【発明の詳細な説明】
発明の名称 抗腫瘍効果を有する新しいＧnＲＨ同族体およ
びその医薬品組成物
発明の背景発明の分野
本発明は一般的には生化学的内分泌学および抗新腫瘍薬理学の分野に関するも
のである。より具体的には、本発明は抗腫瘍効果を有する新しいＧnＲＨ同族体
およびその医薬品組成物に関するものである。関連技術の説明
視床下部由来のこのファクター（10個のアミノ酸で形成されたペプチドホルモ
ン）が黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌に関
与していることは知られている。ＧnＲＨの多数のアゴニスティック（agonistic
）およびアンタゴニスティック（antagonistic）同族体は生殖生理（reproducti
on biology）に有益な影響を及ぼすだけでなく、抗腫瘍剤にも適していることが
分かっている。
ＧnＲＨ同族体は、化学的な去勢効果（Chemical castration：）ばかりでなく
、腫瘍細胞に対して直接作用することによって選択的な方法でも抗腫瘍効果を発
揮することができる。ヒト乳腺、前立腺、卵巣、および膵臓の癌の細胞培養で、
ＧnＲＨあるいはＧnＲＨ同族体とそれぞれ特種的に結合する受容体の存在、およ
びＧnＲＨ−mＲＮＡの存在が示された。さらに、同じ細胞系でＧnＲＨ同族体の
試験管内での増殖抑制作用が証明された。我々の実験で、ヒトＧnＲＨスーパー
ア
ゴニスト（super agonist）であるトリチウムでラベルしたＤ−phe６−ＧnＲＨ
（１−９）−エチルアミド（ＯＶＵＲＥＬＩＮ）のＭＣＦ−７およびＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−231ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株の細胞に対する特異的な結合性が実証された。
これらの結果は直接的な影響の基礎的な条件であるＧnＲＨ同族体に特異的に結
合する受容体が確実に存在していることを示している。同様に、治療的な実践で
用いられたアゴニステイックな同族体であるＤ−Ｔrp６−hＧnＲＨ（ＤＥＣＡＰ
ＥＰＴＹＬ）はＭＤＡ−ＭＢ−231腫瘍細胞株に関する受容体と、上に述べたヒ
ト乳腺腫瘍細胞に対する直接的な成長抑制効果を有していることが示されている
。
有効な濃度を前提として、ひとつあるいは複数の低親和性結合部位が直接的な
抗腫瘍効果を形成する上で重要な役割を果していることが考えられる。文献によ
れば、ＧnＲＨ同族体の直接的な抗腫瘍作用は、ペプチド濃度が比較的高い場合
だけ（10-6−10-5Ｍ）に起きる。この医薬的な効果は、体内で、活性的な分子が
高濃度であるだけでなく、長期に存在している場合だけ、達成することができる
。ＧnＲＨは、長い間、種に特異的なホルモンであると考えられていなかったが
、1980年代の初めにある種の魚類や鳥のゴナドリベリンの構造が、それぞれ、ほ
乳類のそれとは違っていることが知られるようになった。ほ乳類のＧnＲＨと比
較して、魚類および鳥類に特有のＧnＲＨは、それぞれ、アミノ酸位置７および
／または８において相違している。ほ乳類のＬＨおよびＦＳＨ
のそれぞれの放出に関連して、ヒヨコのＧnＲＨあるいはサケのＧnＲＨの同族体
は極度に活性を示すものではなく、したがって、それらは対応する用量範囲で脳
下垂体の性腺刺激ホルモン細胞の感作性を失わせるものではない。ほ乳類、例え
ばヒトのＧnＲＨの組成は以下のとおりである。
pＧlu−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｔyr−Ｇly−Ｌeu−Ａrg−Ｐro-Ｇly−ＮＨ2
1993年に、研究者たちはヤツメウナギからランプリー−III−ＧnＲＨデカペプ
チド（pＧly−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｈis−Ａsp−Ｔrp−Ｌys−Ｐro−Ｇly−ＮＨ2
）を分離、合成した。このランプリー−III−ＧnＲＨ（以下、ＧnＲＨ−III）は
、ヒト乳腺腫瘍細胞株に対するかなりの腫瘍成長抑制効果を発揮する。同時に超
溶融法を用いてネズミの脳下垂体に対するＧnＲＨ−IIIの内分泌効果に関する研
究で、このホルモンのＬＨ−放出効果がヒトＧnＲＨのそれと比較して数千倍弱
いことが見い出されている。生体内での研究の過程で、３つのサイクルに関する
長期間の措置の間に、高い用量の場合でも、雌のネズミの排卵を抑制しないこと
、したがって、感作性の喪失や化学的な去勢効果をもたらさないことが分かって
いる。それと関連して、措置の最初に発生する“フレアアップ（flair up）”腫
瘍成長は、同じ作用メカニズムを通じて作用する他の知られているヒトホルモン
同族体とは対照的に、腫瘍を持った動物においては現れなかった。したがって、
ＧnＲＨ−IIIは選択的な、非常に活性の高い抗腫瘍化合物である。
ペプチドホルモンおよびその合成同族体を治療目的で用いる際、しばしば出さ
れる要求は、薬学的に活性のある分子の量を高いレベルで、そして安定した状態
で保持するということである。したがって、例えば、10個のアミノ酸から構成さ
れ、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の脳下垂体か
らの放出を刺激するペプチドホルモンであるゴナドリベリン（ＧnＲＨ）のいく
つかの対抗する、および相反する合成同族体は、生殖生理に好影響を及ぼすプロ
セスに対してだけでなく、抗腫瘍剤としての利用の可能性も持っている。使用法
に応じて、ＧnＲＨおよびその同族体は、ゴナドトロピンの分泌を促進したり、
抑制したりすることができる。ＧnＲＨ同族体を用いて治療を繰り返し、または
長期間実行する場合、ゴナドトロピンおよびステロイド類の放出の著しい低下か
ら、脳下垂体に対して示される非感作化効果の結果として、いわゆる薬学的生殖
腺除去が誘発される。ステロイドに依存した生殖腺疾病の措置においては、生殖
腺除去は必要な治療的措置である。同時に、生殖腺除去は可逆的な措置で、患者
を精神的に阻害するものではない。これらの同族体は、最も新しいデータによれ
ば、前立腺、乳房、並びに子宮内腺の悪性腫瘍および膵臓と脳下垂体の癌に対し
てさえも有効であることが分かっている。合成ＧnＲＨは、天然ホルモンを競合
的に抑制する誘導体である。強力な拮抗因子（antagonist）の場合、位置１−３
，６および10のアミノ酸は通常、例えばＤ−構造など、コード表現されないアミ
ノ
酸に変換される。ＧnＲＨ拮抗因子の抗排卵効果は良く知られている。ＧnＲＨ同
族体は、その抗腫瘍作用を化学的去勢効果を通じてのみではなく、腫瘍細胞に対
する直接的な効果をを通じて発揮しているのかもしれない。Eideneら［J．Clin
．Endocrinol．Metab．64，423−432（1987）］は、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−
ＭＢ−231ヒト乳腺腫瘍の細胞培養物内に低親和性結合部位が存在していること
を示し、アンタゴニスティック同族体の直接的な抑制効果に基づいて、彼らはＧ
nＲＨが乳腺悪性腫瘍細胞においてオートクリン（autocrine）調整因子として振
る舞うという結論を導き出した。最も最近の文献で発表された結果は、授乳およ
び悪性転換中に同様に起きる、乳房悪性腫瘍細胞中でのＧnＲＨ遺伝子の表現を
確認している［Harrisら；Cancer Res．51，2577−2581（1991）］。新腫瘍組織
内におけるＧnＲＨ結合部位の存在は、ＧnＲＨが乳房悪性腫瘍を患っている患者
の治療において、一時的に症状を緩和させる効果を持っている可能性が非常に高
いことを裏づけている。ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株、あるいはそこから開発された
異種移植が、ＧnＲＨの直接的な作用を実証する上で、試験管内および生体内モ
デルシステムにおいて有益である。ＧnＲＨアゴニストは、物質形態で単独で投
与された場合、蛋白質分解により崩壊され、急速に消失してしまい、したがって
、直接的、または間接的な抗腫瘍効果の形成に必要な安定した、そして高いＧn
ＲＨ同族体レベルは達成することができない。腫瘍を抑制するた
めに必要な高い、そして安定したレベルの保持は、非常に高い頻度での投与の繰
り返し（１日数回程度）、あるいは長期間効果を示す薬学的組成物を用いること
によって達成される。現在までのところ、臨床的な実践においては、マイクロカ
プセルまたは微粒状のＧnＲＨ同族体が腫瘍抑制のために用い
効果を長期間にわたって保持するためにもうひとつの方法においては、薬学的
に活性を有する分子が体内からゆっくりと排出される分子（例えば、ポリマー）
と化学的に結合される。このようにして得られる共役物は生物学的システムにお
いてゆっくり拡散し、体内で分布と、その活性試薬の吸収特性を変えてしまう。
したがって、その薬学的に活性を有する分子の目標とする輸送と、望ましくない
副作用の抑制が達成される。
好ましい担体は水溶性の天然、または合成ポリマーであり、その例としては、
それぞれ合成ポリマーとしてのカルボン酸のホモポリマー、またはコポリマーで
ある。スチレン／マレイン酸無水物コポリマーの分子量は約1600〜2000Ｄの範囲
で、７〜８のスチレン／および部分的に加水分解またはエステル化されたマレイ
ン酸無水物単位で構成されており、新しい制癌剤の薬学的特性を改善するために
用いられて有効性を示した。このように、その活性剤の、体内におけるより好ま
しい分布およびその毒性の低下の両方が達成された［H．Maedaら：
J．Med．Chem．28，455−461（1985）］。
分子量が大きな多価陰イオン性巨大分子も、それ自体生物学的な活性（例えば
、抗腫瘍、免疫アジュバンド、およびインターフェロン誘発効果）を有している
かもしれない。しかしながら、その分子量、および分子量分布が重要な意味を持
つこと、つまり、分子量が増大するとその毒性も増大することが示された［L．G
ros：Encyclopedia ofPolymer Science and Technology，Vol．２，pp．243−26
7；およびG．Butler；J．Macromol．Sci．Chem．Ａ 13，351−368（1979）；お
よびR．Ottenbrite；ibid．Ａ 22．819−832（1985）］。
したがって、こうしたポリマーは良好な再現性、小さな多分散性（polydisper
sity）で調製でき、毒性がなく、体内から最善の速度で消失する担体分子と考え
ることができる。また、薬学的に活性のある分子が良好な再現性をもってこれら
のポリマーを結合して、水に対する適切な溶解性と望ましい薬学的活性を有する
生成物を得られることが重要である。
現在までのところ、ペプチドホルモンおよびこれらの内部でのＧnＲＨあるい
はＧnＲＨ同族体は、担体としての公知のポリカルボン酸と結合された事例は報
告されていない。ビニルピロリドンおよびマレイン無水物からつくられたコポリ
マーはハンガリア特許No.194,286に述べられている。これらのコポリマーは化粧
品としての利用を目的としてつくられたもので、それらは非常に有益な皮膚化粧
剤であり、親水性乳剤と疎水性乳剤の両方で用いることができる。添加される塩
基
の量にしたがって、それらの水溶液のpH値は広い範囲で変えることができ、高い
緩衝容量を有しており、狭い範囲の多分散性と良好な再現性で調製できる。ビニ
ルピロリドンとマレイン酸無水物単位は１：１のモル比で、交互に分子内に組み
入れられる。
以前、Ｎ−ビニル−ポリピロリドン／マレイン酸コポリマー（ＮＶＰ−ＭＡ）
の毒性、除去および体内分布については詳しく調べられて、以下のような発表が
行われた［M．Azoriら：Marcomol．Chem．187，287−302（1986）］。pH7.2のナ
トリウム塩の形態で（平均分子量が20,000の）ポリマーの腹膜内、および静脈内
投与によっては、最初の事例（i．p．）では体重１kgあたり900mg、そして第２
の事例（i．v．）では体重１kgあたり200mgの範囲まで、死亡は起こらなかった
。このことは、ＮＶＰ−ＭＡが同様の構造を有する他の多くの多価陰イオンより
毒性が低いことを示している。［同様の分子量を有するＬＤ50価のジビニルエー
テル／マレイン酸コポリマーを静脈注射する場合は74mg、ポリマレイン酸を静脈
注射する場合は110mg、そして、フラン／マレイン酸コポリマーを静脈注射する
場合は130mg］。14Ｃでラベルしたポリマー（平均分子量は8000）を用いて行っ
た体内分布では、このポリマーは脳および脊髄には入り込むことができないこと
が示された。このポリマーは主に尿内に排出され、導入された放射活性の84％が
24時間以内に除去されたのに対して、56時間後に導入された放射活性の合計95％
が尿と大便内で検出す
ることができた。ＮＶＰ−ＭＡおよびその公知の誘導体は現在までのところでは
治療に用いられていないが、その好ましい属性から考えれば、それらを毒性効果
なく体内に導入することは可能なようである。
先行技術は非常に多様な新腫瘍形成状態を抑制する有効な手段を欠いている点
で、不十分である。本発明はこの技術分野において長期にわたって続いているニ
ーズおよび願望に応えるものである。
発明の要約
本発明は一般式（Ｉ）で示される新しい、薬学的に活性を有する化合物、その
塩、および錯体と、それらを調製するためのプロセスに関するものである。一般
式（Ｉ）
Ｙ（Ｗu，Ｖz，Ｘr，Ａk） （Ｉ）
において、Ｙは一般式（Ｉa）で示される分子部分を意味しており：
ここで、ｎは10〜400の範囲、好ましくは20〜200の範囲の整数であり、Ｒ1とＲ2
のうちの一方は水素、そして他方は式（Ｂ）で示される基を示しており
Ｒ3は、重合開始基、好ましくは（ＣＨ3）2ＣＣＮ基を示しており；
Ｗは、オプションとしてアルカリ金属イオン、好ましくはナトリウムイオンで形
成された塩としての水酸基を示しており、
ＶはＣ1-8、好ましくはＣ4-6のアミノ基または原子価結合で結合されたアルキル
アミノ基であり；
ＸはＹ基のＮ−末端を通じて結合され、また、オプションとしてそのＣ−末端上
に水酸基あるいは原子価結合を有している最大６つの構成要素のアミノ酸基また
はオリゴペプチド基を示しており、上記アミノ酸はＧly，Ａla，Ｌeu，Ｉle，Ｖ
al，Ｐhe，Ｔyr，Ａhx，Ｐro，ＡrgまたはＨisであり、
Ａは、アミノ基を含んでおり、ｒがゼロの場合はそれを通じて上記Ｙ基に結合さ
れており、ｒが１以上の場合は、上記Ｘ基のＣ−末端に結合されている薬学的に
活性のあるポリペプチド基を示しており；
ｒは、０から0.2ｎの範囲の整数であり、
ｋは、最大の場合ｒと等しい整数であり、
ｚは、０から（ｎ−ｒ）の範囲の整数であり、そして
ｕは、ｎから２ｎ−ｒ−の範囲の整数で、これら化合物の塩および錯体である。
本発明は、さらに一般式（Ｉc）で示される新しい中間物に関するものであり
、
Ｙ［Ｗu，Ｖ′z，(ＸＯＱ)r］ （Ｉc）
ここで、Ｙは一般式（Ｉa）で示される分子部分を意味しており、ここでｎは10
〜400、好ましくは20〜200の範囲の整数であり、Ｒ1およびＲ2のいずれか一方は
水素原子を意味しており、他方は式（Ｂ）で示される基を意味しており；
Ｒ3は、重合開始基、好ましくは（ＣＨ3）2ＣＣＮ基を示しており；
Ｗは、オプションとしてアルカリ金属イオン、好ましくはナトリウムイオンで形
成された塩としての水酸基を示しており；
ＶはＣ1-8、好ましくはＣ4-6のアミノ基または原子価結合で結合されたアルキル
アミノ基であり；
Ｘは最大６つの構成要素を含む、そのＮ−末端を通じてＹ基に結合されているア
ミノ酸基またはオリゴペプチド基であり；
ＯＱは、上記Ｘ基のＣ−末端上の活性化されたエステル基、好ましくはＯＮp，
ＯＰcp，ＯＰfpあるいはＯＮＳu基を意味しており；
ｒは、０から0.2ｎの範囲の整数であり；
ｚは、０から（ｎ−ｒ）の範囲の整数であり；、そして
ｕは、ｎから（２ｎ−ｒ−ｚ）の範囲の整数で、これら化合物の塩である。
さらに、本発明は活性成分として一般式（Ｉ）で示される化合物を含んだ腫瘍
抑制および免疫刺激性医薬品組成物に関連している。一般式（Ｉ）で示されるバ
イオ接合体（bioconjugate）は選択的な腫瘍抑制効果を有しており、一般式（Ｉ
）で示される上記化合物の一部はステロイドに依存した腫瘍と、ステロイドとは
