DE69532578T2

DE69532578T2 - NEUARTIGE GnRH - ANALOGE MIT ANTITUMORALEN EFFEKTEN UND SIE ENTHALTENDE PHARMAZEUTISCHE ZUBEREITUNGEN

Info

Publication number: DE69532578T2
Application number: DE69532578T
Authority: DE
Inventors: Sandor Lovas; Richard F Murphy; Geza Toth; Adrienn Kalnay; Dezso Gaal; Istvan Palyi; Gizella Turi; Borbala Vincze; Imre Mezo; Henrietta Tanai; Zsolt Vadasz; Istvan Teplan; Janos Seprodi
Original assignee: Lovas Sandor Omaha; Murphy Richard F Omaha
Current assignee: Lovas Sandor Omaha; Murphy Richard F Omaha
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2015-08-10
Also published as: EP0728012A4; AU3361695A; DE69532578D1; WO1996004927A1; EP0728012A1; JPH09508142A; EP0728012B1; CA2173727A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete biochemischer Endokrinologie und antineoplastischer Pharmakologie. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung neue Verbindungen, die GnRH-Analoga mit antitumoralen Wirkungen umfassen, und pharmazeutische Zubereitungen derselben.
Beschreibung des Standes der Technik
Es ist bekannt, dass dieser Faktor hypothalamischen Ursprungs (ein Peptidhormon, das aus 10 Aminosäuren aufgebaut ist) für die Sekretion von luteinisierendem Hormon (LH) und Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) verantwortlich ist. Es erwies sich, dass eine Anzahl von agonistischen und antagonistischen Analoga von GnRHs nicht nur für eine erfolgreiche Beeinflussung von Verfahren der Reproduktionsbiologie nützlich, sondern auch als antitumorale Arzneistoffe geeignet ist.
GnRH-Analoga können ihre antitumorale Wirkung nicht nur durch chemische Kastration, sondern auch auf selektive Weise durch direkte Einwirkung auf die Tumorzellen ausüben. Die Anwesenheit von (einem) Rezeptor(en), der bzw. die GnRH bzw. GnRH-Analoga spezifisch binden, sowie von GnRH-mRNA wurde in Zellkulturen von Krebsen der menschlichen Mamma, Prostata, des menschlichen Ovariums und Pankreas gezeigt. Weiter wurde die Proliferations-induzierende Wirkung von GnRH-Analoga in vitro bei den gleichen Zelllinien bewiesen. Die spezifische Bindung von Tritium-markiertem D-Phe⁶-GnRH(1-9)-ethylamid (OVURELIN), einem menschlichen GnRH-Superagonisten, an Zellen der menschlichen MCF-7- und MDA-MB-231-Mammakarzinom-Zelllinie wurde in Experimenten demonstriert. Diese Ergebnisse bestätigen die Anwesenheit von (einem) Rezeptor(en), der bzw. die GnRH-Analoga spezifisch binden, was eine fundamentale Bedingung für die Entwicklung einer direkten Wirkung ist. Ähnlich erwies sich, dass D-Trp⁶-hGnRH (DECAPEPTYL), ein agonistisches Analogon, das in die therapeutische Praxis eingebracht wurde, einen Rezeptor auf der MDA-MB-231-Tumor-Zelllinie und eine direkte wachstumsinhibierende Auswirkung auf die oben erwähnte menschliche Mammatumor-Zelllinie besitzt.
Auf der Grundlage der wirksamen Konzentration kann angenommen werden, dass (eine) Bindungsstelle(n) mit niedriger Affinität eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der direkten antitumoralen Wirkung spielen. Gemäß der Literatur findet die direkte antitumorale Wirkung von GnRH-Analoga nur bei relativ hohen Peptidkonzentrationen (10^–6, 10^–5 M) statt. Diese pharmakologische Wirkung kann nur in dem Fall erzielt werden, in dem das aktive Molekül im Körper nicht nur in hoher Konzentration, sondern auch über eine lange Zeit anwesend ist. Lange Zeit glaubte man, dass GnRH kein artspezifisches Hormon ist; es wurde so spät wie in den frühen Achtziger Jahren bekannt, dass die Struktur von Gonadoliberin einiger Fisch- bzw. Vogelarten von derjenigen der Säuger verschieden ist. Im Vergleich zum Säuger-GnRH unterscheidet sich die Struktur des Fisch- bzw. Vogelspezifischen GnRH in der bzw. den Aminosäureposition(en) 7 und/oder 8. Mit Bezug auf die Freisetzung von LH bzw. FSH von Säugern sind die Analoga von Hühner-GnRH oder Lachs-GnRH nicht hyperaktiv und desensibilisieren deshalb nicht die gonadotropen Zellen der Hypophyse im entsprechenden Dosisbereich. Die Zusammensetzung von Säuger-, z. B. menschlichem, GnRH ist wie folgt: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.
Im Jahr 1993 isolierten und synthetisierten Forscher das Neunauge-III-GnRH-Dekapeptid aus Neunauge (Petromyzon marinus) (pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH₂). Dieses Neunauge-III-GnRH (hierin nachstehend GnRH-III) übt eine signifikante Tumorwachstums-inhibierende Wirkung auf menschliche Mammatumor-Zelllinien aus. Gleichzeitig wurde bei der Untersuchung der endokrinologischen Wirkung von GnRH-III auf die Rattenhypophyse unter Verwendung des Superfusionsverfahrens gefunden, dass die LH-freisetzende Wirkung dieses Hormons ungefähr 1000-mal schwächer ist als diejenige des menschlichen GnRH. Im Verlauf von In-vivo-Untersuchungen wurde gefunden, dass es während einer längeren Behandlung über drei Zyklen die Ovulation von weiblichen Ratten selbst in hohen Dosen nicht hemmt. Deshalb induzierte es keine Desensibilisierung und chemische Kastration. Mit Bezug darauf fand bei den Tumor-tragenden Tieren kein „aufflackerndes" Tumorwachstum statt, das zu Beginn einer Behandlung auftritt, im Gegensatz zu anderen bekannten menschlichen Hormon-Analoga, die durch denselben Wirkmechanismus wirken. So ist GnRH-III eine selektive, hoch wirksame Antitumor-Verbindung.
Bei der therapeutischen Verwendung von Peptidhormonen und deren synthetischen Analoga ist eine häufige Forderung, die Menge des pharmakologisch aktiven Moleküls bei einer hohen stetigen Konzentration aufrechtzuerhalten. So erwiesen sich z. B. mehrere agonistische oder antagonistische synthetische Analoga von Gonadoliberin (GnRH), einem Peptidhormon, das aus 10 Aminosäuren aufgebaut ist und die Freisetzung von luteinisierendem Hormon (LH) und Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) aus der Hypophyse stimuliert, nicht nur für eine erfolgreiche Beeinflussung von Prozessen der Reproduktionsbiologie, sondern auch zur Bereitstellung der Möglichkeit einer Verwendung als Antitumor-Arzneistoffe nützlich. Abhängig vom Verwendungsweg sind GnRH und dessen Analoga in der Lage, die Sekretion von Gonadotropin zu stimulieren oder zu inhibieren. Bei der wiederholten oder kontinuierlichen Durchführung einer Behandlung über eine längere Zeit mit GnRH-Analoga wird als Ergebnis einer desensibilisierenden Wirkung, die auf die Hypophyse ausgeübt wird, durch eine ausgeprägte Verringerung der Freisetzung von Gonadotropin und Steroiden eine sogenannte pharmakologische Gonadektomie induziert. Gonadektomie ist eine erforderliche therapeutische Intervention bei der Behandlung von Steroidabhängigen gonadalen Krankheits-Entitäten. Gleichzeitig ist Gonadektomie reversibel und stört den Patienten psychisch nicht. Diese Analoga erwiesen sich auf der Grundlage der jüngsten Daten bei der Therapie von Prostata-, Mamma- und Endometrium-Karzinom und selbst Krebsen des Pankreas und der Hypophyse als wirksam. Synthetische GnRH-Antagonisten sind Derivate, welche das native Hormon kompetitiv inhibieren. Im Fall von potenten Antagonisten sind die Aminosäuren in den Positionen 1 bis 3, 6 und 10 gewöhnlich durch nichtkodierende Aminosäuren, z. B. mit D-Konfiguration, ersetzt. Die Ovulationshemmende Wirkung von GnRH-Antagonisten ist wohlbekannt. Die GnRH-Analoga können ihre antitumorale Wirkung nicht nur durch chemische Kastration, sondern auch durch eine direkte Einwirkung auf die Tumorzellen ausüben. Eidne et al. [J. Clin. Endocrinol. Metab., 64, 423–432 (1987)] demonstrierten die Anwesenheit von Bindungsstellen mit niedriger Affinität in den Zellkulturen von menschlichem MCF-7- und MDA-MB-231-Mammatumor; aufgrund der direkten Inhibierungswirkung von antagonistischen Analoga schlossen sie, dass sich GnRH als ein autokriner Regulierungsfaktor in Mammakarzinom-Zellen benimmt. Ergebnisse, die kürzlich in der Literatur veröffentlicht wurden, bestätigen die Expression des GnRH-Gens in Mammakarzinom-Zellen, was wahrscheinlich bei der Laktation und malignen Transformation stattfindet [Harris et al.: Cancer Res., 51, 2577–2581 (1991)]. Die Anwesenheit von GnRH-Bindungsstellen in dem neoplastischen Gewebe untermauert, dass GnRH sehr wahrscheinlich eine unmittelbare palliative Wirkung bei der Therapie von Patientinnen aufweist, die an Mammakarzinom leiden. Menschliche Mammakarzinom-Zelllinien oder Xenotransplantate, die daraus entwickelt sind, sind nützliche In-vitro- und In-vivo-Modellsysteme für die Demonstration der direkten Wirkung von GnRH. GnRH-Agonisten werden, wenn sie allein in Substanzform verabreicht werden, proteolytisch zersetzt und rasch eliminiert; so kann eine stetige und hohe GnRH-Analogon-Konzentration, die für die Entwicklung einer direkten oder indirekten Antitumorwirkung erforderlich ist, nicht erreicht werden. Die Beibehaltung einer hohen und stetigen Konzentration, die für die Inhibierung des Tumors erforderlich ist, kann durch eine sehr häufige Verabreichung (mehrere Male täglich) oder mittels einer pharmazeutischen Zubereitung mit verlängerter Wirkung gelöst werden. Bis heute ist die Mikrokapsel- oder mikrogranuläre Form von GnRH-Analoga für die Tumorinhibierung in der klinischen Praxis verwendet worden (agonistische Zusammensetzungen Buserelin retard^® und Decapeptyl retard^®).
Gemäß einem weiteren Verfahren, eine verlängerte Wirkung zu erzielen, wird das pharmakologisch aktive Molekül chemisch an Moleküle (z. B. Polymere) ge kuppelt, die langsam aus dem Körper eliminiert werden. So erhaltene Konjugate diffundieren langsam in biologische Systeme und ändern die Verteilung im Körper und die Absorptionseigenschaften des Wirkstoffs. So kann ebenfalls ein zielgerichteter Transport des pharmakologisch aktiven Moleküls und die Verringerung von unerwünschten Nebenwirkungen erreicht werden.
Bevorzugte Träger sind die wasserlöslichen nativen und synthetischen Polymere, an erster Stelle alle Homo- bzw. Copolymere von Carbonsäuren als synthetische Polymere. Styrol/Maleinsäureanhydrid-Copolymer mit einem Molekulargewicht von etwa 1600 bis 2000 D, das aus 7 bis 8 Styrol/Maleinsäureanhydrid-Einheiten besteht, worin Maleinsäureanhydrid partiell hydrolysiert bzw. verestert worden ist, wurde erfolgreich für die Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften von Neo Carcinostatin verwendet. Auf diese Weise konnte ein günstigere Verteilung im Körper zusammen mit einer Verringerung der Toxizität des Wirkstoffs erzielt werden [H. Maeda et al.: J. Med. Chem., 28, 455–461 (1985)].
Polyanionische Makromoleküle mit höherem Molekulargewicht können auch selbst eine biologische Wirkung (z. B. antitumorale, Immunadjuvans-, Interferon-induzierende Wirkung) besitzen. Jedoch erwies sich ihr Molekulargewicht und die Verteilung des Molekulargewichts als kritisch, d. h. ihre Toxizität wurde durch die Erhöhung des Molekulargewichts erhöht [L. Gros: Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Band 2, S. 243–267; sowie G. Butler: J. Macromol. Sci. Chem., A 13, 351–368 (1979) und R. Ottenbrite: ebenda, A 22, 819–832 (1985)].
So können derartige Polymere als Trägermoleküle angesehen werden, die mit guter Reproduzierbarkeit, geringer Polydispersität hergestellt werden können, die nicht toxisch sind und mit einer optimalen Geschwindigkeit aus dem Körper eliminiert werden. Es ist auch wichtig, dass die pharmakologisch aktiven Moleküle, mit guter Reproduzierbarkeit an diese Polymere gekuppelt werden können, um ein Produkt mit einer geeigneten Löslichkeit in Wasser und der gewünschten pharmakologischen Aktivität zu erhalten.
Bis heute sind Peptidhormone und innerhalb dieser GnRH oder GnRH-Analoga nicht an bekannte Polycarbonsäuren als Träger gekuppelt worden. Copolymere, die aus Vinylpyrrolidon und Maleinsäureanhydrid hergestellt sind, werden in der ungarischen Patentschrift Nr. 194,286 (ungarische Patentveröffentlichung Nr. 34519) beschrieben. Diese Copolymere wurden für die kosmetische Verwendung hergestellt; sie sind sehr nützliche Hautkosmetika und können in Emulsionen sowohl der hydrophilen als auch der lipophilen Art verwendet werden. Abhängig von der Menge an zugesetzter Base kann der pH-Wert ihrer wässrigen Lösungen innerhalb großer Grenzen variiert werden, sie besitzen eine hohe Pufferkapazität und können in einem engen Polydispersitäts-Bereich und mit guter Reproduzierbarkeit hergestellt werden. Die Vinylpyrrolidon- und Maleinsäureanhydrid-Einheit werden dem Molekül in einem 1 : 1-Molverhältnis in abwechselnder Reihenfolge einverleibt.
Die Toxizität, Eliminierung und Körperteilung des N-Vinylpyrrolidon/Maleinsäure-Copolymers (NVP-MA) ist früher in Einzelheit untersucht worden, und es wurden die folgenden Angaben gemacht [M. Azori et al.: Macromol. Chem., 187, 297–302 (1986)]. Bei der intraperitonealen bzw. intravenösen Verabreichung des Polymers (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20 000) in Form seines Natriumsalzes mit pH 7,2 trat kein Todesfall bei einer Dosis von bis zu 900 mg/kg Körpergewicht im ersten Fall (i. p.) bzw. 200 mg/kg Körpergewicht im zweiten Fall (i. v.) auf. Dies zeigt an, dass NVP-MA weniger toxisch ist als viele andere Polyanionen mit einer ähnlichen Struktur. [Der intravenöse (i. v.) LD₅₀-Wert eines Divinylether/Maleinsäure-Copolymers mit ähnlichem Molekulargewicht ist 74 mg, der von Polymaleinsäure ist 110 mg, und der von Furan/Maleinsäure-Copolymer beläuft sich auf 130 mg]. Körperverteilungs-Überprüfungen, die mit einem ¹⁴C-markierten Polymer (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8 000) durchgeführt wurden, zeigten an, dass das Polymer nicht in das Gehirn und das Rückenmark eintreten kann. Das Polymer wird hauptsächlich im Urin eliminiert: 84% der eingeführten Radioaktivität wurden im Verlauf von 24 Stunden eliminiert, wohingegen nach 56 Stunden insgesamt 95% der eingeführten Radioaktivität im Urin und den Fäzes nachgewiesen werden konnten. NVP-MA und seine bekannten Derivate sind bis heute nicht in der Therapie verwendet worden, aber auf der Grundlage ihrer günstigen Eigenschaften erscheint es möglich, sie ohne toxische Wirkungen in den Körper einzuführen.
Der Stand der Technik ist bezüglich des Fehlens von wirksamen Mitteln zur Inhibierung der großen Vielfalt von neoplastischen Zuständen immer noch mangelhaft. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen lange bestehenden Bedarf und Wunsch in der Technik.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue pharmakologisch aktive Verbindungen der allgemeinen Formel (I), deren Salze und Komplexe sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben. In der allgemeinen Formel (I) Y(Wu, Vz, Xr, Ak) (I)bedeutet Y die molekulare Einheit der allgemeinen Formel (Ia)
in der n eine ganze Zahl von 10 bis 400, vorzugsweise 20 bis 200 ist; eines von R₁ und R₂ für Wasserstoff steht, wohingegen das andere eine Gruppe der Formel (B) bedeutet
R₃ eine Polymerisation-initiierende Gruppe, vorzugsweise die Gruppe (CH₃)₂CCN bedeutet;
W eine Hydroxylgruppe, gegebenenfalls als Salz mit einem Alkalimetallion, bevorzugt Natriumion, gebildet, bedeutet;
V eine C1-8-, vorzugsweise C4-6-Alkylaminogruppe, die durch ihre Aminogruppe gebunden ist, oder eine Valenzbindung darstellt;
X eine Aminosäuregruppe oder eine Oligopeptidgruppe mit höchstens sechs Mitgliedern bedeutet, wobei die Aminosäure- oder Oligopeptidgruppe durch ihren N-Terminus an die Gruppe Y gekuppelt ist und gegebenenfalls eine Hydroxylgruppe oder eine Valenzbindung an ihrem C-Terminus trägt, wobei die Aminosäuren Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Ahx, pro, Arg oder His sind;
A anwesend ist und eine pharmakologisch aktive Polypeptidhormon-Gruppe darstellt, die eine Aminogruppe enthält und direkt dadurch an die Gruppe Y angekuppelt ist, wenn r für 0 steht; bzw. an den C-Terminus der Gruppe X gekuppelt ist, wenn r größer als 0 ist;
r eine ganze Zahl von 0 bis 0,2 n ist;
k eine ganze Zahl größer 0 und höchstens gleich r ist;
z eine ganze Zahl von 0 bis (n – r) ist; und
u eine ganze Zahl von n bis 2n – r – z ist,
sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Die Erfindung betrifft weiter die neuen Zwischenprodukte der allgemeinen Formel (Ic) Y[W_uV'_z(XOQ)_r] (Ic)in der Y die molekulare Einheit der allgemeinen Formel (Ia) bedeutet, worin n eine ganze Zahl von 10 bis 400, vorzugsweise 20 bis 200 ist; eines von R₁ und R₂ für ein Wasserstoffatom steht, wohingegen das andere eine Gruppe der Formel (B) bedeutet;
R₃ eine Polymerisations-initiierende Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe (CH₃)₂CCN bedeutet;
W eine Hydroxylgruppe, gegebenenfalls als Salz mit einem Alkalimetallion, vorzugsweise Natriumion, gebildet, bedeutet;
V' für eine C1-8-, bevorzugt C4-6-Alkylaminogruppe steht, die durch ihre Aminogruppe gebunden ist;
X eine Aminosäuregruppe oder eine Oligopeptidgruppe mit höchstens sechs Mitgliedern darstellt, die durch ihren N-Terminus an die Gruppe Y gekuppelt ist;
OQ eine aktivierte Estergruppe am C-Terminus der Gruppe X, bevorzugt eine Gruppe ONp, OPcp, OPfp oder ONSu bedeutet;
r eine ganze Zahl von 0 bis 0,2n ist;
z eine ganze Zahl von 0 bis (n – r) ist; und
u eine ganze Zahl von n bis (2n – r – z) ist,
sowie die Salze dieser Verbindungen.
Weiter betrifft die Erfindung Tumor-inhibierende und immunstimulierende pharmazeutische Zubereitungen, die als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassen. Die Biokonjugate der allgemeinen Formel (I) besitzen eine selektive Tumor-inhibierende Wirkung; ein Teil der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) hemmt das Wachstum von sowohl Steroid-abhängigen als auch Steroid-unabhängigen Tumoren, insbesondere Mammakarzinomen. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeigen die Wirkung der pharmakologisch aktiven Einheit in einem erhöhten und längeren Maß.
Andere und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offensichtlich, die für den Zweck der Offenbarung angegeben werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Abkürzungen, die in der Beschreibung verwendet werden, stimmen mit der Nomenklatur überein, die in der Peptidchemie akzeptiert ist und in Edsall et al., Hsg., J. Biol. Chem. 241, 527–533 (1966); und Tabor et al., Hsg., J. Biol. Chem. 247, 977–983 (1972) veröffentlicht ist; weiter steht D-Nal für a-(2-Naphthyl)-D-5-alanin, bedeutet D-Cpa p-Chlorphenyl-D-alanin und steht D-Pal für a-(3-Pyridyl)-D-alanin. Wenn nicht anders angemerkt, weist jede der Aminosäuren, die in der Beschreibung erwähnt sind, die L-Konfiguration auf.
Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können durch Kuppeln pharmakologisch aktiver Polypeptide, bevorzugt GnRH-Analoga, an Moleküle der allgemeinen Formel (Ia) auf die folgende Weise hergestellt werden:

a) pharmakologisch aktive Verbindungen, die eine freie Aminogruppe enthalten, werden an N-Vinylpyrrolidon/Maleinsäureanhydrid-Copolymer der allgemeinen Formel (Ib) gekuppelt,
das an sich bekannt ist, aber bis heute nicht in der Therapie verwendet wird, worin R₁, R₂ und R₃ wie für die allgemeine Formel (Ia) definiert sind;
b) eine Verbindung der allgemeinen Formel (Ib) wird mit einem aktivierten Ester der allgemeinen Formel (III) H-X-OQ (III) einer Aminosäure oder eines Oligopeptids umgesetzt, dann werden die pharmakologisch aktiven Polypeptide an die Trägerverbindung der allgemeinen Formel (Ic) gekuppelt, was mittels der aktivierten Estergruppen erreicht wird. Die erhaltenen Verbindungen können in Salze mit einem pH-Wert von 7,2, bevorzugt Natriumsalze, überführt werden.

Das pharmakologisch aktive Molekül (A), das in der allgemeinen Formel (I) erscheint, ist vorzugsweise ein agonistisches oder antagonistisches GnRH-Analogon. Die Gruppe X von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bedeutet eine Aminogruppe oder ein Oligopeptidgruppe mit höchstens sechs Mitgliedern, die aus nativen oder nicht-natürlichen Aminosäuren aufgebaut ist. Diese können unter Verwendung von in der Peptidchemie bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die Erfindung beruht auf den folgenden Erkenntnissen:

1. Im Vergleich zu den entsprechenden pharmakologisch aktiven Peptidhormonen, hauptsächlich GnRH-Analoga, zeigen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) relativ zu der ursprünglichen Wirkung der Peptidhormon-Moleküle eine erhöhte Wirkung über eine verlängerte Zeitspanne.
2. Verbindungen der allgemeine Formel (I), die eine Abstandshaltergruppe als X enthalten, d. h. worin r von 0 verschieden ist, zeigen eine sogar noch günstigere Wirkung als diejenigen Verbindungen, die keine Gruppe X enthalten. Gleichzeitig zeigen die Verbindungen, welche die Gruppe X enthalten, oder diejenigen ohne Gruppe X keine toxischen Nebenwirkungen; und diese Verbindungen behalten alle Wirkungen des pharmakologisch aktiven Polypeptidmoleküls A bei.
3. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Salze, worin A ein GnRH-Analogon der Formel (IIa) darstellt, das durch die Aminogruppe der Seitenkette der Lys-Gruppe des Peptidhormons gekuppelt ist, Y, W, V, X, r, k, z und u wie für die allgemeine Formel (I) definiert sind, sind Tumor-inhibierende Verbindungen, welche die bekannten pharmakologischen Wirkungen des Analogons (IIa), d. h. pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH₂; MI-1544: Ac-D-Trp^1,3, D-Cpa², D-Lys⁶, D-Ala¹⁰; beibehalten oder sogar übertreffen; so inhibieren sie das Wachstum von sowohl Steroid-abhängigen als auch Steroid-unabhängigen Tumoren. Zusätzlich induzieren sie eine reversible chemische Kastration, welche die antitumorale Wirkung im Fall von Steroid-abhängigen Tumoren verstärkt.
4. Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in der A für ein antagonistisches GnRH-Analogon der Formel (IIb), d. h. MI-1892: Ac-D-Trp^1,3, D-Cpa², Lys⁵, [Asp(a-DEA)]⁶, D-Ala¹⁰-Gln⁸-GnRH, gekuppelt durch die n-Aminogruppe von Lysin in der Position 5, steht und Y, W, V, X, r, k, z sowie u wie für die allgemeine Formel (I) definiert sind, sind selektive Tumor-inhibierende Mittel gemäß ihrem antagonistischen Charakter; so inhibieren sie das Wachstum von sowohl Steroidabhängigen als auch Steroid-unabhängigen Tumoren in der Tat in einem Ausmaß, welches die Wirkung der Verbindung der Formel (IIb) übertrifft. Sowohl der Antagonist der Formel (IIb) als auch dessen Derivat der allgemeinen Formel (I) besitzen eine reversible chemische Kastrationswirkung, welche zusammen mit der selektiven direkten Tumor-inhibierenden Wirkung unter dem Gesichtspunkt der Wirksamkeit der Tumor-Inhibierung bevorzugt ist. Es wurde unerwartet beobachtet, dass der Antagonist der Formel (IIb) auch eine Wirkung der Stimulierung des Immunsystems besitzt, und diese Wirkung wird durch das Derivat der allgemeine Formel (I) ebenfalls beibehalten. Diese Erkenntnis ist überraschend, da die therapeutische Verwendung von Tumor-inhibierenden GnRH-Antagonisten, die bis heute bekannt sind, gerade durch deren immunsuppressive Wirkung behindert worden ist.
5. Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin A für das Neunauge-GnRH-III steht, das durch die n-Aminogruppe der Lysin-Einheit in Position 8 gekuppelt ist, wohingegen Y, W, V, X, r, k, z und u wie für die allgemeine Formel (I) definiert sind, sind selektive Tumor-inhibierende Mittel unter In-vivo-Bedingungen, und deshalb hemmen sie das Wachstum von sowohl Steroid-abhängigen als auch Steroid-unabhängigen Tumoren trotz der Tatsache, dass GnRH-III allein nur eine vernachlässigbare In-vivo-Wirkung zeigt. Konjugate der allgemeinen Formel (I) von GnRH-III, welche die Wirkungen von hGnRH-Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung übertreffen, hatten einen tumorfreien Zustand der Versuchstiere in einer Behandlungs-Zeitspanne zum Ergebnis, in der nur eine Verringerung des Tumorwachstums unter Verwendung bekannter Zusammensetzungen beobachtet wurde. Die bevorzugtesten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß der Erfindung wurden durch Konjugation der folgenden GnRH-Analoga der Formeln (IIa) bis (IIi) hergestellt: humanes GnRH (nachstehend GnRH): pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂; Hühner-GnRH (nachstehend Gln⁸-GnRH): pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH₂; Neunauge-GnRH-III (nachstehend GnRH-III): pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH₂; MI-1544: Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰-GnRH-Antagonist-Analogon der Formel (IIa) von humanem GnRH; MI-1892: Ac-D-Trp^1,3, D-Cpa², Lys⁵, [Asp(a-DEA)]⁶, D-Ala¹⁰-(Gln⁸-GnRH); Antagonist-Analogon der Formel (IIb) von Hühner-GnRH; SJ-1004: D-Phe², D-Trp³, D-Lys⁶-GnRH; Antagonist-Analogon der Formel (IId) von humanem GnRH; TH-614: Lys⁵,cyclo(Asp⁶-Lys⁸)-GnRH-III; Analogon der Formel (IIe) von Neunauge-GnRH-III; HB-694: Lys⁴,[Lys(n-Fmoc)]⁸-GnRH-III; Analogon der Formel (IIf) von Neunauge-GnRH-III; TH-602: Neunauge-GnRH-III; siehe die Formel oben; GnRH der Formel (IIc); HB-685: Lys⁴-GnRH-III; Analogon der Formel (IIg) von Neunauge-GnRH-III; TH-609: D-Lys⁶-GnRH; Analogon der Formel (IIh) von humanem GnRH; TH-615: Lys⁵,D-Trp⁶-GnRH; Analogon der Formel (IIi) von humanem GnRH.

Die GnRH-Analoga wurden entweder direkt oder durch eine Gruppe X, d. h. eine Abstandshaltereinheit, an das Polymer gekuppelt, das als P bezeichnet wird. Für die Benennung der Abstandshalter wird die Einbuchstaben-Bezeichnung der Aminosäuren verwendet, z. B. N-GFLG-OH: H-Gly-Phe-Leu-Gly-OH (Peptid in Form seines Natriumsalzes); P: Polyvinylpyrrolidon/Maleinsäure-Copolymer-Natriumsalz, d. h. ein Salz der Formel (Id), in dem eines von R₁ und R₂ Wasserstoff bedeutet, wohingegen das andere eine Gruppe (B) ist, n für 66 steht, überführt in das Natriumsalz durch n Äquivalente NaHCO₃.
Die biologische Studie der folgenden Substanzen wurde durchgeführt:
P-GLG-1892: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIb), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch die Einheit X = -GLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-1544: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIa), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch die Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-1892: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIb), n = 66, r = 0, k = 0,024n, z = 0, u = 1,9n, W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-1892: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIb), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-609: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIh), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-1004: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IId), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-614: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIe), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-685: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIg), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-602: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (GnRH-III), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-GFLG-615: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIi), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-FLG-892: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIb), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -GFLG-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
P-Ahx-1892: Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der die Gruppe A = (IIb), gekuppelt an die Gruppe Y = (Ia) durch eine Einheit X = -Ahx-; n = 66, r = 0,1n, k = 0,3r, z = 0, u = 1,9n und W = OH bzw. ONa, pH = 7,2;
Die biologischen Tests wurden unter Verwendung der Materialien und des Verfahrens durchgeführt, die nachstehend folgen. Gewisse menschliche Mammakarzinom-Zelllinien oder Xenotransplantate, die daraus hergestellt waren, sind für die biologischen Tests der Konjugate nützlich.
Menschliche Zelllinien, die in In-vitro-Experimenten verwendet wurden. Die menschliche MCF-7-Mammatumor-Zelllinie wurde 1973 von Soule et al. [J. National Cancer Inst., 51, 1409–1416] aus der Flüssigkeit im Pleuraraum von Mammakarzinom-Patienten stabilisiert. Die Zellen wachsen in Monoschicht und sind in ihrem Charakter epithelial. Die menschliche MDA-MB-231 Mammakarzinom-Zelllinie wurde 1974 von Cailleau et al. [J. National Cancer Inst., 53, 661–674] auf ähnliche Weise aus Flüssigkeit im Pleuraraum isoliert und stabilisiert. Diese Zellen wachsen ebenfalls in Monoschicht. Die menschliche PC3-Prostatakarzinom-Zelllinie wurde 1979 in Zellkultur von Kaighn et al. [Investigative Urology, 17, 16–23] stabilisiert; die Zellen sind vom einfachen Epithel-Typ und bilden kompakte Kolonien in klonogenen Assays. Die Ishikawa-Zelllinie stammt vom Adenokarzinom von menschlichem Endometrium ab [Nihida et al.: Obstet. Gynecol. Jpn., 37, 1103–1111 (1985)], weist epithelialen Charakter auf und enthält Steroid- sowie GnRH-Rezeptoren. Menschliche Tumor-Zelllinien werden in Kunststoffkolben (Greiner) in Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Nährmedium (DMEM GIBCO) aufrechterhalten. Das hierin verwendete Medium enthielt 10% fetales Kälberserum (FCS).
Die MCF-7-Zelllinie ist Estradiol-Rezeptor- (ER-) positiv und GnRN-Rezeptor-positiv. Deshalb ist sie geeignet, die Rezeptor-vermittelte direkte Wirkung von GnRH zu untersuchen; da sie ein In-vivo-Modellsystem ist, ist sie zur Untersuchung sowohl der direkten als auch der indirekten Wirkung von GnRH nützlich. Da die MDA-MB-231-Zelllinie ein ER-negatives und GnRH-Rezeptorpositives In-vitro- und In-vivo-Modellsystem ist, ist sie nützlich, die direkte Wirkung von GnRH zu untersuchen. Auf der Grundlage der Literaturdaten enthält die humane PC3-Prostatakarzinom-Zelllinie Rezeptoren, die GnRH spezifisch binden, wodurch die wesentliche Bedingung für die direkte Wirkung erfüllt ist. Die Ishikawa-Zelllinie stammt von menschlichem Endometrium-Adenokarzinom ab, enthält ER und PgR-Proteine und ist GnRH-Rezeptor-positiv. So ist sie für die Untersuchung der direkten Wirkung von GnRH nützlich. Buserelin, chemisch [D-Ser(tBu)]⁶,desGly¹⁰-hGnRH(1-9)EA, ist ein Tumor-inhibierender Agonist, der in der klinischen Praxis in Retardform verwendet wird; beweiskräftig wurde die Substanz selbst, aber nicht ihre Retardform, in den In-vitro-Experimenten verwendet.
Die Herstellung des bekannten polymeren Trägers und die Untersuchung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sowie der Abstandshalter der allgemeinen Formel X wurden wie folgt durchgeführt.
Die hierin verwendeten NVP-MA-Proben wurden gemäß Literatur (Reddy et al.: Polymer, 25, 115–120 (1984)] hergestellt. Aktivierte Ester von Oligopeptiden, die als Abstandshalter verwendet wurden, waren vorzugsweise die Nitrophenylester, die unter Verwendung klassischer Methoden der Peptidchemie erhalten wurden. Die Kupplung der Peptide an die Polymere kann in Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylacetamid bewerkstelligt werden. DMF wurde als Lösungsmittel verwendet.
Die Nitrophenylester der Peptide wurden durch Aminosäure-Analyse gekennzeichnet. Die angegebenen Retentionsfaktoren wurden auf Kieselgel 60 F254-Dünnschicht unter Verwendung der folgenden Entwicklungssysteme bestimmt:

1. Pyridin : Essigsäure : Wasser : Ethylacetat 20 : 6 : 12 : 6;

2. Chloroform : Methanol : Wasser 10 : 5 : 1
Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie- (HPLC-) Überprüfungen wurden auf einer C18-Umkehrphase-Säule bei einem Durchsatz von 0,5 ml/min unter Verwendung der folgenden Gradienten durchgeführt:
Eluent A: 5% Acetonitril plus 95% Triethylamin-Phosphat-Puffer mit pH 2,25;
Eluent B: 80% Acetonitril plus 20% Triethylamin-Phosphat-Puffer mit pH 2,25;
100% Eluent A bis zur 5. Minute; bis 60% Eluent A bis zur 10. Minute; bis 35% Eluent A bis zur 30. Minute; bis 0% Eluent A bis zur 35. Minute; 0% Eluent A bis zur 40. Minute; und bis 100% Eluent A bis zur 45. Minute. Der Nachweis wurde mit einem UV-Detektor bei 280 nm durchgeführt. Die Konjugate wurden durch Ultrafiltration auf einer AMICON PM10-Membran gereinigt.
Die resultierenden Vorteile der neuen Verbindungen könne wie folgt zusammengefasst werden. Auf der Grundlage der In-vitro-Überprüfungen kann angegeben werden, dass die Proliferations- und Kolonienbildungs-inhibierenden Wirkungen der Konjugate P-GFLG-1544 und P-GFLG-1892 – welche die GFLG-Tetrapeptid-Abstandshaltergruppe enthalten -bei weitem die antitumorale Wirkung sowohl der GnRH-Analogon-Substanzen (d. h. MI-1544 oder MI-1892) als auch des Abstandshalter-haltigen Trägers (P-GFLG-OH) und selbst der Verbindung P-1892 übertreffen. Die Konjugate (d. h. die Verbindungen, die aus dem Träger und dem GnRH-Analogon aufgebaut sind), hatten eine Kolonienbildungs-Inhibierung von 100% oberhalb einer Konzentration von 20 μM zum Ergebnis. Ein solch hoher Grad der Inhibierung konnte bis heute nur durch die Verwendung von Zytostatika erzielt werden. Auf der Grundlage der Ergebnisse üben sowohl die polymere Ausgangssubstanz als auch das Abstandshalter-haltige Polymer als Polyanion selbst eine direkte antitumorale Wirkung aus, und sie verstärken, wenn sie kovalent an GnRH-Antagonisten gekuppelt sind, die direkte antitumorale Wirkung der Antagonisten.
Gemäß den In-vivo-Studien erwiesen sich die Konjugate P-GFLG-1544 und P-GFLG-1892 sowie der Träger P-GFLG-OH als nicht-toxisch. Die Konjugate P-GFLG-1544 und P-GFLG-1892 hatten bei dem ER-positiven, GnRH-Rezeptor-positiven menschlichen MCF-7-Mammakarzinom-Xenotransplantat eine Tumor-Volumenverringerung von 30 bis 35% in der zweiten Woche und von 37 bis 49% in der vierten Woche der Behandlung zum Ergebnis; wohingegen eine Tumor verringerung von 37–42% bei dem ER-negativen, GnRH-Rezeptor-positiven menschlichen MDA-MB-231-Mammakarzinom-Xenotransplantat beobachtet werden konnte. Dieses Ergebnis wird als signifikant angesehen, da der Grad der Tumorinhibierung, der von uns bei Humankarzinom-Xenotransplantat beobachtet wurde, nahezu identisch mit demjenigen der Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung SB-75 ist, einem GnRH-Antagonisten [Szepeshazi et al.: Breast Cancer Res. Treat., 21, 181–192 (1992)], der bei dem MXT-Maus-Mammakarzinom, das empfindlicher ist, erzielt worden ist.
Die Substanz MI-1892 und ihr Konjugat P-GFLG-1892 besitzen eine direkte selektive Tumor-inhibierende Wirkung. Das heißt, sie üben im Gegensatz zur Substanz MI-1544 und ihrem Konjugat P-GFLG-1544 eine minimale chemische Kastrationswirkung aus. Aufgrund dieser Tatsache kann angenommen werden, dass sie bei einem breiteren Spektrum von Mammakarzinomen und deshalb auch bei Hormon- (Estrogen-) unabhängigen Tumoren wirken.
Bei der Untersuchung der Wirkung der Verbindungen auf das zelluläre und humorale Immunsystem wurde angeführt, dass MI-1892 als selektiver Hühner-GnRH-Antagonist sowie das Konjugat P-GFLG-1892, das den Antagonisten und das Abstandshalter-haltige P-GFLG enthält, ein neues polyanionisches Makromolekül, die Wirkung von T-Lymphozyten gegen Rinder-Rote-Blutzellen-(BRBC-) Antigen erhöhten (unter Verwendung des Verfahrens der Rosettenbildung). Auf der Grundlage der Überprüfungen der Antikörperproduktion von B-Lymphozyten stärkten MI-1892 und P-GFLG-OH sowie das Konjugat P-GFLG-1892, das die MI-1892-Einheit enthält, auch die humorale Immunantwort.
Die immunsuppressive Nebenwirkung von Zytostatika, die in der Tumortherapie verwendet werden, ist allgemein bekannt. Diese Wirkung kann bis zu einem gewissen Grad durch verschiedene Immunstimulanzien (Endotoxin, Levamisol) kompensiert werden. Polypeptide mit viel niedrigeren Molekulargewichten (etwa 40 000 bis 80 000) sind ebenfalls in der Lage, gegen eine immunsuppressive Wirkung zu schützen (Gaál et al.: J. Biol. Resp. Modif., 5, 148–159 (1986)]. Das Molekulargewicht des von uns getesteten neuen polyanionischen P-GFLG-OH-Makromoleküls beträgt etwa 10 000, dasjenige von MI-1892 ist etwa 2 000, d. h. relativ niedrig; deshalb war ihre immunstimulierende Wirkung unerwartet. Die Bedeutung dieser Ergebnisse wird durch die Tatsache widergespiegelt, dass MI-1892, das Mäusen in einer Dosis von 50 μg/Maus bzw. 100 μg/Maus verabreicht wurde, die humorale Immunantwort auf mehr als das Zweifache bzw. Dreifache erhöhte; die Erhöhung war zweifach im Fall von P-GFLG-OH. Das Konjugat P-GFLG-1892 besitzt ebenfalls eine immunstimulierende Wirkung. Die Untersuchung der zellulären Immunantwort zeigte, dass MI-1892, das mit einer Dosis von 100 μg/Maus verabreicht wurde, die Antwort auf das nahezu Zweifache erhöhte; diese Erhöhung war zweifach im Fall von P-GFLG-OH und P-GFLG-1892.
Die neuen Polycarbonsäure-Derivate gemäß der Erfindung sind sehr bevorzugte Träger für Peptidhormone, da sie mit guter Reproduzierbarkeit und mit einer geringen Polydispersität im Zielbereich der Molekulargewichte hergestellt werden können und wasserlöslich sind.
Bekannte Polycarbonsäure-Derivate besitzen ebenfalls eine schwache tumorhemmende Wirkung und können ähnlich günstig als Trägerverbindungen verwendet werden. Durch Kuppeln von pharmakologisch aktiven Verbindungen, wie GnRH-Analoga, an die Polymere der Erfindung, werden neue Verbindungen erhalten, die eine erhöhte therapeutische Wirksamkeit im Vergleich zu derjenigen ihrer strukturellen Einheiten ausüben.
Das neue Konjugat P-GFLG-1544 ist eine Verbindung mit günstiger therapeutischer Wirkung aus den folgenden Gründen: Sie weist eine selektive Tumorinhibierende Wirkung auf, die durch die direkte Inhibierung der Zellproliferation belegt wird. So hemmt sie nicht nur das Wachstum von Steroid-abhängigen, sondern auch von Steroid-unabhängigen Tumoren, wie durch Untersuchungen demonstriert, die an MDA-MB-231-Mammatumorzellen durchgeführt wurden. Aufgrund der antagonistischen Wirkung besitzt das gekuppelte MI-1544 eine reversible Kastrationswirkung. Diese Wirkung wird durch die Änderung des Uterusgewichts, welche während der In-vivo-Behandlungen gemessen wurde, sowie die Abnahme der zytosolischen Progesteron-Rezeptor- (cPgR-) Konzentration des Uterus belegt. Ein sehr wichtiger Vorteil dieses Effekts besteht darin, dass der Hormonstatus durch Unterbrechung der Behandlung wiederhergestellt wird. Dies steht im Gegensatz zu der chirurgischen Intervention und Bestrahlung, die irreversibel sind und von vielen Patientinnen abgelehnt werden. Der Vorteil der Kastrationswirkung besteht darin, dass im Fall von Steroid-abhängigen Tumoren die selektive direkte und die Kastrationswirkung addiert werden, was eine stärkere Inhibierung der Tumoren zum Ergebnis hat.
Die Kastrationswirkung wird durch die folgenden Daten erläutert. Nach vierwöchiger Behandlung waren die Uterusgewichte von Tieren, welche MCF-7-Xenotransplantate trugen, um 42% verringert (Kontrolle = 0,1980 q 0,0120 g; P-GFLG-1544 = 0,1149 + 0,0110 g); nach zwölfwöchiger Behandlung waren die Uterusgewichte von Tieren, die MDA-MB-231-Xenotransplantate trugen, um 50% verringert (Kontrolle = 0,0263 + 0,0028 g, P-GFLG-1544 = 0,0133 q 0,0018 g). Das Gewicht des Uterus wurde durch P-GFLG-OH allein nicht verringert, sondern leicht erhöht (0,0337 q 0,0034 g, 128%). Die Änderung des Progesteron-Spiegels wurde durch die signifikante Abnahme (von 54%) der Uterus-cPgR-Konzentration von Tieren belegt, welche MCF-7-Xenotransplantate trugen (Kontrolle = 517 q 45 Femtomol/mg Protein, P-GFLG-1544 = 241 q 28 Femtomol/mg Protein).
Im Gegensatz zu mehreren bekannten GnRH-Antagonisten besitzt P-GFLG-1544 keine immunsuppressive Wirkung. Zusammenfassend behielt das Konjugat P-GFLG-1544 nicht nur sowohl die selektive Tumor-inhibierende als auch die Kastrationswirkung des MI-1544, eines Antagonisten-Analogons von GnRH, bei, sondern übertraf diese auch wesentlich, hauptsächlich bezüglich der Tumor-Inhibierung. Bei den Untersuchungen des Konjugats wurden keine schädliche Nebenwirkungen beobachtet. Aufgrund ihrer verlängerten Wirkung kann diese neue antagonistische Verbindung für eine In-vivo-Tumorinhibierung verwendet werden. Das neue Konjugat P-GFLG-1892 ist aus den folgenden Gründen eine günstige Verbindung mit therapeutischer Wirkung: es weist eine selektive Tumor-inhibierende Wirkung auf. Deshalb inhibiert es das Wachstum von sowohl Steroid- abhängigen als auch Steroid-unabhängigen Tumoren, was durch Untersuchungen an MDA-MB-231-Zellen belegt wurde.
Der GnRH-Antagonist MI-1892 und das Konjugat, das den Antagonisten enthält, besitzen eine schwächere Kastrationswirkung im Vergleich zu MI-1544 und dessen Konjugat. Die Kastrationswirkung des Konjugats wurde durch die Änderung des Uterusgewichts, die während In-vivo-Behandlungen gemessen wurde, sowie durch die Abnahme der zytosolischen Progesteron-Rezeptor-(cPgR-) Konzentration des Uterus demonstriert. Nach vierwöchiger Behandlung war das Uterusgewicht von Tieren, die ein Xenotransplantat trugen, um 39% verringert (Kontrolle 0,1980q 0,120 g, P-GFLG-1892 = 0,1215 q 0,0130 g). Nach zwölfwöchiger Behandlung war das Uterusgewicht der Tiere, die MDA-MB-231 trugen, um 20% verringert (Kontrolle = 0,0263 q 0,0028 g, P-GFLG-1892 = 0,0215 q 0,0017 g). Durch P-GFLG-OH allein wurde das Gewicht des Uterus nicht verringert, sondern leicht erhöht (0,0337 q 0,0034 g, 128%). Die Änderung des Progesteron-Spiegels wurde durch die 23%-ige Abnahme der Uterus-cPgR-Konzentration von Tieren belegt, welche ein MCF-7-Xenotransplantat trugen (Kontrolle = 517 q 45 Femtomol/mg Protein, P-GFLG-1892 = 376 q 33 Femtomol/mg Protein).
Im Gegensatz zu mehreren bekannten GnRH-Antagonisten weist er keine immunsuppressive Wirkung auf. Es ist eine neue Erkenntnis, dass dieses neue GnRH-Antagonist-Analogon und das Konjugat, welches dieses Analogon enthält, eine immunstimulierende Wirkung besitzen, wie durch die Untersuchungen der humoralen und zellulären Immunantwort belegt.
Im Vergleich zu gesunden Individuen ist das Funktionieren des Schutzmechanismus (Immunstatus) von Patienten, die an einem Tumor leiden, ungünstiger. Da der Schutz- (Immun-) Mechanismus durch die Verbindung erhöht wird, kann ihre Tumor-inhibierende Wirkung wirksamer werden. Das neue Konjugat P-GFLG-GnRH-III ist eine Verbindung, die aus den folgenden Gründen eine günstige therapeutische Wirkung besitzt: sie weist eine selektive Tumor-inhibierende Wirkung auf. Deshalb inhibiert sie das Wachstum sowohl von Steroid abhängigen als auch von Steroid-unabhängigen Tumoren, was durch die Untersuchungen an MDA-MB-231-Zellen belegt wurde. Sie weist keine Kastrationswirkung auf, da der Zyklus von weiblichen Ratten selbst durch eine hohe Dosis des gekuppelten GnRH-III über drei beobachtete Zyklen nicht beeinflusst wird. Diese Wirkung kann insbesondere bei jungen Patientinnen, die an einem Mammatumor leiden, bevorzugt sein, bei denen eine Kastration psychische Störungen verursachen würde. Auf eine von anderen Konjugaten verschiedene Weise induziert P-GFLG-GnRH-III allmählich eine Inhibierung in fortwährend zunehmendem Maß während der lang anhaltenden Behandlung über 7 Wochen; und am Ende der Behandlung werden tumorfreie Tiere beobachtet, wohingegen im Fall von anderen Konjugaten der Maß der Inhibierung nur bis zur 5. Woche der Behandlung zunahm, dann eine Stagnation des Grades der Inhibierung beobachtet werden konnte.
Die pharmazeutische Zubereitung für die therapeutische Verwendung kann irgendein Füllstoffmaterial und irgendeinen Träger, die in der Therapie verwendet werden (z. B. Calciumcarbonat, Talkum); Lösungsmittel (wie Wasser, eine wässrige Lösung, die Ethanol/Polyalkohol, z. B. Polyethylenglycol und/oder Glycerin und dergleichen enthält); Salze (z. B. Natriumchlorid zur Einstellung des physiologischen osmotischen Drucks; oder z. B. Chloride von Eisen, Cobalt, Zink oder Kupfer und dergleichen zur Ergänzung von Spurenelementen); löslich machende Zusätze, z. B. komplexbildende Mittel (Cyclodextrine, Kronenether, native Proteine, Saponine und dergleichen); Verbindungen, welche die relative Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels verringern, wie Ethanol, Polyole (Polyethylenglycol oder Glycerin); Tablettensprengmittel; komplexbildende Mittel, die üblicherweise in Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung verwendet werden (z. B. wasserunlösliche Cyclodextrin-Derivate, native und künstliche Polymere, Kronenether und dergleichen); pH-einstellende Verbindungen, wie Mineral- und organische Puffer; geschmacksverbessernde Mittel (Saccharose, Fructose und Dextrose, Saccharine, Invertzucker und dergleichen); Antioxidantien (z. B. Vitamin C); sowie andere aktive Bestandteile enthalten, welche die Verwirklichung der Wirkung der Wirkstoffe der allgemeinen Formel (I) fördern. Die pharmazeutischen Zubereitungen können oral, wie Tabletten, Pillen, Dragees, Hart- oder Weichkapseln, Mikrokapseln, Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen; oder parenteral, z. B. injizierbare Lösungen, langsame und rasche Infusionen; sowie pharmazeutische Zubereitungen, die für die rektale Verabreichung nützlich sind, wie Suppositorien, weiter Cremes oder Gelees sein. Es gibt auch die Möglichkeit, pharmazeutische Zubereitungen, die für die obigen Verwendungen entwickelt wurden, Liposomen einzuverleiben. Die Biokonjugate der allgemeinen Formel (I) können auch in Aerosol-Zusammensetzungen verwendet werden, die für die Absorption durch die Hautoberfläche bzw. die Lunge gedacht sind. Für die Herstellung von Tabletten, Dragees oder Hartgelkapseln sind z. B. Calciumcarbonat, Talkum, Fette, Wachse oder Polyalkohole mit einer geeigneten Dichte nützliche Träger.
Für die Herstellung von Lösungen und Sirupen können z. B. Wasser, Polyalkohole (z. B. Polyethylenglycol oder Glycerin), Saccharose oder Dextrose als Träger verwendet werden. Parenterale Zubereitungen können Wasser, Alkohol, Polyalkohole oder Pflanzenöle als Träger enthalten. Bei den Trägern für Suppositorien kann es sich z. B. um Öle, Wachse, Fette oder Polyalkohole mit einer geeigneten Dichte handeln. Die Biokonjugate der allgemeinen Formel (I) sind ebenfalls für die Verwendung in Kombination mit künstlichen oder nativen Wirkstoffen nützlich. Die Biokonjugate der allgemeinen Formel (I) sind in einem Dosisbereich von 0,01 bis 100 μg/kg in subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektionen wirksam. Die in der Praxis zu verwendende Dosis hängt von der Krankheit sowie von dem Zustand und dem Alter des Patienten ab und sollte durch den Arzt festgelegt werden.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele erläutert, in denen sich der Ausdruck „Wirksubstanz" auf die GnRH-Analogon-Einheit der Konjugate bezieht. Die folgenden Beispiele werden für den Zweck der Erläuterung verschiedener Ausführungsformen der Erfindung angegeben und sollen die vorliegende Erfindung auf keine Weise beschränken.
Beispiel 1
Herstellung von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly-nitrophenylester
Nach Lösen von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäureanhydrid) [durchschnittliches Molekulargewicht: 10000, IR: 1840 cm^–1, 1790 cm^–1 (Anhydrid), 1660 cm^–1 (NCO von Pyrrolidon)] in wasserfreiem Dimethylformamid wurden 10 Mol% H-Gly-Phe-Leu-Gly-Nitrophenylestertrifluoracetat (R_f1: 0,50) und eine äquivalente Menge Triethylamin dazugegeben. Nach 3 Stunden wurde das Produkt durch Zugabe von Diethylether gefällt, filtriert und gründlich mit Ether gewaschen. Die Anwesenheit des Nitrophenylester-Gehalts in dem erhaltenen Produkt wurde durch IR-Spektroskopie (1840 cm^–1, 1790 cm^–1 Anhydrid, 1740 cm^–1 COOH, 1660 cm^–1 NCO, 1540 cm^–1, 1350 cm^–1 NO₂) bewiesen und durch seine Ultraviolettabsorption bestimmt, die bei 400 nm in Natriumhydrogencarbonat-Lösung gemessen wurde (molarer Extinktionskoeffizient: 1660). Durch Ultrafiltration eines Aliquotenteils wurde kontrolliert, dass das Produkt frei von ungebundenem Peptidnitrophenylester war. Nach Lösen des Polymers in absolutem DMF wurde eine berechnete Menge (2 Äquivalente) Wasser zur Hydrolyse der Anhydridgruppen dazugegeben. Die Beendigung der Hydrolyse wurde durch das IR-Spektrum einer Probe bestimmt (IR: 1740 cm^–1 COOH; 1540 cm^–1, 1350 cm^–1 NO₂).
Beispiel 2
Herstellung von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Phe-Leu-Gly-nitrophenylester
