskyttedes under hele reaktionen ved hjælp af konventionelle beskyttende grupper, som anvendt inden for polypeptidteknikken. Således beskyttedes den 149091 10 funktionelle gruppe pi lysin med beskyttende grupper, der kunne fjernes ved sekvensens afslutning uden ugunstigt at påvirke det endelige polypeptidprodukt. I. syntesen anvendtes ninhydrin til bestemmelse af, om koblingen var komplet. Såfremt der ikke påvistes 05 komplet kobling, gentoges koblingen med den samme beskyttede aminosyre før afbeskyttelse.

Den C-terminale aminosyre kan fastgøres til polymeren på en række velkendte måder. Resumeer af fremgangsmåder til fastgørelse til halomethylharpikser er givet i Horiki, et al., Chem. Letters, s.

10 165-168 (1978) og Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) samt de deri anførte referencer. Såfremt der skal fremstilles et C-terminalt amid, kan en af to veje anvendes. Enten kan den iht. Merrifield-tek-nikken fremstillede peptid-harpiks spaltes fra harpiksen under anvendelse af vandfri ammoniak, eller en benzhydrylamin-harpiks kan an-15 vendes. Spaltning fra sidstnævnte harpiks med hydrogenfluorid giver det C-terminale amid-peptid. Anvendelse af en benzhydrylamin-harpiks.er fx. vist i J. Rivier, et al., J. Med. Chem., 16, s. 545-549 (1973).

Den almene fremgangsmåde til fremstilling af C-terminal carboxyl-20 peptider involverede først esterificering af L-lysin, beskyttet på dens aminogrupper, til chformethylharpiksen. ved hjælp af den i ovennævnte Gisin-artikel omtalte CsHCOg-metode. Den beskyttende gruppe på a-aminogruppen af lysin-aminosyren (f.eks. t-BOC, dvs. t-butyloxycarbonyl) fjernedes dernæst uden påvirkning af andre be-25 skyttende grupper. Den koblede aminosyre^harpiks filtreredes dernæst, vaskedes og neutraliseredes. Den resulterende'koblede amino-syre-harpiks med den frie aminogruppe omsattes dernæst med en beskyttet L-glutamin, fortrinsvis o^t-BOC-L-glutamin til kobling af L-glutaminen. Sekvensen af reaktioner udførtes som følger: 30 35 U9091 11

Harpiks fl

a-R2-Lys-COOH

fl 05 a-R?-Lys-harpiks \ Fjern a-amino beskyttende gruppe .

H-L^s-harpiks 10 a-Rg-GIn l1 a-R2-Gln-Lys-harpiks

Fjern alle beskyttende grupper og harpiks

15 H-Glh-Lys-OH

I ovenstående reaktionssekvens betegner R1 en beskyttende gruppe på den reaktionsdygtige sidekæde pi L-lysin, som ikke påvirkes eller fjernes, når den beskyttende gruppe pi ot-aminogrup-20 pen fjernes for at tillade yderligere omsætning, og a-R2 er en beskyttende gruppe på α-aminogruppen. Fortrinsvis betegner i ovenstående pentapeptid-harpiks mellemprodukt, R^ en beskyttende gruppe, såsom 2-chlorbenzyloxycarbonyl, og R2 betegner t-butyloxycar-bonyl. Harpiksen er en vilkårlig blandt de ovenfor omtalte harpikser, 25 som kan anvendes til fremgangsmåden.

Når det sidste mellemprodukt er fremstillet, spaltes peptidharpiksen til fjernelse af de beskyttende grupper R^ og R2 derpå samt harpiksen. De beskyttende grupper fjernes på konventionel måde, f.eks. ved behandling med vandfri hydrogenfluorid, og det resulte-30 rende frie peptid udvindes dernæst.