無関係な腫瘍、特に乳腺悪性腫瘍の成長を抑制する。一般式（Ｉ）で示される化
合物は薬学的に活性のある分子部分がより増強されたレベルで、そしてさらに長
い期間、その効果を示す。
本発明は抗腫瘍効果を有する新しいペプチド類、およびその塩およびエステル
類に関連している。抗エストロゲンに加えて、ゴナドトロピン放出ホルモン（Ｇ
nＲＨ）同族体はホルモンに依存した悪性腫瘍の措置において重要な役割を果す
。悪性腫瘍の内部で、その利用範囲は前立腺、乳房（乳腺）、子宮内膜、および
その他のホルモンに依存した腫瘍に及んでいる。本発明によれば、ヒト腫瘍細胞
培養物において抗腫瘍効果を示すヒトＧnＲＨ（hＧnＲＨ）およびランプリーＧn
ＲＨ−IIIの同族体の調製が可能である。この目的は一般式（IV）で示されるペ
プチド類、および薬学的に受け入れられる塩類およびエステル類の調製によって
解決された。
本発明は、これらの化合物がヒト腫瘍細胞に対して直接の抗腫瘍作用を示すと
いう認識に基づいている。予想されなか
ったことであるが、天然のＬアミノ酸だけを含んだ化合物も直接の抗腫瘍効果を
示す。つまり、現在の段階で知られている抗腫瘍ＧnＲＨ同族体は、アゴニスト
（agonist）の場合は非天然Ｄアミノ酸の少なくともひとつ、そして、アンタゴ
ニスト（antagonist）の場合は通常いくつかの非天然Ｄアミノ酸を含んでいる。
さらに、抗腫瘍ＧnＲＨ同族体のより多くのアミノ酸基の場合、Ｌys基を置換
しても、その分子の好ましい抗腫瘍効果はまったく減少しないことが知られてい
る。Ｌysのε−アミノ基を通じて、このペプチドが適切に選択された、アシル化
基を含んだより大型の分子と結合することができるので、このことは有利である
。この場合、この巨大分子はペプチドの担体分子である可能性があり、それによ
って、安定した、そして高いレベルのＧnＲＨ同族体を体内で保持する可能性を
高めることができる。
本発明は一般式（IV）で示されるペプチド類に関するものであり、
Ｘ−Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｒ5−Ｒ6−Ｒ7−Ｒ8−Ｐro−Ｒ10−Ｙ （IV）
ここで、
Ｘは、Ｒ1がpＧlyと異なる場合には水素、アセチル基、またはプロピオニル基
；そしてＲ1がpＧluと同じ場合は分子内酸アミド結合を示しており；
Ｒ1は、pＧlu，Ｇlu，Ｄ−Ｔrp，Ｄ−Ｃpa，Ｄ−Ｎalまた
はＤ−Ｐheに相当し；
Ｒ2は、Ｈis、Ｄ−ＰheまたはＤ−Ｃpaを意味し；
Ｒ3はオプションとしてはインドリル分子部分上で保護されているＤ−Ｃpa，
Ｄ−ＰalあるいはＬまたはＤ−Ｔrpを示し、
Ｒ4は、Ｓer；またはオプションとしてε−アミノ基上に保護されたＬysに相
当し；
Ｒ5は、Ｔyr；またはオプションとしてε−アミノ基上に保護されたＬys；ま
たはＨisを意味しており；
Ｒ6はＡsp，Ｇlu、Ｄ−Ｌysおよびオプションとしてそれらのε−アミノメチ
ル化誘導体およびＤ−Ｔrp，Ｄ−Ｐhe，Ｄ−Ｌeu，Ｄ−Ａla，Ｄ−Ｃpaあるいは
Ｄ−Ａrgを示し；
Ｒ7は、Ｐhe，Ｌeu、またはＮ−Ｍe−Ｌeu、またはオプションとしてインドリ
ル分子部分上に保護されたＬ−Ｔrpを示しており；
Ｒ8は、オプションとしてε−アミノ基上に保護されたＬys，Ａrg，Ｇlnを示
しており；また、Ｒ6とＲ8は、Ｒ6がＡspでＲ8がＬysを示している場合、Ｌysの
ε−アミノ基を通じて分子内環を形成することができ；
Ｒ10はＧly，Ｄ−Ａla、または原子価結合を示しており、
そして
Ｙは、Ｒ10がＧlyまたはＤ−Ａlaを示す時はＯＨまたはＮＨ2を示し；Ｒ10が
原子価結合を示す場合はエチルアミド基、およびそれらの化合物の薬学的に受け
入れられる塩類または
エステル類を示している。本発明はさらに、一般式（IV）で示されるペプチドお
よび／または薬学的に受け入れられるそれらの塩および／またはエステル類を含
んだ医薬品組成物に関するものである。
説明で用いられている略語はペプチド化学で用いられ、J．Biol．Chem．241，
527（1966）；247，977（1972）に発表されているものと同じで、Ｄ−Ｎalはβ
−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニンに相当し、Ｄ−Ｃpaはｐ−クロロフェニル−
Ｄ−アラニンを意味し、Ｄ−Ｐalはβ−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニンに相当
している。特に別の注記がない限り、説明で用いられているすべてのアミノ酸は
Ｌ構造である。
本発明によるペプチドにおいては、Ｔrpのインドリル分子部分の好ましい保護
基はＦorであり、Ｌysのε−アミノ基の好ましい保護基はＦmocである。一般式
（IV）で示されるペプチド類の薬学的に受け入れられる塩類は薬学的に受け入れ
可能な有機酸または無機酸、例えばアセテートあるいは塩酸塩などで形成された
酸付加塩である。
一般式（IV）で示される化合物はペプチド化学で知られている方法（適切に保
護されたアミノ酸またはそれからつくられた断片の濃縮を決められた手順で行う
による）を用いて、あるいは別の好ましい方法で−−固体相ペプチド合成を用い
て−−液相内で調製することができる。その塩の形態で得られるペプチドは、公
知の方法で他の塩に転換することができる。望むなら、得られるエステル化合物
のエステル基を切断
切断することも可能である。
一般式（IV）で示されるペプチドは、主に、注射可能な溶液、静脈への注入、
あるいは鼻腔内用組成物の形態で投与することができる。消化系で分解されるの
で、それ自体を経口で投与することはできないが、他のルートで投与することが
できる。注射は筋肉、静脈、あるいは皮下のいずれの形態ででも行うことができ
る。
一般式（IV）の活性剤は薬学技術で知られている方法を用いて医薬品組成物に
調製することが可能である。この活性剤は通常の方法で（例えば、マイクロカプ
セルや微粒などの形態で）作用期間の長い組成物に変えることができる。この活
性剤に加えて、注射目的のために有益な媒体（等張食塩水やリン酸緩衝液など）
など、医薬品業界で一般的に用いられている補助剤を用いることも可能である。
必要であれば、その組成物は安定剤（アスコービック酸など）を含んでいてもよ
い。
本発明によるペプチド類の製剤は以下の例で示される。中間製品と最終製品の
両方の化学的な純度、および表示は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて
コントロールし、最終的な製品におけるそれら指標はＨＰＬＣクロマトグラフィ
ーを用いて調べられた。
薄層クロマトグラフィーの値は、下記の溶媒混合物を用いてキーセルゲル（Ki
eselgel）シート（ＤＣ Alufolien，Merck）で測定した。
１. エチルアセテート／ピリジン／水／酢酸 15：20：６：11
２. エチルアセテート／ピリジン／水／酢酸 30：20：６：11
３. エチルアセテート／ピリジン／水／酢酸 60：20：６：11
４. エチルアセテート／ピリジン／水／酢酸 120：20：６：11
５. エチルアセテート／ピリジン／水／酢酸 240：20：６：11
６. ｎ−ブタノール／酢酸／水 ４：１：１
７. ｎ−ブタノール／酢酸／水 ４：１：２
保護されたアミノ酸の側鎖は、ＴyrおよびＳerの場合はベンジル基によって、
Ｌysの場合は中間的ペプチド同族体をつくる目的で（ベンジロキシ）カルボニル
（Ｚ）基、あるいは９−フルオレニル（メトキシカルボニル）（Ｆmoc）基で、
Ａrgの場合はトシル（Ｔos）基で、そしてＡspおよびＧlueのカルボキシ基の場
合はシクロヘキシル（Ｃhx）基でそれぞれ保護されている。
本発明を、以下に示す好ましい同族体の調製プロセスを説明することでより詳
細に示す。
１. [Ｌys(ε−Ｆmoc)]5−ＧnＲＨ−III，
２. Ｌys5−ＧnＲＨ−III，
３. Ｌys5，cyclo[Ａsp6−Ｌys8]−ＧnＲＨ−III，
４. Ｌys5，[Ｌys(ε−Ｆmoc)]8−ＧnＲＨ−III，
５. Ｌys4，[Ｌys(ε−Ｆmoc)]8−ＧnＲＨ−III，
６. Ｌys4−ＧnＲＨ−III，
７. [Ｌys(ε−Ａc)]4−ＧnＲＨ−III，
８. Ｇlu6−ＧnＲＨ−III，
９. cyclo[Ａsp6−Ｌys8]−ＧnＲＨ−III，
10. Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−III，
11. Ｈ−Ｄ−Ｔrp1，[Ｌys(ε−Ｆmoc)]8，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−III，
12. Ａc-Ｄ−Ｔrp1，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−III，
13. Ｈ−Ｄ−Ｔrp1，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−III，
14. [Ｔrp(Ｆor−Ｉnd)]3,7−ＧnＲＨ−III，
15. Ｐhe7−ＧnＲＨ−III，
16. ＧnＲＨ−III(１−９)−エチルアミド，
17. Ｌys5，Ｄ−Ｔrp6−hＧnＲＨ，
18. Ｌys4，Ｄ−Ｔrp6−hＧnＲＨ，
19. Ｈ−Ｇlu1，Ｄ−Ｔrp6−hＧnＲＨ，
20. Ｌys5，Ｄ−Ｐhe6−hＧnＲＨ(１−９)−エチルアミド，
21. Ｌys4，Ｄ−Ｐhe6−hＧnＲＨ(１−９)−エチルアミド，
22. Ｌys5，Ｄ−Ｃpa6−hＧnＲＨ(１−９)−エチルアミド，
ＰＨＬＣを用いての、重要性の高いいくつかの同族体の容量ファクターを調べ
たところ、以下の結果が得られた。
ＩＳＣＯモデル2350ポンプ １ml/min，ＩＳＣＯ Ｖ４デテクタ（215nm）。
カラム：ＢＳＴ，ＯＤＳハイパーシル５μm、270×４mm
流出液：ＭeＯＨ/0.1 Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（pH＝2.22）
開示のために示される本発明の現段階での好ましい実施例についての説明を参
照することによって、本発明の他の、さらに詳細な側面、特徴、そして利点が明
らかになるであろう。
本発明の詳細な説明
説明で用いられている略語はペプチド化学で用いられ、J．Biol．Chem．241，
527（1966）；247，977（1972）に発表されているものと同じで、Ｄ−Ｎalはａ
−（２−ナフチル）−Ｄ−５−アラニンに相当し、Ｄ−Ｃpaはｐ−クロロフェニ
ル−Ｄ−アラニンを意味し、Ｄ−Ｐalはａ−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニンに
相当している。特に別の注記がない限り、説明で用いられているすべてのアミノ
酸はＬ構造である。
一般式（Ｉ）で示される新しい化合物は、薬学的に活性なポリペプチド、好ま
しくはＧnＲＨ同族体を以下のような方法で、一般式（Ｉａ）で示される分子に
結合させることによってつくることができる。ａ）遊離アミノ基を含んでいる薬
学的に活性な化合物を一般式（Ｉｂ）で示される、それ自体は知られているもの
の、現在までの段階では治療のために用いられていない、Ｎ−ビニルピロリドン
／マレイン酸無水物コポリマーに結合させる。
ここで、Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は一般式（Ｉａ）の場合と同様である。ｂ）一般
式（Ｉｂ）で示される化合物を一般式（III）のアミノ酸またはオリゴペプチド
の活性化されたエステルと
反応させ
Ｈ−Ｘ−ＯＱ （III）
次に、この薬学的に活性のあるポリペプチド類をその活性化されたエステル基を
使って得られる一般式（Ｉc）の担体化合物に結合する。こうして得られた化合
物はpH値が7.2の塩、好ましくはナトリウム塩に転換される。
一般式（Ｉ）に現れる薬学的に活性のある分子（Ａ）は好ましくはアゴスティ
ックまたはアンタゴニスティックＧnＲＨ同族体である。一般式（Ｉ）で示され
る化合物のＸ基は天然、または非天然アミノ酸で構成される最大６つの構成要素
によるアミノ酸基またはオリゴペプチド基を意味している。これらは、ペプチド
化学で公知のプロセスを用いてつくることができる。
本発明は以下の認識に基づいている。
1. 対応する薬学的に活性を有するペプチドホルモン、特にＧnＲＨ同族体と
比較して、そのペプチドホルモン分子の本来の効果との関連で、一般式（Ｉ）で
示される化合物がより増強された効果をより長い時間示すことができる。
2. Ｘ、つまりｒがゼロ以外のスペーサー基を含んでいる一般式（Ｉ）で示さ
れる化合物は、Ｘ基を含んでいない化合物より好ましい効果を示す。同時に、Ｘ
基を含んでいるこれらの化合物、あるいはＸ基を持たないこれらの化合物は、毒
性副作用を示さない。そして、これらの化合物は薬学的に活
性のあるポリペプチド分子Ａのすべての効果を保持している。
3. ＡがペプチドホルモンのＬys基の側鎖のアミノ基を通じて結合されている
式（IIa）のＧnＲＨ同族体を示しており、Ｙ，Ｗ，Ｖ，Ｘ，ｒ，ｋ，ｚおよびｕ
が一般式（Ｉ）で定義されているような場合の、一般式（Ｉ）で示される化合物
は、その同族体（IIa）、つまり、Ｇlp−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｈis−Ａsp−Ｔrp
−Ｌys−Ｐro−Ｇly−ＮＨ2；ＭＩ−1544；Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa2，Ｄ−
Ｌys6，Ｄ−Ａla10などの公知の薬学的効果と同等、あるいはそれを上回る効果
を保持する腫瘍抑制化合物であり、したがって、それらはステロイド依存型、お
よびステロイド非依存型両方の腫瘍の成長を抑止する。加えて、それらは可逆的
な化学的去勢効果を示し、ステロイド依存型の場合の抗腫瘍作用を増強する。
4. Ａが式（IIb）で示されるＧnＲＨアンタゴニスト同族体、つまり、ＭＩ−
1892：位置５でリシンのｎ−アミノ基を通じて結合されているＡc−Ｄ−Ｔrp1,3
，Ｄ−Ｃpa2，Ｌys5，[Ａsp(′−ＤＥＡ)]6，Ｄ−Ａla10−（Ｇln8-ＧnＲＨ）で
あり、Ｙ，Ｗ，Ｖ，Ｘ，ｒ，ｋ，ｚおよびｕが一般式（Ｉ）で定義されている通
りである場合の、一般式（Ｉ）で示される化合物は、そのアンタゴニスティック
な性質により選択的な腫瘍抑制剤となり、したがって、それらはステロイド依存
型とステロイド非依存型の両方のタイプの腫瘍の成長を、実際上、式（IIb）の
化合物の影響を上回る程度まで抑制する能力を有している。式（IIb）のアンタ
ゴニストと一般式
（Ｉ）で示されるその誘導体は非可逆的な化学的去勢効果を示し、この方が、そ
の選択的な直接的腫瘍抑制効果と結びつけて考えれば、腫瘍抑制の観点から見て
、より好ましいといえる。予想外のことであるが、式（IIb）のアンタゴニスト
も免疫システムを刺激する効果を持っており、この効果は一般式（Ｉ）の誘導体
によっても保持されているものであることが分かっている。現在までに知られて
いる腫瘍抑制作用を有するＧnＲＨアンタゴニストの治療目的のための利用が、
その免疫抑制作用の故に実現されなかったことを考えると、これは驚くべきこと
である。
5. Ａが位置８のリシン分子部分のｎ−アミノ基を通じて結合されたヤツメウ
ナギのＧnＲＨ−IIIに相当し、Ｙ，Ｗ，Ｖ，Ｘ，ｒ，ｋ，ｚおよびｕが一般式（
Ｉ）で定義されている通りである一般式（Ｉ）の化合物は生体内状態で選択的な
腫瘍抑制剤であり、したがって、それらは、ＧnＲＨ−IIIだけが無視できる程度
の生体内効果を示すという事実があるにもかかわらず、ステロイド依存型および
ステロイド非依存型両方の腫瘍の成長を抑止する。ＧnＲＨ−IIIの一般式（Ｉ）
の接合体（conjugate）は、抑制された放出hＧnＲＨ組成物の効果を上回って、
措置期間中実験動物に腫瘍のない状態をもたらし、公知の組成物を用いた場合、
腫瘍成長の低下だけが観察された。本発明による一般式（Ｉ）の最も好ましい化
合物は、式（IIa）−（IIi）の以下のＧnＲＨ同族体：ヒトＧnＲＨ（以下単にＧ
nＲＨと記載）を接合することによって
つくられる：Ｇlp−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｔyr−Ｇly−Ｌeu−Ａrg−Ｐro−Ｇly−
