DE2215687C3

DE2215687C3 - Neue wasserunlösliche Proteinpräparate

Info

Publication number: DE2215687C3
Application number: DE2215687A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr. 5074 Odenthal Bartl; Bruno Dr. 5090 Leverkusen Boemer; Fritz Dr. Hueper; Erich Dr. Rauenbusch; Guenter Dr. Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1980-12-11
Also published as: JPS496114A; US3871964A; IT1033413B; HU169022B; IL41886A; BG25648A3; PL90704B1; AR201660A1; LU67314A1; DE2215687B2; SE420203B; CA1036745A; IE37476B1; TR17197A; KR780000242B1; IE37476L; FR2186478A1; DE2215687A1; FI52731C; BE797505A

Description

Die Erfindung betrifft neue wasserunlösliche Proteinpräparate, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Proteine handelt, welche an neue, vernetzte, quellfähige Copolymerisate fixiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen wasserunlöslichen Proteinpräparate und die Verwendung von neuen wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z.B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleinsäureanhydrkjs mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäßrigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während der Umsetzung zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer, z. B. ein Diamin, zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und. besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vgl. E Katchalski, Biochemistry 3 [1964], Seiten 1905-1919).

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die AnhyU.idform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernc'zt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen ein*? nur mäßige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten '-si der Anwendung dieser Harze führt (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 19 08 290).

Außerdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen — in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid —, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 20 08 996).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit neuen stark vernetzten, in Wasser quellfähigen Copolymerisaten mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dicarbonsäureanhydridgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Die neuen Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit den neuen Copolymerisaten sollten die Nachteile der bisher bekannten Proteinpräparate nicht bzw. nur in geringerem Maße aufweisen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride «,^monoolefinisch ungesättigter Dicarbonsäuren, Di- oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- oder PoIyolen und mindestens ein weiteres hydrophiles Monomere zu statistisch aufgebauten Copolymerisaten polymerisiert und diese erfindungsgemäßen Copolymerisate mit wäßrigen Proteinlösungen zu Proteinpräparaten umgesetzt wurden.

Gegenstand der Erfindung sind somit Proteine, die an vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymeri-

sterten Einheiten von '

A 0,1 —30 Gew.-%, vorzugsweise 2—20 Gew,-% flc/3-monooIefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4—9 Kohlenstoffatomen,

B 35 -90Gew.-%, vorzugsweise 50—85 Gew.-% Di- und/oder PoIy-(Meth)Acrylaten von Di- und/oder Polyulen und

C 5 —60Gew.-%, vorzugsweise 10—50 Gew.-% mindestens eines nicht unter B genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2—20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1 —400 m²/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02—11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, fixiert sind.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Proteinpräparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere —

A 0,1 — 50 Gew.-%, vorzugsweise 2—25 Gew.-% «^!-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoffatomen,

B 35 — 90Gew.-%, vorzugsweise 50—85 Gew.-%

Di- und/oder Poly-(Meth)Acry-

late von Di- und/oder Polyolen

und

C 5 —60Gew.-%, vorzugsweise 10—50 Gew.-% mindestens eines hydrophilen

Monomeren

- die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 —

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20—200⁰C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und die so erhaltenen Copolymerisate mit Proteinlösungen unter Bildung der erfindungsgemäßen Proteinpräparate umsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von erfindungsgemäß erhaltenen wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Über die Darstellung der als Ausgangsprodukte für die S>nthese der Proteinpräparate benötigten Copolymerisate ist folgendes zu sagen.
Als «^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4—5 Kohlenstoffatomen, die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden, seien namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von Di- und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxiden mit 2—8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2—4 Kohlenstoffatomen

oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1 —1(H, bevorzugt 1—to Alkylenoxidbausteine anpolymerisiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxid, Trimethylenoxid, Tetramethylenoxid, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxid, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxiden zur Herstellung der Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylate zu verwenden.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und PoIy-(Meth)Acrylate von Di- und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di- und/oder Polyole mit (Meth)Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert Aminen wie Triethylamin, bei Temperaturen unter 20⁰C, in Anwesenheit von Benzo! gewonnen (vgl. deutsche Offcnlcgungsschrift 19 07 666). Als Di- bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2—12 Kohlenstoffatomen kommen z.B. in Frage: Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole, insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxide™, wie vorstehend angegeben. Auch Poly-bis-chlormethyi-oxacyclobutan oder Polystyroloxid sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2—4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 — 10 Molen Alkylenoxid mit 2—4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.

Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgv-wichten bis 500 oder deren Gemische.

Die dritte Gruppe der Copolymerisationskomponenten besteht aus einfach ungesättigten, hydrophilen Monomeren. Als solche können alle polymerisierbaren, einfach ungesättigten Verbindungen, welche keine gegen Anhydridgruppen reaktiven funktionellen Gruppen besiUen und hydrophile Pol>mere bilden, verwendet werden.

Die hydrophilen Monomeren besitzen vorzugsweise mindestens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe, wobei die Aminogruppen des Aminocarbonyl- oder Sulfamoyirestes ggf. durch Alkylgruppen mit i —4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxymethyl mit 1—4 Kohlenstoffatomen im Alkoxyrest substituiert sein können.