Das Produkt wurde durch Ankuppeln von H-Phe-Leu-Gly-Nitrophenylesterhydrochlorid (R_f1: 0,59) wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und charakterisiert (IR: 1740 cm^–1 COOH; 1540 cm^–1, 1350 cm^–1 NO₂).
Beispiel 3
Herstellung von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Leu-Gly-nitrophenylester
Das Produkt wurde durch Ankuppeln von N-Gly-Leu-Gly-Nitrophenylestertrifluoracetat (R_f2: 0,53) wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und charakterisiert (IR: 1740 cm^–1 COOH; 1540 cm^–1, 1350 cm^–1 NO₂).
Beispiel 4
Herstellung von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Ahx-nitrophenylester
Das Produkt wurde durch Ankuppeln von H-Ahx-Nitrophenylesteracetat (R_f1: 0,7) wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und charakterisiert (IR: 1740 cm^–1 COOH; 1540 cm^–1, 1350 cm^–1 NO₂).
Beispiel 5
Herstellung von Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,{Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁵, [a-Asp(DEA)1⁶, D-Ala¹⁰-GnRH (abgekürzt: P-GFLG-1892)
Nach Zugabe von 1 Äquivalent MI-1892 (berechnet für die Nitrophenylestergruppen) zu der gemäß Beispiel 1 hergestellten Lösung wurde der pH der Lösung durch Zugabe von Triethylamin auf zwischen 7 und 8 eingestellt. Nach 24 Stunden wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von Wasser auf das 20-fache ihres Volumens verdünnt, und eine 5%-ige NaHCO₃-Lösung wurde für die vollständige Hydrolyse der unumgesetzten Nitrophenylestergruppen dazugegeben. Niedermolekulare Materialien wurden durch Ultrafiltration entfernt, und die hochmolekulare Fraktion wurde lyophilisiert. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert (Rt: 34,48 min, die Retentionszeit von MI-1892 beträgt 20,61 min), und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt (die spezifische Extinktion von MI-1892 ist 10400 bei 280 nm). Gleichzeitig wurde angemerkt, dass das Produkt kein freies oder ungebundenes Nitrophenol (zwischen 380 und 420 nm) enthielt.
Beispiel 6
Herstellung von Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,{Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁶,D-Ala¹⁰-GnRH (abgekürzt: P-GFLG-1544)
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass MI-1544 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert [Retentionszeit: Rt: 29,96 min, die Rt von MI-1544 beträgt 22,93 min], sein Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt. Die spezifische molare Extinktion von MI-1544 beträgt 11000 bei 280 nm.
Beispiel 7
Herstellung von {D-Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁶-GnRH (abgekürzt: P-GFLG-609
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass D-Lys⁶-GnRH als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert, und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt.
Beispiel 8
Herstellung von D-Phe²,D-Trp³,{D-Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁶-GnRH (abgekürzt: P-GFLG-1004)
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass SJ-1004 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert [Rt: 20,7 min, diejenige von SJ-1004 beträgt 17,3 min], und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt. Die spezifische molare Extinktion von SJ-1004 beträgt 6500 bei 280 nm.
Beispiel 9
Herstellung von {Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁵,cyclo(Asp⁶-Lys⁸)-GnRH-III (abgekürzt: P-GFLG-614)
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass TH-614 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert (Rt von TH-614 ist 16,4 min), und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt. Die spezifische molare Extinktion von TH-614 beträgt 8800 bei 280 nm.
Beispiel 10
Herstellung von {Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁴-GnRH-III (abgekürzt P-GFLG-685)
Zu der gemäß Beispiel 1 hergestellten Polymerlösung wurden 0,5 Äquivalente (berechnet für die Nitrophenylestergruppen) NB-694-Hormon-Analogon gegeben, das eine freie Aminogruppe enthielt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von Diisopropylamin auf 10 eingestellt. Nach einigen Stunden wurde Piperidin portionsweise dazugegeben, um die Schutzgruppe von dem [Lys(n-Fmoc)]⁸-Derivat zu entfernen. Nach Rühren über einige zusätzliche Stunden wurde die mit Wasser verdünnte Reaktionsmischung ultrafiltriert, und die Ultrafiltration wurde nach Verdünnung des Überstands mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung wiederholt. Das so gereinigte Produkt wurde lyophilisiert, seine Reinheit wurde durch HPLC kontrolliert, und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt. Die spezifische molare Extinktion von HB-685 beträgt 900 bei 280 nm.
Beispiel 11
Herstellung von {Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁸-GnRH-III (abgekürzt: P-GFLG-602)
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass TH-602 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert (Rt: 14,8 min, diejenige von TH-602 beträgt 13,4 min), und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt. Die spezifische molare Extinktion von TH-602 beträgt 9800 bei 280 nm.
Beispiel 12
Herstellung von Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,{Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Phe-Leu-Gly]}⁵,a-Asp(DEA)]⁶,D-Ala¹⁰-GnRH (abgekürzt: P-FLG-1892)
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass das gemäß Beispiel 2 hergestellte Produkt als Träger verwendet wurde und MK-1892 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert (Rt: 30,77 min), und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt.
Beispiel 13
Herstellung von Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,{Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Phe-Leu-Gly]}⁵,[a-Asp(DEA)]⁶,D-Ala¹⁰-GnRH (abgekürzt: P-GLG-1892)
Man folgte dem Beispiel 12, außer dass das in Beispiel 3 hergestellte Produkt als Träger verwendet wurde und MI-1892 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert (Rt: 25,39 min), und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt.
Beispiel 14
Herstellung von Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,(Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Ahx]}⁵,[a-Asp(DEA)]⁶,D-Ala¹⁰-GnRH (abgekürzt: P-Ahx-1892)
Man folgte dem Beispiel 12, außer dass das in Beispiel 4 hergestellte Produkt als Träger verwendet wurde und MI-1892 als GnRH-Analogon verwendet wurde. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert (Rt: 19,89 min), und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt.
Beispiel 15
Herstellung von Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,{Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)]}⁵,[a-Asp(DEA)]⁶,D-Ala¹⁰-GnRH (abgekürzt: P-1892)
Nach Lösen von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure) in DMF wurden berechnete Mengen von MI-1892 und Triethylamin dazugegeben. Nach zwölfstündigem Stehen wurde das Produkt durch Diethylether gefällt, dann in 5%-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gelöst und wie in den vorangehenden Beispielen gereinigt sowie analysiert (Rt: 19,59 min).
Beispiel 16
Herstellung von {Lys[n-poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)-Gly-Phe-Leu-Gly]}⁵,D-Trg⁶-GnRH (abgekürzt: A-GFLG-615)
Man folgte dem Beispiel 5, außer dass TH-615 als GnRH-Analogon (siehe Beispiel 9) verwendet wurde. d: 10300.
Beispiel 17
Herstellung von Gly-Phe-Leu-Gly-GnRH-Analoga, die an das Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure)hexylamid-Derivat gekuppelt sind
Eine berechnet Menge von Hexylamin wurde unter Rühren zu der Lösung von Poly(N-vinylpyrrolidon-co-maleinsäure) gegeben. Nach 2 Stunden wurde das Produkt durch Zugabe von Diethylether gefällt, dann abfiltriert und mit Ether gewaschen, bis es Amin-frei wurde (negativer Ninhydrin-Test, IR: 293 cm^–1 CH₂). Der Feststoff wurde wieder in DMF gelöst, und H-Gly-Phe-Leu-Gly-Nitrophenylesterhydrochlorid wurde dazugegeben. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde mit Triethylamin auf 7–8 eingestellt, und die Fällung wurde nach 3 Stunden wiederholt. Die Kupplung des GnRH-Analogons und die Reinigung der Produkte wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC kontrolliert, und der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde durch UV-Spektroskopie im Bereich von 200 bis 450 nm bestimmt.
Beispiel 18
Untersuchung der Beziehung Dosis-Überleben
Die Untersuchung ergibt eine genaue Information über die Zellschädigungswirkung der getesteten Substanz. Im Fall von Zytostatika ist die Zell-Schädigungswirkung nicht zellspezifisch. GnRH-Analoga besitzen eine Phasen-spezifische Wirkung, sie blockieren, aber töten nicht die Zellen in der G0/G1-Phase. Ein Teil der blockierten Zellen geht wiederum in den Zyklus, der andere Teil kann absterben (Apoptosis). Die Kolonien, die aus den blockierten Zellen gebildet sind, erreichen nicht die zählbare Koloniengröße zum Zeitpunkt der Bewertung (die Zählung der Kolonien kann identisch sein, aber die Größe der Kolonien ist verschieden). Im Fall von Hormon-Analoga kann eine spezifische Inhibierung von 10 bis 30% bei den Zellen erreicht werden, die einen Rezeptor für das fragliche Hormon besitzen. Die Untersuchungen wurden bei der menschlichen MCF-7- und MDA-MB-231-Mammakarzinom-Zelllinie, der menschlichen PC3-Prostatakarzinom-Zelllinie und der menschlichen Ishikawa-Endometrium-Karzinom-Zelllinie durchgeführt. 300 Zellen wurden in Petri-Schalen mit jeweils einem Durchmesser von 3,5 cm abgesetzt. Die Behandlung wurde einmal 24 Stunden nach der Explantation durchgeführt, dann wurden die gebildeten Kolonien nach 9 bis 12 Tagen gezählt.
Nach Lösen der Substanzen in dem Nährmedium wurden die Kulturen mit 1 bis 50 μm MI-1554-Human-GnRH-Antagonist-, MI-1892-Hühner-GnRH-Antagonist, SJ-1004-Human-GnRH-Antagonist-Analogon und synthetischer Neunauge-GnRH-III-Substanz sowie mit Lys⁴-GnRH-III- und Lys⁵-cyclo(Asp⁶,Lys⁸)-GnRH-III-Neunauge-GnRH-III-Analogon; weiter mit P-GFLG-1544-, P-GFLG-1892-, P-GFLG-GnRH-III-, P-GFLG-Lys⁴-GnRH-III-, P-GFLG-Lys⁵-cyclo(Asp⁶,Lys⁸)-GnRH-III-Konjugat oder P-FLG-1892- bzw. P-GLG-1892-Konjugat entsprechend den gleichen Mengen der Wirksubstanzen behandelt.
MI-1892-Hühner-GnRH-Antagonist-Substanz (verabreicht in einer Konzentration von 50 μM) inhibierte die Kolonienbildung beider Mammakarzinom-Zellkulturen (MCF-7, MDA-MB-231) in einem nahezu identischen Ausmaß, nämlich 15 bis 20% bzw. 35 bis 38%. Wenn er in einer Konzentration von 50 μM verabreicht wurde, zeigte der MI-1544-hGnRH-Antagonist eine Inhibierung von 45% der Kolonienbildung bei der MCF-7-Zelllinie und von 20% bei der MDA-MB-231-Zelllinie.
Beide Konjugate P-GFLG-1544 und P-GFLG-1892 übten in einer Konzentration von 10 μM eine Inhibierung von 80 bis 85% auf die Kolonienbildung bzw. in einer Konzentration der Wirksubstanz von 50 μM eine 100%-ige Inhibierung aus (Tabelle 1).
Tabelle 1 Inhibierung der Kolonienbildung durch GnRH-Analogon/Makromolekül-Konjugate (P-GFLG-GnRH-Analoga) bei menschlichen Tumor-Zelllinien
Die Tripeptid-Abstandshalter-haltigen Konjugate P-FLG-1892 und P-GLG-1892 übten eine etwas schwächere, nämlich 70–80%-ige Inhibierung auf das Überleben der Zellen in einer Konzentration an Wirksubstanz von 50 μM aus. P-GFLG-1544 und P-GFLG-1892 waren auch die stärksten Inhibitoren der Kolonienbildung bei der PC3-Prostata- und Ishikawa-Endometrium-Karzinom- Zelllinie: Unter Verwendung einer Konzentration von 30–50 μM wurde sowohl bei der PC3- als auch der Ishikawa-Zellkultur eine Inhibierung von 100% beobachtet (Tabelle 1). Beide Konjugate übertrafen in hohem Maß die Inhibierung der Kolonienbildung durch die Wirksubstanzen MI-1544-GnRH-Antagonist und MI-1892-Hühner-GnRH-Antagonist-Analogon, von der man fand, dass sie unter Verwendung einer Konzentration von 50 μM 5% bzw. 10% bei der Ishikawa-Zelllinie und 20% bzw. 5% bei der PC3-Zelllinie betrug.
Als es in einer Konzentration von 50 μM verabreicht wurde, inhibierte SJ-1004 als schwache GnRH-Antagonist-Analogon-Substanz den Grad der Kolonienbildung um 31% bei der MCF-7-Zelllinie und um 26% bei der MDA-MB-231-Zelllinie, während es keinerlei Inhibierung bei der PC3-Zelllinie (0%) bzw. bei der Ishikawa-Zelllinie (5%) zeigte. Im Gegensatz dazu hatte, wenn es in einer Konzentration an Wirksubstanz von 50 μM verabreicht wurde, das P-GFLG-1004-Konjugat eine Inhibierung von 92 bis 95% bei Mammakarzinom-Zelllinien; 100% bei der PC3-Prostatakarzinom-Zellkultur; und 46% bei der Ishikawa-Zelllinie zum Ergebnis (Tabelle 1). Im Gegensatz zu dem eigenen oder menschlichen oder Hühner-GnRH-Analogon hatte das synthetische Neunauge-GnRH-III bei der MCF-7-, MDA-MD-231- und PC3-Zelllinie die signifikanteste Inhibierung der Kolonienbildung als Wirksubstanz selbst, aber nicht als Konjugat, zum Ergebnis. Bei einer Konzentration von 50 μM inhibierte GnRH-III die Kolonienbildung um 65% (bei MCF-7), 69% (bei MDA-MB-231) bzw. 21% (bei PC3), wohingegen das P-GFLG-GnRH-III-Konjugat keine Inhibierung von mehr als 16% bei irgendeiner Zelllinie zum Ergebnis hatte (Tabelle 1).
In Fall des Lys⁴-GnRH-III- und Lys⁵-cyclo(Asp⁶,Lys⁸)-GnRH-III-Neunauge-GnRH-III-Analogons erwiesen sich die Inhibierungswirkungen der Konjugate, nämlich P-GFLG-Lys⁴-GnRH-III und P-GFLG-Lys⁵,cyclo(Asp⁶,Lys⁸)-GnRH-III wieder als bedeutender (Tabelle 1). In Form der aktiven Substanz übte Lys⁴-GnRH-III eine Inhibierung der Kolonienbildung von 40% bei der MCF-7-Zelllinie, 35% bei der MDA-MB-231-Zellkultur bzw. 21% bei Ishikawa-Zellen aus. Es zeigte keine Inhibierung im Fall der PC3-Zellen.
Das P-GFLG-Lys⁴-GnRH-III-Konjugat zeigte eine Inhibierung der Kolonienbildung von 68% bei der MCF-7-Zelllinie, 75% bei der MDA-MB-231-Zellkultur und 25% bei Ishikawa-Zellen; interessanterweise inhibierte es die Kolonienbildung bei der PC3-Zelllinie zu 94% (Tabelle 1).
Das Lys⁵,cyclo(Asp⁶,Lys⁸)-GnRH-III-Neunauge-Analogon übte eine Inhibierung der Kolonienbildung von 44% bei der MCF-7-Zelllinie und 13% bei der Ishikawa-Zelllinie aus. Als Konjugat inhibierte P-GFLG-Lys⁵,cyclo(Asp⁶,Lys⁸)-GnRH-III die Kolonienbildung in Mammakarzinom-Zellkulturen viel stärker (78 bis 82%) als die Wirksubstanz. Bei der Ishikawa-Zelllinie war die Inhibierungswirkung des Konjugats (19%) nahezu die gleiche wie diejenige der Wirksubstanz (13%). Das Konjugat blockierte die Kolonienbildung bei der PC3-Zelllinie zu 100%.
Beispiel 19
In-vitro-Inhibierung der Proliferation der menschlichen Mammakarzinom-Zelllinie
Das Behandlungsverfahren war wie folgt. Nach Trypsinisierung der Zellen wurden jeweils 400000 Zellen von menschlichem MCF-7-, MDA-MB-231-Mammakarzinom, menschlichem PC3-Prostatakarzinom oder menschlichem Ishikawa-Endometrium-Tumor in Petri-Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Ausgehend vom Tag nach der Übertragung wurden die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase mit den zu testenden Substanzen in Lösung, die mit dem Nährmedium hergestellt war, behandelt. Die Kulturen wurden jeden 2. Tag mit 1 bis 50 μM (berechnet für das Gesamtvolumen der Kultur) MI-1544-GnRH-Antagonist-, MI-1892-Hühner-GnRH-Antagonist- oder SJ-1004-GnRH-Antagonist-Analogon sowie synthetischem Neunauge-GnRH-III-Hormon behandelt, und die Zellzählung wurde am 7. Tag vorgenommen. Gleichzeitig mit den obigen Überprüfungen wurden die Zellen einmal am Tag nach der Überführung mit den Konjugaten P-GFLG-1544, P-GFLG-1892, P-GFLG-1004 sowie P-GFLG-GnRH-III in 1 bis 50 μM Wirksubstanz entsprechenden Mengen behandelt, dann wurde die Zellzählung am 7. Tag nach Explantation vorgenommen. Die GnRH-Peptidhormon-Substanzen, die in einer Konzentration von 30 μM verwendet wurden, hatten die bedeutendste Inhibierung der Zellproliferation zum Ergebnis. Die Inhibierungswirkung wurde durch Erhöhen der Konzentration nicht verstärkt.
Im Fall der menschlichen Estradiol-Rezeptor- (ER-) positiven MCF-7-Zelllinie (10% FCS) wurde zwischen der direkten atitumoralen Wirkung des schwachen GnRH-Antagonisten SJ-1400 und des GnRH-Antagonisten MI-1544 bzw. des Hühner-GnRH-Antagonisten MI-1892 ein signifikanter Unterschied beobachtet. SJ-1004 rief nur eine Verringerung von 17% bei der Zellzählung hervor, während beide Antagonisten (30 μM) eine 34 bis 36%-ige Inhibierung im Fall einer Behandlung zum Ergebnis hatten, die jeden 2. Tag über 5 Tage durchgeführt wurde.
Als es mit der gleichen Dosis der Wirksubstanz verwendet wurde, induzierte das P-GFLG-1544-Konjugat eine Inhibierung von 58%. Man kann annehmen, dass die antitumorale Wirkung des M1-1544-Antagonisten additiv durch das Copolymer, das kovalent daran gebunden ist, verstärkt wird (Tabelle II).
Als es mit einer Konzentration von 30 μM der Wirksubstanz verabreicht wurde, zeigte das P-GFLG-1892-Konjugat, das MI-1892 enthielt, eine 45%-ige Inhibierung der Zellproliferation. In Anbetracht der Tatsache, dass mit dem Konjugat nur eine einzige Behandlung durchgeführt wurde, verbesserte das Polymer auch in diesem Fall die Inhibierungswirkung des Antagonisten (Tabelle II). Tabelle II Inhibierung der Zellteilung durch GnRH-Analogon/Makromolekül-Konjugate bei verschiedenen menschlichen Tumor-Zelllinien