ＮＨ2；ヒヨコＧnＲＨ（以下、Ｇln8−ＧnＲＨ）：
Ｇlp−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｔyr−Ｇly−Ｌeu−Ｇln−Ｐro−Ｇly−ＮＨ2；ヤ
ツメウナギＧnＲＨ（以下、ＧnＲＨ−III）：
Ｇlp−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｈis−Ａsp−Ｔrp−Ｌys−Ｐro−Ｇly−ＮＨ2；Ｍ
Ｉ−1544：ヒトＧnＲＨの式（IIa）のアンタゴニスト同族体であるＡc−Ｄ−Ｔr
p1,3，Ｄ−Ｃpa2，Ｄ−Ｌys6，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ；
ＭＩ−1892：Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa2，Ｌys5，[Ａsp(′−ＤＥＡ)]６，
Ｄ−Ａla10−（Ｇln8−ＧnＲＨ）；ヒヨコＧnＲＨの式（IIb）のアンタゴニスト
同族体；
ＳＪ1004：Ｄ−Ｐhe２，Ｄ−Ｔrp３，Ｄ−Ｌys６−ＧnＲＨ；ヒトＧnＲＨの式
（IId）のアンタゴニスト同族体；
ＴＨ−614：Ｌys5，cyclo（Ａsp6−Ｌys8）−ＧnＲＨ−III；ヤツメウナギＧn
ＲＨ−IIIの式（IIe）の同族体；
ＨＢ−694：Ｌys4，[Ｌys（nＦmoc）]8−ＧnＲＨ-III；ヤツメウナギＧnＲＨ
−IIIの式（IIf）の同族体；
ＴＨ−602：ヤツメウナギＧnＲＨ−III；上記式を参照；式（IIc）のＧnＲＨ
；
ＨＢ−685；Ｌys４−ＧnＲＨ−III；ヤツメウナギＧnＲＨ−IIIの式（IIg）の
同族体；
ＴＨ−609；Ｄ−Ｌys６−ＧnＲＨ；ヒトＧnＲＨの式（IIh）
の同族体；
ＴＨ−615：Ｌys５，Ｄ−Ｔrp６−ＧnＲＨ；ヒトＧnＲＨの式（IIi）の同族体
；
ＧnＲＨ同族体は、直接またはＸグループ、つまりスペーサ部分を通じてＰと
して表わされるポリマーに結合された。上記各スペーサに名前をつけるために、
一文字マークのアミノ酸が使用される、例えば、Ｈ−ＧＦＬＧ−ＯＨ：Ｈ−Ｇly
−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly−ＯＨ（ナトリウム塩の形態をしたペプチド）；Ｐ：ポリビ
ニルピロリドン／マレイン酸コポリマーナトリウム塩、つまり式（Ｉd）の塩で
、ここで、Ｒ1とＲ2の１つは水素を意味し、もう一方はグループ（Ｂ）であり、
ｎは66、ＮaＨＣＯ3の同等物ｎによってナトリウム塩に変えられる。
次の物質の生物学的研究が行われた：
Ｐ−ＧＬＧ−1892：一般式（Ｉ）の化合物、ここでＸ＝−ＧＬＧ−部分を通じて
Ｙ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIb）グループ；それぞれ、ｎ＝66，ｒ＝
0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ，ｚ＝０，ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.2；Ｐ−
ＧＦＬＧ−1544：一般式（Ｉ）の化合物，ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分を通じ
てＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIa）グループ；それぞれ、ｎ＝66，ｒ
＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ，ｚ＝０、ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.2；
Ｐ−1892：一般式（Ｉ）の化合物，ここで、Ａ＝（IIb）グループで、それぞ
れ、ｎ＝66，ｒ＝０，ｋ＝0.024ｎ，ｚ
＝０，ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−1892：一般式（Ｉ）の化合物，ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分
を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIb）グループ；それぞれ、ｎ＝
66，ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ，ｚ＝０，ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.
2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−609：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、20Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部
分を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIh）グループ；それぞれ、ｎ
＝66，ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝
7.2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−1004：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、25Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部
分を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IId）グループ；それぞれ、ｎ
＝66、ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝
7.2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−614：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分
を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIc）グループ；それぞれ、ｎ＝
66，ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.
2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−685：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分
を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIg）グループ；それぞれ、ｎ＝
66，ｒ＝0.1ｎ，ｋ
＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−602：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分
を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（ＧnＲＨ−III）グループ；それ
ぞれ、ｎ＝66，ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯ
Ｎa，pH＝7.2；
Ｐ−ＧＦＬＧ−615：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分
を通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIi）グループ；それぞれ、ｎ＝
66，ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.
2；
Ｐ−ＦＬＧ−892：一般式（Ｉ）の化合物、ここで、Ｘ＝−ＧＦＬＧ−部分を
通じてＹ＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIb）グループ；それぞれ、ｎ＝66
，ｒ＝0.1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.2
；
Ｐ−Ａhx−1892：一般式（Ｉ）の化合物，ここで、Ｘ＝−Ａhx部分を通じてＹ
＝（Ｉa）グループと結合するＡ＝（IIb）グループ；それぞれ、ｎ＝66，ｒ＝0.
1ｎ，ｋ＝0.3ｒ；ｚ＝０；ｕ＝1.9ｎ，Ｗ＝ＯＨまたはＯＮa，pH＝7.2。
以下の物質および方法を用いて、生物学的なテストが行われた。ある種のヒト
乳腺悪性腫瘍細胞株、あるいはそれからつくられた異種移植（xenograft）はそ
れら接合体の生物学的なテストにとって有益である。
ヒトの細胞株が生体内の実験で用いられた。ＭＣＦ−７ヒト乳腺腫瘍細胞株は
、1973年にSouleらによって乳腺悪性腫瘍患者の胸膜液から安定化（stabilize）
されたものである。この細胞は単層で成長し、その性格においては上皮性である
。ＭＤＡ−ＭＢ−231ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株はCaileauらによって、1974年に同
様に胸膜液から分離され、安定化された。これらの細胞も単層で成長する。ＰＣ
３ヒト前立腺悪性腫瘍細胞株は1979年にKaighnらによって確立されたもので、こ
れらの細胞は単純な上皮性のもので、クロノジェニック（clonogenic）アッセイ
で小さなコロニーを形成した。ヒト子宮内膜の腺悪性腫瘍からつくられたIshika
wa細胞株［Nishidaら、Obstet．Gynecol．Jpn，37，25 1103−1111（1985）］
は、上皮性の性質を持っており、ステロイド、およびＧnＲＨ受容体を含んでい
る。ヒト腫瘍細胞株プラスティックフラスコ（Greiner）内でダルベッコ修正イ
ーグル−ＭＥＭ（ＤＭＥＭ ＧＩＢＣＯ）栄養性培養液内で保持される。ここで
用いられた培養液は10％の仔ウシ胎児血清（ＰＣＳ）を含んでいた。
ＭＣＦ−７細胞株はエストラジオール受容体（ＥＲ）ポジティブであり、かつ
ＧnＲＨ受容体ポジティブである。したがって、それは受容体を媒介とするＧnＲ
Ｈの直接的効果を研究するのに適しており、生体内モデルシステムであるから、
それはＧnＲＨの直接的影響と間接的影響の両方を調査する上で有益である。ま
た、試験管内および生体内モデルシステ
ムにおいてＥＲ−ネガティブおよびＧnＲＨ受容体ポジティブであるので、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−231細胞株はＧnＲＨの直接的な影響を調べるのに有益である。文献デ
ータによれば、ＰＣ３ヒト前立腺悪性腫瘍細胞株はＧnＲＨと特異的に結合する
受容体を含んでいるので、それによって、直接的な影響を発揮するための基本的
な条件が満たされている。Ishikawa細胞株はヒト子宮内膜からのものであり、Ｅ
ＲおよびＰgＲ蛋白質を含んでおり、そして、ＧnＲＨ受容体ポジティブである。
したがって、それはＧnＲＨの直接的な影響を調べるのに有益である。化学的に
［Ｄ−Ｓer（tＢu）］６，desＧly10−hＧnＲＨ（１−９）ＥＡと表現されるBus
erelinは、臨床的な実践で作用の発現を緩和した形態で用いる腫瘍抑制性アゴニ
ストであり、試験管内実験ではその物質だけでなく、その作用が緩和された形態
で用いられた。
公知のポリマー担体の調製と一般式（Ｉ）の化合物、および一般式Ｘのスペー
サーの調査は以下の通り行われた。
ここで用いられたＮＶＰ−ＭＡサンプルは文献［Boreddyら：Polymer 25，115
−120（1980）］に従って調製された。スペーサーとして用いられたオリゴペプ
チドの活性化エステルは好ましくはペプチド化学の標準的な方法を用いて得られ
たニトロフェニルエステルである。ペプチドのポリマーへの結合はジメチルスル
フォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、あるいはジメチ
ルアセトアミドなどの溶媒中で行うことができる。ＤＭＦが溶媒として用いられ
た。
ペプチド類のニトロフェニルエステルはアミノ酸分析によって特徴づけられた
。対照とされた保持ファクターは以下の形成系（developing system）を用いてK
ieselge160 Ｆ254上で判定された。
1. ピリジン：酢酸：水：酢酸エチル 20：６：12：62
2. クロロフォルム：メタノール：水 10：５：１
Ｃ−18逆相カラム上で、0.5ml/minの流量で、以下の要素を用いて高圧液体グ
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検査が行われた；
流出液Ａ：５％アセトニトリル＋95％トリメチルアミン−フォスフェート緩衝液
（pH：2.25）
流出液Ｂ：80％アセトニトリル＋20％トリメチルアミン−フォスフェート緩衝液
（pH：2.25）；100％の流出液Ａを５分目まで；流出液60％までを10分目まで、
流出液Ａの35％までを30回目の25分単位まで；流出液Ａの０％までを35分目まで
；流出液の０％を40分目まで；そして流出液Ａの100％を45分目まで。検出は紫
外線検出器を用いて280nmで行われた。接合体はＡＭＩＣＯＮＰＭ10薄膜上で限
外ろ過によって精製された。
この新しい化合物の結果上の利点は以下のように要約することができる。試験
管内試験の結果に基づけば、ＧＦＬＧテトラペプチドスペーサ基を含んでいる接
合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1544およびＰ−ＧＦＬＧ−1892の増殖およびコロニー形成抑
制効果は、ＧnＲＨ同族体物質（すなわち、ＭＩ−1544またはＭＩ−1892）の抗
腫瘍性効果、およびスペーサ含有担体（Ｐ−ＧＦＬＧ−ＯＨ）の同じ効果、そし
て化合物Ｐ−1892の同効果さえをも上回っている。この接合体（すなわち、担体
およびＧnＲＨ同族体で構成された化合物）は20μMの濃度以上で100％のコロニ
ー形成抑止効果を示した。こうした高いレベルの抑止効果は、現在までのところ
、シトスタティックス（cytostatics）を用いてのみ達成することができたもの
である。こうした結果に基づいて、ポリマー開始物質とスペーサ含有ポリマーは
それら自体が直接的な抗腫瘍効果を示し、ＧnＲＨアンタゴニストに共有結合で
結合されると、アンタゴニストの直接的抗腫瘍作用を増大すると言うことができ
る。
生体内調査によれば、接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1544およびＰ−ＧＦＬＧ−1892お
よび担体Ｐ−ＧＦＬＧ−ＯＨは非毒性であることが分かっている。接合体Ｐ−Ｇ
ＦＬＧ−1544およびＰ−ＧＦＬＧ−1892は、ＥＲポジティブ、ＧnＲＨ受容体ポ
ジティブＭＣＦ−７ヒト乳腺悪性腫瘍異種移植で措置を開始してから第２週目に
腫瘍体積を30−35％縮小させ、第４週目には37〜49％縮小させた。一方、ＥＲネ
ガティブ、ＧnＲＨポジティブＭＤＡ−ＭＢ−231ヒト乳腺悪腫瘍異種移植には37
〜42％の腫瘍体積の減少をみることができた。ヒト悪性腫瘍異種移植上で観察さ
れた腫瘍抑制の程度は、より感作性の高いＭＸＴマウス乳腺悪性腫瘍上で達成さ
れたＧnＲＨアン
タゴニスト［Szepeshziら：Breast Canser Res．Treat.21，181−192（1992）］
であるＳＢ−75という抑制放出組成物（sustained-release composition）のそ
れとほぼ同じであることから、この結果は重要であると考えられる。
物質ＭＩ−1892とその接合体であるＰ−ＧＦＬＧ−1892は直接的で選択的な腫
瘍抑制効果を有している。つまり、物質ＭＩ−1544およびその接合体であるＰ−
ＧＦＬＧ−1544とは対照的に、それらは最低限の化学的去勢効果しか示さない。
この事実に基づいて、それらが広い範囲の乳腺悪性腫瘍に作用し、したがって、
ホルモン（エストロゲン）非依存型腫瘍にも作用すると考えることができる。
細胞および体液免疫システムに対するその化合物の影響について調べたことに