Som anført ovenfor er det ved udøvelsen af fremgangsmåden nødvendigt at beskytte eller blokere aminogrupperne for at kontrol- . lere reaktionen og opnå de ønskede produkter. Egnede aminobeskyt-tende grupper, som kan anvendes, omfatter saltdannelse til beskyt-35 telse af stærkt basiske aminogrupper, eller urethan-beskyttende substitutter, såsom benzyloxycarbonyl og t-butyloxycårbonyl·.· Det foretrækkes at anvende t-butyloxycarbonyl (t-BOC) eller t-amyloxycar- 149091 12 bonyl (AOC) til beskyttelse af α-aminogruppen i de aminosyrer, som undergår reaktion ved molekylets carboxylende, eftersom BOC og AOC (t-amyloxycarbonyl) som beskyttende grupper let fjernes efter en sådan reaktion og inden det efterfølgende trin (hvor en sådan 05 α-aminogruppe selv undergår reaktion) ved relativ mild indvirkning af syrer, (f.eks. trifluoreddikesyre), hvilken behandling ikke iøv-rigt påvirker grupper, som anvendes til at beskytte andre reaktive sidekæder. Det vil således kunne forstås, at a-aminogrupperne kan beskyttes ved omsætning med ethvert materiale, der vil beskytte 70 aminogrupperne for den eller de efterfølgende reaktioner, men som senere kan fjernes under betingelser, som ikke iøvrigt vil påvirke molekylet. Eksempler på sådanne materialer er organiske carboxylsyre- eller carbonsyrederivater, der vil acylere aminogruppen.

I almindelighed kan enhver af aminogrupperne beskyttes ved 75 omsætning med en forbindelse indeholdende en gruppe med formlen

O

R3-°-é- 20 hvori R3 betegner enhver sådan gruppe, som vil hindre aminogruppen i at indgå efterfølgende koblingsreaktioner, og som kan fjernes uden ødelæggelse af molekylet. Således kan være en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe, som kan være umættet, fortrinsvis med 1-10 carbonatomer, og fortrinsvis halogen- eller cyano-substitueret, 25 a ry I, fortrinsvis med 6-14 carbonatomer, cycloalkyl, fortrinsvis med 5-8 carbonatomer, aralkyl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, alka-ryl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, eller heterocyclyI, f.eks. isonicotinyl. Aryl-, aralkyl- og alkarylgrupperne kan også være yderligere substitueret, såsom med en eller flere alkylgrupper med 1 til 30 ca. 4 carbonatomer. Foretrukne grupper for R3 omfatter t-butyl, t-amyl, phenyl, toly I, xylyl og benzyl. Særligt foretrukne specifikke aminobeskyttende grupper omfatter benzyloxycarbonyl, substitueret benzyloxycarbonyl, hvori phenylringen er substitueret med et eller flere halogener, f.eks. Cl eller Br, nitro, lavere-alkoxy, f.eks., me-35 thoxy eller lavere-alkyl, t-butyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, cyc-lohexyloxycarbonyl, vinyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyI, biphenyl isopropoxycarbonyl, og lignende. Andre beskyttende grupper, 13 1A9091 som kan anvendes, omfatter isonicotinyloxycarbonyl, phthaloyl, p-to-lylsulfonyl, formyl, og lignende.

Ved udførelse af den almene fremgangsmåde ifølge opfindelsen opbygges peptidet ved omsætning af den frie α-aminogruppe med en 05 forbindelse, som besidder beskyttede aminogrupper. Til omsætning eller kobling bliver forbindelsen, som skal fastgøres, aktiveret ved sin carboxylgruppe, således at carboxylgruppen dernæst kan reagere med den frie ot-aminogruppe på den fastgjorte peptidkæde. For at opnå aktivering kan carboxylgruppen omdannes til enhver reaktiv ΊΟ gruppe, såsom en ester, et anhydrid, et azid, et syrechlorid, eller lignende. Alternativt kan et passende koblingsreagens tilsættes under reaktionen. Egnede koblingsreagenser er omhandlet, f.eks. i Bodanszky et al. Peptide Synthesis, Interscience, 2. udgave, 1976, kapitel 5, herunder carbodiimider (f.eks. dicyclohexylcarbodiimid), 15 carbonyldiimidizol, og lignende.

Det skal endvidere forstis, at aminosyredelene under disse re- -aktioner indeholder både aminogrupper og carboxylgrupper, og sædvanligvis indgår den ene gruppe i reaktionen, medens den anden er beskyttet. Før koblingstrinet fjernes den beskyttende gruppe på 20 det fastgjorte peptids a- eller terminale aminogruppe under betingelser, som ikke i væsentlig grad vil påvirke andre beskyttende grupper, f.eks. på lysin-molekylets ε-amino. Den foretrukne fremgangsmåde til udførelse af dette trin er mild acidolyse, såsom ved omsætning ved stuetemperatur med trifluoreddikesyre.

25 Som det vil kunne indses, resulterer den ovenfor beskrevne række procestrin i fremstillingen af det specifikke peptid med formlen

II H-GLN-LYS-OH

30 Fremstilling af de tilsvarende sarcosin-holdige peptider kan ske ved hjælp af samme reaktionssekvens som ovenfor, hvorved beskyttet sarcosin tilsættes på det eller de passende steder af proceduren.

På denne måde kan f. eks. fremstilles peptider med følgende formler: H-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-SAR-35 GLN-LYS-OH, H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-OH og H-GLN-LYS- SAR-OH. Peptider med formel I, hvori A betegner desamino-GLN kan fremstilles ved i de ovenfor beskrevne fremgangsmåder at erstatte 149091 14 GLN med beskyttet desamino-GLN. Herved kan fremstilles desamino-GLN-LYS-OH og desamino-GLN-LYS-SAR-OH.

Peptider med formel I, hvori B betegner LYS-NHg eller LYS-SAR-NH2 kan fremstilles ved hjælp af den ovenfor beskrevne frem-05 gangsmåde, men med en benzhydrylamin-harpiks i stedet for den der anvendte chlormethylharpiks. På denne måde kan fremstilles amider til de ovenfor beskrevne peptider. En alternativ fremgangsmåde til fremstilling af disse amider består i at spalte fra chlor-methylharpiksen under anvendelse af vandfri ammoniak.

TO Identiteten, renheden og sekvensen af de omhandlede peptider bestemtes ved hjælp af velkendt teknik i form af tyndtlagskromatogra-fi, elektroforese, aminosyre-analyse, kernemagnetisk resonansspektro-skopi, elementæranalyse, infrarødspektroskopi o.I.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler. Her og i 15 det foregående er alle dele vægtdele med mindre andet er anført.

Eksempel 1

Til fremstilling af ét af de omhandlede peptider indkøbtes følgende materialer kommercielt.

20

Alpha-BOC-L-Glutamin

Alpha-BOC-s-benzyloxycarbonyl-L-lysin.

I disse reagenser betyder BOC t-butyloxycarbonyl. Reagenser 25 af "sequenal"-kvalitet til aminosyresekvensbestemmelse, dicyclohexyl-carbodiimid (DCC), ninhydrin og harpiksen indkøbtes kommercielt.

Den anvendte harpiks var en benzhydrylamin-harpiks med en kapacitet på 0,5 mækv/g harpiks.

Til fremstilling af peptidet kobledes a-BOC-e-benzyloxycarbonyl-30 L-lysin til benzhydrylamin-harpiksen under anvendelse af DCC som koblingsreagenset. Den resulterende beskyttede aminosyreharpiks indeholdt 0,4-0,5 mmol aminosyre per gram harpiks. Under anvendelse af en "Schwarz/Mann Automatic Peptide Synthesizer" anvendtes følgende program til kobling af a-BOC-L-glutaminaminosyre til a-BOC-35 ε-benzyloxycarbonyl-L-lysinharpiksen: 14909 1 15 1. Forvaskning med 40% trifluoreddikesyre (TFA) i CH2CI2, én gang, 1,5 minutter.

2. Afbeskyttelse med 40% TFA i CHgClg, én gang, 20 minut ter.

05 3. Vaskning med CHCIg, én gang, 1,5 minutter.

4. Vaskning med EtOH, én gang, 1,5 minutter.

5. Vaskning med CH2CI2, to gange, 1,5 minutter.

6. Forvaskning med 10% EtgN i CHgC^, én gang, 1,5 minutter.

10 7. Neutralisering med 10% Et^N i CHgClg, én gang, 10 minutter.

8. Vaskning med CHgClg, tre gange, 1,5 minutter.

9. Tilsætning af BOC-beskyttet aminosyre (5 molært overskud) i dimethylformamid (DMF) og CH2CI2 (1:9 vol/vol).

15 10. Tilsætning af DCC i CHgClg (0,5M 5 molært overskud), reaktionstiden var indtil 2 timer.

11. Vaskning med CH2CI2, to gange, 1,5 minutter.

Efter koblingsreaktionen testedes en portion af harpiksen med ninhy-20 drin og såfremt der forekom et positivt resultat, blev det antaget, at koblingen var ukomplet og den gentoges med den samme beskyttede aminosyre. Som resultat af en enkelt koblingsreaktion under anvendelse af a-BOC-L-glutamin resulterede følgende peptid-harpiks:

25 C BZ

of-BOC-GLN-LYS-harpiks hvori BOC er butyloxycarbonyl og CBZ er benzyloxycarbonyl.

Denne peptid-harpiks spaltedes og de beskyttende grupper fj'er-30 nedes i et "Kel-F" spaltningsapparat (Peninsula Laboratories, Tnc.) under anvendelse af 10 ml vandfri hydrogenfluorid per gram harpiks ved 0°C i 60 minutter med 5 ml anisol per gram peptid-harpiks som skyllemiddel. Efter inddampning til tørhed i vakuum vaskedes remanensen med vandfri ether. Det rå peptid opløstes i 10% vandig eddi-35 kesyre og filtreredes. Harpiksen vaskedes med 10% vandig eddikesyre og det forenede filtrat opsamledes og lyophiliseredes til dannefse af råt peptid. Det rå peptid rensedes ved modstrøms-fordeling under 149091 16 anvendelse af n-butanol.-eddikesyre:vand (4:1:5) som fordelingsfase til frembringelse af det rene peptid. Det resulterende peptid har følgende sekvens: 05 h-gln-lys-nh2

Til identifikation anvendtes tyndtlagskromatografi og elektrofore-se. Aminosyresammensætningen bestemtes ved anvendelse af en amino-syre-analysator.

10 Tyndtlags kromatografi foretoges på 20 pg prøver pi silikagel (kiselgel, 5 x 20 cm) under anvendelse af 1:1:1:1 n-butanol:eddike-syre:ethylacetat:vand som opløsningsmiddelsystem (R^ ) og på cellulose 6064 (Eastman 20 x 20 cm) under anvendelse af 15:10:3:12 n-buta- 2 1 nol:pyridin:eddikesyre:vand som opløsningsmiddelsystem (R^. ). Rf -15 værdierne for H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH var Rf1 = 1,16 og Rf2 = 0,57. Ninhydrin anvendtes som et spray-reagens.

Elektroforese foretoges på en 100 pg prøve på Whitman nr. 3 papir (5,7 x 55 cm) under anvendelse af en pH 5,6 pyridin-acetat-puffer ved en spænding på 1000 V i 1,0 time. Pentapeptidet havde 20 en mobilitet på 2,21 mod katoden for H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH. Ninhydrin- og Pauly-sprayreagenser anvendtes.

Eksempel 2

Til bestemmelse af aktiviteten og egenskaberne af peptidet fra 25 eksempel 1 foretoges bestemmelser på 5-6 uger gamle raske nu/nu mus af begge køn, hvilke mus opfostredes på en BALB/c baggrund (thymocyter udtrykkende Thy-1,2 overfladeantigen) og holdtes under konventionelle betingelser. For antisera, fremstilledes anti Thy-1,2 sera i Thy-1 type mus.

30 Til induktion in vitro af Thy-1+ T-celler eller CR+ B-celle diffe rentiering foretoges induktionen af thymocyt differentiering fra pro-thymocyter in vitro som beskrevet af Komuro og Boyse (Lancet, 1, 740, 1973) under anvendelse af tilvejebringelsen af Thy-1,2 som tegn på T-celle differentiering. Induktionen CR+ B-celle differentiering 35 fra CR~ B-celle prækursorer in vitro foretoges under tilsvarende betingelser under anvendelse som prøvekriterium af evnen af CR+ B-celler til at binde fåre-erythrocyter belagt med subagglutinerende mængder af kanin-antistof og non-lytisk komplement. Milt-celle popu- 149091 17 lationer fra sunde nu/nu mus fraktioneret pi diskontinuerte oksese-rumalbumin-gradienter anvendtes som kilde for begge prækursor-ty-per (Thy-1 og CR ), fordi de har få eller ingen Thy-1+ celler og lavt antal CR+ celler.

05 Som resultat af denne bestemmelse blev det fundet, at peptidet udviste en virkningsselektivitet svarende til ubiquitins ved at inducere differentieringen af Thy-1+ T-lymphocyter og af komplement-re-ceptorer (CR ) B-lymphocyter i koncentrationer varierende fra 10 ng/ml til 10 pg/ml.

10

Eksempel 3-7

Under anvendelse af fremgangsmåden i eksempel 1 og kobling af α-BOC-aminosyrerne i den ønskede rækkefølge efter det i eksempel 1 angivne skema, men med beskyttet sarcosin (fx. or-BOC-sarco- 15 sin) i de passende trin fremstilledes følgende:

Eksempel Forbindelse 3 h-gln-lys-sar-nh2 4 h-sar-gln-lys-nh2 20 5 H-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2 6 H-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2 7 H-SAR-SAR-SAR-SAR-GLN-LYS-NH2

Sekvensen af disse peptider bestemtes med en aminosyre-analy- 25 sator. Tyndtlagskromatografi og elektroforese under samme betingelser som i eksempel 1 gav følgende information: 1 2

Eksempel R^ R^ Mobilitet mod katode 3 0/73 0752 1,52 (2 timer) 30 4 1,16 0,57 2,04 5 0,83 0,61 1,88 6 0,5 0,58 1,83 7 0,32 0,54 1,98 (2 timer) 35 Alle R^- og elektroforese-værdier er i forhold til reference-pep- tidet H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH.

18 1A 90 91

Eksempel 8

Under anvendelse af fremgangsmåden i eksempel 2 vurderedes forbindelserne fremstillet ifølge eksempel 3-7 med hensyn til deres evne til at inducere differentieringen af Thy-1+ T-lymphocyter og 05 CR+ B-lymphocyter. Aktivitetsområderne er anført nedenfor:

Forbindelse Aktiv koncentrationsområde

Eksempel nr._ 3 100 pg/ml - 100 ng/ml 10 4 1-10 pg/ml 5 100 pg/ml - 10 ng/ml 6 10 fg/ml - 100 pg/ml 7 1-100 pg/ml

Claims (3)

149091

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af peptider indeholdende 05 2 - 7 aminosyrerester, desaminodipeptider eller amider deraf med ubiquitin-lignende aktivitet med den almene formel: A-B 10 hvori A er udvalgt fra gruppen bestående af desamino-GLN, GLN og (SAR)n-GLN, hvor n er et helt tal fra 1 til 4, og B er udvalgt fra gruppen bestående af LYS-OH, LYS-NHg og LYS-SAR-NHg eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, KENDETEGNET ved, at man 15 i) binder sarcosin eller Ne-beskyttet lysin, der er beskyttet på a-aminogruppen, til en polymer-harpiks ved covalent binding, hvilken polymer er en sådan, som indeholder en funktionel gruppe, hvortil den første beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af den covalente binding,

20 H) fjerner den α-amino-beskyttende gruppe fra aminosyrehar- piksen og om nødvendigt binder lysin, der er N - og N -beskyttet, til SAR-harpiksen og fjerner α-amino-beskyttelsesgruppen fra LYS-SAR-harpiksen, iii) kobler glutamin eller desaminoglutamin, som er beskyt- 25 tet på dens eventuelle a-aminogruppe og på dens ε-amino- gruppe, til B-aminosyre-harpiksen, og iv) når A-gruppen indeholder en eller flere sarcosyl-dele, fjerner α-aminobeskyttelsesgruppen fra GLN-B-harpiksen, og binder sarcosin, som er beskyttet på dens ot-aminogrup- 3® pe, til kæden og fjerner den α-amino-beskyttende gruppe fra sarcosyl-delen og om nødvendigt gentager denne fremgangsmåde for hver sarcosylrest, der skal kobles, og v) fjerner harpiksen og alle beskyttende grupper fra det resulterende peptid med passende reagenser, og om 33 ønsket fremstiller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af produktet.