Beispielhaft seien Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäurehalbester mit 1—8 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, N-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-substituierte (Meth)Acrylamide wie N-Methyl- und N-Methoxymethyl-(meth)-acrylamid und N-Acryloyl-dimethyltaurin genannt.

Sie werden je nach der gewünschten Hydrophilie und Quellbarkeit der Copolymeren und der Länge der PoIyalkylenoxidkette(n) des mehrwertigen (Meth)-acrylesters in Mengen von 5—60 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt.

Außer der Hydrophilie beeinflußt der Zusatz dieser Monomeren über;/aschenderweise auch die Struktur der Polymeren, was bei der Herstellung von Pcrlpolymerisaten von ganz besonderem Vorteil ist, da hier die Auswahl der zur Monomerenmischung zufügbsren Verdünnungsmittel durch die Bedingungen der Unlöslichkeit in Paraffinkohlenwasserstoffen und der inertheit gegen Anhydridgruppen stark eingeschränkt wird.

Aufgrund der Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb " eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der

ίο erfindungsgemäßen Copolymeriate dem jeweiligen Verwendungszweck optimal angepaßt werden.

Falls gewünscht, können neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Trialiylcyanurat in Mengen von etwa 0,01—30 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt werden.

Die Polymerisation kann z. ß. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt v/erden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet Besonders günstige Lösungsmittel sind a'iphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubstituierte Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.

Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200⁰C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 6O⁰C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2—50, bevorzugt 5—20 Gew.-Teile, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflußt.

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Außerdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator al.* Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmitteimenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird. Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche jei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate werden vorzugsweise durch Suspensionspolymerisation hergestellt. Die gebräuchlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, ggf. unter Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden, läßt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in geringer Menge in das

Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt. Als zusammenhängende Phase eignen sich besonders Paraffinkohlenwasserstoffe, wie Hexan. Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan, sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäurelriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Das Volumenverhältnis, zusammenhängende Phase : Monomerphase beträgt I : I bis 10:1, vorzugsweise 2 : 1 bis 5 : I.

Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und -dioleate sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und -trioleate bzw. -stearate, Poiyäthyiengiykoimonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit ölsäure, Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen, sowie das Na-SaIz des Sulfobernsteinsäuredioctylesters verwendet werden. Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0,1 — 10%. bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgröße der Suspensionspolymerisate kann außer durch Vergrößerung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0,01—2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.

Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B. Azo verbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindiing ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxide wie Dibenzoylperoxid oder Percarbonate wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat in Frage, es können jedoch auch Diacylperoxide, Hydroperoxide und in organischen gruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0,01 — 14 mÄquiv/g, vorzugsweise 0,02—11 mÄquiv/g.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten im wesentlichen statistisch verteilt. Aufgrund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1.1 - bis 3fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können. Außerdem besitzen sie eine ausgezeichnete mechanische Stabilität und damit praktisch keinen Abrieb.

Die oben beschriebenen Trägerharze binden alle Substanzen, die eine funktionelle Gruppe tragen, die befähigt ist mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor aiiem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden. Man geht hierbei so vor. daß man zu einer gerührten wäßrigen Lösung des Proteins bei einer Temperatur zwischen 0 und 30°C die benötigte Polymerenmenge zugibt. Das Gewichtsverhältnis von Protein zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bit, 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig.

Bei zahlreichen Enzymen ist es auch zweckmäßig. Stabilisatoren zuzusetzen. Als solche kommen PoIyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung von Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen. Das pH wird zweckmäßig mit einem pH-Staten auf dem für die betreffende Bindung optimalen pH-Wert gehalten. Dieser pH-Wert liegt in einem Bereich von 2 bis 9. vorzugsweise 5 bis 7. Beim Einsatz von Penicillinacylase hat es

r.w ς 7

verwendet werden.

Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 — 10%, vorzugsweise 0,1 —3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt.

Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20—200⁰C, vorzugsweise 50—100°C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolyme.isationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2—20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0,1 —500 m²/g, bevorzugt 1 —400 mVg. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0,01 bis 14 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0,02—11 mÄquiv/g.

Die Suspensionspolymerisate sind weiße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03—3 mm, vorzugsweise 0,05—0,5 mm und Schüttvolumina von etwa 1,4—8 ml/g, vorzugsweise 1,4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydrid-

pH 6,8 zu arbeiten. Dabei müssen zur Konstanthaltung des pH-Wertes anorganische Basen (z. B. Alkalilaugen) oder organische Basen (z. B. tert. organ. Amine) zugesetzt werden. Der Fortschritt der Reaktion ist am Verbrauch der zur pH-Konstanthaltung nötigen Menge an Base ersichtlich. Bei Raumtemperatur werden bis zur Beendigung der Reaktion etwa 16 Stunden, bei 4° C bis zu 40 Stunden benötigt. Das Harz wird hierauf abgesaugt und zur Ablösung eines kleinen Anteils an ionugen gebundenem Protein mit Puffern bzw. Salzen im Konzentrationsbereich von 0,2 bis 1 M gewaschen.