関連して、選択的ヒヨコＧnＲＨアンタゴニストとしてのＭＩ−1892、およびそ
の接合体で、そのアンタゴニストを含んでいるＰ−ＧＦＬＧ−1892、そして、新
しい多価陰イオン高分子であるスペーサー含有Ｐ−ＧＦＬＧは仔ウシ赤血球細胞
（ＢＲＢＣ）抗原に対するＴリンパ球の活性を（ロゼッテ形成法を用いて）増大
させた。Ｂリンパ球の抗体生産の調査結果に基づいて、ＭＩ−1892とＰ−ＧＦＬ
Ｇ−ＯＨ、およびＭＩ−1892を含有した接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1892は体液免疫応
答も強化した。
腫瘍治療に用いられるシトスタティックスの免疫抑制副作用は一般的に知られ
ている。この効果は種々の免疫刺激因子（エンドトキシン、レバミゾル）などに
よって一定程度相殺
することができる。分子量がずっと低い（40,000から80,000程度）ポリペプチド
も免疫抑制効果に対して保護効果を発揮することができる［Galら：J．Biol．Re
sp．Modif．５，148−159（1986）］。我々がテストした新しい多価陰イオン性
Ｐ−ＧＦＬＧ−ＯＨ高分子の分子量は10,000程度で、ＭＩ−1892にそれは2000程
度と比較的低く、したがって、その免疫刺激作用は期待できなかった。これらの
結果の重要性は、50μg/マウス、あるいは100μg/マウスの容量でマウスに投与
されたＭＩ−1892がそれぞれ、体液免疫応答を２倍から３倍に増大させたという
事実にも示されている。Ｐ−ＧＦＬＧ−ＰＨの場合、その増大率は２倍であった
。接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1892も免疫刺激効果を保有している。細胞免疫応答の調
査結果は、100μg/マウスの用量で与えられたＭＩ−1892はその応答性をほぼ２
倍に増大させたことを示した。Ｐ−ＧＦＬＧ−ＯＨおよびＰ−ＧＦＬＧ−1982の
場合、その増大率は２倍であった。接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1892も免疫刺激効果を
保有している。細胞免疫応答の調査結果は、100μg/マウスの用量で与えられた
ＭＩ−1892はその応答性をほぼ２倍に増大させたことを示した。Ｐ−ＧＦＬＧ−
ＯＨおよびＰ−ＧＦＬＧ−1982の場合、その増大率は２倍であった。
本発明による新しいポリカルボン酸誘導体は、優れた再現性をもってつくるこ
とができ、目的とする分子量範囲での分散性が低く、そして水溶性であるので、
ペプチド・ホルモンにとっての非常に好ましい担体である。
公知のポリカルボン酸誘導体も弱い腫瘍抑制作用を有しており、担体化合物と
して同様に好ましく使用することができる。ＧnＲＨ同族体など薬学的に活性の
ある化合物を本発明によるポリマーに結合させることによって、その構造的一部
分の作用と比較してより強い効果を発揮する新しい化合物が得られる。
新しい接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1544は以下のような理由から好ましい治療効果を
有する化合物である。つまり、それは細胞増殖の直接的抑制によって実証された
選択的腫瘍抑制効果を有している。したがって、ＭＤＡ−ＭＢ−231乳腺腫瘍細
胞で行われた調査によって示されているように、それはステロイド依存型ばかり
でなく、ステロイド非依存型の腫瘍の成長も抑制する。そのアンタゴニスティッ
ク効果によって、結合されたＭＩ−1544は可逆的な去勢効果を示す。この効果は
生体内措置期間中に測定される子宮重量の変化と、子宮のシトソリックプロゲス
テロン受容体（cＰgＲ）の低下によって証明されている。この効果の非常に重要
なひとつの利点は、その措置を中断するとホルモンステータスが再び確立される
ことである。これは非可逆的で、多くの患者が受け入れない外科的措置や放射線
照射措置とは対照的である。去勢効果の利点は、ステロイド依存型腫瘍の場合、
選択的で直接的な去勢効果は全体として腫瘍をより強く抑制する点にある。
この去勢効果は以下のデータによって示される。措置を４週間続けた後、ＭＣ
Ｆ−７異種移植を有する動物の子宮重量
は42％減少した（コントロール＝0.1980ｑ0.0120ｇ；Ｐ−ＣＦＬＧ−1544＝0.11
49＋0.110ｇ）；12週間の措置後、ＭＤＡ−ＭＢ−231異種移植を有する動物の子
宮重量は50％減少した（コントロール＝0.0263＋0.0028ｇ，Ｐ−ＧＦＬＧ−1544
＝0.0133ｑ0.0018ｇ）。ｐ−ＧＦＬＧ−ＯＨalone（0.0337ｑ0.0034ｇ，128％）
によっては子宮の重量は減少せず、やや増大した。プロゲステロンレベルの変化
はＭＣＦ−７異種移植を持った動物の子宮cＰgＲレベルのかなりの減少（54％）
によって実証された（コントロール＝517ｑ45フェムトモル/mg蛋白質、Ｐ−ＧＦ
ＬＧ−1544＝241ｑ28フェムトモル/mg蛋白質）。
いくつかの公知のＧnＲＨアンタゴニストとは反対に、Ｐ−ＧＦＬＧ−1544は
免疫抑制効果を持っていない。要するに、接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1544は腫瘍抑制
効果および去勢効果を持っているだけでなく、特に腫瘍抑制に関してＧnＲＨの
アンタゴニスト同族体であるＭＩ−1544のそれら効果をかなり上回る効果を有し
ている。この接合体の調査期間中、悪影響を及ぼす副作用は認められなかった。
その効果を発揮する時間が長いことから、この新しいアンタゴニスト化合物は生
体内での腫瘍抑制のために用いることができる。この新しい接合体Ｐ−ＧＦＬＧ
−1892は以下のような理由から、治療上の効果を持った望ましい化合物である。
つまり、それは選択的な腫瘍抑制効果を有している。したがって、それは、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−231細胞に関する調査で実証されているように、ス
テロイド依存型およびステロイド非依存型の両方のタイプの成長を抑止する。
ＧnＲＨアンタゴニストＭＩ−1892およびそのアンタゴニストを含む接合体の
去勢効果はＭＩ−1544およびその接合体と比較すると弱い。この接合体の去勢硬
化は生体内措置期間中に測定された子宮重量の変化と子宮におけるシトソリック
（cytosolic；細胞分裂抑止的）プロゲステロン受容体（cＰgＲ）レベルの低下
とによって実証された。４週間の措置の後、異種移植を有する動物の子宮の重さ
は39％減少した（コントロール＝0.1980ｑ0.0120ｇ，Ｐ−ＧＦＬＧ−1892＝0.12
15ｑ0.0130ｇ）。12週間にわたる措置後、ＭＤＡ−ＭＢ−231を持った動物の予
宮重量は20％減少した（コントロール=0.0263ｑ0.0028g、Ｐ−ＧＦＬＧ−1892=0
.0215ｑ0.0017ｇ）。Ｐ−ＧＦＬＧ−ＯＨだけでは子宮の重量は減少せず、多少
増大した（0.0337ｑ0.0034ｇ，128％）。プロゲステロンレベルの変化はＭＣＦ
−７異種移植を持った動物における子宮cＰgＲレベルの23％の減少によって実証
された（コントロール＝517ｑ45フェムトモル/mg蛋白質，Ｐ−ＧＦＬＧ−1892＝
376ｑ33フェムトモル/mg蛋白質）。
いくつかの知られているＧnＲＨアンタゴニストとは対照的に、この化合物は
免疫抑制効果は持っていない。この新しいＧnＲＨアンタゴニスト同族体および
この同族体を含有する接合体が体液、および細胞免疫応答調査で示されたような
免疫刺激性効果を有していることは新しい知見である。
健康な固体と比較して、腫瘍を患っている患者の保護メカニズムの機能性はあ
まり好ましくない。この化合物によって保護（免疫）メカニズムは強化されるの
で、その腫瘍抑制作用はより強力に有効となる。この新しい接合体Ｐ−ＧＦＬＧ
−ＧnＲＨ−IIIは以下のような理由から、好ましい治療効果をもった化合物であ
る。同化合物は腫瘍抑制効果を有している。したがって、この化合物はステロイ
ド依存型およびステロイド非依存型両方の腫瘍の成長を抑制し、そのことはＭＤ
Ａ−ＭＢ−231細胞の調査で実証されている。雌ラットのサイクルは、観察され
た３サイクル中に結合ＧnＲＨ−IIIの用量を高くしても影響は認められなかった
ので、この化合物は特別の影響は及ぼさない様である。この影響は去勢が心理的
な障害をもたらしてしまう若い乳腺腫瘍患者に対しては特に好ましい。他の接合
体とは違って、Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−IIIは７週間もの長期にわたって続けら
れる期間中持続的な増殖の程度の抑制を徐々に誘発する。そして、措置の終了時
、腫瘍をまったく持たない動物が認められるのに対して、他の接合体の場合には
、措置が開始されてから第５週目までだけ抑制度の増大が認められるが、その後
は抑制度は頭打ちになってしまう。
本発明による一般式（Ｉ）で示される化合物を含んだ医薬品組成物は、一般式
（Ｉ）で示される化合物、または、薬学的に受け入れられるその塩または錯体を
、薬学技術で知られている操作によって医薬品産業で一般的に用いられている担
体および／または添加剤を有する組成物に形質変換することによって調製するこ
とができる。
治療的な目的に使用するための医薬品組成物は（炭酸カルシウム、タルクなど
）治療で用いられる充填剤および担体：つまり、（水、エタノールおよび／また
は多価アルコール、例えばポリエチレングリコールおよび／またはグリセロール
などの）溶媒；（生理学的浸透圧を調節するための塩化ナトリウム；あるいは、
トレース要素を補うための、例えば、鉄、コバルト、亜鉛、あるいは銅の塩化物
などの）塩類；例えば錯体形成剤（シクロデキストリン、クラウンエーテル類、
天然蛋白質、サポニン類など）などの可溶化剤；エタノール、ポリオール類（ポ
リエチレングリコールまたはグリセロール）などの溶剤の相対的誘電率を低下さ
せるための化合物；錠剤分解剤；（水溶性シクロデキストリン誘導体、天然およ
び人造ポリマー、クラウンエーテルなどの）抑制放出組成物で一般的に用いられ
ている錯体形成剤；鉱物性および有機緩衝剤などのｐＨ調節化合物；（てんさい
糖、フルクトースおよびデキストロース、サッカリン、転化糖などの）味覚改善
剤；（ビタミンＣなどの）酸化防止剤、および、一般式（Ｉ）の活性剤の作用の
発現を促進する他の活性成分などを含むことができる。これら薬学的組成物は錠
剤、ピル、糖衣錠、固い、または柔らかいカプセル、マイクロカプセル、溶液、
乳剤あるいは懸濁液などの経口剤、あるいは浸出性が遅い、または急激な注射可
能な非経口的形状、あるいは、坐薬などの直
腸経由で投与するための薬学的組成物、さらにはクリームやジェリーなどであっ
てもよい。また、上記の使用目的のために開発された薬学的組成物をリポゾーム
に組み入れる可能性も存在している。一般式（Ｉ）で示される生物接合体（bioc
onjugates)は皮膚表面や肺などを通じての吸収を目的とするエアロゾル組成物で
用いることもできる。錠剤をつくるためには、炭酸カルシウム、タルク、脂肪類
、ワックスまたは多価アルコールなど適切な密度を有する糖衣錠またはゲルカプ
セルなどが有益な担体である。
溶液やシロップなどの調製には、例えば水、（ポリエチレングリコールやグリ
セロールなどの）多価アルコール、てんさい糖、またはデキストロースなどを担
体として用いることができる。非経口的投与を目的とする組成物は、水、アルコ
ール、多価アルコール、あるいはベジタブルオイルなどを担体として含んでいて
もよい。坐薬の担体は、例えば、適切な密度を有するオイル、ワックス、脂肪、
あるいは多価アルコールなどであってよい。一般式（Ｉ）で示される生物学的接
合体は人造または天然の活性剤と組み合わせて治療的な目的に使用しても有益で
ある。一般式（Ｉ）で示される生物学的接合体は腹膜、筋肉内、あるいは静脈注
射で投与される場合、0.01〜100μg/kgの用量範囲で有効である。実際に用いら
れる用量は疾患のタイプと患者の病状や年齢に依存しており、医師が決めるべき
である。
本発明はさらに、以下の非限定的な実例によって明らかに
されるが、これらの実例において“活性のある物質”とはそれら接合体のＧnＲ
Ｈ同族体分子部分を意味している。以下の実施例は本発明の種々の実施例を説明
するために述べられるのであって、いかなる意味においても本発明の限定を意図
したものではない。
実施例１ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlyニト ロフェニルエステルの調製
ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共マレイン酸無水物）［平均分子量：10,000，
ＩＲ：1840cm-1，1790cm-1（無水物）、1660cm-1（ピロリドンのＮＣＯ）］をＨ
−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlyニトロフェニルエステルトリフルオロアセテート（Ｒ
fl：0.50）に溶かした後、同量のトリエチルアミンを加えた。３時間後、ジエチ
ルエーテルを加え、ろ過し、エーテルで徹底的に洗浄することによって、生成物
が得られた。得られた生成物内にニトロフェニルエステル成分が存在しているこ
とは赤外線分光分析で確認され（1840cm-1，1790cm-1無水物、1740cm-1 ＣＯＯ
Ｈ，1660cm-1 ＮＣＯ，1540cm-1，1359cm-1 ＮＯ２）、ナトリウム10炭酸水素溶
液（モル消滅係数：1660）内で400nmで測定された紫外線吸収によって判定され
た。画分部分の限外ろ過によって、その生成物が非結合ペプチドニトロフェニル
エステルを含んでいないようにコントロールされた。このポリマーを無水のＤＭ
Ｆ内に溶解した後、その無水物基を加水分解するために、計算量（２当量）の水
を加えた。加水分解の終了はサンプルの赤外線スペクトルによって判定した（Ｉ
Ｒ：1740cm-1 ＣＯＯＨ，1540cm-1，1350cm-1 ＮＯ２）。
実施例２ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly−ニトロフ ェニルエステルの調製
この生成物は、Ｈ−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlyニトロフェニルエステル塩酸塩（Ｒf１
：0.59）（ＩＲ：1740cm-1 ＣＯＯＨ，1540cm-1，1350cm-1 ＮＯ２）と結合させ
ることによって実施例１で説明したように調製され、特徴づけられた。
実施例３ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｌeu−Ｇlyニトロフェ ニルエステルの調製
この生成物は、Ｈ−Ｇly−Ｌeu−Ｇlyニトロフェニルエステルトリフルオロア
セテート（Ｒf２：0.53）．（ＩＲ：1740cm-1 ＣＯＯＨ，1540cm-1，1350cm-1
ＮＯ２）と結合させることによって実施例１で説明したように調製され、特徴づ
けられた。
実施例４ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ａhxニトロフェニルエステル の調製
この生成物は、Ｈ−Ａhxニトロフェニルエステルアセテート（Ｒf１：0.7）．
（ＩＲ：1740cm-1 ＣＯＯＨ，1540cm-1，1350cm-1 ＮＯ２）と結合させることに
よって実施例１で説
明したように調製され、特徴づけられた。
実施例５Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3．Ｄ−Ｃpa2，｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共 −マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly−］｝５，［ａ−Ａsp（ＤＥＡ）］６ ，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ（略語：Ｐ−ＧＦＬＧ−1892）の調製
ＭＩ−1892の（ニトロフェニルエステル基に対し計算された）１当量を実施例
１に従って調製した溶液を加えた後で、トリエチルアミンを加えることによって
、溶液のpHが７から８の間で調整された。24時間後、反応混合物は水を加えるこ
とによって20倍の量に希釈され、５％のＮaＨＣＯ３溶液が末反応ニトロフェニ