MCF-7: Mammatumor-Zelllinie menschlichen Ursprungs;
MDA-MB-231: Mammatumor-Zelllinie menschlichen Ursprungs;
PC3: Prostatatumor-Zellliniemenschlichen Ursprungs;
Ishikawa: Endometriumtumor-Zelllinie menschlichen Ursprungs.

P-FLG-1892- und P-GLG-1892-Konjugat, die eine Tripeptid-Abstandshaltergruppe enthielten und mit einem Gehalt an Wirksubstanz von 30 μM verabreicht wurden, hatten eine direkte Antitumorwirkung von lediglich 30 bis 35% zum Ergebnis (Tabelle II). Im Fall der ER-negativen MDA-MB-231-Zellen (10% FCS) hatte die Behandlung an jedem zweiten Tag mit SJ-1004 eine Verringerung der Zellzählrate um 23% zum Ergebnis, wohingegen die Behandlung mit MI-1544 und MI-1892 (30 μM) die Zellzählrate um 35% bis 36% verringerte.
Wenn es mit einer Konzentration an Wirksubstanz von 30 μM verabreicht wurden, hatte P-GFLG-1544-Konjugat eine 45%-ige und P-GFLG-1892 eine 42%-ige Inhibierung der Proliferation zum Ergebnis (Tabelle II). Unter Verwendung von P-FLG-1892 oder P-GLG-1892 wurde eine niedrigere, nämlich 33 bis 35%-ige Inhibierung gesehen (Tabelle II).
Bei der PC3-Prostata- und der Ishikawa-Endometriumkarzinom-Zelllinie wurde die Proliferations-inhibierende Wirkung der GnRH-Analogon-Wirksubstanzen (MI-1544 und MI-1892) signifikant durch das kovalent daran gekuppelte Copolymer erhöht. Wenn es in einer Konzentration von 30 μM verwendet wurde, inhibierte MI-1544 nach zwei Behandlungen an den Tagen 2 und 4 die Proliferation der Ishikawa-Zelllinie um 8% und der PC3-Zelllinie um 20%; wohingegen P-GFLG-1544 bei einmaliger Verabreichung eine direkte Inhibierung von 95% der Proliferation bei der Ishikawa-Zelllinie und von 68,5% bei der PC3-Zelllinie zum Ergebnis hatte.
Nach zwei Behandlungen hatte die MI-1892-Hühner-GnRH-Antagonist-Wirksubstanz eine 14%-ige und 33%-ige Inhibierung bei der Ishikawa- bzw. PC3-Zellkultur zum Ergebnis. Nach einer einzigen Verabreichung übte das P-GFLG-1892-Konjugat eine direkte Proliferations-inhibierende Wirkung von 51% bei der PC3-Zelllinie bzw. eine signifikantere Inhibierung von 91% bei der Ishikawa-Zelllinie aus (Tabelle II).
SJ-1004 als schwacher GnRH-Antagonist zeigte eine schwache antitumorale Wirkung. Nach zwei Behandlungen (Tage 3 und 4) wurde eine Inhibierung von lediglich 17% bei der MCF-7-Zelllinie beobachtet, wohingegen man fand, dass diese Inhibierung 23% bei der MDA-MB-231-Zelllinie, 20% bei der Ishikawa-Zelllinie bzw. 10% bei der PC3-Zelllinie betrug. Als es einmal in Konjugatform verabreicht wurde, hatte P-GFLG-1004 eine nahezu identische signifikante Inhibierung (63 bis 68%) bei beiden Mammakarzinom-Zelllinien zum Ergebnis (Tabelle II).
Das P-GFLG-1004-Konjugat übte eine schwächere direkte Proliferationsinhibierende Wirkung aus als P-GFLG-1554 oder P-GFLG-1892; man fand, dass diese 35% bei der PC3- bzw. 20% bei der Ishikawa-Zelllinie betrug. Bei den Konjugaten von synthetischem GnRH-III-Neunauge-GnRH oder P-GFLG-GnRH-III wurde die Untersuchung der Proliferations-inhibierenden Wirkung nur bei der MCF-7- und der MDA-MB-231-Zelllinie durchgeführt. In Übereinstimmung mit den Untersuchungen der Inhibierung der Kolonienbildung war dies das einzige GnRH-Hormon aus den getesteten agonistischen und antagonistischen Derivaten, das als Wirksubstanz allein eine bedeutendere Inhibierung der Kolonienbildung bzw. Proliferation im Vergleich zu den Ergebnissen zeigte, die mit dem P-GFLG-GnRH-III-Konjugat erzielt wurden. Unter Verwendung der Wirksubstanz hatten zwei Behandlungen (Tage 2 und 4) eine direkte Inhibierung von 40 bis 39% zum Ergebnis, während nach einmaliger Behandlung (am Tag 2) mit P-GFLG-GnRH-III eine Inhibierung von lediglich 10 bis 11% beobachtet wurde (Tabelle III).
Wie in Tabelle II gezeigt, steht die Proliferations-inhibierende Wirkung innerhalb eines gewissen Fehlers in Einklang mit den Ergebnissen der Inhibierung der Kolonienbildung. Auf der Grundlage unserer Beobachtungen besteht auch zwischen der Inhibierung der Kolonienbildung und der In-vivo-Wirkung der Substanzen eine strenge Korrelation.
Beispiel 20
Toxikologische In-vivo-Studie des P-GFLG-1892- und P-GFLG-1544 Konjugats
Diese Experimente wurden bei 21 Kontrollen und behandelten weiblichen CBA/Ca-Mäusen durchgeführt. Die Behandlungen waren wie folgt: 7 Tiere als Kontrollen ohne Behandlung; 7 Tage mit einmaliger subkutaner (s. c.) Verabreichung mit dem 10-fachen der effektiven Dosis (Konzentration an Wirksubstanz: 400 μg/Tier); 7 Tiere mit einmaliger intraperitonealer (i. p.) Verabreichung des 10-fachen der effektiven Dosis (Konzentration an Wirksubstanz: 400 μg/Tier). Keine der Substanzen erwies sich als toxisch. Am 5. Tag nach der i. p.-Behandlung und am 7. Tag nach der s. c.-Behandlung hatten die Körpergewichte der Tiere um 10% zugenommen, wohingegen sich die Gewichte der Kontrolltiere nicht änderten.
Beispiel 21
Untersuchung der In-vivo-Antitumor-Wirkung des P-GFLG-1892- und des P-GFLG-1544-Konjugats bei immunsupprimierten Mäusen, die menschliches MCF-7- oder MDA-MB-231-Xenotransplantat tragen
Als sie immunsupprimierten CBA/Ca-Mäusen eingeimpft wurden, bildeten die MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen einen Tumor, der erfolgreich transplantiert werden konnte. Die Immunsuppression der Mäuse wurde unter Verwendung des Verfahrens von Steel et al. (Br. J. Cancer, 37, 224–230 (1978)] durchgeführt.
Immunsuppression und Xenotransplantation
Etwa 6 Wochen alte weibliche CBA-Ca-Mäuse wurden thymektomiert und dann nach einer Woche mit 60Co (Ganzkörperbestrahlung; die letale Dosis ist 9,5 Gray) bestrahlt. Innerhalb von 24 Stunden wurden 3 bis 5 × 10⁵ Myelozyten in die Tiere injiziert. Unter die Haut der immunsupprimierten Mäuse wurden 2 × 10⁷ Tumorzellen oder im Fall von späteren Passagen etwa 2 mm³ Tumorzellen oder im Fall von späteren zusätzlichen Passagen etwa 2 mm³-Tumorstücke implantiert. Nach der Xenotransplantation wurden die Mäuse, die MCF-7-Xenotransplantat trugen, wöchentlich einmal mit einer Mischung von 50 μg Estradiolvalerat und 30 μg Norgestomet (Intervet Inernational B. V.) behandelt. Man unterbrach die Behandlung mit Steroidhormon mindestens eine Woche vor Beginn der Untersuchung. (Das Anwachsen fand gewöhnlich während 24 Tagen statt).
Im Fall der MCF-7-Tumoren (Xenotransplantate) wurden die Überprüfungen mit Passagen durchgeführt, die in der Phase der 37. bzw. 38. Transplantation waren. Auf der Grundlage der Beobachtungen war das Wachstum von Tumoren nach Transplantation von mehreren Jahren beschleunigt und zeigte eine zweifache Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich zu dem Zustand nach der 4. oder 5. Passage (Im Fall der Kontrolltiere wuchs der Tumor nach 4–5 Passagen von 0,3 g auf 3–4 g an, wohingegen die Gewichte von Tumoren nach der 37. oder 38. Transplantation während 6 Wochen von 0,3 g auf 8 g zunahmen). Es sollte bemerkt werden, dass während der Passagen wahrscheinlich eine klonale Selektion auftrat; d. h. Klone, die schneller wuchsen, waren vorherrschend über die langsamer wachsenden Populationen (klonale Selektion).
Im Fall von Mäusen, die MCF-7-Xenotransplantat trugen, begann man mit der Behandlung in der 4. Woche nach der Xenotransplantation. Diese Überprüfung wurde bei 50 Tieren [mit einem Tumorvolumen von 255–319 mm³; (d12 × d2 × 3,14):6] durchgeführt. Die Behandlungen wurden wie folgt durchgeführt. MI-1892 wurde zweimal täglich (2 × 25 μg jede 12. Stunde) jeweils 8 Tieren s. c. verabreicht; täglich 50 μg oder jeden dritten Tag 150 μg P-GFLG-1892- oder P-GFLG-1544-Konjugat (berechnet für die Wirksubstanz) jeweils 8 Tieren bzw. 6 Tieren; P-GFLG-OH wurde täglich in einer s. c.-Dosis, die 50 μg Wirksubstanz entsprach, jeweils 6 Tieren verabreicht; und 150 μl physiologische Kochsalzlösung wurden täglich jeweils 8 Kontrolltieren s. c. verabreicht. Am Ende der 4. Woche der Behandlung hatten die täglich 2 Behandlungen mit dem MI-1892-Antagonist-Substrat und die tägliche einmalige Behandlung mit P-GFLG-1892- und P-GFLG-1544-Konjugat eine 20 bis 30%-ige Verringerung des Tumorvolumens im Vergleich zum Tumorvolumen von Kontrollen des gleichen Alters zum Ergebnis. So verringerten die Behandlungen die Geschwindigkeit des Tumorwachstums auf solche Weise, dass die Substanz, die zweimal täglich verabreicht wurde, und das Konjugat, das einmal täglich verabreicht wurde, zu etwa dem gleichen Ergebnis führten (die erstgenannte Behandlung verursachte eine Abnahme von 20%, die letztgenannte eine Abnahme von 30% des Tumorwachstums). Die Geschwindigkeit des Tumorwachstums wurde von P-GFLG-1892 oder P-GFLG-1544, das jeden 3. Tag verabreicht wurde, oder durch täglich verabreichtes P-GFLG-OH nicht beeinflusst.
Kürzliche Untersuchungen haben bei 28 Tieren, die MCF-7-Xenotransplant tragen, und bei 28 Tieren, die MDA-MB-231-Xenotransplantat tragen, begonnen.
Bei Tieren, die den MCF-7-Tumor tragen, wurde in der 5. Woche nach der Xenotransplantation mit der Behandlung begonnen; das Tumorvolumen betrug 205 bis 225 mm³. Bei Tieren, die den MDA-MB-231-Tumor tragen, wurde in der 4. Woche nach der Xenotransplantation mit der Behandlung bei einem Tumorvolumen von 140 bis 150 mm³ begonnen. Die Behandlungen wurden auf solche Weise durchgeführt, dass täglich 75 μg P-GFLG-1892-Konjugat s. c. (berechnet für die Wirksubstanz) bzw. täglich 50 μg P-GFLG-1544-Konjugat s. c. (berechnet für die Wirksubstanz) bzw. täglich 50 μg P-GFLG-OH-Träger s. c. (berechnet für die Wirksubstanz) verwendet wurden. Die Kontrollgruppen wurden täglich mit physiologischer Kochsalzlösung s. c. behandelt (jede behandelte Gruppe bestand aus 7 Tieren).
Es soll betont werden, dass bei wiederholten Untersuchungen, die bei Mäusen durchgeführt wurden, welche MCF-7-Xenotransplantat trugen, beide Konjugate P-GFLG-1892 und P-GFLG-1544 eine 30 bis 35%-ige Inhibierung des Tumorwachstums selbst in der 2. Woche der Behandlung zum Ergebnis hatten (Tabelle III). Indem die Ergebnisse von früheren Untersuchungen in der 4. Woche übertroffen wurden, betrug die Abnahme, die von P-GFLG-1892 verursacht wurde, 37% (das Tumorvolumen betrug 2,428 cm³), betrug die Abnahme, die von P-GFLG-1544 verursacht wurde, 49% (das Tumorvolumen betrug 1,806 cm³) der Tumorvolumina im Vergleich zu Kontrollen des gleichen Alters. Man fand, dass in der 6. Woche die Inhibierungswirkungen beider Konjugate im Wesentlichen gleich waren; im Fall von P-GFLG-1544 wurde sogar ein Tumor-freies Tier gefunden. Es wurde eine 43 bis 49%-ige Inhibierung des Tumorwachstums erzielt (Tabelle III). Tabelle III Auswirkung auf das Tumorwachstum bei MCF-7-Xenotransplantat