Die gebundene Substanz wird entweder durch Elementaranalyse oder bei Enzymen oder Inhibitoren durch die enzymatische Aktivität bzw. die Hemmung der enzymatischen Aktivität bestimmt Die Ausbeuten an gebundener Substanz sind von der Art der Substanz und der Zusammensetzung des Polymeren abhängig. So wurden z. B. Aminosäuren und niedermolekulare Peptide praktisch vollständig angekoppelt; aber auch bei den Proteinen liegen die Ausbeuten an gebundener enzymatischer Aktivität bei 20 bis über 90% der eingesetzten Aktivität

Nach dem Stand der Technik (deutsche Offenlegungsschriften 19 35 711 und 20 08 990) wird die Ankoppelung der Proteine in Pufferlösungen in Konzentrationen von 0,05 M bis 0,2 M vorgenommen. Arbeitet man ohne

Puffer, so steigt der Anteil des ionogen gebundenen Proteins (deutsche Offenlegungsschrift 19 35 711). Überraschenderweise zeigte sich, daß bei den erfindungsgemäßen Harzen die Kopplung in möglichst ionenfreiem Medium maximale Ausbeuten an covalent > gebundenem Enzym ergibt. Das pH kann bei dieser Arh-itsweise durch einen pH-Staten sehr genau auf dem optimalen Wert konstant gehalten werden.

Die Anwendung von Enzymharzen ist technisch von besonderer Bedeutung, da mit ihrer Hilfe technisch wertvolle Produkte hergestellt werden können. Die vorherige Bindung der biologischen Katalysatoren nach dem vorliegenden Verfahren gestattet durch ganz einfache .Separationsprozesse ihre vollständige Abtrennung aus der Reaktionsmischung und ermöglicht i> die, aus wirtschaftlichen Gründen entscheidende, vielfache Wiederverwendung. Darüber hinaus wird in r!rn mriupn Fällrn Hip .Stabilität der empfindlichen und teuren Proteine entscheidend verbessert.

Im folgenden werden einige Beispiele der Anwen- -'" dung von trägergebundenen Substanzen angegeben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können.

Die Gruppe der Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase kann z. B. zur Herstellung von 2"> Proteinhydrolysaten für mikrobiologische Prozesse verwendet werden. Außerdem können die Enzyme auch zur Entfernung von antigenen Proteinen aus pharmazeutischen Wirkstoffen dienen.

■'icylasen werden technisch zur Herstellung von w 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen oder zur Trennung von Racematen acylierter Aminosäuren verwendet. Trägergebundene Amylase kann zum hydrolytischen Abbau von Stärke verwendet werden.

Spezielle Hydrolasen, wie Asparaginase oder Urease J-'> können in gebundener Form im extrakorporalen Kreislauf therapeutisch eingesetzt werden.

Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z. B. die Zusammenfassungen in Chem. Eng. News ·*" v. 15. 2. 1971, Seite 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83(1971).

Ein weiteres großes Anwendungsgebiet von an Trägern fixierten Substanzen ist die Affinitätschromatographie. So kann man mit gebundenen Antigenen oder auch Haptenen Antikörper und umgekehrt mit fixierten Antikörpern (y-GIobuIine) Antigene isolieren. Ebenso lassen sich Enzyme mit Hilfe gebundener Inhibitoren oder Substratanalogen spezifisch anreichern. Bekannt ist z. B. die Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin durch gebundene pflanzliche oder tierische Inhibitoren. Andere Beispiele sind die Gewinnung von Peptidasen an speziellen, gebundenen Peptiden oder die Isolierung von Plasmin mit an einem Träger gebundenem Lysin. Zusammenfassende Arbeiten über dieses Anwendungsgebiet sind von G. Feinstein in Naturwissenschaften 58, 389 (1971), und F. Fried in Chromatographie Reviews 14, 121 (1971), erschienen.

Zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6-APS) können Penicilline mit. Hilfe von Acylasen aus Mikro- M) Organismen wie zum Beispiel Bakterien, insbesondere E. coli, Erwinia oder Actinomyceten wie Streptomyces, Micromonospora, Nocardia und Pilzen wie Fusarium und Hefen gespalten werden.

Gemäß dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1111 778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Penicil-Iin-G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (E. C 15.1.11) enthält Durch die Einwirkung des Enzyms wird die seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der 0-Lactamring geöffnet wird.

Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile:

a. Die Suspension von Mikroorganismen enthält außer der intracellulären Penicillinacylase weitere Proteine und Enzyme sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b. Die Suspension von Mikroorganismen kann wirtschaftlich zweckmäßig nur einmal eingesetzt werden.

c. Die Suspension von Mikroorganismen enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Peniciiiin und/oder 6-APS durch öffnung des /?-Lactamringes inaktivieren.

d. Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z. B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich.

e. Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden Penicillinacylase-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab.

f. Die vollständige Abtrennung suspendierter Mikroorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinhaltigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (britische Patente U 69 696; 10 78 847; 11 14 311).

Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man anstelle einer Suspension von Mikroorganismus eine Penicillinacylase verwendet, die durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen Trager erhalten wird.