ルエステル基を完全に加水分解するために加えられた。低分子物は限外ろ過によ
って除去され、高分子画分は親液性化（lyophilize）凍結乾燥された。生成物の
純度はＨＰＬＣ（Ｒt：34.38min、ＭＩ−1892の保持時間は20.61min）でコント
ロールされ、活性成分含量は、200nmから450nmの範囲で（ＭＩ−1892の比吸収係
数は280nmで10400である）紫外線分光分析によって測定された。それと同時に、
その生成物が非結合ニトロフェノール（380nmから420nm）を含んでいなかった。
実施例６Ａc-Ｄ−Ｔrp1,3．Ｄ−Ｃpa２，｛Ｄ−Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン −共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly］｝６，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ（ 略語：Ｐ−ＧＦＬＧ−1544）の調製
ＭＩ−1544がＧnＲＨ同族体として使われた以外は実施例５に準じた。その生
成物の純度はＨＰＬＣ［保持時間（Ｒt）：29.96min、ＭＩ−1544の保持時間Ｒt
は22.93min］によってコントロールされ、その活性成分含量は、200から450nmの
範囲の紫外線の10分光測定によって判定された。ＭＩ−1544のモル比吸収係数は
280nmで11,000である。
実施例７｛Ｄ−Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe −Ｌeu−Ｇly］｝６，−ＧnＲＨ（略語：Ｐ−ＧＦＬＧ−６０９）の調製
Ｄ−Ｌys６−ＧnＲＨがＧnＲＨ同族体として使われた以外は実施例５に準じた
。その生成物の純度はＨＰＬＣによってコントロールされ、その活性成分含量は
、200から450nmの範囲の20本の紫外線の分光測定によって判定された。
実施例８Ｄ−Ｐhe２，Ｄ−Ｔrp３，｛Ｄ−Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共− マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly−］｝６，−ＧnＲＨ（略語：Ｐ−ＧＦ ＬＧ−１００４）の調製
ＳＪ−１００４がＧnＲＨ同族体として使われた以外は実
施例５に準じた。その生成物の純度はＨＰＬＣ（Ｒt：20.7min、ＳＪ−1544のＲ
tは17.3min）によってコントロールされ、その活性成分含量は、200から450nmの
範囲の紫外線の分光測定によって判定された。
ＳＪ−1004のモル比吸収係数は280nmで6500である。
実施例９｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌ eu−Ｇly−］｝５，cyclo（Ａsp６−Ｌys８−ＧnＲＨ−III（略語：Ｐ−ＧＦＬ Ｇ−６１４）の調製
ＴＨ−614がＧnＲＨ同族体として使われた以外は実施例５に準じた。その生成
物の純度はＨＰＬＣ（ＴＨ−614のＲt：16.4min）によってコントロールされ、
その活性構成成分は、200から450nmの範囲の紫外線の分光測定によって判定され
た。ＴＨ−614のモル比吸収係数は280nmで8800である。
実施例10｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌ eu−Ｇly−］｝４，−ＧnＲＨ−III（略語：Ｐ−ＧＦＬＧ−685）の調製
実施例１によって調製されたポリマー溶液に、遊離アミノ基を含むＨＢ−694
ホルモン類似体の0.5当量（ニトロフェニルエステル基に対し計算した）を加え
た。（ジイソプロピル）−エチルアミンを使うことによって、反応混合物のpH値
は10に調整された。数時間後、［Ｌys（ｎ−Ｆmoc）］８誘導体から保護基を取
り除くために、ピペリジンを定量加えた。さら
に２〜３時間撹拌した後で、水で希釈した反応混合物を限外ろ過したが、この限
外ろ過は、上澄み液が炭酸水素ナトリウムで希釈された後で繰り返し行われた。
このように精製した生成物は親液性化され、その純度はＨＰＬＣによってコント
ロールされ、活性成分含量は、200nmから450nmの範囲での紫外線５分光測定によ
って判定された。ＨＢ−685のモル比吸収係数は280nmで9800である。
実施例11｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌ eu−Ｇly−］｝８，−ＧnＲＨ−III（略語：Ｐ−ＧＦＬＧ−602）の調製
ＴＨ−602がＧnＲＨ同族体として使われた以外は実施例５に準じた。その生成
物の純度はＨＰＬＣ（Ｒt：14.8min，ＴＨ−602のＲtは13.4min）によってコン
トロールされ、その活性成分含量は、200から450nmの範囲の紫外線の分光測定に
よって判定された。ＴＨ−602のモル比吸収係数は280nmで9800である。
実施例12Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa2，｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共 −マレイン酸）−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly］｝5［ａ−Ａｓｐ（ＤＥＡ）］6，Ｄ−Ａla 10−ＧnＲＨ（略語：Ｐ−ＦＬＧ−1892）の調製
実施例２によって調製された生成物が担体として使われ、またＭＩ−1892がＧ
nＲＨ同族体として採用される以外は実
施例５に準じた。その生成物の純度はＨＰＬＣ（Ｒt：30.77min）によってコン
トロールされ、その活性剤成分は、200から450nmの範囲の分光測定によって判定
された。
実施例13Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa2，｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共 −マレイン酸）−Ｇly−Ｌeu−Ｇly］｝5［ａ−Ａｓｐ（ＤＥＡ）］6，Ｄ−Ａla 10−ＧnＲＨ（略語：Ｐ−ＧＬＧ−1892）の調製
実施例３によって調製された生成物が担体として使われ、またＭＩ−1892がＧ
nＲＨ同族体として採用された以外は実施例12に準じた。その生成物の純度はＨ
ＰＬＣ（Ｒt：25.39min）によってコントロールされ、その活性成分含量は、200
から450nmの範囲の紫外線の分光測定によって判定された。
実施例14Ａc-Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa２，｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共 −マレイン酸）−Ａhx］｝５，［ａ−Ａsp（ＤＥＡ）］６，Ｄ−Ａla10−ＧnＲ Ｈ（略語：Ｐ−Ａhx−1892）の調製
実施例４によって調製された生成物が担体として使われ、またＭＩ−1892がＧ
nＲＨ同族体として採用された以外は実施例12に準じた。その生成物の純度はＨ
ＰＬＣ（Ｒt：19.98min）によってコントロールされ、その活性成分含量は、200
nmから450nmの範囲の紫外線の分光測定によって判定された。
実施例15Ａc-Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa２，｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共 −マレイン酸）−］｝５，［ａ−Ａ（ＤＥＡ）］６，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ（略 語：Ｐ−1892）の調製
ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−無水マレイン酸）をＤＭＦ内に溶かした後
、ＭＩ−1892とトリエチラミンの計算した量を加えた。12時間経過後、ジエチル
エーテルを加え、沈澱させ、ろ過し、５％の炭酸水素ナトリウム溶液に溶かし、
前記の実施例で説明したように精製、分析された。
実施例16｛Ｌys［ｎ−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−Ｇly−Ｐhe−Ｌ eu−Ｇly−］｝５，Ｄ−Ｔrp６−ＧnＲＨ（略語：Ａ−ＧＦＬＧ−615）の調製
ＴＨ−615がＧnＲＨ同族体（実施例９参照）として使われた以外は実施例５に
準じた。ｄ：10300
実施例17ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−共−マレイン酸）−ヘキシルアミド誘導体と結合 したＧly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇly−ＧnＲＨ同族体の調製
ヘキシルアミンの計算量がジメチルホルムアミドのポリ（Ｎ−ビニルピロリド
ン−共−マレイン酸無水物）溶液に、撹拌しながら加えられた。２時間後、ジメ
チルエーテルを加え、沈澱物をろ過し、アミンフリー（ニンヒドリン陰性テス
ト、ＩＲ：293cm-1 ＣＨ2）になるまでエーテルで洗浄して、生成物が得られた
。この物質はＤＭＦで再び溶かされ、Ｈ−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlyニトロフェニ
ルエステルヒドロクロライドが加えられた。反応混合物20のpH値はトリエチルア
ミンで７から８に設定され、その後、３時間析出が繰り返された。ＧnＲＨ同族
体の結合と生成物の純化については実施例５で説明したように行われた。生成物
の純度はＨＰＬＣでコントロールされ、活性剤成分は、200nmから400nmの範囲の
紫外線の25分光測定よって判定された。
実施例18投与量−生存関係に関する研究
この研究は被検物質の細胞破壊作用についての正確な情報を提供している。シ
トスタティックス（細胞活性抑制剤）の場合は、細胞破壊作用は細胞特異性のも
のではない。ＧnＲＨ同族体は相特異性の作用を有し、Ｇ０/Ｇ１相の細胞をブロ
ックはするが、殺すことはない。阻止（arrest）された細胞の一部は再度サイク
ルの中に入り、その他の部分は消滅する（細胞消滅）。阻止された細胞から形成
されたコロニーは、判定される時には数え得る細胞群の大きさに達していない（
細胞群の数は同じだが、細胞群の大きさが違う）。ホルモン同族体の場合は、当
該ホルモンの受容体を持つ細胞に関して10％から30％の特異的抑制効果を達成す
ることができる。この研究はＭＣＦ−７とＭＤＡ−ＭＢ−231ヒト乳腺悪性腫瘍
細胞株、ＰＣ３ヒト前立腺15悪性腫瘍細胞株、およびIshi
kawaヒト子宮内膜悪性腫瘍細胞株に関して行われた。300の細胞が，それぞれ直
径3.5cmのペトリ皿に用意された。措置は一度、外植24時間後に行われ、形成さ
れたコロニーが９日から12日後にカウントされた。
培養液内に物質を溶かした後、その培養体は、それぞれ活性物質と同量の１−
50μMのＭＩ−1544ヒトＧnＲＨアンタゴニスト；ＭＩ−1892ヒヨコＧnＲＨアン
タゴニスト；ＳＪ−1004ヒトＧnＲＨアンタゴニスト類似物；合成ヤルメウナギ
ＧnＲＨ−III物質、それにＬys４−ＧnＲＨ−IIIおよびＬys５−cyclo（Ａsp６
，Ｌys８）−ＧnＲＨ−IIIランプリＧnＲＨ−III同族体；さらにＰ−ＧＦＬＧ−
1544，Ｐ−ＧＦＬＧ−1892，Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−III，Ｐ−ＧＦＬＧ−Ｌys
４−ＧnＲＨ−III，Ｐ−ＧＦＬＧ−Ｌys５−cyclo（Ａsp６，Ｌys８）ＧnＲＨ−
III接合体、またＰ−ＦＬＧ−1892とＰ−ＧＬＧ−1892接合体によって措置され
た。
（50fmの濃度で投与された）ＭＩ−1892ヒヨコＧnＲＨアンタゴニスト物質は
両方の乳腺悪性腫瘍細胞培養体（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−231）のコロニー
形成を同じ程度に、つまり、それぞれ15〜20％、および35〜38％抑制した。50μ
Mの濃度で投与すると、ＭＩ−1544hＧnＲＨアンタゴニストはＭＣＦ−７細胞株
上では45％、そしてＭＤＡ−ＭＢ−231細胞株上では20％の抑制効果を示した。
接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1544および接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1892は両方とも10μM
の濃度では80〜85％程度のコロニー形成
抑制効果を、そして活性物質が50μMの濃度の場合は100％の抑制効果を示した（
表Ｉ）。
トリペプチドスペーサー含有接合体Ｐ−ＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＬＧ−1892
は活性物質濃度が50μMの場合細胞の残存に対する抑止効果が多少低く、70〜80
％程度であった。Ｐ−ＧＦＬＧ−1544およびＰ−ＧＦＬＧ−1892はＰＣ３前立腺
およびIshikawa子宮内膜悪性腫瘍細胞株に対しても、最も強力な20の抑止剤であ
ることを示した。30〜50μMの濃度を用いた場合、ＰＣ３とIshikawa細胞培養物
の両方で、100％の抑止効果が観察された（表Ｉ）。両方の接合体とも、50μMの
濃度を用いた場合、Ishikawa細胞株ではそれぞれ５％と10％、そしてＰＣ３細胞
株ではそれぞれ20％および５％と観察されているＭＩ−1544ＧnＲＨアンタゴニ
ストおよびＭＩ−1892ヒヨコＧnＲＨアンタゴニスト同族体活性物質による25コ
ロニー形成抑止効果をはるかに上回った。
50μMの濃度で投与された場合、弱いＧnＲＨアンタゴニスト同族体物質である
ＳＪ−1004はＭＣＦ−７細胞株上では31％、そしてＭＤＡ−ＭＢ−231細胞株上
では26％のコロニー形成抑制度を示すが、ＰＣ３細胞株（０％）あるいはIshika
wa細胞株（５％）上ではほとんど抑制作用を示さなかった。これとは対照的に、
活性物質の濃度を50μＭとした場合、Ｐ−ＧＦＬＧ−1004接合体は乳腺悪性腫瘍
細胞株では92〜95％，ＰＣ３前立腺悪性腫瘍細胞培養体では100％、そしてIshik
awa細胞株では46％の抑制効果を示した（表Ｉ）。ヒトおよびヒヨコＧnＲＨ同族
体とは対照的に、合成ヤツメウナギＧnＲＨはＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ−231お
よびＰＣ３細胞株上
で、接合体としてではなく、それ自体活性物質として、コロニー形成の最も大幅
な抑制をもたらした。50μmの濃度の場合、ＧnＲＨ−IIIはコロニー形成を（Ｍ
ＣＦ−７上で）65％、（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上で）69％、そして（ＰＣ３上で
）21％抑止し、一方、Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−III接合体はどの細胞株上でも16
％以上の抑制効果は示さなかった（表Ｉ）。
Ｌys４−ＧnＲＨ−IIIおよびＬys５−シクロ（Ａsp６，Ｌyｓ８）−ＧnＲＨ−
IIIヤツメウナギＧnＲＨ−III同族体の場合、これら接合体、つまりＰ−ＧＦＬ
Ｇ−Ｌys４−ＧnＲＨ−IIIおよびＰ−ＧＦＬＧ−25Ｌys５−シグロ（Ａsp６，Ｌ
ys８）−ＧnＲＨ−IIIの抑制効果もより強力であることが分かった（表Ｉ）。活
性物質の形態で、Ｌys４−ＧnＲＨ−IIIはコロニー形成に関して、ＭＣＦ−７細
胞株で40％、ＭＤＡ−ＭＢ−231細胞培養体38で35％、そしてIshikawa細胞で21
％の抑制効果をそれぞれ示した。ＰＣ３細胞の場合は抑制効果は示さなかった。
Ｐ−ＧＦＬＧ−Ｌys４−ＧnＲＨ−III接合体はコロニー形成に関して、ＭＣＦ
−７細胞株で68％、５ＭＤＡ−Ｍ８−231細胞培養体で75％、そしてIshikawa細
胞で25％の抑制効果を示した。興味深いことに、ＰＣ３細胞株ではコロニー形成
を94％抑制した（表Ｉ）。
Ｌys５−シクロ（Ａsp６，Ｌys８）−ＧnＲＨ−IIIヤツメウナギ同族体は、コ
ロニー形成に関して、ＭＣＦ−７細胞株で44％、Ishikawa細胞株で13％の抑制効
果を示した。接合体
として、Ｐ−ＧＦＬＧ−Ｌys５−シクロ（Ａsp６，Ｌys８）−ＧnＲＨ−IIIは乳
腺悪性腫瘍細胞培養体におけるコロニー形成を、上記活性物質より強力に抑制し
た（78〜82％）。Ishikawa細胞では、この接合体の抑制効果（19％）は上記活性
物質の抑制効果（13％）とほぼ同じであった。この接合体はＰＣ３細胞株上でコ
ロニー形成を100％阻止した。
実施例19ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株の増殖の試験管内での抑制
措置の手順は以下の通りである。細胞をトリプシン化した後、ＭＣＦ−７，Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−231ヒト乳腺悪性腫瘍、ＰＣ３ヒト前立腺悪性腫瘍、またはIshikaw
aヒト子宮内膜の細胞400,000個を直径10cmのペトリ皿に移した。移した翌日から
、それらの細胞を上記試験物質で措置し、指数関数的成長期間中、栄養媒体で調
製した溶液中でテストした。この培養物は１−50μM（培養体の総体積で計算し
て）のＭＩ−1544ＧnＲＨアンタゴニスト、ＭＩ−1892ヒヨコＧnＲＨアンタゴニ
スト、またはＳＪ−1004ＧnＲＨアンタゴニスト同族体、および合成ヤツメウナ
ギＧnＲＨ−IIIホルモンで２日置きに措置して、７日目に細胞数をカウントした
。上記実験と同時に、これらの細胞を接合体Ｐ−ＧＦＬＧ−1544，Ｐ−ＧＦＬＧ
−1892，Ｐ−ＧＦＬＧ−1004およびＰ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−IIIを、活性物質の
１〜50μMの量でペトリ皿に移した翌日に措置し、その後、７日目に細胞数を判
定した。ＧnＲＨペプチドホルモン物質を30μMの濃度で用いた場合、細胞増
殖を最も強力に抑制した。濃度を増大させても、抑制効果は増大しなかった。
ＭＣＦ−７エストラジオール受容体（ＥＲ）−ポジティブヒト細胞株（10％Ｆ
ＣＳ）の場合、弱いＧnＲＨアンタゴニストＳＪ−1004の直接的な抗腫瘍効果と
ＧnＲＨアンタゴニストＭＩ−1544またはヒヨコＧnＲＨアンタゴニストＭＩ−18
92との間にはかなりの相違が観察された。ＳＪ−1004は細胞数を17％程度減少さ
せただけだが、両方のアンタゴニスト共（30μMの濃度で）、５日間に一度ずつ
措置を続けた場合に34−36％の抑制効果を発揮した。
同じ濃度の活性物質を用いた場合，Ｐ−ＧＦＬＧ−1544接合体は58％の抑制を
もたらした。ＭＩ−1544アンタゴニストの抗腫瘍効果は、それに共有結合で結び
つけられたコポリマーによって付加的に強化されると考えることができるかもし
れない（表II）。
活性物質を30μMの濃度で投与した場合、ＭＩ−1892を含有したＰ−ＧＦＬＧ
−1892は細胞増殖を45％抑制した。措置がその接合体で１回だけ行われたことを
考えれば、このポリマーはこの場合も上記アンタゴニストの抑制効果を強化した
と考えることができる（表II）。
ＭＣＦ−７：ヒト由来の乳腺腫瘍細胞株；ＭＤＡ−ＭＢ−231：ヒト由来の乳
腺腫瘍細胞株；ＰＣ３：ヒト由来の前立腺腫瘍細胞株；Ishikawa：ヒト由来の子
宮内膜腫瘍細胞株。
トリペプチドスペーサー基を含んでおり、活性物質の含有量が30μM程度のＰ
−ＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＬＧ−1892は30−35％程度の直接的な抗腫瘍効果を
もたらしただけであ
った。ＭＤＡ−ＭＢ−231ＥＲネガティブ細胞（10％ＦＣＳ）の場合、ＳＪ1004
で２日に一度ずつ措置すると、細胞数は23％程度減少したが、15ＭＩ−1544およ
びＭＩ−1892（30μM）で措置した場合は、細胞の数は35％−36％程度減少した
。
活性物質の濃度を30μMで投与した場合、Ｐ−ＧＦＬＧ−1544接合体は45％、
そしてＰ−ＧＦＬＧ−1892は42％の増殖抑制をもたらした（表II）。Ｐ−ＦＬＧ
−1892またはＰ−ＧＬＧ−1892を用いた場合（20）、より低い、具体的には33−
35％程度の抑制効果が見られた（表II）。
ＰＣ３前立腺およびIshikawa子宮内膜悪性腫瘍細胞株の場合、有効なＧnＲＨ
同族体物質（ＭＩ−1544およびＭＩ−1892）の増殖抑制効果は共有結合でそれに
結合されたコポリマーによってかなり増大された（25）。30μMの濃度で用いら
れた場合、２日目および４日目での２回の措置後、ＭＩ−1544はIshikawa細胞株
の増殖を８％、そしてＰＣ３の増殖を24％抑制した。一方、Ｐ−ＧＦＬＧ−1544
を一度投与した場合は、Ishikawa細胞株の増殖を95％、そしてＰＣ３細胞株の増
殖を68.5％、それぞれ直接的に抑制した。
２回の措置後、ＭＩ−1892ヒヨコＧnＲＨアンタゴニスト活性物質はIshikawa
およびＰＣ３細胞培養体でそれぞれ14％および33％の抑制効果を発揮した。１回
の投与後、Ｐ−ＧＦＬＧ−1892接合体はＰＣ３細胞株で51％の直接的な増殖抑制
効果を示し、そして、Ishikawa細胞株では、より高いレベルで、91％という抑制
効果を示した（表II）。
弱いＧnＲＨアンタゴニストとしてのＳＪ1004は弱い抗腫瘍効果を示した。２
回の措置後（２日目および４日目）、ＭＣＦ−７細胞株では17％程度の抑制効果
を示しただけであったが（15）、ＭＤＡ−ＭＢ−231細胞株で23％、Ishikawa細
胞株では20％、ＰＣ３では10％の抑制効果が認められた。接合体形態で一度投与
された場合、両方の乳腺悪性腫瘍細胞株ではほとんど同じ程度の抑制効果が示さ
れた（63〜68％）（20）（表II）。
Ｐ−ＧＦＬＧ−1004接合体はＰ−ＧＦＬＧ−1554またはＰ−ＧＦＬＧ−1892よ
り弱い増殖抑制効果を示した。これはＰＣ３では35％、そしてIshikawa細胞株で
は20％と観察された。ＧnＲＨ−III合成ヤツメウナギＧnＲＨまたはＰ−ＧＦＬ
Ｇ−ＧnＲＨ−IIIの接合体の場合、増殖抑制に関する研究はＭＣＦ−７およびＭ
ＤＡ−ＭＢ−231細胞株でだけ行われた。コロニー形成の抑制研究結果と同様、
Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−III接合体で得られた結果と比較して、活性物質だけで
コロニー形成あるいは増殖をより強度に抑制した被検アゴニスティックおよびア
ンタゴニステイック誘導体のうちのひとつのＧnＲＨホルモンが用いられた。こ
の活性物質を用いて２回の措置を行ったところ（２日目と４日目）40〜39％の直
接抑制効果が認められたのに対して、Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−IIIによる１回の
措置（２日目）後では10〜11％の抑制が観察されただけであった（表II）。
表IIに示されているように、増殖抑制効果は一定の誤差の
範囲で、コロニー形成の抑制結果とほぼ一致していた。我々の観察結果に基づけ
ば、コロニー形成の抑止とそれらの物質の生体内での効果とには強い相関関係が
存在している。
実施例20Ｐ−ＧＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＦＬＧ−1544接合体の生体内での毒性に関する 研究
これらの実験はコントロール（21）と措置された雌のＣＢＡ／Ｃaマウス（20
）とで行われた。措置は以下のように行われた。７匹の動物はコントロールとし
て用いられた。７匹の動物に対しては有効量（活性物質濃度：400μg/動物）の1
0倍を一回腹膜に注射した；７匹の動物に対しては有効量（活性物質濃度：400μ
g／動物）の10倍を筋肉内に１回注射した。その結果、どの物質の毒性も認めら
れなかった。筋肉内注射による措置から５日目と、腹膜内注射による措置から７
日目に、これらの動物の体重は10％増大したのに対して、コントロールの動物の
体重は変化しなかった。
実例21ヒトＭＣＦ−７またはＭＤＡ−ＭＢ−231異種移植を持った免疫抑制マウスでの Ｐ−ＧＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＦＬＧ−1544接合体の生体内での抗腫瘍効果に 関する研究
免疫を抑制されたＣＢＡ/Ｃaに接種した場合、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ
−231細胞はうまく移植された腫瘍を形成していた。マウスの免疫抑制はSteelら
（1978）の方法を用いて実行された。
免疫抑制と異種移植
生後６週間程度のＣＢＡ/Ｃa雌マウスを胸腺切除した後、１週間後に、それら
のマウスに60Ｃoを照射した（全身照射：致死量は9.5グレイ）。24時間以内に、
５×105個の骨髄細胞を注入した。免疫抑制されたマウスの皮膚の下に、２×107
個の腫瘍細胞、あるいは後の期間（passage）では、２mm3の腫瘍細胞、あるいは
さらに後の追加的期間では、２mm3程度の腫瘍片を移植した。異種移植後、ＭＣ
Ｆ−７異種移植を有するマウスを50μgのエストラジオールヴァレレートと30μg
のNorgestomet（IntervetInternational B．V．）の混合物で一度弱く措置した
。ステロイドホルモンによる措置は、調査の開始の少なくとも１週間前には停止
した（takeは通常24日間で行われた）。ＭＣＦ−７腫瘍（異種移植）の場合、検
査はそれぞれ、37番および38番移植のフェーズ内の経路を使って行われた。観察
の結果によると、数年間の移植（transplantation of several years）後腫瘍の
成長は加速され、第４あるいは第５passage後の状態と比較すると２倍の成長速
度を示した。（コントロールの動物の場合、４〜５期間後の腫瘍は0.3ｇから３
〜４ｇ程度に成長したのに対して、37番目または38番目の移植後の腫瘍の重量は
６週間で0.3ｇから８ｇに成長した。なお、これらの期間中に、クローン選択が
起きた。つまり、急速に成長するクローンがゆっくり成長する細胞群より優勢に
なった（クローン選択）。
ＭＣＦ−７異種移植を有するマウスの場合、措置は異種移
植を行ってから４週間目に開始された。この試験は50匹の動物を用いて行われた
［腫瘍の量は255〜319mm3；（ｄ12×ｄ２×3.14）：６］。措置は以下のように
行われた。１日２度、ＭＩ−1892（12時間ごとに２×25μg）ｓ．ｃが８匹の動
物に対して与えられた。１日に１度5μg，または３日に１度150μgのＰ−ＧＦＬ
Ｇ−1892またはＰ−ＧＦＬＧ−1544接合体（活性物質で計算して）が８匹、また
は６匹の動物にそれぞれ与えられた。６匹の動物に対しては活性物質50μgに対
応するｓ．ｃ用量でＰ−ＧＦＬＧ−ＯＨが与えられた。そして、８匹のコントロ
ール動物に対しては150μgの生理食塩水が１日１度与えられた。措置を開始して
第４週の終わりには、ＭＩ−1892アンタゴニストによる１日２度の措置と、Ｐ−
ＧＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＦＬＧ−1544接合体による１日１度の措置を行った
ところ、同じ年齢のコントロール群の腫瘍体積と比較して腫瘍体積が20〜30％減
少した。したがって、この措置は腫瘍成長の速度を遅らせ、１日２度上記物質を
投与した場合と接合体を１日１度投与した場合との効果はほぼ同じであった（前
者の措置では腫瘍成長の20％の減少、そして後者の措置では30％の減少がそれぞ
れ認められた）。腫瘍成長の速度は、３日に１度ずつＰ−ＧＦＬＧ−1892または
Ｐ−ＧＦＬＧ−1544を与えた場合、あるいはＰ−ＧＦＬＧ−ＯＨを毎日１度ずつ
与えた場合には影響は認められなかった。
最近、ＭＣＦ−７異種移植を有する28匹の動物と、ＭＤＡ−ＭＢ−231異種移
植を有する28匹の動物についての調査が
開始された。ＭＣＦ−７腫瘍を持った動物に対しては、移植が行われてから５週
目に措置が開始された。腫瘍の体積は205〜225mm3であった。ＭＤＡ−ＭＢ0231
腫瘍を持った動物に対しては、措置は140〜150mm3の腫瘍を移植してから４週目
から措置が開始された。措置は１日１度、75μgのＰ−ＧＦＬＧ−1892接合体ｓ
．ｃ（活性物質で計算した場合）、あるいは１日１度、50μgのＰ−ＧＦＬＧ−1
544接合体ｓ．ｃ．（活性物質で計算した場合）、あるいは１日１度、50μgのＰ
−ＧＦＬＧ−ＯＮ担体ｓ．ｃ．（活性物質で計算した場合）をそれぞれ与える方
法で行われた。コントロールグループに対しては、１日１度生理食塩水ｓ．ｃが
与えられた（各措置グループとも７匹の動物で構成）。
ＭＣＦ−７異種移植を持ったマウスで繰り返し行われた調査で、Ｐ−ＧＦＬＧ
−1892とＰ−ＧＦＬＦ−1544接合体は両方とも措置を開始してから２週目に、す
でに腫瘍成長を30〜35％抑制したことを強調しておかねばならない。４週目には
前者の調査結果を上回って、同じ年齢のコントロール群と比較して、Ｐ−ＧＦＬ
Ｆ−1892によってもたらされた腫瘍体積の減少は37％(腫瘍体積は2,428cm3)、Ｐ
−ＧＦＬＦ−1544によってもたらされた滅少は49％（腫瘍体積は1.806ｃm3）で
あった。６週目には、両方の接合体の抑制甲かとも基本的には同じように見えた
。そして、Ｐ−ＧＦＬＦ−1544で措置したグループでは腫瘍を持たない動物も観
察された。43〜49％の腫瘍抑制が達成された（表III）。
６週間の措置後の腫瘍の体積と重量
ＭＤＡ−ＭＢ−231腫瘍を持ったマウスの場合、同じ年齢（20）のコントロー
ルグループと比較して、腫瘍体積の21〜34％の減少がすでに２週目から観察され
た（表IV）。腫瘍の成長（エストラジオール受容体ネガティブ、エストラジオー
ル−非依存型腫瘍）は化学的な去勢によっては抑制されなかった。したがって、
観察された効果は疑いもなく直接的抗腫瘍作用の結果であった。措置は６週目に
打ち切られた。２つの接合体（Ｐ−ＧＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＦＬＧ−1544）
による措置後、37〜42％のほぼ同じ抑制効果が観察された（表III）。これらの
接合体で措置されたグループでは６週目の終わりに腫瘍を含まない動物が開始さ
れた。
より最近、ＭＤＡ−ＭＢ−231異種移植を持った28匹の動物に関する調査が開
始された。措置は、移植後４週目または５週目に開始された。腫瘍体積は0.165
〜0.194cm3であった。措置は100μgの活性物質（それぞれＧnＲＨ−III，Ｐ−Ｇ
ＦＬＦ−ＧnＲＨ−IIIまたはＰ−ＧＦＬＦ−1544で計算して）を皮下注射で投与
することによって行われた（コントロール群の措置に関しては、先の例参照。）
。
各グループは７匹の動物で構成されていた。措置期間中、腫瘍体積は９週間に
わたって毎週測定された。結果を表IIIに要約して示してある。
ＧnＲＨ−III活性物質それ自体では腫瘍の成長は抑制されなかった。Ｐ−ＧＦ
ＬＧ−1544ＧnＲＨアンタゴニスト接合体の用量を増やしても（前のシリーズで
は50μg、今回の実
験シリーズでは100μg）、それら接合体による腫瘍成長に対する抑制効果は増大
しなかった。Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−IIIで措置された７匹の動物のうちの２匹
、そして、Ｐ−ＧＦＬＧ−1544で措置された７匹の動物のうちの１匹が措置を開
始してから６週目に腫瘍なしになったことは非常に重要な結果であると考えられ
る。
措置開始後９週目の腫瘍の体積と重量
９週目の終わりには、Ｐ−ＧＦＬＧ−ＧnＲＨ−III接合体によって、73〜78％
という、これまでに観察されなかったような優れた抑制効果が得られた。措置さ
れた動物とコントロール群の動物との間での体重は、措置中、および措置後にも
認められなかった。
実例25ＭＸＴマウス乳腺腫瘍を持ったマウスでのＰ−ＧＦＬＦ−1892およびＰ−ＧＦＬ Ｆ−1544の生体内での抗腫瘍効果に関する調査
ＣＢＡ/Ｃaマウスに接種した場合、ＭＸＴマウス乳腺腫瘍
細胞は腫瘍を形成した。腫瘍の取り込み（take）は100％の例で発生した。した
がって、腫瘍の発現より前に、つまり移植の翌日から、措置を開始することがで
きた。このモデルのさらなる重要性は、ヒト異種移植を有するマウスの免疫シス
テムとは対照的に、ＭＸＴマウス乳腺腫瘍の免疫システムは十分には抑制されな
かった。したがって、このモデルは抗腫瘍効果と、免疫システムに対する作用の
両方を調べるのに同じように有益であった。ＭＸＴマウス乳腺悪性腫瘍はＥＲお
よびＰgＲ蛋白質を含んでいる。さらに、それはＧnＲＨ受容体も含んでいる。し
たがって、この生体内腫瘍モデルは直接的効果と間接的効果の両方を調査するの
に適している。ＭＸＴ乳腺腫瘍を持ったマウスの措置は移植３日後から開始され
た。この調査は３５匹の動物を対象として行われ、ＭＩ−1892，ＭＩ−1544，Ｐ
−ＧＦＬＧ−1892およびＰ−ＧＦＬＧ−1544の75μｇを１日１度各固体に皮下注
射する方法で行われ、措置を開始してから９日目に腫瘍の体積を測定した。結果
は表VIに示してある。
これらの動物に対しては、ＭＸＴマウス乳腺腫瘍の移植の翌日から皮下のルー
トで１日１度の措置が行われた。措置は以下のように行われた。Ｐ−ＧＦＬＧ−
1544：ＭＩ−1544活性物質75μg/日/動物；Ｐ−ＧＦＬＧ−1892：ＭＩ−1892活
性物質75μg/日/動物；ＭＩ−1544：ＭＩ−1892 75μg/日/動物。
抑制のパーセンテージを表VIIに示す。腫瘍成長の最も強力な抑制は措置を開
始して２週間目の終わりに観察された。２週目および３週目の終わりに測定され
た抑制のパーセンテー
ジを表VIIに示す。この結果は、このモデルで、Ｐ−ＧＦＬＧ−1892接合体がＭ
Ｉ−1982活性物質自体よりはるかに効率的であることを示している。ＭＩ−1544
とＰ−ＧＦＬＧ−1544との間では抑制効果に違いは見られなかった。
これらの動物に対しては、ＭＸＴマウス腫瘍を移植した翌日から、１日１度、
皮下注射のルートで措置が行われた。
実例26［Ｌys（εＦmos）］５−ＧnＲＨ−IIIの調製
このペプチドは自動ペプチド合成装置を用いて、ベンジルヒドリルアミン樹脂
（0.65ミリ当量/ｇ容量）上で調製される。その樹脂の容量基準で計算して３当
量以上の保護アミノ酸Ｂoc−グリシンが用いられ、さらに、上記保護アミノ酸と
等しい当量のＤＩＣが濃縮剤として、またＨＯＢtが触媒として用いられる。Ｂo
c−Ｇly−ＯＨのその樹脂に対する結合は12時間継続する。したがって、樹脂に
対する結合の終了は樹脂／保護されたアミノ酸化合物のニンヒドリン反応によっ
てコントロールされる。Ｂoc−Ｇly−ＯＨの上記樹脂に対する結合は、通常、最
初の結合で完了するが、いくつかの例でニンヒドリン反応がポジティブな結果を
もたらした場合（これはベンズヒドリルアミン樹脂のアミノ基が十分に置換され
ないことを意味している）、その樹脂に対する結合はシンメトリック無水物法を
用いて完全なものとすることができる（体積増加に基づいて判断すると、この樹
脂の容量(capacity)はメーカーが示している値の75〜80％程度に相当する）。通
常の方法でＢoc−Ｇly−ＢＨＡ樹脂を切断、中性化した後、以下の方法でペプチ
ド合成を行う。
分
１. ジクロロメタンで３回洗浄 ２
２. ＴＦＡとジクロロメタンの体積で１：２の
比率の混合物で一度切断 ２
３. ＴＦＡとジクロロメタンの体積で１：２の
比率の混合物で一度切断
４. クロロメタンで３回洗浄 ２
５. エタノールで３回洗浄 ２
６. クロロフォルムで３回洗浄 ２
７. トリメチルアミンとクロロフォルムの体積で
１：９の比率の混合物で二度中性化
８. クロロフォルムで二度洗浄 ２
９. ジクロロメタンで３回洗浄 ２
10. Ｂoc−アミノ酸の追加
11. ジイソプロピルキャルボジイミドと１回結合 120〜300
13. エタノールで洗浄
Ｂoc保護基を切断する際、副作用を防ぐために、重量で0.5〜10％のインドー
ルと重量で0.2％のチオアニソールの混合物、または重量で２％のアニゾールと
重量で0.2％のＬ−メチオニンを用いる。保護アミノ酸は通常、カーボジイミド
法を用いて結合されるが、（Ｌeu，Ｔrp，Ｃpaなど）（高い立体要求＝steric d
emandを有する）大量のアミノ酸の場合はＢＯＰを用いる。
ポジティブニンヒドリン反応の場合、結合はカーボジイミド結合後にシンメト
リック無水物を用いて、あるいはＢＯＰ剤結合後にＢＯＰ剤を用いて行う。この
合成の過程で、モル比で、ＤＩＣカップリング剤の３倍の量のＢoc−アミノ酸お
よびＨＯＢt触媒を含有しているジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）溶液と0.5ミ
リモルのＢＨＡ樹脂で計算したＨＯＢt触媒を手順の順で用いる。本例では、位
置５のアミノ酸をしてＢoc−Ｌ−Ｌys（ε−Ｆmoc）−ＯＨ保護アミノ酸を用い
た。
側鎖の保護基とペプチドはＨＦ溶液を用いて、体積で10％のアニソルを含有し
た−−クレゾール2.5mlと100mgのジチオスレイトールの存在下、０℃の温度で１
時間、0.25ミリモル
のペプチド−ＢＨＡ樹脂が20−25mlのＨＦ内に保持されるような方法でその樹脂
から除去される。減圧下でＨＦを取り除いた後、無水ジエチルエーテルで残滓を
措置した後、ペプチドを15〜33体積％のアセチル酸溶液でその固体残滓から溶解
される。本例では、ペプチドのフッ化水素塩は33体積％のアセチル酸でセパデッ
クスＧ−25カラム内でゲルろ過によって精製し、化学的純度が85％の粗生成物36
0mgが得られる。Ｒf２＝0.5。その後、ペプチドをＣ18逆相シリカゲルカラム上
で傾斜溶液を用いて精製される。
実例27Ｌys5−ＧnＲＨ−IIIの調製
240mgの粗中間ペプチド誘導体を10mlのＤＭＦと水の１：１比率混合物内に溶
かし、撹拌しながら、また氷水で冷却しながら２mlのピペリジンを加える。2.5
時間後、この混合物を蒸発させ、残滓を３３％の酢酸に溶かし、セファデックス
Ｇ−25カラムで精製した。各画分をＴＬＣで調べ、主要生成物を集める。粗生成
物はＭＰＬＣ手順を用いて精製する。
カラムの作動条件は以下の通り：プリペックスＣ−18（25〜40μ，Phenomenex
，ＵＳＡ）カラム：400mm（長さ）×25mm（直径）、流出液Ａ：70体積％の0.05
Ｍアンモニウムアセテート溶液（pH：4.00）および30体積％のメタノール、流出
液Ｂ：50体積％の0.05Ｍアンモニウムアセテート溶液（pH：4.00）および50体積
％のメタノール。
溶出は溶液ＡおよびＢで構成される流出液を用いて傾斜溶
出によって行われる。純粋な主要画分が集められ、次に、塩を除去し、その後、
上のカラム上で傾斜溶出を実行することで精製される。流出液：Ａ：10％酢酸40
0ml，Ｂ：Ａとイソプロパノール400mlの80：20混合物。純粋な画分を集めて、残
滓を凍結乾燥して、目的生成物77mgを得る。Ｒf１＝0.40，Ｒf２＝0.15。
実施例28Ｌys５，シクロ「Ａsp６−Ｌys８］−ＧnＲＨ−IIIの調製
a) 実施例26で述べた粗中間ペプチド誘導体（120mg）を、そのペプチド１を
６mlの水に溶かしてから２mlの0.1Ｎ塩酸溶液を加えることによって、その塩酸
塩に形質変換する。減圧状態下でその溶液を乾燥状態にまで蒸発させ、102mgの
塩酸塩を得る。Ｒf２＝0.5。
b) 環化：ＤＭＦ25ml内にステップ３/ａ）のペプチド塩化物29mgを含んでい
る溶液を０℃まで冷却してから、200μlの１％炭酸水素ナトリウム溶液を加える
。同時に、10mgのＢＯＰ剤と10mgの１−ヒドロキシベンゾトリアゾルを５mlのＤ
ＭＦに溶解し、上記水溶液にゆっくり加える。その後、170μlのジイソプロピル
エチルアミン（ＤＩＥＡ）と５mlのＤＭＦを含有する原料溶液から、200μlを反
応混合物に加え、室温で一昼夜撹拌する。生成した中間ペプチド（Ｒf２＝0.6）
は分離せずに次の形質変換処理にかけられる。c) Ｆmoc基の除去。減圧下で反
応混合物３/ｂ）を蒸発させた後、残滓をエチルアセテートと共に粉末化し、ろ
過する。その固体分
を５mlのＤＭＦと200μlのピペリジンの混合物を付加して、反応混合物を減圧状
態下で蒸発させる。残滓を33体積％酢酸に溶かして、セファデックスＧ−25カラ
ム上で精製する。主要生成物を含んだ画分をＭＰＬＣ法でさらに精製する。
流出液Ａ：70体積％の0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液および30体積％のメタノー
ル、Ｂ：30体積％の0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液、および70体積％のメタノール
。純粋な留分を２度凍結乾燥して、目的の生成物11mgを得る。Ｒf２＝0.35，Ｒf
７＝0.187。
実施例29Ｌys5「Ｌys(ε−Ｆmoc)］8−ＧnＲＨ−IIIの調製
Ｂoc−Ｌ−Ｌys（ε−Ｆmoc）−ＯＨが、ＧnＲＨ−IIIの位置８にあるＢoc−
Ｌ−Ｌys（ε−Ｚ）−ＯＨの代わりに使われ、一方で位置５にあるＢoc−Ｌ−Ｌ
ys（ε−Ｚ）−ＯＨは保護されたアミノ誘導体としてＢoc−Ｈis（Ｔos）−ＯＨ
の代わりに採用されるという点が，実施例26で説明された方法とは異なる。精製
は実施例26の方法を使用して行う。335ｇ（化学的純度は約80％）の収量で、粗
ペプチドが得られる；Ｒｆ２＝0.55。
実施例30Ｌys4「Ｌys(ε−Ｆmoc)]8−ＧnＲＨ−IIIの調製
１ミリモルのＢＨＡ樹脂を使うことによって、Ｂoc−Ｌys（ε−Ｆmoc）−Ｏ
Ｈが、ペプチドの８位置にある保護されたアミノ酸と位置４にあるＢoc−Ｌys（
ε−Ｚ）−ＯＨとし
て使われる点が、実施例26と異なる。セファデックスＧ−25カラム上で精製後、
純度約80％、1.04ｇの収量で粗ペプチドが得られる；Ｒf２＝0.29。
精製のため、20％の酢酸に550mgの粗ペプチドを含んだ溶液が実施例27の方法
でＭＰＬＣカラムにかけられ、最初に20体積％酢酸200mlで溶出が行われ（イソ
クラティック流出）、次に溶液をそれぞれ400ml使った傾斜溶出により精製した
。溶液Ａ：20体積％酢酸。溶液Ｂ：溶液Ａとイソプロパノルが３：１の混合液。
画分は集められ凍結乾燥され、その結果、217mgの目的生成物が得られる；Ｒf２
＝0.45，Ｒf７＝200.18。
実施例31Ｌys４−ＧnＲＨ−IIIの調製
10mlのＤＭＦに実施例31で得た200mgの粗ペプチド溶液に、10％のピペリジン
を含んだ15mlのＤＭＦが氷水で冷した状態で加えられる。１時間後、反応混合物
を蒸発させ、残留物をＭＰＬＣと、25％酢酸から25％酢酸とメタノールの混合比
が最大２：１の混合液で傾斜溶出によって精製される。かくして、68mgの純粋生
成物が得られ、それらがＴＬＣとＨＰＬＣ分析によって均一であることが証明さ
れた。；Ｒf１＝0.5，Ｒf２＝0.67，Ｒf３＝0.05。
実施例32[Ｌys（ｉ−Ａc）]４−ＧnＲＨ−IIIの調製
30mlのＤＭＦに実施例31で得た200mgの粗ペプチドを含ん
だ溶液に、ＤＴＥＡと130mgのイミダゾールを加え、次いで５mlのジクロロメタ
ン（ＤＣＭ）と200μlの酢酸無水物の混合液を、撹拌、冷却しながら滴下させる
。１時間後、反応混合物が減圧状態下で蒸発させられる。残留物はジエチルエー
テルと共に粉末化され、エーテル状の上澄み液はデカントされ、残留物は15mlの
ＤＭＦに溶かされる。次に200μlのピペリジンを含む２mlのＤＭＦが加えられ、
１時間後、蒸発させられる。残留物は20％酢酸に溶かされ、ＭＰＬＣ法を使って
精製される。傾斜溶出（20％酢酸と、10％酢酸とメタノールが６：４の混合液で
構成された）を使うことによって溶離が行われ、70mgの純粋生成物が得られ、そ
れらがＴＬＣとＨＰＬＣ分析によって均一であることが証明された。Ｒf２＝0.0
67，Ｒf７＝0.087。
実施例33Ｇlu6−ＧnＲＨ−IIIの調製
Ｂoc−Ｇlu−25（ＯＣhx）−ＯＨが、ＧnＲＨ−IIIの位置６にあるアミノ酸の
保護に使われる点が、実施例26と異なる。精製は、実施例２により、アンモニア
アセテート緩衝液における傾斜溶出を使うことによって行われる。生成物の特性
値は：Ｒｆ＝18 0.19，Ｒf７＝0.086。
実施例34cyclo［Ａsp6−Ｌys8］−ＧnＲＨ−IIIの調製
出発物質としてヤツメウナギＧnＲＨ−IIIデカペプチドを使うことによって、
実施例28による塩酸塩を調製した後で、
環化が実施例28の方法で行われる。生成物は実施例27の方法で精製される。
実施例35Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−IIIの調製
Ｂoc−Ｇly−ＯＨの代わりに、Ｂoc−Ｄ−Ａla−ＯＨ保護されたアミノ酸が、
最初のアミノ酸としてベンズヒドリルアミン樹脂に結合する点が、実施例26と異
なる。精製は、実施例27の方法で行われる。
実施例36Ｈ−Ｄ−Ｔrp1，[Ｌys(ε−Ｆmoc)]8，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−IIIの調製
ＧnＲＨ−III配列において、Ｂoc−Ｄ−アラニンが最初のアミノ酸に結合する
点が、実施例26と異なる：位置８のリジンの場合は、保護されたアミノ酸Ｂoc−
Ｌys（ε−Ｆmoc）−ＯＨはデカペプチドＢoc−Ｄ−Ｔrp−ＯＨ保護されたアミ
ノ酸のＮ−末端と結合する。精製はセファデックスＧ−25カラム上で、実施例26
により達成される。中間誘導体は実施例26による傾斜溶出を使って精製される。
実施例37Ａc−Ｄ−Ｔrp1，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−IIIの調製
実施例36によって調製された、保護されたペプチド−ＢＨＡ樹脂から、Ｂoc基
が実施例26の方法によって取り除かれ、次いで遊離アミノ末端を有するペプチド
−ＢＨＡ樹脂が、酢酸無水物とイミダゾールの混合液でアセチル化される。その
後、目的ペプチドが上記樹脂から実施例１に従ってＨＦ液によって切り離され、
保護基は実施例32の方法で分離され、生成物は実施例27の方法によって精製され
る。
実施例38Ｈ−Ｄ−Ｔrp１，Ｄ−Ａla10−ＧnＲＨ−IIIの調製
Ｆmoc保護基は、実施例36で調製された保護中間ペプチドより実施例32の方法
によって除去される。粗ペプチドの精製は実施例27に従って行われる。
実施例39[Ｔrp(Ｆor−Ｉnd)]3,7−ＧnＲＨ−IIIの調製
ＧnＲＨ−III配列Ｂoc−Ｌys（ε−Ｚ）−ＯＨの位置８と、Ｂoc−Ｔrp（Ｆor
−Ｉnd）−Ｈの位置３および位置７とに、保護されたアミノ酸誘導体が使われて
いる点が実施例26と異なる。精製は実施例26の方法に従って行われる。
実施例40Ｐhe7−ＧnＲＨ−IIIの調製
Ｂoc−フェニルアラニンがＧnＲＨ−III配列の位置７に使われていることが、
実施例26と異なる。精製は実施例26の方法によって行われる。
実施例41ＧnＲＨ−III（１−９）−エチルアミドの調製
ＧnＲＨ−III配列の保護されたアミノ酸は、実施例26に従って調製された1.46
ミリモルのＢoc−Ｐro−Merrifield樹脂から開始して、結合される。側鎖上に保
護されているペプチ
ドは、ＤＭＦに20％のエチルアミンを入れた溶液で、10℃で48時間撹拌すること
によってその樹脂から切断される。Ｒf２＝0.5。
減圧下でＤＭＦを蒸発させた後、残留物はジエチルエーテルと共に粉末化され
る。実施例26の液体水素フッ化物を使うことによって、側鎖の保護基が、保護さ
れた粗ペプチドから取り除かれる。粗ペプチド16はまず、セファデックスＧ−25
カラム上で、そして次に中圧液体クロマトグラフィで精製され、215mgの目的生
成物が得られる。Ｒf２＝0.31。
実施例42Ｌys5，Ｄ−Ｔrp6−hＧnＲＨの調製
0.5ミリモルのＢＨＡ樹脂から始めて、実施例26の方法に従って、保護された
アミノ酸として、ヒトＧnＲＨのアミノ酸列による位置６のＢoc−Ｇlyの代わり
に、Ｂoc−Ｄ−Ｔrp−ＯＨが合成に使われ、また位置５のＢoc−Ｌ−Ｔrp（Ｂzl
）−ＯＨの代わりに、Ｂoc−Ｌ−Ｔrp（ε−Ｚ）−ＯＨが使わる。精製はセファ
デックスＧ−25を使って実施例１の方法で行われる。傾斜溶出は400mlの次の各
溶液で行われる：Ａ：0.05Ｍアンモニウムアセテート70％溶液と30％メタノール
25，Ｂ：0.05Ｍアンモニウムアセテート30％溶液（pH4.00）と70％メタノール。
得られた溶液はアンモニウムアセテートを除去するために３回凍結乾燥され、52
mgの目的生成物を得る。Ｒf２＝0.34，Ｒf７＝0.21。
実施例43Ｌys4，Ｄ−Ｔrp6−hＧnＲＨの調製