Xenotransplantat: Transplantation von menschlichem Tumor in immunsupprimierte Mäuse

Xenotransplantat: Transplantation von menschlichem Tumor in immunsupprimierte Mäuse. Die Tiere wurden täglich auf dem s. c.-Weg behandelt.

Volumina und Gewicht von Tumoren nach 6-wöchiger Behandlung
Im Fall von Mäusen, die einen MDA-MB-231-Tumor trugen, wurde eine 21 bis 34%-ige Verringerung selbst von der 2. Woche an beobachtet, verglichen mit der Kontrollgruppe des gleichen Alters (Tabelle IV). Das Wachstum der Tumoren (Estradiol-Rezeptor-negative, Estradiol-unabhängige Tumoren) wurde nicht durch chemische Kastration inhibiert; deshalb war die beobachtete Wirkung eindeutig das Ergebnis einer direkten antitumoralen Wirkung. Die Behandlung wurde in der 6. Woche beendet; nahezu die gleiche Inhibierung von 37 bis 42% wurde nach der Behandlung mit den zwei Konjugaten (P-GFLG-1892 bzw. P-GFLG-1544) beobachtet (Tabelle III). Am Ende der 6. Woche wurde in den Gruppen, die mit den Konjugaten behandelt wurden, ein Tumor-freies Tier gefunden.
Man begann mit einer neueren Studie an 28 Tieren, die MDA-MB-231-Xenotransplantat trugen. Man begann in der 4. oder 5. Woche nach Xenotransplantation mit der Behandlung. Das Tumorvolumen betrug 0,165 bis 0,194 cm³. Die Behandlungen wurden täglich mit 100 μg Wirksubstanz (berechnet für GnRH-III, P-GFLG-GnRH-III bzw. P-GFLG-1544), die auf dem s. c.-Weg verabreicht wurden. (Bezüglich der Behandlung der Kontrollgruppe siehe die vorangehenden Beispiele.) Jede Gruppe bestand aus 7 Tieren. Während der Behandlungen wurden die Tumorvolumina 9 Wochen lang wöchentlich gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst.
Die GnRH-III-Wirksubstanzen selbst hemmten die Geschwindigkeit des Tumorwachstums nicht. Die Erhöhung der Dosis des P-GFLG-1544-GnRH-Antagonist-Konjugats (50 μg in der vorangehenden Reihe, 100 μg in dieser Reihe von Experimenten) erhöhte die Inhibierungswirkung des Konjugats auf das Tumorwachstum nicht. Es wird als ein sehr wichtiges Ergebnis angesehen, dass 2 Tiere aus 7, die mit P-GFLG-GnRH-III behandelt wurden, und 1 Tier aus 7, die mit P-GFLG-1544 behandelt wurden, in der 6. Woche der Behandlung Tumor-frei wurden.
Volumina und Gewichte von Tumoren nach neunwöchiger Behandlung
Am Ende der 9. Woche wurde mit dem P-GFLG-GnRH-III-Konjugat eine ausgezeichnete 73 bis 78%-ige Inhibierung erhalten, die bis heute nicht beobachtet wurde. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Körpergewichten von behandelten bzw. Kontrolltieren gefunden, weder während der Behandlung noch am Ende der Behandlung.
Beispiel 25
Untersuchung der In-vivo-Antitumor-Wirkung von P-GFLG-1892 und P-GFLG-1544 bei Mäusen, die den MXT-Maus-Mammatumor tragen
Als sie CBA/Ca-Mäusen eingeimpft wurden, entwickelten die MXT-Maus-Mammatumor-Zellen einen Tumor. Das Anwachsen des Tumors fand zu 100% statt; so konnte mit den Behandlungen vor der Entwicklung von Tumoren am Tag nach der Xenotransplantation begonnen werden. Eine weitere Bedeutung des Modells besteht darin, dass, im Gegensatz zum Immunsystem von Mäusen, die ein menschliches Xenotransplantat tragen, das Immunsystem von Mäusen, die den MXT-Maus-Mammatumor trugen, nicht künstlich supprimiert wurde; deshalb war dieses Modell gleichermaßen nützlich, um die antitumorale Wirkung wie auch die Wirkung zu untersuchen, die auf das Immunsystem ausgeübt wurde. Das MXT-Maus-Mammakarzinom enthält ER und PgR-Proteine. Weiter enthält es auch GnRH-Rezeptoren; Deshalb ist diese In-vivo-Tumormodell sowohl für die Untersuchung der direkten als auch der indirekten Wirkungen geeignet. Mit der Behandlung von Mäusen, die den MXT-Mammatumor trugen, wurde am Tag nach der Transplantation begonnen. Die Untersuchungen wurden bei 35 Tieren auf solche Weise bewerkstelligt, dass 75 μg MI-1892, MI-1544, P-GFLG-1892 bzw. P-GFLG-1544 (berechnet für die Wirksubstanzen) einmal täglich jeder Maus s. c. injiziert wurden, während das Tumorvolumen systematisch ab dem 9. Tag der Behandlung gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt.
Tabelle VI Auswirkung auf das Tumorwachstum bei MXT-Maus-Mammatumor
Die Tiere wurden täglich ab dem Tag der Transplantation des MXT-Maus-Mammatumors auf dem s. c.-Weg behandelt. Die Behandlung wurde wie folgt durchgeführt: P-PFLG-1544: 75 μg/Tag/Tier mit Bezug auf die MI-1544-Wirksubstanz; P-GFLG-1892: 75 μg/Tag/Tier mit Bezug auf die MI-1892-Wirksubstanz; MI-1544: 75 μg/Tag/Tier; MI-1892: 75 μg/Tag/Tier.
Die Prozentsätze der Inhibierung sind in Tabelle VII zusammengefasst. Die stärkste Inhibierung des Tumorwachstums wurde am Ende der zweiten Woche der Behandlung beobachtet. Die Prozentsätze der Inhibierung, die am Ende der zweiten und der dritten Woche gemessen wurden, sind in Tabelle VII gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass in diesem Modell das P-GFLG-1892-Konjugat viel wirksamer ist als die MI-1892-Wirksubstanz selbst. Zwischen der Inhibierungswirkung von MI-1544 und derjenigen von P-PFLG-1544 besteht kein Unterschied.
Tabelle VII Auswirkung auf das Tumorwachstum bei MXT-Maus-Mammatumor
Die Tiere wurden täglich ab dem Tag der Transplantation des MXT-Maus-Tumors auf dem s. c.-Weg behandelt.
Beispiel 26
Herstellung von [Lys(ε-Fmoc)]⁵-GnRH-III

Das Peptid wird auf einem Benzhydrylamin-Harz (0,65 Milliäquivalent/g Kapazität) unter Verwendung eines automatischen Peptid-Synthetisierers hergestellt. Die geschützte Aminosäure Boc-Glycin wird mit einem Überschuss von drei Äquivalenten, berechnet für die Kapazität des Harzes, verwendet; DIC als Kondensationsmittel und HOBt als Katalysator werden in Mengen verwendet, die der geschützten Aminosäure äquivalent sind. Die Kupplung des Boc-Gly-OH an das Harz dauert 12 Stunden. Danach wird die Vollständigkeit der Kupplung an das Harz mittels der Ninhydrin-Reaktion der Harz-geschützte Aminosäure-Verbindung kontrolliert. Die Kupplung von Boc-Gly-OH an das Harz ist gewöhnlich bei der ersten Kupplung vollständig; falls in einigen Fällen die Ninhydrin-Reaktion ein positives Ergebnis gibt (was anzeigt, dass die Aminogruppen des Benzhydrylamin-Harzes nicht voll substituiert sind), kann die Kupplung an das Harz durch Verwendung des symmetrischen Anhydrid-Verfahrens vollständig gemacht werden. (Bezogen auf die Gewichtszunahme beläuft sich die Kapazität des Harzes auf 75–80% des Kapazitätswertes, der von der Herstellungsfirma angegeben ist). Nach Abspalten und Neutralisation des Boc-Gly-BHA-Harzes auf die übliche Weise wird die Peptid-Synthese schrittweise gemäß dem folgenden Schema durchgeführt:

	Minuten
1. Dreimaliges Waschen mit Dichlormethan	2
2. Einmalige Spaltung mit einer Mischung mit einem 1 : 2-Volumenverhältnis von TFA und Dichlormethan	2
3. Einmalige Spaltung mit einer Mischung mit einem 1 : 2-Volumenverhältnis von TFA und Dichlormethan
4. Dreimaliges Waschen mit Dichlormethan	2
5. Dreimaliges Waschen mit Ethanol	2
6. Dreimaliges Waschen mit Chloroform	2
7. Zweimalige Neutralisation mit einer Mischung mit einem 1 : 9-Volumenverhältnis von Triethylamin und Chloroform	3
8. Zweimaliges Waschen mit Chloroform	2
9. Dreimaliges Waschen mit Dichlormethan	2
10. Zugabe der Boc-Aminosäure
11. Einmaliges Kuppeln mit Diisopropylcarbodiimid	120–300
12. Waschen mit Ethanol

Beim Abspalten der Boc-Schutzgruppe wird eine Mischung von 0,5 Gew.-% Indol mit 0,2 Vol.-% Thioanisol oder eine Mischung von 2 Vol.-% Anisol mit 0,2 Gew.-% L-Methionin zur Verhinderung von Nebenreaktionen verwendet. Geschützte Aminosäuren werden gewöhnlich unter Verwendung des Carbodiimid-Verfahrens gekuppelt, aber das Bop-Reagens wird für voluminöse Aminosäuren (mit hohem sterischem Bedarf) (z. B. Leu, Trp, Cpa) verwendet.
Im Fall einer positiven Ninhydrin-Reaktion wird die Kupplung nach der Carbodiimid-Kupplung mit symmetrischem Anhydrid oder mit BOP-Reagens nach BOP-Reagens-Kupplung durchgeführt. Im Lauf der Synthese werden eine Dimethylformamid- (DMF-) Lösung, die einen dreifachen Überschuss an Boc-Aminosäure, ein molares Verhältnis an DIC-Kupplungsmittel und HOBt-Katalysator, berechnet für 0,5 mMol BHA-Harz, enthält, in einer Reihenfolge gemäß der Sequenz verwendet. Im vorliegenden Beispiel wird die geschützte Aminosäure Boc-L-Lys (ε-Fmoc)-OH als Aminosäure in der Position 5 verwendet.
Mittels flüssigem HF werden die Schutzgruppen der Seitenketten und das Peptid vom Harz auf solche Weise entfernt, dass 0,25 mMol Peptid-BHA-Harz in 20–25 ml HF in Anwesenheit von 2,5 ml 10%-igem p-Kresol, das Anisol und 100 mg Dithiothreit enthält, 1 Stunde bei 0°C gehalten werden. Nach Entfernung von HF unter verringertem Druck und Behandlung des Rückstands mit absolutem Diethylether wird das Peptid in einer 15–33-vol.-%-igen Essigsäure-Lösung von dem festen Rückstand abgelöst. Im vorliegenden Fall wird das Hydrofluorid-Salz des Peptids durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-25-Säule in 33-gew.-%iger Essigsäure gereinigt, wodurch man 360 mg Rohprodukt mit einer chemischen Reinheit von 85% erhält. R_f2 = 0,5. Anschließend wird das Peptid unter Verwendung von Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie (MPLC) auf einer C18-Umkehrphase-Kieselgelsäule mit Gradientenlösungen gereinigt.
Beispiel 27
Herstellung von Lys⁵-GnRH-III
Nach Lösen von 240 mg rohem Peptidderivat-Zwischenprodukt in einer DMF-Wasser-Mischung im Verhältnis 1 : 1 werden 2 ml Piperidin unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser dazugegeben. Nach 2,5 Stunden wird die Mischung eingedampft, und der Rückstand wird in 33%-igen Essigsäure gelöst und auf einer Sephadex G-25-Säule gereinigt. Die Fraktionen werden mittels TLC untersucht, und das Hauptprodukt wird gesammelt. Das Rohprodukt wird unter Verwendung des MPLC-Verfahrens gereinigt.
Die Bedingungen der Säule umfassen: Prepex C-18 (25–40 μ, Phenomenex, USA); Säule: 400 mm (Länge) × 25 (Durchmesser); Eluent A: 70 Vol.-% 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung (pH 4,00) und 30 Vol.-% Methanol; B: 50 Vol.-% 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung (pH 4,00) und 50 Vol.-% Methanol.
Die Elution wird durch Gradientenelution mit einem Eluent durchgeführt, das aus den Lösungen A und B zusammengesetzt ist. Die reine Hauptfraktion wird gesammelt, dann von Salzen befreit und mittels Durchführung von Gradientenelution auf der obigen Säule gereinigt. Eluent A: 10% Essigsäure 400 ml; B: eine 80 : 20-Mischung von A und Isopropanol 400 ml. Die reinen Fraktionen werden gesammelt, und der Rückstand wird lyophilisiert, was 77 mg angestrebtes Produkts ergibt; R_f1 = 0,40, R_f2 = 0,15.
Beispiel 28
Herstellung von Lys⁵,cyclo[Asp⁶-Lys⁸]-GnRH-III