Versuche, 6-APS durch enzymatische Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase herzustellen, sind zwar bekannt (siehe dazu DE-OS 19 17 057, DE-OS 19 07 365), konnten jedoch nicht in einen technischen Maßstab übergeführt werden. Die Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb führt, zum anderen konnten bei mäßigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden.

Auch das in der deutschen Patentanmeldung P 21 57 970.4 verwendete unlösliche Enzym, das durch kovalente Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid gewonnen wurde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Maßstab Nachteile, da es stark quillt und mechanisch nicht stabil ist Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im technischen Maßstab. Es wurde nun gefunden, daß die genannten Nachteile vermieden werden, wenn eine an einen erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.

Die Spaltung von Penicillinen mit erfindungsgemäßer trägergebundener Penicillinacylase läßt sich einfach und auch im großtechnischen Maßstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75 000-150 000 IU/ml Penicillin, z. B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatische Spaltung wird bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6—9 vornehmlich im Bereich des pH-Optimums der jeweils gebundenen Penicillinacylase, z. B. bei pH 7,8, durchgeführt. Zur Neutralisation des abgespaltenen Acylrestes z. B. der Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wäßrige Alkalilösungen, z. B. Kali- oder Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triäthylamin. Aus dem Verbrauch der Base ist die Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das (Jleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums.

Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin. Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer Acylreste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.

Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38°C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z. B. bei 25°C durchgeführt, muß doppelt soviel Enzym wie bei 38°C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.

Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Außerdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100 000 IU/ml Penicillin-G-Kalium ist nach 10 Std. bei pH 7,8 und 38°C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase

nn D^_nUIK_n Γ.

durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozeß wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so daß nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozeß im Reaktionsgefäß verbleiben und

to direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann. Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen.

Ii wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflußgeschwindigkeit erlaubt.

Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionsiösung nach bekannten Verfahren gewonnen

-Ό (siehe z. B. deutsche Patentschrift 1111 778) und bei pH 4,3 kristallisiert.

Bei der erfindungsgemäßen Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Aus-

2ί beuten an 6-APS erhalten, als bei Verwendung von E.-coli-Schlamm, aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der deutschen Patentanmeldung P 21 57 970.4. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Aus-

ii) beute von ca. 90% d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei anderen Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Pro-

3> teine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäß hergestellten 6-APS ausgeschlossen.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene

Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hiernach ist die Enzym-

■w aktivität noch praktisch vollständig erhalten.

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden Lei Nor-

υ ι. ι .:_

Enzymeinheit (E) ist definiert als die Aktivität, die 1 μΜοΙ Penicillin G pro Minute bei 37°C zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert). Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0,5—1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 10⁵ IU Penicillin G 5 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur zwei Stunden. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase ist perlförmig, zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlust durch mechanische Beanspruchung, z. B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfindu?>gsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebertso eine schnelle und einfache Filtration, da B e i s ρ i e I la)

70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylsäure. 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und zunächst 4 Stunden bei 6O⁰C polymerisiert. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100-140⁰C) zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70⁰C und 2 Stunden bei 8O⁰C.

Das pulvrige Polymere wird gründlich mit Petroläther (Kp 30—50⁰C) gewaschen und im Vakuum getrocknet

Ausbeute: 96 g
Schüttvolumen: 8,8 ml/g
Quell volumen in Wasser: 12,4 ml/g Spez. Oberfläche: 8,6 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,85 mÄquiv/g

Beispiel Ib)

•ög des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes werden in einer Lösung von 610 U Penicillinacylase in 150 ml Wasser suspendiert Durch Zugabe von 1 N-NaOH mit einem pH-Staten wird der pH-Wert

auf 6,3 gehalten und die Suspension 20 h bei 25⁰C gerührt.

Dann saugt man über eine Glasfrittc- G 3 ab und wäscht mit je 300 ml 0,05 M-Phosphatpuffcr pH 7,5, der 1 M-Natriumchlorid enthält, und mit demselben Puffer > ohne Natriumchlorid. Durch weiteres V'aschen kann keine Aktivität mehr eluiert werden. Überstand und Waschlösungen werden vereinigt und ihre enzymatische Aktivität bestimmt. In einer aliquoten Menge wird die enzymatische Aktivität des feuchten Harzes gemessen.

Ergebnis:

Enzyna'ische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 610U r>

Über land + Waschlösungen 112 U

Trägerharz nach der Umsetzung 561 U

d.s. 92% der Ausgangsaktivität

Die enzymatische Aktivität der Penicillinacylase wird >n colorimetrisch oder titrimetrisch mit 0,002 M-6-Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NlPAB) als Substrat bei pH 7,5 und 25° C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden 6-Nitro-3-aminobenzoesäure beträgt E₄o5nm = 9090. 1 Einheit (U) :ϊ entspricht dem Umsatz von 1 μΜοΙ Substrat pro Minute.

Beispiel Ic)

In einer Lösung von 40 mg Urease in 32 ml Wasser werden 400 mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Bei ständigem Rühren bei Raumtemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf pH 6,0 konstant gehalten. Nach 16 Stunden ist die Reaktion beendet, das Harz wird ab- s> gesaugt und wie in Beispiel Ib) mit Puffer gewaschen.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität
Ausgangslösung
Überstand + Waschlösungen

168 U 64,5 U

d. s. 52% der Ausgangsaktivität

Die enzymatische Aktivität der Urease wird titrimetrisch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat bei 25⁰C und pH 6,1 bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die 1 μΜο! Harnstoff, d. h. 2 μΜοΙ Salzsäure pro Minute verbraucht.