hＧnＲＨのアミノ酸配列より、位置６のＢoc−Ｄ−Ｔrp−ＯＨが使われ、位置
４の、保護されたアミノ酸誘導体であるＢoc−Ｌ−Ｌys（ε−Ｚ）−ＯＨが、Ｂ
oc−Ｌ−Ｓer（Ｂzl）−ＯＨの代わりに使われる点が、実施例26と異なる。生成
物の精製は実施例42の方法で行われ、60mgの純粋生成物を得る。
実施例44Ｈ−Ｇlu1，Ｄ−Ｔrp6−hＧnＲＨの調製
ｈＧnＲＨのアミノ酸配列により、位置６のＢoc−Ｄ−Ｔrp−ＯＨがＢoc−グ
リシンの代わりに使われ、一方、位置１の、保護されたアミノ酸誘導体であるＢ
oc−Ｌ−Ｇlu−（ＯＣhx）−ＯＨが、パイログルタミン酸の代わりに使われる点
が、実施例26と異なる。生成物は以下の点を除いては実施例26の方法で精製され
る。つまり、アンモニウムアセテートで傾斜溶出した後、塩を取り除くステップ
が挿入され、そのステップで300mlの次の各溶液を使ってＭＰＬＣカラム上で傾
斜溶出が行われる；溶液Ａ：20％酢酸；溶液Ｂ：Ａ溶液とイソプロパノールが３
：１の混合液。純粋留分が集められ凍結乾燥され、53mgの目的生成物を得る。Ｒ
f１＝0.29；Ｔf17＝0.19。
実施例45Ｌys5，Ｄ−Ｐhe6−ｈＧnＲＨ（１−９）−エチルアミドの調製
実施例41により、Ｂoc−Ｐro−Merrifield樹脂が出発物質
として使われるが、合成は、保護されるアミノ酸として、位置６のＢoc−Ｐ−Ｐ
he−ＯＨと位置５のＢoc−Ｌys（ε−Ｚ）−ＯＨが使われた以外は、ヒトＧnＲ
Ｈの配列に従って行われる。ペプチドは、エチルアミンの中で、０℃で８時間、
撹拌し、次にエチルアミンが蒸発している間、室温で一昼夜撹拌することによっ
て樹脂から切断される。その後、メタノールとＤＭＦで洗浄することによって、
保護された非ペプチドエチルアミドが樹脂から溶解される。得られた溶液は蒸発
させ、残留物はエーテルで砕いて結晶化させる。得られた生成物は実施例26に従
ってＨＦ液で措置され、実施例27のＨＰＬＣ法によって精製される。
実施例46Ｌys4，Ｐhe6−hＧnＲＨ（１−９）エチルアミドの調製
位置４にある保護されるアミノ酸として、Ｂoc−Ｌys（ε−Ｚ）一ＯＨが使わ
れた以外は、実施例45に準ずる。
実施例47Ｌys5，Ｄ−Ｃpa6−ＧnＲＨ（１−９）エチルアミドの調製
位置６にある保護されるアミノ酸として、Ｂoc−Ｄ−Ｐhe−ＯＨの代わりに、
Ｂoc−Ｄ−Ｃpa−ＯＨが使われる以外は、実施例45に準ずる。試験管内実験で使われるヒト細胞株
ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株ＭＣＦ−７は、Souleらによって1973年に、乳腺悪性
腫瘍を持つ患者の胸膜液から安定化された。ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−231は、
Cailleauらによって1974年に胸膜液から同様に分離され、安定化された。両細胞
株は単一層で成長する。ヒト乳腺悪性腫瘍細胞株であるＭＣＦ−７とＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−231はプラスチックのフラスコ（Greiner）の、10％の子牛胎児の血清を含ん
だ培養液ダルベッコ修正Eagle−ＭＥＭ（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）の中で保存さ
れる。細胞株ＭＦＣ−７は、ＧnＲＨを特殊な形で結合した蛋白質を含む陽性卵
胞ホルモン受容体（ＥＲ）である。したがって、上記細胞株は、ＧnＲＨ受容体
が介在するＧnＲＨの直接作用を研究するために、有効なモデルシステムである
。ＥＲがネガティブで、ＧnＲＨ受容体がポジティブであれば、ＭＤＡ−ＭＢ−2
31細胞株は同様に、ＧnＲＨの直接作用を研究するのに適切である。ヒト前立腺
悪性腫瘍細胞株ＰＣ３は、Kaighnらによって1979年、細胞培養で安定化された。
これらの細胞は上皮組織タイプのもので、クローン遺伝子アッセイでコンパクト
な細胞群を形成する。Ishikawa細胞株はヒト子宮内膜悪性腫瘍［M．Nishida et
al．：Acta Obstet．Gynecol．Jpn．37，1103−1111（1985）］から得られるも
ので、この細胞株もその特質上、上皮組織であり、ステロイドおよびＧnＲＨ受
容体を含んでいる。
実施例48ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ−231ヒト乳腺悪性腫瘍、ＰＣ３前立腺癌およびIshik awa子宮内膜腫瘍細胞培養におけるＧnＲＨ同族体の用量−生残率の関係
この調査は用量を変化させた場合の被検物質の細胞損傷効果についての詳細な
情報を与えてくれる。措置は以下のようにして一度だけ行われた。生き残った細
胞から形成されたコロニーは８〜12日後にカウントされた。ホルモンを用いた場
合、これらの物質は一般的に毒性を示さず、それぞれ、細胞あるいは受容体に固
有の性質を示すという大きな利点を有していた。ＧnＲＨ同族体は相特異性であ
り、それらはＧＧＩ相で細胞を破壊した。捕捉（arrest）された細胞の一部は再
びサイクルに入り、他の一部は破壊することができた（apoptosis）。捕捉細胞
から形成されたコロニーはコロニーをカウントする日までに、カウントできるサ
イズのコロニーか形成しなかった（コロニー数は同じであるかもしれないが、コ
ロニーのサイズは同じであり得ない）。用量と反応の関係に関する調査では、細
胞15個以下を含んでいるコロニーはカウントされなかった。300個の細胞を直径3
.5cmの各ペトリ皿に入れた。措置はセット24時間後に一度行われ、そして８〜12
後に形成されたコロニーがカウントされた。細胞は24時間後に上の実施例で述べ
た種々のＧnＲＨ類似部を１〜50μM、あるいはＧnＲＨ−IIIを１〜50μMそれぞ
れ用いて一度行われた。ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ−231，ＰＣ３およびIshikaw
a細胞上で得られた抑制のパーセンテージを、用いられた活性剤の量と共に表VII
Iに示す。
これらの調査結果に基づいて、50μMの容量で用いられた場合、公知のＧnＲＨ
−IIIペプチドはＭＣＦ−７およびＭＤ
Ａ−ＭＢ−231細胞培養体のコロニー形成に対してそれぞれ45％と49％の抑制効
果を示した。どのＧnＲＨアゴニスト（オバレリン、ブセレリン）を用いた場合
、あるいはＧnＲＨアンタゴニスト（ＭＩ−1544）を場合でさえ、今日までのと
ころ、有意な抑制効果は認められていない。ＧnＲＨ−IIIは用いられた用量範囲
ではIshikawa細胞株に対しては抑制効果を発揮せず、ＰＣ３前立腺細胞培養体の
コロニー形成を21％抑制しただけであった。ＧnＲＨ−IIIペプチドの効果は、Ｍ
ＣＦ−７で65％、ＭＤＡ−ＭＢ−231で63％の抑制効果を示した実施例17の化合
物を下回った。実施例42の化合物を除けば、実施例31および32のペプチドはＭＤ
Ａ−ＭＢ−231乳腺悪性腫瘍細胞株上で最も効果的であった（32〜42％）（表VII
I）。ＰＣ３前立腺細胞株上では、実施例８の化合物が50μMの用量で投与された
場合、最も強い抑制効果（31％）を示したのに対して、化合物６および７は影響
を示さず、化合物17は用いられた用量範囲でＰＣ３細胞株のコロニー形成能力を
わずかに抑制した（表VIII）。Ishikawa子宮内膜腫瘍細胞培養体上で50μMの用
量で用いられた場合、以下の結果が得られた。化合物３ではコロニー形成の14％
抑制；化合物６では21％；化合物７では14％；化合物８では２％；化合物17では
15％；そして化合物14では25％。
これらの研究で、腫瘍治療で一般的に用いられているＤ−Ｔrp６−hＧnＲＨ同
族体（Sigma Ｃo．）がコントロールとして用いられた。表VIIIのデータから、
テストされた同族体の
中で、実施例26および40の同族体は、効果があっても、弱かった。同族体14およ
び19はコントロールの活性とほぼ同じであった。他の同族体（３，６，７および
８）はコントロールの抑制効果を上回っていた。同族体17は２倍強い抑制効果を
示した。
実施例49ヒト腫瘍細胞株の細胞分裂の抑制
トリプシンで措置した後、ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ−231，ＰＣ３またはIsh
ikawaのそれぞれ30万個をそれぞれ直径10cmのペトリ皿に入れた。セットの翌日
から、それらの細胞と指数的成長段階で、ＧnＲＨ同族体１〜50μMで措置した。
５日間続けられた実験中、それらの細胞は２日に１度ずつ栄養液に溶解したペプ
チドホルモンで措置し、次に、６日目に細胞数をカウントした。
30μMで用いられた場合、ＧnＲＨ−IIIはＭＣＦ−７とＭＤＡ−ＭＢ−231細胞
の両方に対して35〜40％の抑制効果を示した。これらの調査によれば、hＧnＲＨ
アゴニストとしてのオヴレリンまたはブセレリンは措置後６日目にＭＣＦ−７
ＥＲ−前立腺細胞株の細胞数に大幅な変化は引き起こさなかった（５−１５％程
度の抑制）が、それらはＤＭＡ−ＭＢ−231 ＥＲネガティブ細胞株の細胞増殖
は25〜30％程度抑制した。
30μMの用量で用いられた場合、ＧnＲＨ−IIIの抗増殖効果は両方の乳腺腫瘍
細胞株で公知のＧnＲＨアンタゴニスト
（いくつかのＤアミノ酸、ＭＩ−1892およびＭＩ−1544を含有した乳腺ＧnＲＨ
誘導体）と直接的な抗腫瘍効果と一致した。両方の物質６と７の増殖抑制効果は
いくつかのＤ−アミノ酸（ＭＩ−1544，ＭＩ−1892，ＳＪ−1004）を含有したＧ
nＲＨアンタゴニストの直接的増殖抑制効果とほぼ同じであった（27〜31％）（
表IX）。
表IXに示されているいるように、化合物15を除けば、これらの物質の増殖抑制
効果は一定の限度内でコロニー形成抑制の結果と一致した。コロニー形成の抑制
とそれら物質のインビボでの効果との間にも強い相関関係が存在する。比較対象
として用いられたのペプチド類の組成は以下の通りである。
ＭＩ−1892：
Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa2，Ｌys5[β−Ａsp(ＤＥＡ)]6，Ｄ−Ａla10−hＧ
nＲＨ
ＭＩ−1544：
Ａc−Ｄ−Ｔrp1,3，Ｄ−Ｃpa2，Ｄ−Ｌys6，Ｄ−Ａla10−hＧnＲＨ
[M．Kovcsら:Peptides 10，925-931(1989)]
ＳＪ−1004：
Ｄ−Ｐhe2，Ｄ−Ｔrp3，Ｄ−Ｌys6−hＧnＲＨ
ＧnＲＨ−III：
pＧlu−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｈis−Ａsp-Ｔrp−Ｌys−Ｐro−Ｇly−ＮＨ2
Decapeptyl：
pＧlu−Ｈis−Ｔrp−Ｓer−Ｔyr−Ｄ−Ｔrp−Ｌeu−Ａrg−Ｐro−Ｇly−ＮＨ2
この明細書で述べられているいずれの特許あるいは出版物も、本発明が関連す
る技術に通じた人々のレベルに適したものである。これらの特許および出版物は
、個々の出版物が個
別的、具体的に参照されているのと同じ程度に、本明細書中に引例として組み入
れられるものである。
当業者であれば、本発明が上記目的を達成し、課題や利点、あるいはそれらと
本質的に関連した課題や利点を得るのに良く適合していることは容易に分かるで
あろう。本実例はここに述べられている方法や手順、措置、分子、および具体的
な化合物は現在の段階で好ましい実施例を代表するものであり、具体例であって
、本発明の範囲を限定することは意図していない。特許請求の範囲に定義されて
いるような発明の精神の範囲内で、変更や他の利用法は当業者には容易に想起で
きるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
// Ｃ０７Ｋ 105:00
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ
(71)出願人 カルネイ，アドリエン
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(71)出願人 ガアル，デザ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(71)出願人 パイジィ，イーシュトヴァーン
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(71)出願人 テューリィ，ギゼラ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(71)出願人 ヴィンズ，バーバラ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(71)出願人 メゾ，イムレ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(71)出願人 タネイ，エンリエタ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(71)出願人 ヴァダーズ，ゾート
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(71)出願人 タプラン イーシュトヴァーン
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(71)出願人 セプローディ，ジャーノース
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(74)上記１４名の代理人 弁理士 佐田 守雄
(72)発明者 ラヴァス，シャーンドウ
アメリカ合衆国 68178 ネブラスカ オ
ウマハー，キャリフォーニア プラザ
2500
(72)発明者 マーフィー，リチャド，エフ.
アメリカ合衆国 68178 ネブラスカ オ
ウマハー，キャリフォーニア プラザ
500
(72)発明者 トウト，ゲイザ
ハンガリィ セジド エイチ―6701 ピ
ー．オー．ボックス 521
(72)発明者 カルネイ，アドリエン
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(72)発明者 ガアル，デザ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(72)発明者 パイジィ，イーシュトヴァーン
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(72)発明者 テューリィ，ギセラ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(72)発明者 ヴィンズ，バーバラ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1122 ラート ジャージィ ストリート
７―９
(72)発明者 メゾ，イムレ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(72)発明者 タネイ，エンリエタ
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(72)発明者 ヴァダーズ，ゾート
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(72)発明者 タプラン イーシュトヴァーン
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(72)発明者 セプローディ，ジャーノース
ハンガリィ ビューダペスト エイチ―
1088 パスキン ユー．９
(72)発明者 ザボウ，エディート，ジィ.
ハンガリィ 1088 パスキン ユー．９
ビューダペスト ゼマルヴィス ユーナヴ
ァーサティ メディカル スクール，ファ
ースト インスタテュート オブ バイオ
ケミカル
(72)発明者 パトウ，ジャーノウ
ハンガリィ 1025 パズタザリ ユーティ
56―67 ビューダペスト セントラル
リサーチ インスタテュート フォァ ケ
ミカル オブ ザ ハンガリアン アカデ
ミィ オブ サイエンス
(72)発明者 モーラ，ミリンダ
ハンガリィ 1025 パズタザリ ユーティ
56―67 ビューダペスト セントラル
リサーチ インスタテュート フォァ ケ
ミカル オブ ザ ハンガリアン アカデ
ミィ オブ サイエンス