a) Das in Beispiel 26 beschriebene rohe Peptidderivat-Zwischenprodukt (120 mg) wird durch Lösen des Peptids in 6 ml Wasser und Zugabe von 2 ml 0,1 N Salzsäure in sein Hydrochlorid-Salz überführt. Nach Eindampfen der Lösung zur Trockne unter verringertem Druck werden 102 mg Hydrochlorid-Salz erhalten; R_f2 = 0,5.
b) Cyclisierung: Eine Lösung, die 29 mg Peptid-Hydrochlorid von Schritt 3(a) in 25 ml DMF enthält, wird auf 0°C abgekühlt, und 200 μl 1%-ige Natriumhydrogencarbonat-Lösung werden dazugegeben. Gleichzeitig werden 10 mg BOP-Reagens und 10 mg 1-Hydroxybenzotriazol in 5 ml DMF gelöst und langsam portionsweise zu der obigen wässrigen Lösung gegeben. Anschließend werden aus einer Vorratslösung, die 170 μl Diisopropylethylamin (DIEA) und 5 ml DMF enthält, 200 μl zu der Reaktionsmischung gegeben, die dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wird. Das gebildete Peptid-Zwischenprodukt (R_f2 = 0,6) wird ohne Isolierung der nächsten Umwandlung unterzogen.
c) Entfernung der Fmoc-Gruppe. Nach Eindampfen der Reaktionsmischung 3(b) unter verringertem Druck wird der Rückstand mit Ethylacetat digeriert und filtriert. Der Festkörper wird in 5 ml DMF gelöst, dann wird eine Mischung von 5 ml DMF mit 200 μl Piperidin dazugegeben, und die Reaktionsmischung wird unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 33-vol.-%iger Essigsäure gelöst und auf einer Sephadex G-25-Säule gereinigt. Die Fraktionen, die das Hauptprodukt enthalten, werden weiter unter Verwendung des MPLC-Verfahrens gereinigt.

Eluent A: 70 Vol.-% 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung und 30 Vol.-% Methanol; B: 30 Vol.-% 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung und 70 Vol.-% Methanol. Die reinen Fraktionen werden zweimal lyophilisiert, wodurch man 11 mg angestrebtes Produkts erhält. R_f2 = 0,35, R_f7 = 0,187.
Beispiel 29
Herstellung von Lys⁵,[Lys(ε-Fmoc)]⁸-GnRH-III
Man folgt dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren mit dem Unterschied, dass Boc-L-Lys(ε-Fmoc)-OH anstelle von Boc-L-Lys(ε-Z)-OH in der Position 8 der GnRH-III-Sequenz verwendet wird, wohingegen in Position 5 Boc-L-Lys(ε-Z)-OH anstelle von Boc-His(Tos)-OH als geschütztes Aminosäure-Derivat verwendet wird. Die Reinigung wird durch die Verwendung des Verfahrens von Beispiel 26 bewerkstelligt. Es wird ein Rohprodukt mit einer Ausbeute von 335 mg erhalten (mit einer chemischen Reinheit von etwa 80%). R_f2 = 0,55.
Beispiel 30
Herstellung von Lys⁴,[Lys(ε-Fmoc)]⁸-GnRH-III
Unter Verwendung von 1 mMol BHA-Harz folgt man dem Beispiel 26 mit dem Unterschied, dass Boc-Lys(ε-Fmoc)-OH als geschützte Aminosäure in Position 8 und Boc-Lys(ε-Z)-OH in Position 4 des Peptids verwendet werden. Nach Reinigung auf einer Sephadex G-25-Säule wird das rohe Peptid mit einer Ausbeute von 1,04 g mit einer Reinheit von 80% erhalten; R_f2 = 0,29.
Für die Reinigung wird eine Lösung, die 550 mg Rohprodukt in 20-vol.-%iger Essigsäure enthält, auf einer MPLC-Säule gemäß Beispiel 27 aufgetragen und zuerst mit 200 ml 20 vol.-%iger Essigsäure (isokratische Elution) eluiert und dann unter Verwendung von Gradientenelution mit jeweils 400 ml der folgenden Lösungen gereinigt: Lösung A: 20-vol.-%-ige Essigsäure. Lösung B: eine 3 : 1-Mischung von Lösung A und Isopropanol. Die Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert, was eine Ausbeute von 217 mg angestrebtem Produkts zum Ergebnis hat; R_f2 = 0,45, R_f7 = 0,18.
Beispiel 31
Herstellung von Lys⁴-GnRH-III
Zu einer Lösung von 200 mg des in Beispiel 31 erhaltenen rohen Peptids in 10 ml DMF wurden unter Kühlen mit Eiswasser 15 ml DMF gegeben, die 10% Piperidin enthielten. Eine Stunde später wird die Reaktionsmischung eingedampft, und der Rückstand wird unter Verwendung von MPLC und Gradientenelution mit 25%-iger Essigsäure bis zu einer 2 : 1-Mischung von 25%-iger Essigsäure und Methanol gereinigt. So werden 68 mg reines Produkts erhalten, das sich auf der Grundlage von TLC und HPLC-Analyse als einheitlich erwies; R_f1 = 0,5, R_f2 = 0,67, R_f3 = 0,05.
Beispiel 32
Herstellung von [Lys(i-Ac)]⁴-GnRH-III
Zu einer Lösung, die 200 mg des in Beispiel 31 erhaltenen rohen Peptids in 30 ml DMF enthielt, wurden DIEA und 130 mg Imidazol gegeben, dann wurde eine Mischung von 5 ml Dichlormethan (DCM) und 200 μl Essigsäureanhydrid tropfenweise unter Rühren und Kühlen dazugegeben. Nach einer Stunde wird die Reaktionsmischung unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Diethylether digeriert, der etherische Überstand wird dekantiert, und der Rückstand wird in 15 ml DMF gelöst. Dann werden 2 ml DMF, die 200 μl Piperidin enthalten, dazugegeben, und eine Stunde später dampft man ein. Der Rückstand wird in 20%-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung des MPLC-Verfahrens gereinigt. Die Elution wird unter Verwendung von Gradientenelution (zusammengesetzt aus 20%-iger Essigsäure und einer 6 : 4-Mischung von 10%-iger Essigsäure und Methanol) durchgeführt, was 70 mg reines Produkt ergab, das sich auf der Grundlage von TLC und HPLC-Analyse als einheitlich erwies; R_f2 = 0,067, R_f7 = 0,087.
Beispiel 33
Herstellung von Glu⁶-GnRH-III
Man folgt dem Beispiel 26 mit dem Unterschied, dass Boc-Gly(OChx)-OH als geschützte Aminosäure in der Position 6 der GnRH-III-Sequenz verwendet wird. Die Reinigung wird gemäß Beispiel 2 unter Verwendung von Gradientenelution in Ammoniumacetat-Pufferlösung bewerkstelligt. Charakteristische Werte des Produkts: R_f = 0,19, R_f7 = 0,086.
Beispiel 34
Herstellung von Cyclo[Asp⁶-Lys⁸]-GnRH-III
Nach Herstellung des Hydrochlorid-Salzes gemäß Beispiel 28 unter Verwendung des Neunauge-GnRH-III-Decapeptids als Ausgangssubstanz wird die Cyclisierung gemäß Beispiel 28 durchgeführt. Das Produkt wird gemäß Beispiel 27 gereinigt.
Beispiel 35
Herstellung von D-Ala¹⁰-GnRH-III
Man folgt dem Beispiel 26 mit dem Unterschied, dass anstelle von Boc-Gly-OH die geschützte Aminosäure Boc-D-Ala-OH als erste Aminosäure an das Benzhydrylamin-Harz gekuppelt wird. Die Reinigung wird gemäß Beispiel 27 bewerkstelligt.
Beispiel 36
Herstellung von H-D-Trp¹,[Lys(ε-Fmoc)]⁸,D-Ala¹⁰-GnRH-III
Man folgt Beispiel 26 mit dem Unterschied, dass in der GnRH-III-Sequenz Boc-D-Alanin als erste Aminosäure gekuppelt wird: im Fall von Lysin an Position 8 werden die geschützte Aminosäure Boc-Lys(ε-Fmoc)-OH und die geschützte Aminosäure Boc-D-Trp-OH an den N-Terminus des Decapeptids gekuppelt. Die Reinigung wird gemäß Beispiel 26 auf einer Sephadex-G-25-Säule bewerkstelligt. Das Zwischenprodukt-Derivat wird unter Verwendung von Gradientenelution gemäß Beispiel 26 gereinigt.
Beispiel 37
Herstellung von Ac-D-Trg¹,D-Ala¹⁰-GnRH-III
Von dem BHA-Harz mit dem geschützten Peptid, das gemäß Beispiel 36 hergestellt wurde, wird die Boc-Gruppe gemäß Beispiel 26 entfernt, dann wird das Peptid-BHA-Harz mit einem freien Amino-Terminus mit einer Mischung acetyliert, die Acetanhydrid und Imidazol enthält. Danach wird das angestrebte Peptid durch flüssiges HF gemäß Beispiel 1 abgespalten, die Schutzgruppe wird gemäß Beispiel 32 abgespalten, und das Produkt wird gemäß Beispiel 27 gereinigt.
Beispiel 38
Herstellung von H-D-Trp¹,D-Ala¹⁰-GnRH-III
Aus dem gemäß Beispiel 36 hergestellten geschützten Peptid-Zwischenprodukt wird die Fmoc-Schutzgruppe gemäß Beispiel 32 entfernt. Dann wird die Reinigung des Rohprodukts durchgeführt, indem man Beispiel 27 folgt.
Beispiel 39
Herstellung von [Trp(For-Ind)]^3,7-GnRH-III
Man folgte Beispiel 26 mit dem Unterschied, dass in Position 8 der GnRH-III-Sequenz Boc-Lys(ε-Z)-OH, in den Positionen 3 und 7 das geschützte Aminosäure- Derivat Boc-Trp(For-Ind)-H verwendet wurden. Die Reinigung wird durchgeführt, indem man Beispiel 26 folgt.
Beispiel 40
Herstellung von Phe⁷-GnRH-III
Man folgte dem Beispiel 26 mit dem Unterschied, dass Boc-Phenylalanin in Position 7 der GnRH-III-Sequenz verwendet wurde. Die Reinigung wird durchgeführt, indem man Beispiel 26 folgt.
Beispiel 41
Herstellung von GnRH-III(1-9)-ethylamid
Gemäß der GnRH-III-Sequenz wird die geschützte Aminosäure gekuppelt, indem man von 1,46 mMol Boc-Pro-Merrifield-Harz unter Befolgung von Beispiel 26 ausgeht. Das Peptid, das an seinen Seitenketten geschützt ist, wird von dem Harz abgespalten, indem man es mit einer 20 vol.-%igen Ethylamin-Lösung in DMF bei 10°C 48 Stunden lang rührt, R_f2 = 0,5.
Nach Verdampfen des DMF unter verringertem Druck wird der Rückstand mit Diethylether digeriert. Die Schutzgruppen der Seitenkette werden von dem rohen geschützten Peptid unter Verwendung von flüssigem Fluorwasserstoff gemäß Beispiel 26 entfernt. Das rohe Peptid wird zuerst auf einer Sephadex G-25-Säule gereinigt, gefolgt von Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie, was 215 mg des angestrebten Produkts ergibt, R_f2 = 0,31.
Beispiel 42
Herstellung von Lys⁵,D-Trp⁶-hGnRH
Indem man von 0,5 mMol BHA-Harz ausgeht und dem Verfahren von Beispiel 26 folgt, werden als geschützte Aminosäuren Boc-D-Trp-OH anstelle von Boc-Gly in Position 6 und Boc-L-Lys(ε-Z)-OH anstelle von Boc-L-Tyr(Bzl)-OH in Position 5 gemäß der Sequenz der Aminosäuren für Human-GnRH für die Synthese verwendet. Die Reinigung wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Sephadex G-25 durchgeführt. Die Gradientenelution wird mit jeweils 400 ml der folgenden Lösung durchgeführt: A: 70 Vol.-% 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung (pH 4,00) und 30 Vol.-% Methanol; B: 30 Vol.-% 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung (pH 4,00) und 70 Vol.-% Methanol. Die erhaltene Lösung wird dreimal lyophilisiert, um das Ammoniumacetat zu entfernen, was 52 mg des angestrebten Produkts ergibt; R_f2 = 0,34, R_f2 = 0,21.
Beispiel 43
Herstellung von Lys⁴,D-Trg⁶-hGnRH
Man folgt Beispiel 26 gemäß der Aminosäuresequenz von hGnRH mit dem Unterschied, dass in Position 6 Boc-D-Trp-OH verwendet wird und in Position 4 das geschützte Aminosäure-Derivat Boc-L-Lys(ε-Z)-OH anstelle von Boc-L-Ser(Bzl)-OH verwendet wird. Die Reinigung des Produkts wird auch gemäß Beispiel 42 durchgeführt, wodurch man 60 mg reines Produkt erhält.
Beispiel 44
Herstellung von H-Glu¹,D-Trp⁶-hGnRH
Man folgt Beispiel 26 gemäß der Aminosäuresequenz von hGnRH mit dem Unterschied, dass in Position 6 Boc-D-Trp-OH anstelle von Boc-Glycin verwendet wird, wohingegen in Position 1 das geschützte Aminosäure-Derivat Boc-L-Glu(OChx)-OH anstelle von Pyroglutaminsäure verwendet wird. Das Produkt wird gemäß Beispiel 42 gereinigt, außer dass nach der Gradientenelution mit Ammoniumacetat ein Schritt der Befreiung von Salzen eingeschoben wird, bei dem die Gradientenelution auf einer MPLC-Säule unter Verwendung von jeweils 300 ml der folgenden Lösungen durchgeführt wird: Lösung A: 20-vol.%-ige Essigsäure; Lösung B: eine 3 : 1-Mischung von Lösung A und Isopropanol. Die reinen Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert, was 54 mg des angestrebten Produkts ergibt; R_f1 = 0,29; R_f17 = 0,19.
Beispiel 45
Herstellung von Lys⁵,D-Phe⁵-hGnRH(1-9)-ethylamid
Gemäß Beispiel 41 wird Boc-Pro-Merrifield-Harz als Ausgangsmaterial verwendet, aber die Synthese wird gemäß der Sequenz von Human-GnRH durchgeführt, außer dass in Position 6 Boc-P-Phe-OH und in Position 5 Boc-Lys(ε-Z)-OH als geschützte Aminosäuren verwendet werden. Das Peptid wird von dem Harz abgespalten, indem man 8 Stunden bei 0°C in Ethylamin rührt, dann über Nacht bei Raumtemperatur rührt, während Ethylamin verdampft. Danach wird das geschützte Nonapeptidethylamid durch Waschen mit Methanol und DMF von dem Harz gelöst. Die erhaltene Lösung wird eingedampft, der Rückstand wird mit Ether digeriert, bis er sich verfestigt. Das erhaltene Produkt wird mit flüssigem HF gemäß Beispiel 26 behandelt, dann wird das Produkt durch das HPLC-Verfahren gemäß Beispiel 27 gereinigt.
Beispiel 46
Herstellung von Lys⁴,D-Phe⁶-hGnRH(1-9)-ethylamid
Man folgt Beispiel 45 mit dem Unterschied, dass Boc-Lys(ε-Z)-OH als geschützte Aminosäure in Position 4 verwendet wird.
Beispiel 47
Herstellung von Lys⁵,D-Cpa⁶-GnRH(1-9)-ethylamid
Man folgt Beispiel 45 mit dem Unterschied, dass anstelle von Boc-D-Phe-OH Boc-D-Cpa-OH als geschützte Aminosäure in Positon 6 verwendet wird.
Menschliche Zelllinien, die in den In-vitro-Experimenten verwendet werden
Die menschliche MCF-7-Mammakarzinom-Zelllinie wurde 1973 von Soule et al. [J. National Cancer Inst., 51, 1409–1416) aus der Flüssigkeit im Pleuraraum einer Patientin stabilisiert, die an Mammakarzinom litt. Die menschliche MDA-MB-231-Mammakarzinom-Zelllinie wurde von Cailleau et al. [J. National Cancer Inst., 53, 661–674] 1974 ähnlich aus der Flüssigkeit im Pleuraraum isoliert und stabilisiert. Beide Zelllinien wachsen in Monoschicht. Die menschliche MCF-7- und MDA-MB-231-Mammakarzinom-Zelllinie werden in Kunststoffkolben (Greiner) in flüssigem Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Nährmedium (DMEM, GIBCO), das 10% fetales Kälberserum enthält, aufrechterhalten. Die MCF-7-Zelllinie ist Estradiol-Rezeptor- (ER-) positiv, wobei sie Proteine enthält, die sich spezifisch an GnRH binden. So stellt sie ein nützliches Modellsystem für eine Untersuchung der direkten Wirkung von GnRH dar, die vom GnRH-Rezeptor vermittelt wird. Da sie ER-negativ und GnRH-Rezeptor-positiv ist, ist die MDA-MB-231-Zelllinie ähnlich für die Untersuchung der direkten Wirkung von GnRH geeignet. Die menschliche PC3-Prostatakarzinom-Zelllinie wurde von Kaighn et al. [Investigative Urology, 17, 16–23] 1979 in Zellkultur stabilisiert. Die Zellen sind vom epithelialen Typ und bilden kompakte Kolonien in klonogenen Assays. Die Ishikawa-Zelllinie stammt vom menschlichen Endometrium-Adenokarzinom ab [M. Nishida et al.: Acta Obstet. Gynecol. Jpn. 37, 1103–1111 (1985)], ihr Charakter ist epithelial und enthält Steroid- sowie GnRH-Rezeptoren.
Beispiel 48
Dosis-Überleben mit GnRH-Analoga bei der menschlichen MCF-7- MDA-MB-231-Mammakarzinom-, PC3-Prostata-Krebs- und Ishikawa-Endometrium-Tumorzellkultur
Die Überprüfung ergibt eine genaue Information über die Zell-schädigende Wirkung der getesteten Substanz als Funktion variierender Dosen. Die Behandlung wurde einmal durchgeführt; die Kolonien, die aus den überlebenden Zellen gebildet wurden, wurden nach 8–12 Tagen gezählt. Wenn Hormone verwendet wurden, waren die Substanzen im Allgemeinen nicht toxisch und besaßen den großen Vorteil, Zell- bzw. Rezeptor-spezifisch zu sein. GnRH-Analoga waren Phasen-spezifisch, sie hemmten die Zellen in der G0/G1-Phase, zerstörten sie aber nicht. Ein Teil der blockierten Zellen traten wieder in den Zyklus ein, ein anderer Teil derselben könnte zerstört weren (Apoptosis). Die Kolonien, die aus blockierten. Zellen gebildet wurden, erreichten nicht die zählbare Koloniengröße am Tag der Zählung der Kolonien (die Kolonienzahl kann identisch sein, die Koloniengröße kann nicht identisch sein). Im Fall einer Dosis-Antwort-Untersuchung wurden Kolonien, die weniger als 15 Zellen enthielten, nicht gezählt. Jeweils 300 Zellen wurden in eine Petri-Schale mit einem Durchmesser von 3,5 cm gegeben. Die Behandlung wurde einmal 24 Stunden nach dem Absetzen durchgeführt, dann wurden die gebildeten Kolonien nach 8–12 Tagen gezählt. Die Zellen wurden einmal nach 24 Stunden mit 1–50 μM verschiedener GnRH-Analoga der obigen Beispiele bzw. mit 1–50 μM GnRH-III behandelt. Die prozentuale Inhibierung, die bei MCF-7-, MDA-MB-231-, PC3- bzw. Ishikawa-Zellen erhalten wurde, sind zusammen mit der verwendeten Dosis des Wirkstoffs in Tabelle VIII gezeigt.
Auf der Grundlage dieser Untersuchungen hatte das bekannte synthetische GnRH-III-Peptid, wenn es in einer Dosis von 50 μM verwendet wurde, eine 45%-ige bzw. 49%-ige Inhibierung der Kolonienbildung der MCF-7- bzw. MDA-MB-231-Zellkultur zum Ergebnis. Eine derartige signifikante Inhibierung ist bis heute bei keiner Verwendung irgendeines GnRH-Agonisten (Ovurelin, Buserelin) oder selbst GnRH-Antagonisten (MI-1544) beobachtet worden. GnRH-III inhibierte die Ishikawa-Zelllinie innerhalb des verwendeten Dosisbereichs nicht und hatte nur eine 21%-ige Inhibierung der Kolonienbildung der PC3-Prostata-Zellkultur zum Ergebnis. Die Wirkung des GnRH-III-Peptids wurde durch die Verbindung des Beispiels 17 übertroffen, die eine Inhibierung von 65% bei MCF-7 und 63% bei MDA-MB-231 verursachte (siehe Tabelle VIII). Neben der Verbindung von Beispiel 42 erwiesen sich die Peptide von Beispiel 31 und 32 bei der MDA-MB-231-Mammakarzinom-Zellkultur am wirksamsten (35–42%) (Tabelle VIII). Bei der PC3-Prostatatumor-Zellkultur induzierte die Verbindung von Beispiel 8, verabreicht in einer Dosis von 50 μM, die stärkste Inhibierung (31%), wohingegen die Verbindungen 6 und 7 die kolonienbildende Fähigkeit der PC3-Zelllinie innerhalb des verwendeten Dosisbereichs nicht beeinflussten und die Verbindung 17 dieselbe schwach inhibierte (Tabelle VIII). Als sie in einer Dosis von 50 μM bei der Ishikawa-Endometriumtumor-Zellkultur verwendet wurden, wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: 13%-ige Inhibierung der Kolonienbildung durch Verbindung 3, 21%-ige durch Verbindung 6; 14%-ige durch Verbindung 8, 2%-ige durch Verbindung 8, 15%-ige durch Verbindung 17 und 24%-ige durch Verbindung 14.
In diesen Studien wurde das D-Trp⁶-hGnRH-Analogon (Sigma Co.), das üblicherweise in der Tumortherapie verwendet wird, als Kontrolle verwendet. Es erscheint aus den Daten von Tabelle VIII, dass unter den getesteten Analoga die Analoga der Beispiele 26 und 40 eine schwache Wirkung, falls überhaupt, zeigten. Die Analoga 14 und 19 zeigten etwa die Aktivität der Kontrolle. Andere Analoga (3, 6, 7 und 8) übertrafen die Inhibierungswirkung der Kontrolle; Analogon 17 hatte eine zweimal stärkere Inhibierung zum Ergebnis.
Beispiel 49
Inhibierung der Zellteilung von menschlichen Tumor-Zelllinien
Nachdem sie mit Trypsin behandelt worden waren, wurden jeweils 300 000 MCF-7-, MDA-MB-231- PC3- bzw. Ishikawa-Zellen in Petri-Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm überführt. Beginnend am Tag nach dem Absetzen wurden die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase mit 1–50 μM des GnRH-Analogons behandelt. Während des Experiments, das 5 Tage dauerte, wurden die Zellen jeden 2. Tag mit dem Peptid-Hormon behandelt, das in dem Nährmedium gelöst war, dann wurde die Zell-Zählrate am 6. Tag bestimmt.
Wenn es in einer Dosis von 30 μM verwendet wurde, übte GnRH-III sowohl bei MCF-7- als auch bei MDA-MB-231-Zellen eine Inhibierung von 35–40% aus. Auf der Grundlage dieser Untersuchungen induzierten Ovurelin oder Buserelin als hGnRH-Agonisten nach 6-tägiger Behandlung keine signifikante Änderung der Zellzählrate bei der ER-positiven MCR-7-Zelllinie (5–15% Inhibierung); wohingegen sie eine 25–30%-ige Inhibierung der Zellproliferation bei der ER-negativen MDA-MB-231-Zelllinie zum Ergebnis hatten.
Als es mit einer Dosis von 30 μM verwendet wurde, stimmte die Antiproliferations-Wirkung von GnRH-III mit der direkten Antitumor-Wirkung von bekannten GnRH-Antagonisten (Mamma-GnRH-Derivate, die mehrere D-Aminosäuren enthalten, MI-1892 und MI-1544) bei beiden Mammatumor-Zelllinien überein (Tabelle IX). Die Proliferations-inhibierende Wirkung der beiden Substanzen 6 und 7 war nahezu identisch (27–31%) mit der direkten Proliferations-inhibierenden Wirkung von GnRH-Antagonisten, die mehrere D-Aminosäuren enthalten (MI-1544, MI-1892, SJ-1004) (Tabelle IX)
Wie in Tabelle IX angezeigt, stimmte die Proliferations-inhibierende Wirkung der Substanzen, außer Verbindung 15, innerhalb gewisser Grenzen mit den Ergebnissen der Inhibierung der Kolonienbildung überein. Eine enge Korrelation besteht auch zwischen der Inhibierung der Kolonienbildung und der In-vivo-Wirksamkeit der Substanzen. Die Zusammensetzungen von bekannten Peptiden, die als Bezugssubstanzen verwendet wurden, sind wie folgt.
MI-1892:
Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,Lys⁵,[β-Asp(DEA)]⁶,D-Ala¹⁰-hGnRH
MI-1544:
Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa²,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰-hGnRH
[M. Kovács et al.: Peptides 10, 925–931 (1989)]
SJ-1004:
D-Phe²,D-Trp³,D-Lys⁶-hGnRH
GnRH-III:
pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH₂
Decapeptyl:
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂
Tabelle VIII Inhibierung der Kolonienbildung bei verschiedenen menschlichen Tumor-Zelllinien
Tabelle IX Inhibierung der Zellproliferation in menschlichen Tumor-Zelllinien durch GnRH-Analoga
Alle Patente oder Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, zeigen das Niveau des Fachmanns an, an den sich die Erfindung richtet. Diese Patente und Veröffentlichungen werden hierin durch Bezugnahme in dem gleichen Ausmaß aufgenommen, als wenn von jeder einzelnen Veröffentlichung speziell und einzeln angegeben wäre, dass sie durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Der Fachmann wird leicht erkennen, dass die vorliegende Erfindung gut angepasst ist, um die Gegenstände durchzuführen und die erwähnten Zwecke und Vorteile sowie diejenigen, die ihnen inhärent sind, zu erreichen. Die vorliegenden Beispiele sind zusammen mit den hierin beschriebenen Methoden, Verfahren, Behandlungen, Molekülen und speziellen Verbindungen derzeit für die bevorzugten Ausführungsformen repräsentativ, sind beispielhaft und sollen den Bereich der Erfindung nicht beschränken.