Beispiel 1 d)

In einer Lösung von 100 mg Trypsin in 32 ml 0,02 M-Calciumchlorid werden 500 mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert Unter ständigem Rühren bei 4° C wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf pH 6,3 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und wie in Beispiel Ib) mit Puffer gewaschen.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität

Ausgangslösung 110 U

Überstand + Waschlösungen 15,6 U

Trägerharz nach der Umsetzung 64 U d. s. 58% der Ausgangsaktivität

Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 (1962), 278, mit Benzol-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 μΜοΙ Substrat pro Minute bei 25°C und pH 7,8.

Beispiel 2a)

Eine Lösung von 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid 'und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 1 I Benzol wird unter langsamem Rühren 4 Stunden bei 60°C, 2 Stunden bei 70° C und 1 Stunde bei 80° C polymerisiert. Das Polymere wird abfiltriert, dreimal in Benzol ausgerührt, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 70 g
Schüttvolumen: 7,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 8,2 ml/g
Spez. Oberfläche: 5.3 m²/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 2.55 mÄcjuiv/g

^?" B e i s ρ i e I 2b)

1 g des nach Beispiel 2a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand + Waschlösungen 21 U

Sd Trägerharz nach der Umsetzung 82 U

d. s. 69% der Ausgangsaktivität

Beispiel 3a)

60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 30 g Meth-S) acrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 300 ml Acetonitril gelöst. Diese Lösung wird in 1 1 Benzin (Kp 100- 140°C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat enthält, suspendiert und 22 Stunden bei 6O⁰C 4(i polymerisiert.

Die Polymerperlen werden abfiltriert, dreimal in Benzol und anschließend zweimal in Petroläther (Kp 30—50°C) suspendiert und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 94 g weiße Kugeln
Schüttvolumen: 4,4 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 5,5 ml/g
Spez. Oberfläche: 6,6 m²/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: -200 μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgrupp :. = 4,3 mÄquiv/g

Beispiel 3b)

1 g des nach Beispiel 3a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 118 U

Überstand + Waschlösungen 43 U

Trägerharz nach der Umsetzung 96 U

d. s. 81% der Ausgangsaktivität

Beispiel 4a)

Eine Lösung von 2100 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 600 g Methacrylsäure, 300 g Maleinsäureanhydrid und 30 g Azoisobuttersäurenitril in 7,5 1 Acetonitril

wird in 21 !Benzin (Kp 100-140⁰C), in dem 150 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert und 1 Stunde bei 50⁰C und 20 Stunden bei 60° C polymerisiert

Das Perlpolymerisat wird abgesaugt, zweimal mit Toluol und einmal mit Petroläther (Kp 30—50⁰C) ausgerührt und bei 60⁰C getrocknet

Ausbeute: 1$5 kg
Schottvolumen: 4,7 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 5,4 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: ca. 03 mm
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 4,0 mÄquiv/g

Beispiel 4b)

1 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

In der Ausgangslösung 107 U

Oberstand und Waschlösungen 27 U

Trägerharz nach der Umsetzung 67 U

d. s. 63% der Ausgangsaktivität

Beispiel 4c)

20 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren werden bei Raumtemperatur in 500 ml einer Lösung von 1,0 g unspezifischer Elastase aus Schweinepankreas unter Rühren eingetragen. Das pH wird hierbei auf 5,8 konstant gehalten. Nach einer Reaktionszeit von 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und in der in Beispiel Ib) beschriebenen Weise aufgearbeitet.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (Casein-Test)
Ausgangslösung
Überstand + Waschlösungen
Trägerharz nach der Umsetzung
d. s. 56% der Ausgangsaktivität

2180 E

993 E

1225 E

Ergebnis:

Enzymatisch^ Aktivität (NIPAB-Test)
Ausgangslösung
Oberstand + Waschlösungen
Trägerharz nach der Umsetzung
d. s. 52% der Ausgangsaktivität

20

25 U8U

34U
61 U

Beispiel 6a)

Eine Lösung von 50 g Äthylenglykoldimethacrylat, 40 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird in 1 I Benzin (Kp 100—140⁰C), in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerinmonooleat und -dioleat gelöst sind, suspendiert und 20 Stunden bei 60° C polymerisiert. Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und zweimal in Petroläther (Kp 30—50⁰C) suspendiert und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet

40

Die enzymatische Aktivität der unspezifischen Elastase wird titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 113 mg/ml) bei pH 8,0 und 25°C bestimmt. I Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1 μΜοΙ Kalilauge pro Minute.

Beispiel 5a)

Eine Lösung von 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat. 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 3a) polymerisiert.

Ausbeute: 92 g weiße, eiförmige Partikel
Schüttvolumen: 2,5 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 3,2 m!/g
Spez. Oberfläche: 1,7 mVg
Mittlerer Partikeldurchmesser: 125 μ Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,5 mÄquiv/g

Beispiel 5b) _b<.

1 g des nach Beispiel 5a) hergestellten Polymeren wird analog zu BeispieMb) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ausbeute: 87 g
Schüttvolumen: 4,S ml/g
Quellvolumen in Wasser: 5,6 ml/g
Spez. Oberfläche: 13,2 m²/g
Säuregehalt nach Verseifung der
=4,2 mÄquiv/g

!ridgruppen

Beispiel 6b)

1 g des nach Beispiel 6a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel I b) mit Penicillinacylase in 33 ml jo Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzyr.iatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand und Waschlösungen 29 U

Trägerharz nach der Umsetzung 55 U

d. s. 47% der Ausgangsaktivität

45

50

Beispiel 7a)

Eine Lösung von 50 g Trimethylolpropan-trimethacrylat, 30 g Methacrylsäure, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 6a) polymerisiert.

Ausbeute: 86 g
Schüttvolumen: 2,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 2,2 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: ~30μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4,1 mÄquiv/g

Beispiel 7b)

1 g des nach Beispiel 7a) hergestellten Polymeren wird bei Raumtemperatur und ständigem Rühren zu einer Lösung von 100 mg Lysin in 32 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird auf 63 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt, in 50 ml I M-Natriumchloridlösung suspendiert, abgesaugt und mit 100 ml Wasser nachgewaschen. Der Rückstand wird im Vakuum bei IÖÖ^aC getrocknet und der Stickstoffgehalt nach Kjeldahl bestimmt.

Ergebnis: Trockengewicht: 860 mg

Stickstoffgehalt: 1,5% entsprechend einem Gehalt des Harzes von 65 mg Lysin. Das sind 65% der eingesetzten Menge an Lysin.

030 250/92

Beispiel 8 Analog zu Beispiel 6a) wurden polymerisiert (Variation der Maleinsäureanhydrid-Menge):

Versuch Nr. a

TGDM (g)
MAS (g)
MSA (g)
AIBN (g)
Acetonitril (ml)
Benzin (ml)
Emulgator (g)
Ausbeute (g)
Vs (ml/g)
V₀ (ml/g)
Säure (mAqVg)

250

1000

3,4

4,4

3,1

70

20

10

250

1000

2,5

93

3,4

6,0

4,2

65	60	55	50	45
20	20	20	20	20
15	20	25	30	35
1	1	1	1	1
250	250	250	250	250
1000	1000	1000	1000	1000
5	5	5	5	5
86	88	80	79	70
3,6	2,6	3,0	3,2	23
4,5	3,5	4,0	43	3,4
3,6	3,8	3,9	4,7	4,3

TGDM = TetraäthylenglykoldimethacrylaL MAS = Methacrylsäure. MSA = Maleinsäureanhydrid AIBN = Azoisobuttersäurenitril. Emulgator = Gemisch aus Glycerin-mono- und -dioleaten. Vs = Schüttvolumen. Vq = Quellvolumen in Wasser. Säure = Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen. Beispiel 9a)

Eine Lösung von 70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Acrylsäure. 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in I 1 Benzol wird unter Luftausschluß und langsamem Rühren 4 Stunden auf 60° C, 2 Stunden auf 70⁰C und 2 Stunden auf 80⁰C erwärmt. Das feinteilige Fällungspolymerisat wird J5 dreimal in Benzol und zweimal in Acetonitril suspendiert, abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 94 g
Schüttvolumen: 6,8 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 7,6 ml/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 1,64 mÄquiv/g

Beispiel 9b)

1 g des nach Beispiel 9a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 6.3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslosung 107 U

Überstand + Waschlösung 26 U

Trägerharz nach der Umsetzung 38 U

d. s. 36% der Ausgangsaktivität

Beispiel 10a)

Eine Lösung von 50 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 40 g N-Vinylpyrrolidon. 10 g Maleinsäureanhydrid und I g Oicyclohexylpercarbonat in 200 ml Acetonitril wird in I I Benzin (Kp 100-140°C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleaten enthält, suspendiert und unter Rühren zunächst 18 Stunden auf 5O^-1C erwärmt. Dann gibt man I g des Initiators nach und rührt weitere 8 Stunden bei 60⁰C. Die Polymerkugeln werden mit Benzol und Petroläther gründlich gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 54 g klare Perlen
Schüttvolumen: 1,6 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 2,4 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: —0,3 mm
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen

= 33 mÄquiv/g

Gehalt an Stickstoff: 3,4% &27% N-Vinylpyrrolidon

Beispiel 10b)

g des nach Beispiel I Oa) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
Ausgangslösung

Überstand + Waschlösungen
Trägerharz nach der Umsetzung
d. s. 77% der Ausgangsaktivität

107 U

26U
82 U

hl) Beispiel 11 a)

Eine Lösung von 70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid, Ig Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Acetonitril werden analog zu Beispiel 5a) in Benzin suspendiert und polymerisiert.

Ausbeute: 93 g
Schüttvolumen: 2,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 3,3 ml/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,7 mÄquiv/g

Beispiel lib)

g des nach Beispiel I la) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt.

15

20

Ergebnis;

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand und Waschlösungen 42 U

Trägerharz nach der Umsetzung 33 U

d.s. 31% der Ausgangsaktivität

Beispiel 12a)

Eine Lösung von 60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat 30 g N-Methoxymethyl-acrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 11 Benzin, in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und -dioleal gelöst werden, suspendiert und 20 Stunden bei 60⁰C polymerisiert

Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Essigester suspendiert und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet

Ausbeute: 97 g
Schüttvolumen: 1,6 ml/g
Queiivölumen in Wasser: 3,1 ml/g Mittlerer Teilchendurchmesser: -03 mm

Beispiel 12b)

1 g des nach Beispiel 12a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit PenicilEaacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand + Waschlösungsn 49 U

Trägerharz nach der Umsetzung 25 U

d. s. 23% der Ausgangsaktivität

Beispiel 13a)

Setzt man im Ansatz von 12a) statt N-Methoxymethyl-acrylamid 30 g N-Methoxymethylmethacrylamid ein, so erhält man folgendes Ergebnis:

Ausbeute: 94 g

Schüttvolumen: 2,4 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 3,9 ml/g _A5

Mittlerer Partikeldurchmesser: ~ 0,6 mm

Beispiel 13b)

1 g des nach Beispiel 13a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml >o Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand und Waschlösungen 60 U

Trägerharz nach der Umsetzung 24 U

d. s. 22% der Ausgangsaktivität 20

Nach 8 Stunden wird kein Triethylamin mehr aufgenommen. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert, mit jeweils 601 Wasser und 0,2 M-Phosphatpuffer, pH 6,5, nachgewaschen und für weitere Spaltungsansätze erneut eingesetzt Das Filtrat einschließlich Waschwasser wird im Vakuum auf 3001 eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei pH 43 in Gegenwart von 2001 Methylisobutylke'on ausgefällt. Nach einer Stunde wird abfiltriert, mit 2001 Wasser und dann mit 2001 Aceton nachgewaschen. Getrocknet wird im Vakuum bei 40⁰C; Schmelzpunkt 208° C; Ausbeute 66,7 kg, das sind 91,9% d. Th.; Reinheit 98%.

Die trägergebundene Penicillinacylase wurde nacheinander zu insgesamt 30 Ansätzen eingesetzt Auch nach 30 Spaltungen ist die trägergebundene Penicillinacylase nicht verbraucht Die Reaktionszeit verändert sich nicht Aufgearbeitet wurde wie vorstehend beschrieben. Die erzielten 6-APS-Ausbeuten sind nachstehend zusammengestellt:

Beispiel 14

76,1 kg (Feuchtgewicht) trägergebundener Penicillinacylase dargestellt gemäß Beispiel 4 (NIPAB-Test) mit einer Aktivität von 737 000 U und 125 kg Penicillin-G-Kalium (Reinheit 98%) werden nacheinander zu 20001 Wasser gegeben und bei 38°C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triethylamin konstant bei 7,8 gehalten.

60

1. Spaltung

2. Spaltung

3. Spaltung

4. Spaltung

5. Spaltung

6. Spaltung

7. Spaltung

8. Spaltung

9. Spaltung

10. Spaltung

11. Spaltung

12. Spaltung

13. Spaltung

14. Spaltung

15. Spaltung

16. Spaltung

17. Spaltung

18. Spaltung

19. Spaltung

20. Spaltung

21. Spaltung

22. Spaltung

23. Spaltung

24. Spaltung

25. Spaltung

26. Spaltung

27. Spaltung

28. Spaltung

29. Spaltung

30. Spaltung

91,9% 91,4% 91,6% 91,0% 91,2% 903% 91,5% 90,9% 91,9% 90,7% 91,2% 90,1% 90,9% 90,7% 91,0% 90,2% 90,3% 89,9% 89,8% 89,1% 91,7% 91,9% 91,6% 91,1¹Vo 91,8% 90,7% 91,7% 91,4% 90,8% 90,3%

d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th. d.Th.

0=90,95% d.Th.

65

Beispiel

g trägergebundene Penicillinacylase dargestellt gemäß Beispiel 1 mit einer enzymatischen Aktivität von 3410U (NIPAB-Test) und 129 g Penicillin-G-Kalium werden nacheinander zu 2000 ml Wasser gegeben und wie im Beispiel 14 beschrieben bei 38°C und pH 7g gerührt. Das Penicillin G wird in 2 Stunden vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure gespalten. Die 6-APS wird, wie im Beispiel 14 beschrieben, isoliert. Die trägergebundene Penicillinacylase wird zwanzigmal nacheinander eingesetzt. Auch nach der zwanzigsten Spaltung muß zur vollständigen Spaltung die Reaktionszeit nicht verlängert werden.

6-A PS-Ausbeuten:

1. Spaltung

2. Spaltung

3. Spaltung

4. Spaltung

5. Spaltung

6. Spaltung

7. Spaltung

8. Spaltung

9. Spaltung

10. Spaltung

11. Spaltung

12. Spaltung

13. Spaltung

14. Spaltung

15. Spaltung

16. Spaltung

17. Spaltung

18. Spaltung

19. Spaltung

20. Spaltung

67.5 g (90,1 %d. Th.) 68,4 g (91,1% d. Th.) 68,7 g (91,90/0 d. Th.)

68.6 g (91,5% d. Th.) 68,4 g (91 0%d Th.) 68,1g (90,8% d. Th.)

68.7 g (91,6% d. Th.)

68.4 g (91,2% dTh.)

68.5 g (91,5% d. Th.) 68,1g (90,9% d. Th.)

68.5 g (91,3% d. Th.)

68.6 g (91,7% d. Th.) 68,5 g (91,3% d. Th.) 68,1g (90,8% dTh.)

68.3 g (91.1% d. Th.)

67.8 g (90,5% d. Th.) 68,0 g (90,6% dTh.)

67.4 g (89,9% d. Th.)

67.5 g (90,0% d. Th.) 66.8g (89,1% dTh.)

0=90,89% dTh.

Beispiel 16

g trägergebundene Penicillinacylase (Feuchtgewicht) gemäß Beispiel 4 mit einer Aktivität von 1160 '

(NIPAB-Test) werden mit 120 g Penicillin G-Kalium in 130OmI Wasser gegeben und 9 Stunden bei 38°C und pH 7,8 wie im Beispiel 14 beschrieben gerührt Aufgearbeitet wird wie im Beispiel 14 beschrieben. Die trägergebundene Penicillinacylase wird fünfmal nacheinander zur enzymatischen Spaltung eingesetzt Die erzielten Ausbeuten an 6-APS sind nachstehend zusammengestellt:

1. Spaltung 61,2g (87,6% dTh.)

2. Spaltung 62,0 g (883% d. Th.)

3. Spaltung 633 g (90,6% dTh.)

4. Spaltung 62,7 g (893% dTh.)

5. Spaltung 63,1 g (90,4% dTh.)

Beispiel 17

290 g trägergebundene Penicillinacylase gemäß Beispiel 4 mit einer enzymatischer aktivität von 2803 U (NIPÄB-Test) werden mit 138 g Peiiic^;'iin-V-Kaiium zu 2000 ml Wasser gegeben und 9 Stunden bei 38° C gerührt Der pH-Wert wird durch laufende Zugabe von Triethylamin konstant bei 7,8 gehalten. Aufgearbeitet wird vie im Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute
6-APS 643 g (86,1% dTh.); Reinheit 97,4%.

Claims

15 Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Proteinpräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, welches an ei» vemetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von

A 0,1—30 Gew.-°/o «^-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4—9 Kohlenstoffatomen,

B 35 -90Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylaten von Di- und/oder Polyolen und

C 5 —60 Gew.-% mindestens eines nicht unter A und B genannten hydrophilen Monomeren,

. wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2—20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1 —400 m²/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgiuppen 0,02—11 MiIIiäquivalente Säure pro Gramm enthalten, besteht

2. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, die copolymerisierten Einheiten der Komponente B des Copolymerisates aus Di(Meth)Acrylaten von Diolen mit 2—4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 — 10 Molen Alkylenoxid mit 2—4 Kohlenstoffatomen bzw. aus Trimethylolpropantrimethacrylat und die copolymerisierten Einheiten der Komponente C des Copolymerisates aus mindestens einem hydrophilen Monomeren mit mindestens einer Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe bestehen.

3. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäureanhydrid, die der Komponente B aus Äthylenglykol-, Diäthylenglykol-, Triäthylenglykol- oder Tetraäthylenglykoldimethacrylat bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat oder deren Mischungen und die der Komponente C aus Methacrylsäure, Acrylsäure, Methacrylamid, N-Methoxymethylacrylamid, N-Methoxymethylmethacrylamid oder N-Vinylpyrrolidon oder deren Mischungen bestehen.

4. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um ein Enzym handelt.

5. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um einen Enzyminhibitor handelt. fan

6. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um Penicillinacylase handelt.

7. Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Proteinpräparaten gemäß Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtnionomere des Copolymerisates —

A 0,1 —50 Gew.-% «,/f-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoff-

B 35 -SOGew.-q

atomen,

Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5 —60Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100-

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20- 200⁰C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend das Copolymerisat in einer wäßrigen Suspension mit einer Proteinlösung zu wasserunlöslichen Proteinpräparaten umsetzt.

8. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Pinicillinacylasepräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere des Copolymerisates —

A 0,1 —50 Gew.-% o^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—3 Kohlenstoffatomen,

B 35 —90Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5 —60Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 -

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20—200⁰C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend mit wäßriger salzarmer Penicillinacylaselösung in einem pH-Bereich von 5,7 bis 6,8 zu einem unlöslichen Penicillinacylasepräparat umsetzt.

9. Verfahren zur Herstellung eiires wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates gemäß Anspruch o, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration des ReaKtionsmediums zu Beginn der Umsetzungsreaktion des Copolymerisates mit der Penicillinacylaselösung weniger als 0,02 Mol/l beträgt.

10. Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympraparates gemäß Anspruch 4 zur Durchführung einer durch Enzyme katalysierbaren Reaktion.

11. Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 zur hydrolytischen Spaltung von Substraten.

12. Verwendung von wasserunlöslicher Penicillinacylase gemäß Anspruch 6 zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.