DE4011207A1

DE4011207A1 - Humane splenopentinderivate und verfahren zu deren herstellung

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Publication number: DE4011207A1
Application number: DE19904011207
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Stiefel; Harald Dr Porcher
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1990-04-06
Publication date: 1991-10-10
Also published as: WO1991015508A1

Description

Die Erfindung betrifft humane Splenopentinderivate, deren Dimere und cyclische Derivate, und ein Verfahren zu deren Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und deren Verwendung.

Für die Immunabwehr des Organismus ist das abgestimmte Zusammenspiel aller Blutzellen von entscheidender Bedeutung. Die Proliferation und Differenzierung (Funktionalisierung) der Blutzellen wird durch Homogene beeinflußt, die durch primäre und sekundäre Lymphorgane, wie Thymus und Milz, sekretiert werden. So wird durch das 1981 erstmals beschriebene Rinder-Thymopoietin (bTP) die Differenzierung von T-Lymphozyten stimuliert und die von B-Lymphozyten inhibiert, sowie die neuromuskuläre Transmission beeinflußt, während durch das Rinder-Splenin (bSP) die Differenzierung sowohl von T- und B-Lymphozyten stimuliert wird und keine Wirkung auf die neuromuskuläre Transmission erfolgt (AUDHYA et al., Biochemistry 20, 6195, 1981).

1987 wurden die aus menschlichem Thymus und Milz isolierten Hormone hTP und hSP beschrieben (AUDHYA et al., Proc. Nat. Adac. Sci. USA 84, 3345, 1987).

Die biologischen Wirkungen dieser aus 49 bzw. 48 Aminosäuren aufgebauten Hormone werden durch deren sog. "aktives Zentrum", dem Fragment 32-36, reproduziert. Dieses als Thymo- bzw. Splenopentin bezeichnete Pentapeptid weist die Struktur Arg-Lys-X-Val-Tyr auf, wobei im Falle des bTP5 und hTP5 X=Asp ist, während für bSP5 X=Glu und für hSP5 X=Ala ist.

Gegenwärtig wird hTP5 als "Timunox" zur Behandlung von sekundären Immundefizienzen eingesetzt.

Weiterhin ist eine Stimulation der Proliferation und Differenzierung von Knochenmarkstammzellen durch Diacetyl bSP5 beschrieben worden (Z. Klin. Med. 44, S. 2075-2078, 1989).

Da sich das aktive Zentrum des Rinder-Splenins jedoch von dem des humanen Splenins unterscheidet, wäre bei einer längerfristigen Anwendung des Rinder-Splenins oder Rinder-Splenopentins u. U. mit unerwünschten immunologischen Reaktionen zu rechnen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, neue Peptide, die einerseits eine höhere immunmodulierende Aktivität und höhere Stabilität und andererseits keine neurotropen Nebenwirkungen aufweisen und einfach herstellbar sind, sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch humane Splenopentinderivate der allgemeinen Formel I

Arg-X-Ala-R¹ (I),

gelöst, wobei die Aminosäurereste jeweils die L- oder D-Konfiguration aufweisen können und

Arg - einen substituierten oder unsubstituierten Argininrest,
X - einen substituierten oder unsubstituierten Sar-, Pro-, Gly-, Ala-, Leu-, Ile-, Thr-, Ser-, Lys-, Val-, Phe- oder Cys-Rest und
R¹ - einen Rest der allgemeinen Formel -X-Z-OR³ oder -X-Z-N(R³ R⁴)

bedeuten, wobei

R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und H, eine Alkylgruppe mit 1-18 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkarylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen oder Polyhydroxyalkyl bedeuten und
Z einen ggf. mindestens durch OH, NO₂, Halogen und/oder OCH₃ substituierten Tyr-, Phe-, decarboxy-Tyr- oder decarboxy-Phe-Rest oder einen Trp-Rest bedeutet.

Der N-terminal angeordnete Argininrest hat dabei die folgende Formel:

in der Mitte angeordnete Aminosäurereste sind in dem Fachmann bekannter Weise über Peptidbindungen mit benachbarten Resten verbunden, und der vom Rest R¹ umfaßte C-terminale Aminosäurerest Z hat die folgende allgemeine Formel:

wobei Z′ den für den Aminosäurerest typischen aromatischen oder heterocyclischen Rest bedeutet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen ausgezeichnete immunbiologische Eigenschaften auf. Sie besitzen eine immunmodulierende Aktivität und üben u. a. einen direkten Einfluß auf die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen des Knochenmarks aus.

Es konnte gezeigt werden, daß die Human- Splenopentinderivate nicht nur unter immunbiologischen Aspekten unbedenklicher, sondern auch um vieles wirksamer sind als die Rinder-Derivate.

Hinsichtlich ihrer immunmodulierenden Aktivität und ihrer Stabilität sind Verbindungen der Formel I besonders bevorzugt, worin die Aminogruppe des Argininrestes und/oder des Aminosäurerestes X, wobei X bevorzugt ein Lysinrest ist, durch eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 8-12 Kohlenstoffatomen, eine Alkarylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3-7 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkenylgruppe mit 3-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkanoylgruppe mit 1-18 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkanoylgruppe mit 4-12 Kohlenstoffatomen, eine Aroylgruppe mit 7-11 Kohlenstoffatomen, eine Polyhydroxyalkanoylgruppe mit 8-12 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkanoylgruppe mit 7-24 Kohlenstoffatomen oder eine der folgenden Gruppen substituiert ist:

-CO(CH₂)m-CO-R⁵, -CO(CHOH)n-CO-R⁵, wobei m=1-8 und n=1-12 bedeutet, und
R⁵ OH bzw. ein entsprechendes Salz, Ester, Amid,
N -Arg-X-Ala-R¹ oder N -Lys-(Arg)-Ala-R¹ bedeutet.

Verbindungen der Formel I, worin X einen Ala-, Ile-, Lys-, Sar- oder Pro-Rest bedeutet, weisen eine besonders hohe Stabilität auf.

Eine besonders hohe immunmodulierende Aktivität und Stabilität ohne neurotrope Nebenwirkungen zeigen Splenopentinderivate der allgemeinen Formel I, worin X einen Lys-Rest und R¹ einen Val-Tyr-OR³-Rest oder Val-Tyr-N(R³ R⁴)-Rest bedeuten und der Arg- und/oder Lys- und/oder Val-Tyr-Rest substituiert sind, insbesondere folgenden Verbindungen:

(N^α-Acyl-Arg)-X-Ala-R¹,
Arg-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹,
(N^a-Acyl-Arg)-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹,

wobei Acyl bevorzugt Acetyl, X bevorzugt ein Lys-Rest und R¹ bevorzugt ein Val-Tyr-OR³-Rest oder Val-Tyr- N(R³ R⁴)-Rest bedeuten und der Valin- und/oder Tyrosinrest ggf. substituiert sind.

Es wurde gefunden, daß durch N^α- und/oder N^ε-Acylierung, insbesondere Acetylierung, der Splenopentine eine erhebliche Steigerung der immunmodulierenden Aktivität erreicht wird, die auf eine deutliche Erhöhung der Abbaustabilität gegenüber Aminopeptidasen und eine damit verbundene verbesserte Bioverfügbarkeit zurückzuführen ist. Besonders ausgeprägt ist diese Wirkungssteigerung bei Verbindungen der Formel I, worin die N^α-Position des Arginins und/oder die N^ε-Position des Lysins acyliert, insbesondere acetyliert, ist.

Durch Dimerisierung der Splenopentinderivate der Formel I bzw. der entsprechenden Fragmente zur Herstellung von dimerisierten Splenopentinderivaten kann eine weitere Steigerung der immunbiologischen Aktivität erreicht werden. Bevorzugte Dimere werden durch Verknüpfung der α- bzw. ε-Aminogruppe mit der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z direkt oder über Dicarbonsäuren und/oder durch Verknüpfung der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z über Polyoxyethylen-, Polyoxyethylendiamino- oder Polymethylendiamino-Ketten und/oder durch Verknüpfung über S-S-Brückenbindung am Cystein erhalten.

Von besonderer Bedeutung hinsichtlich der immunbiologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide erscheint ihr Effekt der Wirkungssteigerung des GM-CSF (Granulocyten-Macrophagen colony stimulating factor), wodurch die Proliferation und Differenzierung von Knochenmarkstammzellen erhöht wird (Tabelle 1). Offensichtlich initiieren die erfindungsgemäß hergestellten Splenopentinderivate gleichartige biologische Effekte wie der gentechnisch hergestellte GM-CSF, weshalb die Splenopentinderivate bei solchen Krankheiten Therapiewirkungen zeigen, bei denen auch der GM-CSF therapiewirksam ist: Beim AIDS in Kombination mit Azidothymidin (s. Beispiel 3), nach Chemotherapie und autologer Knochenmarktransplantation und bei HIV-Infizierten zwecks Verminderung des Schweregrades der Erkrankung.

Die Beeinflussung der Bildung bestimmter Typen von Blutzellen ermöglicht es, sowohl den Bedarf an Bluttransfusionen erheblich zu mindern und Knochemarktransplantationen einfacher und risikoärmer zu gestalten, als auch die Immunabwehr gegenüber Krankheitserregern (einschließlich AIDS) oder auch Krebs zu unterstützen.

Unter den Dimeren der Splenopentinderivate der allgemeinen Formel I weisen u. a. die Verbindungen, die über eine der folgenden Gruppierungen verknüpft sind, eine hohe immunmodulierende Aktivität auf:

-O-(CH₂)p-O-,
-NH-(CH₂)p-NH-,
-O-(CH₂-CH₂-O-)q-,
-NH-(CH₂-CH₂-O-)q-CH₂-CH₂-NH-,
wobei p=1-18 und q=1-10 000.

Weiterhin wurde beobachtet, daß cyclische Derivate, die durch Verknüpfen der Carboxylgruppe des Aminosäurerestes Z mit einer Aminogruppe des Argininrestes erhalten werden, eine überraschend hohe immunmodulatorische Aktivität bei gleichzeitig hoher Stabilität aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Splenopentinderivate der Formel I können durch Vermischen mit pharmakologisch unbedenklichen Trägermaterialien und/oder Verdünnungsmitteln in pharmazeutische Verabreichungsformen überführt werden.

Die erfindungsgemäßen Splenopentinderivate weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, insbesondere solche zur Normalisierung des Immunsystems, auf. Daher eignen sie sich zur Anwendung bei folgenden medizinischen Indikationen:

- Behandlung viraler Infektionen
Die Splenopentinderivate, insbesondere die acylierten Splenopentinderivate, haben sich als geeignete Wirkstoffe gegen Influenzaviren oder zur Pankreatitis-Behandlung nach Infektion mit Coxsackieviren erwiesen. Hinsichtlich des Ausmaßes der Stimulierung der antiviralen Immunabwehr wurde festgestellt, daß bei Gabe von Virusmengen, die zu einer Infektion mittlerer Schwere führen, die Erkrankung vollständig verhindert werden kann und daß die zur Auslösung einer Erkrankung gleichen Schweregrades notwendige Virusdosis unter der Behandlung um ein Vielfaches höher ist als bei Individuen ohne Therapie.
- Behandlung nach Chemotherapie
Die pharmazeutischen Mittel auf der Basis der erfindungsgemäßen Splenopentinderivate sind geeignet zur Überwindung immunsuppressiver Zustände nach chemotherapeutischen Maßnahmen, z. B. bei der Krebsbehandlung oder infolge überdosierter Ciclosporin-Therapie.
Die Normalisierung der humoralen Immunantwort nach Cyclophosphamid- oder Dexamethason-Behandlung von Mäusen läßt sich durch die Gabe der erfindungsgemäßen Splenopentinderivate erreichen. Da diese jedoch keinen Einfluß auf die Ausbildung der normalen Antigen-spezifischen humoralen Immunantwort haben, sind keine nachteiligen immunmodulatorischen Nebenwirkungen zu erwarten.
Die Splenopentinderivate bewirken die beschleunigte Rekonstitution des Immunsystems von Patienten mit sekundärer Immundefizienz als Folge immunsuppressiver Therapie.
- Stimulierung des Wachstums und der Reifung von Knochenmarkzellen
Die Anwendung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen führt in vitro zu einer Erhöhung der Bildungsrate von Stammzellkolonien aus Maus-Knochenmarkzellen, die mit Leukozyten von Normalpersonen oder Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes in Agar ko-kultiviert wurden. Die vermehrte Bildung von "Kolonien" als Folge der Gegenwart der Splenopentinderivate ist ein Hinweis dafür, daß durch diese direkt die Proliferation unreifer Stammzellen des Knochenmarks angeregt wird und/oder Leukozyten des Menschen unter dem Einfluß der Splenopentinderivate vermehrt koloniebildende Faktoren sezernieren.
Bei subletal bestrahlten und mit syngenen Knochenmarkzellen transplantierten Mäusen ist eine beschleunigte Rekonstitution der humoralen Immunantwort zu beobachten.
Die Wirkstoffe sind bei immunsuppressiver bzw. cytostatischer Therapie nach Bestrahlung und nach Knochenmarktransplantationen anwendbar. Sie wirken dadurch, daß sie spezifische Bindungsorte (Rezeptoren) auf Knochenmarkzellen des Menschen (insbesondere auf Stammzellen) besitzen, die durch Radioligand- Bindungsstudien nachgewiesen werden können. Derartige Bindungsstellen finden sich auch auf Thymozyten und können durch ³H-markierte Splenopentinderivate oder durch ¹²⁵J-markierte, insbesondere diacylierte Splenopentinderivate nachgewiesen werden.
- Therapie von HIV-Infektionen
Die Gabe der erfindungsgemäßen Splenopentinderivate, insbesondere der diacylierten Verbindungen, bewirkt bei HIV-infizierten Patienten eine Anhebung der Gesamtlymphozytenzahl in den Kontrollbereich sowie eine Erhöhung der Absolutzahl von CD3-, CD4- und DR- Zellen sowie eine Verbesserung des CD4/CD8- Verhältnisses. Nach 16wöchiger Therapie traten keine Nebenwirkungen auf.
Eine Kombination mit dem in der AIDS-Therapie eingesetzten Cytostatikum und Revertasehemmer Azidotyhmidin sowie wirksameren Substanzen dieses Typs (Fluor-Thymidin) führt zu einer beschleunigten Normalisierung der durch diese Substanzen bewirkten nachteiligen Veränderungen im Immunsystem.
- Verhinderung immunsuppressiver Effekte chronischer Intoxikationen
Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß die durch Alkohol und andere chronisch wirkende Noxen induzierte Suppression der Antigenspezifischen humoralen Immunreaktion sowie die Verminderung der Zahl bzw. Aktivität phagocytierender Zellen aufgehoben und die partielle Atropie des Thymus und der Milz verhindert wird.
- Therapie von Autoimmunreaktionen
Die erfindungsgemäß hergestellten Substanzen eignen sich zur Therapie verschiedener Krankheiten mit einer Autoimmunkomponente, wie Rheumatoidarthritis, Systemischem Lupus erythematodes, und atopischen Reaktionen. Sie bewirken jedoch nicht die nachteilige Reduktion des Antigen-spezifischen Antikörpertiters nach erfolgter Immunisierung.

Zum Nachweis der immunologischen Wirkungen wurden folgende Modelle verwendet:

- "Kolonien-Bildung" ("Kolonien"-Bildungstest) durch menschliche Knochenmarkzellen nach Kultivierung der Zellen mit dem menschlichen Granulocyten- Makrophagen-"Kolonien"-stimulierenden Faktor (hGM-CSF) und Splenopentinderivaten.
- die Antikörperbildung gegen Schaftserythrozyten (Plaque-bildende Milzzellen) durch AB/Bln.-Mäuse nach Röntgenbestrahlung (Tabelle 2).

Die einzelnen Aminosäurereste bzw. Peptidfragmente sowie die Splenopentinderivate der Formel I können auf dem Fachmann bekannte Weise hergestellt und an entsprechender Stelle der Synthese in an sich bekannter Weise acyliert, cyclisiert bzw. dimerisiert werden.

Die Acylierung der ggf. geschützten Splenopentinderivate der Formel I und der entsprechenden, ggf. geschützten Aminosäurereste bzw. der entsprechenden, ggf. geschützten Di-, Tri- und Tetrapeptidfragmente wird bevorzugt mit N-Hydroxy-norborn-5-en-2,3- dicarboximidestern von Carbonsäuren, insbesondere mit N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid oder N-Acetoxybenzotriazol durchgeführt.

Diese Acylierungsmittel sind wegen ihrer geringen Neigung zu unerwünschten Nebenreaktionen und der damit zu erreichenden hohen Ausbeute an Splenopentinderivaten besonders geeignet.

Aufgrund der hohen Hydrolysebeständigkeit des N-Acetoxy- norborn-5-en,-2,3-dicarboximides besitzt es eine sehr gute Lagerstabilität und kann bei Acylierungsreaktionen sowohl in organischen als auch in wäßrigen Medien eingesetzt werden. Außerdem weist es eine hohe Reaktionsfähigkeit mit Aminogruppen auch ohne Basenzusatz auf.

Die Herstellung von (N^α-Acyl-Arg)-(N^ε-Acyl-Lys)- Ala-R¹ kann durch Acylierung von Arg-Lys-Ala-R¹ erfolgen.

Arg-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹ und (N^α-Acyl-Arg)- Lys-Ala-R¹ werden durch Acylierung von partiell geschützten Arg-Lys-Ala-R¹ und anschließende Abspaltung der N^α- bzw. N^ε-Schutzgruppe hergestellt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Stimulierung des Wachstums und der Reifung von Knochenmarkstammzellen (in vitro)

Die folgende Tabelle 1 gibt die Ergebnisse eines Versuchs wieder, bei dem die Anzahl der Kolonien pro 10⁵ menschlicher Knochenmarkzellen (KMZ) nach Kultivierung (Spoonoer et al., Differentation 31, 111, 1986) der Zellen mit dem menschlichen Granulocyten-Makrophagen- Kolonien-stimulierenden Faktor (hGMCSF)⁵) und Splenopentin (SP5), Splenopentin-Analoga oder Thymopentin (TP5) bestimmt wurde.

Tabelle 1

Die Anzahl der gebildeten "Kolonien" ist dabei ein Maß für die mitotische bzw. differenzierende Wirkung der Faktoren auf die Knochenmarkzellen.

Da Thymopentin in diesem Testsystem (Tab. 1, Nr. 6) keine Wirkung zeigte, ist anzunehmen, daß die immunstimulierende Wirkung von Timunox nicht über eine Wirkung auf Stammzellen des Knochenmarks zustande kommt.

Beispiel 2 Beeinflussung der Funktion von Zellen des Knochenmarks (in vivo)

Es wurden drei Monate alte AB/Bln.-Mäuse einmalig mit 800 cGy röntgenbestrahlt. Danach wurden die Tiere in drei Gruppen aufgeteilt und folgendermaßen weiterbehandelt:
Gruppe 1: Nach der Bestrahlung wurden den Tieren Knochenmarkzellen von Tieren des gleichen Inzuchtstammes transplantiert (Injektion von je 5mal 10⁶ Knochenmarkzellen pro Tier). Anschließend wurden die Tiere dreimal wöchentlich mit DAc-hSP5 in einer Dosis von 10 µg pro Tier behandelt (intraperitoneale Applikation). In differenten Zeitabständen nach der Bestrahlung und während der DAc-hSP5-Behandlung wurde mittels des JERNE-Plaque-Testes die Fähigkeit der Tiere untersucht, Antikörper zu bilden.
Gruppe 2: Gleiche Behandlung der Tiere wie in Gruppe 1, jedoch keine Therapie der Tiere mit DAc-hSP5.
Gruppe 3: Alleinige Röntgenbestrahlung der Tiere; keine Transplantation syngener Knochenmarkzellen, keine Therapie der Tiere mit DAc-hSP5.

Fünf Tage vor der Bestimmung der IgM Plaque-bildenden Milzzellen (Tage, angegeben in Tabelle 2) wurden die Tiere mit 5×10⁸ Schafserythrozyten immunisiert (intraperitoneale Applikation). Methodik: Eckert et al., Biomed. Biochem. Acta 44, 1239, 1985.

Die Ergebnisse zeigen (Tabelle 2), daß unter in vivo Bedindungen Zellen des Knochenmarks durch DAc-hSP5 beschleunigt und zu einer normalen Antikörperbildung befähigt werden. Dies impliziert, daß durch DAc-hSP5 Zellen des Knochenmarks auch in vivo beschleunigt "reifen", d. h. sich schneller in funktionell aktive Zellen differenzieren.

Die intraperitoneale Applikation von 10 µg pro Tier dreimal wöchentlich hatte einen optimalen Effekt, 1 µg, 2 µg und 4 µg waren unter identischen Bedingungen nicht wirksam, 8 µg wirkten suboptimal. Nach Applikation von 20 µg und 50 µg konnte ein Effekt wie nach der von 10 µg gemessen werden. Grundsätzlich gleichartige Ergebnisse wurden bei der Verwendung anderer Splenopentinderivate der Formel I erzielt.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt, wobei die Anzahl Plaque-bildender Milzzellen pro Milz als Maß für die Antikörperbildung gegen Schafserythrozyten durch AB/Bln.-Mäuse nach einmaliger Röntgenbestrahlung der Tiere mit 800 cGy, nachfolgender Transplantation syngener Knochenmarkzellen (5×10⁶ Knochenmarkzellen) und ggf. anschließender Behandlung der Tiere mit DAc-hSP5 (Nr. 3) angegeben ist. Gabe von 10 µg DAc-hSP5 erfolgte umtägig dreimal wöchentlich. Jeder Wert (Mittelwert±Streuung) repräsentiert den Mittelwert von mindestens fünf Tieren.

Tabelle 2

Beispiel 3 Azidothymidin-Experimente

Bei den in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßten Experimenten wurden je 10⁵ menschliche Knochenmarkzellen (KMZ) zunächst 10 Tage lediglich in Iscove's Medium (Iscove und Melchers, J. Exp. Med. 147, 923-933, 1978) mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum und dem entsprechenden, in der Tabelle angegebenen Splenopentinderivat kultiviert (5 µg pro 1 ml Medium). Anschließend wurden die Zellen weitere 12 Tage in Agar-Medium ohne Splenopentinderivate, jedoch mit Zusatz von 100 Einheiten pro 1 ml Medium rekombinanten menschlichen GM-CSF (rHuGM-CSF) und mit bzw. ohne Azidothymidin (Endkonzentration 0,4 bzw. 0,8 µM) kultiviert. Kontrolldaten wurden gewonnen, indem die Vorinkubation ohne Zusatz von Splenopentin durchgeführt wurde.

Wie Tabelle 3 zu entnehmen ist, läßt sich durch eine Vorinkubation der Knochenmarkzellen mit bovinen Splenopentin der cytostatische Effekt des Azidothymidins bereits weitgehend aufheben. Eine mit DAc-bSP5 vorinkubierte Probe führt nach Kultivierung mit rHuGM- CSF und 0,8 µM Azidothymidin (AZT) zur Bildung von 27,4±6,9 Kolonien, was ungefähr der Anzahl der Kolonien einer nicht cytostatisch behandelten Knochenmarkzellenpopulation entspricht (s. Nr. 1). Überraschenderweise übertrifft jedoch der Effekt humanen DAc-hSP5 die Wirkung des bovinen Splenopentins bei weitem. Ein Vergleich der Proben Nr. 9 und 6 zeigt, daß eine Inkubation mit modifiziertem humanem Splenopentin eine Steigerung der Kolonienzahl um ca. 2/3 des mit modifiziertem bSP5 erzielbaren Ergebnisses ergibt.

Wurden die Knochenmarkzellen, ohne zuvor mit einem Splenopentinderivat inkubiert worden zu sein, mit AZT, rHuGM-CSF und den Splenopentinderivaten gleichzeitig kultiviert, wurde keine Erhöhung der Kolonienzahl beobachtet (Ergebnisse nicht vorgestellt).

Die folgende Tabelle 3 gibt die Anzahl der "Kolonien" pro 10⁵ menschlicher Knochenmarkzellen (KMZ) nach 10tägiger Vorinkubation der Zellen mit bzw. ohne Splenopentinderivate und nachfolgender Kultivierung der Zellen mit menschlichem rekombinanten Granulocyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierenden Faktor (rHuGM-CSF) in Verbindung mit oder ohne Azidothymidin (AZT, Wellcome, UK) an.

Tabelle 3

Beispiel 4

In den folgenden beispielhaft beschriebenen Synthesen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

AcOH - Essigsäure
AcONE - N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid
CAIBE - Chlorameisensäureisobutylester
DMF - Dimethylformamid
EE - Essigsäureethylester
NMM - N-Methylmorpholin
TFA - Trifluoressigsäure

1. Herstellung von (N^α-Acetyl)-arginyl-(N^ε-Acetyl)- lysylalanylvalyltyrosin (DAc-h-SP-5) 1.1 Synthese von Boc-Val-Tyr-OBzl

1,2 g (5,5 mMol) Boc-Val-OH werden in DMF unter Zusatz von 0,65 ml (5,5 mMol) NMM mit 0,68 ml (5,25 mMol) CAIBE bei -15°C zum Mischanhydrid aktiviert. Dazu gibt man die gekühlte Lösung von 2,22 g (5 mMol) Tyr-OBzl*Tos in DMF unter Zusatz von 0,55 ml (5 mMol) NMM. Nach beendeter Reaktion wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Den Rückstand nimmt man in EE auf und schüttelt die organische Phase sauer und alkalisch aus, trocknet über Na₂SO₄, engt im Vakuum ein und fällt mit Ether. Der Feststoff wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 2,2 g/93,5% d. Th.
MG: 470,58
Summenformel: C₂₆H₃₄N₂O₆

1.2 Freisetzung zum H-Val-Tyr-OBzl*HCl

2 g (4,25 mMol) Boc-Val-Tyr-OBzl werden 30 min mit 10,6 ml 4n HCl/EE behandelt. Die überschüssige HCl/EE wird im Vakuum abdestilliert und das Produkt aus EE gefällt, abfiltriert, mit EE gewaschen und im Vakuum über KOH getrocknet.

Ausbeute: 1,37 g/79,3% d. Th.
MG: 406,91
Summenformel: C₂₁H₂₇N₂O₄Cl

1.3 Synthese von Boc-Ala-Val-Tyr-OBzl

1,02 g (5,41 mMol) Boc-Ala-OH werden in DMF unter Zusatz von 0,59 ml (5,4 mMol) NMM bei -15°C mit 0,67 ml (5,16 mMol) CAIBE aktiviert und anschließend mit der vorgekühlten Lösung von 2,0 g (4,92 mMol) H-Val-Tyr-OBzl*HCl und 0,54 ml (4,92 mMol) NMM zur Reaktion gebracht. Aufarbeitung erfolgt analog 1.1.

Ausbeute: 2,5 g/92,4% d. Th.
MG: 541,66
Summenformel: C₂₉H₃₉N₃O₇

1.4 Freisetzung zum H-Ala-Val-Tyr-OBzl*HCl

2,46 g (4,54 mMol) Boc-Ala-Val-Tyr-OBzl werden mit 12,5 ml (050 mMol) 4 n HCl/EE behandelt. Die überschüssige HCl/EE wird im Vakuum abdestilliert und das Produkt mit Ether gefällt, abfiltriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum über KOH getrocknet.

Ausbeute: 1,95 g/89,9% d. Th.
MG: 478,0
Summenformel: C₂₄H₃₂N₃O₅Cl

1.5 Synthese von Boc-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl

1,9 g (5 mMol) Boc-Lys(Z)-OH werden in DMF unter Zusatz von 0,55 ml (5 mMol) NMM bei -15°C mit 0,62 ml (4,77 mMol) CAIBE aktiviert und anschließend mit der vorgekühlten Lösung von 2,17 g (4,54 mMol) H-Ala-Val-Tyr-OBzl*HCl und 0,5 ml (4,54 mMol) NMM zur Reaktion gebracht. Nach beendeter Reaktion wird die Reaktionslösung in 5%ige NaHCO₃ eingerührt. Das Produkt wird abfiltriert und neutral gewaschen, anschließend erneut in DMF gelöst und in 1 n HCl eingerührt, filtriert und neutral gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 3,47 g/95% d. Th.
MG: 803,92
Summenformel: C₄₃H₅₇N₅O₁₀

1.6 Freisetzung zum H-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl*TFA

3,65 g (4,54 mMol) Boc-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl werden 1 Stunde mit 17,3 ml (227 mMol) TFA in 15 ml Dichlorethan behandelt. Nach Abdestillieren der überschüssigen TFA/Dichlorethan wird der Rückstand in wenig Dichlorethan aufgenommen und in Ether eingerührt, das Produkt abfiltiert, mit Ether gewaschen und im Vakuum über KOH getrocknet.

Ausbeute: 3,23 g/87% d. Th.
MG: 817,88
Summenformel: C₄₀H₅₀N₅O₁₀F₃

1.7 Synthese von Boc-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl

1,39 g (4,35 mMol) (Boc-Arg(NO₂)-OH werden in DMF unter Zusatz von 0,48 ml (4,35 mMol) NMM bei -15°C mit 0,54 ml (4,15 mMol) CAIBE aktiviert und mit der vorgekühlten Lösung von 3,23 g (3,95 mMol) H-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr- OBzl*TFA und 0,44 ml (3,95 mMol) NMM zur Reaktion gebracht. Die Aufarbeitung erfolgt analog 1.5.

Ausbeute: 3,48 g/87,6% d. Th.
MG: 1005,18
Summenformel: C₄₉H₆₈N₁₀O₁₃

1.8 Freisetzung zum H-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr- OBzl*TFA

3,48 g (3,46 mMol) Boc-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl werden 1 Stunde mit 13,15 ml (173 mMol) TFA in 12 ml Dichlorethan behandelt. Die Aufarbeitung erfolgt analog 1.6.

Ausbeute: 3,4 g/96,4% d. Th.
MG: 1019,07
Summenformel: C₄₆H₆₁N₁₀O₁₃F₃

1.9 Hydrierung zum H-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-OH*3AcOH

3,0 g (2,94 mMol) H-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl*TFA werden in 90%iger AcOH gelöst, 0,3 g Pd/Aktivkohle (10%ig) zugesetzt und bei RT und Normaldruck H₂-Gas eingeleitet. Nach vollständiger Schutzgruppenabspaltung wird Katalysator abfiltriert, die Lösung eingeengt und in Ether eingerührt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 2,28 g/95% d. Th.
MG: 815,78
Summenformel: C₃₅H₆₁N₉O₁₃

1.10 Acetylierung zum Ac-Arg-Lys(Ac)-Ala-Val-Tyr-OH*AcOH

0,816 g (1 mMol) Arg-Lys-Ala-Val-Tyr * 3AcOH, gelöst in 10 ml Wasser, werden mit einer Lösung von 0,66 g (3 mMol) AcONB (N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid) in 10 ml DMF zur Reaktion gebracht. Nach beendeter Reaktion wird das Lösungsmittelgemisch im Vakuum eingeengt und der Rückstand in Ether eingetropft. Das Produkt wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 0,7 g/90% d. Th.
MG: 778,91
Summenformel: C₃₅H₅₇N₉O₁₁

2. Herstellung von (N^α-Acetyl-)arginyllysylalanylvalyl- tyrosin (α-MAc-SP-5*2AcOH) 2.1 Synthese von Ac-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl

1,09 g (1 mMol) H-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl*TFA werden in 5 ml DMF gelöst und nach Zugabe von 180 ml NMM (oder einem anderen tertiären Amin) mit 0,27 g (1,2 mMol) AcONB umgesetzt. Nach 30 min wird die Reaktionsmischung unter Rühren in 1 n HCl eingetragen, der Niederschlag abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird in ca. 10 ml DMF gelöst und mit 5%iger NaHCO₃-Lösung gefällt, filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 0,92 g/96,6% d. Th.
MG: 947,01
Summenformel: C₄₆H₆₉N₁₀O₁₂

2.2 Hydrierung zum Ac-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-OH*2AcOH

0,9 g (0,95 mMol) Ac-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl werden analog Schritt 1.9 hydriert.

Ausbeute: 0,7 g/92% d. Th.
MG: 797,93
Summenformel: C₃₅H₅₉N₉O₁₂

3. Herstellung von H-Arg-Lys(Ac)-Ala-Val-Tyr-OH*2AcOH 3.1 Hydrierung zum Boc-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-OH*2AcOH

Analog zu Schritt 1.9 werden 5,02 g (5 mMol) Boc-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Ala-Val-Tyr-OBzl hydriert.

Ausbeute: 3,98 g/93% d. Th.
MG: 856
Summenformel: C₃₈H₆₅N₉O₁₃

3.2 Acetylierung zum Boc-Arg-Lys(Ac)-Ala-Val-Tyr-OH*AcOH

Analog zu Schritt 1.10 werden 3,42 g (4 mMol) Boc-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-OH*2AcOH acetyliert.

Ausbeute: 2,98 g/89% d. Th.
MG: 837,98
Summenformel: C₃₈H₆₃N₉O₁₂

3.3. Deblockierung zum H-Arg-Lys(Ac)-Ala-Val-Tyr-OH*2AcOH

Analog zu Schritt 1.8 werden 2,51 g (3 mMol) Boc-Arg-Lys(Ac)-Ala-Val-Tyr-OH*AcOH deblockiert. Nach vollständiger Deblockierung wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Eisessig aufgenommen und in Ether eingetropft, filtriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 2,03 g/85% d. Th.
MG: 797,93
Summenformel: C₃₅H₅₉N₉O₁₂

4. Herstellung der Peptid-Hydrochloride

Durch Auflösen der in den Schritten 1.9, 1.10, 2.2 und 3.3 beschriebenen Peptide in 1,1 Äquivalenten 0,1 n HCl und nachfolgende Lyophilisation werden die entsprechenden Peptid-Hydrochloride erhalten.

5. Herstellung der freien Peptide

Durch Auflösen der in den Schritten 1.9, 1.10, 2.2 und 3.3 oder in Schritt 4 beschriebenen Peptide in Wasser und Titration mit 0,1 n NaOH werden nach säulenchromatographischer Entsalzung und Lyophilisation die entsprechenden freien Peptide erhalten.

Claims

1. Humane Splenopentinderivate der allgemeinen Formel I Arg-X-Ala-R¹ (I),wobei die Aminosäurereste jeweils die L- oder D- Konfiguration aufweisen können undArg - einen substituierten oder unsubstituierten Argininrest,
X - einen substituierten oder unsubstituierten Sar-, Pro-, Gly-, Ala-, Leu-, Ile-, Thr-, Ser-, Lys-, Val-, Phe- oder Cys-Rest und
R¹ - einen Rest der allgemeinen Formel -X-Z-OR³ oder -X-Z-N(R³ R⁴)bedeuten wobeiR³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und H, eine Alkylgruppe mit 1-18 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkarylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen oder Polyhydroxylalkyl bedeuten und
Z einen ggf. mindestens durch OH, NO₂, Halogen und/oder OCH₃ substituierten Tyr-, Phe-, decarboxy-Tyr- oder decarboxy-Phe-Rest oder einen Trp-Rest bedeutet.

2. Splenopentinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppe des Argininrestes und/oder des Aminosäurerestes X, wobei X bevorzugt ein Lysinrest ist, durch eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 8-12 Kohlenstoffatomen, eine Alkarylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3-7 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkenylgruppe mit 3-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkanoylgruppe mit 1-18 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkanoylgruppe mit 4-12 Kohlenstoffatomen, eine Aroylgruppe mit 7-11 Kohlenstoffatomen, eine Polyhydroxyalkanoylgruppe mit 8-12 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkanoylgruppe mit 7-24 Kohlenstoffatomen oder eine der folgenden Gruppen substituiert ist: -CO(CH₂)m-CO-R⁵, -CO(CHOH)n-CO-R⁵, wobei m=1-8 und n=1-12 bedeutet, und
R⁵ OH bzw. ein entsprechendes Salz, Ester, Amid,
N -Arg-X-Ala-R¹ oder N -Lys-(Arg)-Ala-R¹ bedeutet.

3. Splenopentinderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Lysinrest und R¹ ein Val-Tyr-OR³-Rest oder Val-Tyr-N(R³ R⁴)-Rest bedeuten und der Arg- und/oder Lys- und/oder Val-Tyr-Rest substituiert oder unsubstituiert sind.

4. Splenopentinderivate nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der allgemeinen Formel: (N^α-Acyl-Arg)-X-Ala-R¹,
Arg-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹,
(N^α-Acyl-Arg)-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹,wobei Acyl bevorzugt Acetyl, X bevorzugt ein Lys-Rest und R¹ bevorzugt ein Val-Tyr-OR³-Rest oder Val-Tyr- N(R³ R⁴)-Rest bedeuten, und der Valin- und/oder Tyrosinrest substituiert oder unsubstituiert sind.

5. Dimere der Splenopentinderivate nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Dimerisierung auf einer Verknüpfung der α- bzw. ε-Aminogruppe mit der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z direkt oder über Dicarbonsäuren und/oder auf einer Verknüpfung der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z über Polyoxyethylen-, Polyoxyethylendiamino oder Polymethylendiamino-Ketten und/oder auf einer Verknüpfung über S-S- Brückenbindung an den Cysteinresten beruht.

6. Dimere der Splenopentinderivate nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Dimerisierung durch eine Verknüpfung der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z über eine der folgenden Gruppierungen erhalten wird: -O-(CH₂)_p-O-,
-NH-(CH₂)p-NH-,
-O-(CH₂-CH₂-O-)_q-,
-NH-(CH₂-CH₂-O-)_q-CH₂-CH₂-NH-,
wobei p=1-18 und q=1-10 000.

7. Cyclische Derivate der Splenopentinderivate nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, erhältlich durch Verknüpfung der Carboxylgruppe des Aminosäurerestes Z mit einer Aminogruppe des Argininrestes.

8. Pharmazeutische Zubereitung mit immunmodulierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Splenopentinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein pharmakologisch unbedenkliches Trägermaterial enthält.

9. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Verdünnungsmittel enthält.

10. Verwendung der Splenopentinderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Normalisierung des Immunsystems, zur Behandlung viraler Infektionen, zur Behandlung nach chemotherapeutischen Maßnahmen, zur Stimulierung des Wachstums und der Reifung von Knochenmarkzellen, zur Therapie von HIV-Infektionen, zur Verhinderung von immunsuppressiven Wirkungen bei chronischer Intoxikation, wie chronischem Alkoholkonsum, und zur Therapie von Autoimmunreaktionen.

11. Verfahren zur Herstellung humaner Splenopentinderivate der allgemeinen Formel I Arg-X-Ala-R¹ (I),wobei die Aminosäurereste jeweils L- oder D- Konfiguration aufweisen können undArg - einen substituierten oder unsubstituierten Argininrest,
X - einen substituierten oder unsubstituierten Sar-, Pro-, Gly-, Ala-, Leu-, Ile-, Thr-, Ser-, Lys-, Val-, Phe- oder Cys-Rest und
R¹ - einen Rest der allgemeinen Formel -X-Z-OR³ oder -X-Z-N(R³ R⁴)bedeuten, wobeiR³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und H, eine Alkylgruppe mit 1-18 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkarylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen oder Polyhydroxyalkyl bedeuten und
Z einen ggf mindestens durch OH, NO₂, Halogen und/oder OCH₃ substituierten Tyr-, Phe-, decarboxy-Tyr- oder decarboxy-Phe-Rest oder einen Trp-Rest bedeutet,wobei man die entsprechenden, ggf. geschützten und/oder acylierten Aminosäurereste bzw. deren Salze, Komplexe, Amide oder Ester stufenweise oder durch Fragmentkondensation nach an sich bekannten Methoden der Peptidsynthese zu den ggf. geschützten Splenopentinderivaten der Formel I bzw. deren Salzen, Komplexen, Amiden und Estern umsetzt, ggf. in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen selektiv abspaltet, ggf. in an sich bekannter Weise acyliert, ggf. die ggf. geschützten Splenopentinderivate der Formel I in ihre Salze, Komplexe, Amide oder Ester überführt und/oder aus den Salzen, Komplexen, Amiden und Estern das freie Peptid der Formel I freisetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in den Splenopentinderivaten der Formel I die Aminogruppe des Argininrestes und/oder des Aminosäurerestes X, wobei X bevorzugt ein Lysinrest ist, durch eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6-12 Kohlenstoffatomen, eine Alkarylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7-20 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3-7 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkenylgruppe mit 3-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkanoylgruppe mit 1-18 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkanoylgruppe mit 4-12 Kohlenstoffatomen, eine Aroylgruppe mit 7-11 Kohlenstoffatomen, eine Polyhydroxyalkanoylgruppe mit 6-12 Kohlenstoffatomen, eine Aralkanoylgruppe mit 7-24 Kohlenstoffatomen, oder eine der folgenden Gruppen substituiert ist: -CO(CH₂)_m-CO-R⁵, -CO(CHOH)_n-CO-R⁵, wobei m=1-8 und n=1-12 bedeutet, und
wobei R⁵ OH bzw. ein entsprechendes Salz, Ester, Amid, N -Arg-X-Ala-R¹ oder N -Lys-(Arg)-Ala-R¹ bedeutet.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß Splenopentinderivate der Formel I, worin X ein Lys-Rest und R¹ ein Val-Tyr-OR³- Rest oder Val-Tyr-N(R³ R⁴)-Rest bedeuten und der Arg- und/oder Lys- und/oder Val-Tyr-Rest substituiert sind, hergestellt werden.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Splenopentinderivate der Formel I hergestellt werden, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: (N^α-Acyl-Arg)-X-Ala-R¹
Arg-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹
(N^α-Acyl-Arg)-(N^ε-Acyl-Lys)-Ala-R¹,wobei Acyl bevorzugt Acetyl, X bevorzugt ein Lys-Rest und R¹ bevorzugt ein Val-Tyr-OR³-Rest oder Val-Tyr- N(R³ R⁴)-Rest bedeuten und der Valin- und/oder Tyrosin-Rest substituiert oder unsubstituiert sind.

15. Verfahren nach mindestes einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin durch Verknüpfung der α- bzw. ε-Aminogruppe mit der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z direkt oder über Dicarbonsäuren und/oder durch Verknüpfung der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z über Polyoxyethylen-, Polyoxyethylendiamino- oder Polymethylendiamino-Ketten oder durch Verknüpfung über S-S-Brückenbindung in an sich bekannter Weise Dimere erzeugt werden.

16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 14,
dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin durch Verknüpfen der α-Carboxylgruppe des Alaninrestes bzw. des Aminosäurerestes Z über eine der folgenden Gruppierungen in an sich bekannter Weise Dimere erzeugt werden: -O-(CH₂)_p-O-,
-NH-(CH₂)_p-NH-,
-O-(CH₂-CH₂-O-)_q-,
-NH-(CH₂-CH₂-O-)_q-CH₂-CH₂-NH-,
wobei p=1-18 und q=1-10 000.

17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß durch Verknüpfung der α-Carboxylgruppe des Aminosäurerestes Z mit einer Aminogruppe des Argininrestes in an sich bekannter Weise cyclische Derivate erzeugt werden.

18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung des ggf. geschützten Splenopentinderivats der allgemeinen Formel I und der entsprechenden, ggf. geschützten Aminosäurereste bzw. der entsprechenden ggf. geschützten Di-, Tri- und Tetrapeptidfragmente mit N-Hydroxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximidestern von Carbonsäuren, vorzugsweise mit N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid, durchgeführt wird.

19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung des ggf. geschützten Splenopentinderivats der allgemeinen Formel I und der entsprechenden, ggf. geschützten Aminosäurereste bzw. der entsprechenden, ggf. geschützten Di-, Tri- und Tetrapeptidfragmente mit N-Acetoxybenzotriazol durchgeführt wird.

20. Verfahren zur Herstellung von (N^α-Acyl-Arg)-(N^ε- Acyl-Lys)-Ala-R¹ nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei Arg-Lys-Ala-R¹ acyliert wird.

21. Verfahren zur Herstellung von Arg-(N^ε-Acyl-Lys)- Ala-R¹ und (N^α-Acyl-Arg)-Lys-Ala-R¹ nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei partiell geschütztes Arg-Lys-Ala-R¹ acyliert und anschließend die N^α- bzw. N^ε-Schutzgruppe abgespalten wird.