Claims

Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) Y(W_u,V_z,X_r,A_k) (I)in der Y die molekulare Einheit der Formel (Ia)
darstellt, in der n eine ganze Zahl von 10 bis 400 ist; eines von R₁ und R₂ ein Wasserstoffatom darstellt, während das andere eine Gruppe der Formel (B) darstellt;
R₃ eine Polymerisations-Initiierungsgruppe darstellt; W eine Hydroxylgruppe oder ein Salz derselben darstellt, welches mit einem Alkalimetallion gebildet ist; V eine C_1-8-Alkylaminogruppe, die durch ihre Aminogruppe gebunden ist, oder eine Valenzbindung darstellt; X eine "Abstandshalter"-Gruppe ist, bei der es sich um eine Aminosäuregruppe oder eine Oligopeptidgruppe mit höchstens sechs Gliedern handelt, wobei die Aminosäure oder die Oligopeptidgruppe durch ihren N-Terminus an die Gruppe Y gekuppelt ist und gegebenenfalls an ihrem C-Terminus eine Hydroxylgruppe oder eine Valenzbindung trägt, wobei die Aminosäuren Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Ahx, Pro, Arg oder His sind; A vorhanden ist und eine pharmakologisch aktive Polypeptid-Hormongruppe darstellt, die eine Aminogruppe enthält und direkt durch diese an die Gruppe Y gekuppelt ist, wenn r für 0 steht; bzw. an den C-Terminus der Gruppe X gekuppelt ist, wenn r größer als 0 ist; r eine ganze Zahl von 0 bis 0,2n ist; k eine ganze Zahl größer 0 und höchstens gleich r ist; z eine ganze Zahl von 0 bis (n – r) ist und u eine ganze Zahl von n bis 2n – r – z ist, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von Anspruch 1, in der R₃ eine (CH₃)₂CCN-Gruppe ist.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von Anspruch 2, in der: A ein natives Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH), das durch seine Aminogruppe gekuppelt ist, oder ein pharmakologisch aktives Analogon desselben darstellt; und k, r, u, z, X, Y, V und W wie in Anspruch 1 definiert sind, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von Anspruch 3, in der A pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH₂, Ac-D-Trp^1,3, p-Chlorphenyl-D-alanin²(D-Cpa²), D-Lys⁶, D-Ala¹⁰-GnRH, Ac-D-Trp^1,3-p-Chlorphenyl-D-alanin²(D-Cpa²), D-Lys⁵, [Asp(a-DEA)]⁶, D-Ala¹⁰-Gln⁸-GnRH, D-Phe², D-Trp³, D-Lys⁶, -GnRH, Lys⁵, Cyclo(Asp⁶-Lys⁸)-GnRH-III, Lys⁴, [Lys(e-Fmoc)]⁸-GnRH-III, Lys⁴-GnRH-III, D-Lys⁶-GnRH Lys⁵, D-Trp⁶-GnRH darstellt, die durch die e-Aminogruppe ihrer Lys-Seitenketten an X oder Y gekuppelt sind; und k, r, u, z, X, Y, V und W wie in Anspruch 1 definiert sind, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in der X eine Oligopeptidgruppe darstellt, die aus vier Gliedern besteht, und k, r, u, z, A, Y, V und W wie in Anspruch 1 definiert sind, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in der X eine Oligopeptidgruppe darstellt, die aus drei Gliedern besteht, und k, r, u, z, A, Y, V und W wie in Anspruch 1 definiert sind, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in der V eine C_4-6-Alkylaminogruppe ist.
Pharmakologisch aktive Verbindung der Formel (I) von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in der r für 0 steht, und k, u, z, A, Y, V und W wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert sind, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.
Verbindung der Formel (Ic) Y[W_uV'_z,(XOQ)_r] (Ic)die eine aktivierte Estergruppe enthält und in der Y die molekulare Einheit der Formel (I)
darstellt, in der n eine ganze Zahl von 10 bis 400 ist; eines von R₁ und R₂ ein Wasserstoffatom darstellt, während das andere eine Gruppe der Formel (B) darstellt; R₃ eine Polymerisations-Initiierungsgruppe darstellt, W eine Hydroxylgruppe darstellt, gegebenenfalls als ein Salz, das mit einem Alkalimetallion gebildet ist, V' für eine C_1-8-, bevorzugt C_4-6-Alkylaminogruppe steht, die durch ihre Aminogruppe gebunden ist, X eine Aminosäuregruppe oder eine Oligopeptidgruppe mit höchstens 6 Gliedern darstellt, die durch ihren N-Terminus an die Gruppe Y gekuppelt ist; OQ eine aktivierte Estergruppe am C-Terminus der Gruppe X darstellt, r eine ganze Zahl von 0 bis 0,2n ist; z eine ganze Zahl von 0 bis (n – r) ist und u eine ganze Zahl von n bis (2n – r – z) ist, sowie die Salze dieser Verbindungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Formel (I) von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, in der k, r, u, z, X, Y, V und W wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 definiert sind, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Komplex derselben in Mischung mit Trägern und/oder Zusätzen, die üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden.
Tumor-inhibierende pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Formel (I) von Anspruch 3 oder Anspruch 4 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Komplex derselben in Mischung mit Trägern und/oder Zusätzen, die üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden.
Tumor-inhibierende und immunstimulierende pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I), in der A für Ac-D-Trp^1,3,D-Cpa², Lys⁵, [Asp(a-DEA)]⁶, D-Ala¹⁰-Gln⁸-GnRH steht und k, r, z, u, X, Y, V und W wie in Anspruch 1 definiert sind, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Komplex desselben in Mischung mit Trägern und/oder Zusätzen umfasst, die üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden.