EP0000486A1 - Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen - Google Patents

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EP0000486A1 EP78100312A EP78100312A EP0000486A1 EP 0000486 A1 EP0000486 A1 EP 0000486A1 EP 78100312 A EP78100312 A EP 78100312A EP 78100312 A EP78100312 A EP 78100312A EP 0000486 A1 EP0000486 A1 EP 0000486A1
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Definitions

  • the amount of the mercapto group-containing compound is generally such that at least 0.3% by weight, based on the wet weight of the carrier enzyme product, is bound to free SH groups.
  • Hydrogen sulfide and compounds with 2 or more mercapto groups contain two (or more) hydrogen atoms bonded to sulfur, so that at least one free mercapto group remains after their binding to the support.
  • Compounds with two or more SH groups are particularly preferred.

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Abstract

Stabilisierte trägergebundene Proteine werden durch Umsetzung eines Proteins in wäßriger Lösung mit einem wasserunlöslichen, merkaptogruppen-freien Trägermaterial, das gegenüber Proteinen bindungsaktive Gruppen enthält, und durch nachfolgende Einwirkung von Schwefelwasserstoff oder von vorzugsweise aliphatischen Verbindungen mit einem Molekulargewicht unter 5000, vorzugsweise unter 2000, mit wenigstens einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxyoder primären oder sekundären Aminogruppe erhalten. Vorzugsweise wird ein perlförmiges Trägermaterial mit einem Perldurchmesser zwischen 5 und 1000 µm auf Basis eines vernetzten Polyacrylamids mit Oxirangruppen oder cyanbromierte Cellulose, Agarose oder Dextrane mit einem Enzym, z.B. Penicillinacylase umgesetzt. Anschließend werden wenigstens 0,03 Gew.-% an freien Merkaptogruppen an das Trägermaterial angelagert. Die Produkte zeichnen sich durch verminderten Abbau der biologischen Aktivität bei vielfacher Wiederverwendung des gebundenen Proteins aus.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen..Bei Verfahren, die auf der biospezifischen Wechselwirkung zwischen einem Protein und einem korrespondierenden Substrat beruhen, werden die Proteine mit Vorteil in Form eines an einen festen Träger gebundenen Materials eingesetzt. Das Protein läßt sich dadurch durch einfaches Filtrieren von der behandelten Substratlösung abtrennen. Trägergebundene Proteine haben Bedeutung bei der Affinitätschromatographie und besonders bei der Durchführung enzymatischer Prozesse, wobei das von dem Träger gebundene Protein ein Enzym ist.
  • Gegenüber den freien Proteinen in wäßriger Lösung zeichnen sich trägergebundene Proteine in der Regel durch eine erhöhte Stabilität gegen Inaktivierung durch pH-Wert-Verschiebung,.hohe Temperaturen oder Aut-oxydation aus. Trotzdem sinkt die biospezifisehe Wirksamkeit, z.B. im Falle von Enzymen die enzymatische Aktivität, bei mehrfacher Widerverwendung des trägergebundenen Proteins bei jeder Verwendungsstufe etwas ab. Es ist bekannt, daß man den Aktivitätsverlust von Proteinen aufhalten oder rückgängig machen kann, wenn man sie mit Merkaptanen behandelt (vgl. Dissertation Jan Carlsson, Uppsala 1974, S. 8, Abstract). Die Wirkung der Merkaptane wird darauf zurückgeführt, daß sie Disulfidbrücken innerhalb des Proteinmoleküls aufspalten, die durch Autoxydation aus Thiolgruppen entstanden sind. Diese Autoxydation wird als die Ursache des reversiblen Aktivitätsverlustes angesehen.
  • Es ist in den meisten Fällen jedoch nicht erwünscht,. zur Aufrechterhaltung der Aktivität des gebundenen Proteins der Substratlösung ein Merkaptan zuzu- setzen, weil die Substratlösung dadurch verunreinigt wird und eine zusätzliche aufwendige Reinigungsstufe erforderlich wird. Auch die getrennte Reaktivierung des trägergebundenen Proteins zwischen zwei Anwendungen ist wegen des zusätzlichen Arbeitsaufwandes keine befriedigende Lösung. Außerdem sind die meisten Mercaptane toxisch und übelriechend.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, trägergebundene Proteine mit erhöhter Stabilität gegen allmählichen Aktivitätsverlust in wäßriger Lösung durch Umsetzung des Proteins mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial herzustellen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man auf das an einen merkaptogruppen-freien Träger gebundene Protein Schwefelwasserstoff oder eine Verbindung mit einem Molekulargewicht unter 5000, vorzugsweise unter 2000, mit wenigstens einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxy- oder primären oder sekundären Aminogruppe einwirken läßt.
  • Da in der Fachwelt die Meinung vertreten wurde, daß die stabilisierende Wirkung von Merkaptanen auf ihrer Reaktion mit Disulfidbrücken beruht, war nicht zu erwarten,. daß sie auch dann wirksam sein würden, wenn sie an das Trägermaterial gebunden und daher nicht in der Lage sind, in räumliche Nähe der Disulfidbrücken zu gelangen. Überraschenderweise wird durch die gebundenen Merkaptogruppen dennoch eine erhebliche Stabilisierung erreicht. In der nachfolgenden Tabelle wird am Beispiel einer trägergebundenen Penicillin-Acylase der Aktivitätsverlust bei mehrfacher Wiederverwendung mit und ohne Merkaptogruppen am Träger gegenübergestellt. Die Merkaptogruppen wurden in diesem Falle durch Bindung von Dithioerythrit an einen Epoxydgruppen enthaltenden Enzymträger eingeführt. Das Trägermaterial war ein vernetztes Acrylamidpolymerisat mit Epoxydgruppen, das zunächst mit Penicillin-Acylase und danach gegebenenfalls mit 50 bzw. 500 mg Dithioerythrit je Gramm des feuchten Trägermaterials umgesetzt worden war. Die Aktivität des Präparats gegenüber 6-Amino-penicillinsäure wurden in wiederholter Umsetzung von 1 bis 2 g des Präparats mit jeweils 5 % Substrat in 200 ml Substratlösung (0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5) bei 37°C durch automatische Titration mit 1,0 N NaOH ermittelt. Die Ausgangsaktivität bei der ersten Verwendung wurde jeweils als 100 % bezeichnet.
    Figure imgb0001
  • Die erfindungsgemäß erreichte Stabilisierung beruht auf der Bindung von Schwefelwasserstoff oder einer wenigstens eine Merkaptogruppe und wenigstens eine weitere Merkapto-, Hydroxy- oder primäre oder sekundäre Aminogruppe enthaltenden Verbindung an die bindungsaktiven Gruppen des Trägermaterials. Die Merkapto-, Hydroxy- oder Aminogruppen der genannten Verbindungen reagieren ebenso wie die.entsprechenden Gruppen der zu bindenden Proteine mit den bindungsaktiven Gruppen des Trägermaterials. Da die Verbindungen ein Molekulargewicht unter 5000 haben, vermögen sie aufgrund ihrer geringen Molekülgröße noch mit solchen bindungsaktiven Gruppen des Trägermaterials zu reagisren, die für Proteinmoleküle aus Gründen sterischer Hinderung nicht zugänglich sind. Die bindungsaktiven Gruppen reagieren mit Schwefelwasserstoff bzw. mit Merkapto-, Hydroxy- und Aminogruppen leichter als mit Wasser, so daß es möglich ist, sowohl die Umsetzung der bindungsaktiven Gruppen mit dem Protein als auch die nachfolgende Umsetzung mit der Merkapto- und gegebenenfalls Hydroxy- oder Aminogruppen enthaltenden Verbindung in wäßriger Phase vorzunehmen. Da die bindungsaktiven Gruppen dennoch allmählich durch Wasser zersdzt werden, sollte zwischen der ersten und der zweiten Umsetzungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kein unnötig langer Zeitraum liegen.
  • Die erwünschte Stabilisierungswirkung kommt dann zustande, wenn wenigstens eine Merkaptogruppe je gebundenes Molekül in freier Form erhalten bleibt und die weitere Merkapto-, Hydroxy- oder Aminogruppe mit der bindungsaktiven Gruppe des Trägers reagiert. Da der Träger aus einer unlöslichen festen Matrix besteht und eine entsprechend niedrige Molekülbeweglichkeit hat, wird die Merkaptogruppen-haltige Verbindung zum weit überwiegenden Teil nur mit einer ihrer funktionellen Gruppen an den Träger gebunden. Wenn diese Gruppe eine Hydroxyl- oder Aminogruppe ist, bleibt auf jeden Fall eine Merkaptogruppe erhalten. Bei Verwendung einer Verbindung mit nur einer Merkaptogruppe und einer oder mehreren Amino-oder Hydroxygruppen kann gerade die Merkaptogruppe mit-der bindungsaktiven Gruppe'des Trägers reagieren, so daß nur noch-Amino- oder Hydroxygruppen übrigbleiben. In diesem Fall trägt das gebundene Molekül nicht zur Stabilisierung bei. Da jedoch ein Teil der Moleküle nicht mit der Merkapto- sondern mit einer Amino- oder Hydroxygruppe reagiert, bleiben im statistischen Mittel genügend stabilisierend wirkende Merkaptogruppen übrig.
  • Die Menge der Merkaptogruppen-haltigen Verbindung wird im allgemeinen so bemessen, daß wenigstens 0,3 Gew.-%, bezogen auf das Feuchtgewicht des Träger-Enzym-Produkts, an freien SH-Gruppen gebunden ist. Schwefelwasserstoff und Verbindungen mit 2 oder mehr Merkaptogruppen enthalten zwei (oder mehr) an Schwefel gebundene Wasserstoffatome, so daß nach ihrer Bindung an den Träger auf jeden Fall wenigstens eine freie Merkaptogruppe übrig bleibt. Verbindungen mit zwei oder mehr SH-Gruppen sind besonders bevorzugt. Dazu gehören Dithioäthylenglykol, Dithiopropylenglykol oder Dithiobutylenglykol, 1,12-Dimerkaptododecan, Di-merkaptoessigester des Äthylenglykols, Dodecandiols, Neopentylglykols oder des 2,2'-Bis-(4-hydroxy-cyclohexyl)-propans, Trimethylolpropan-tri-merkaptopropionat, Pentaerythrittetra-merkaptoacetat, -tetra-merkaptopropionat. -tetra-merkaptocapronsäureester oder -tetra-merkapto und ecansäureester sowie Verbindungen mit weiteren funktionellen Gruppen, wie Dithioerythrit, Als Verbindungen mit je einer Amino- und einer Merkaptogruppe seien Merkaptoäthylamin und Cystein genannt. Verbindungen mit nur einer Merkapto- und einer oder mehr Hydroxylgruppen sind am wenigsten. bevorzugt, da die Merkaptogruppen in der Regel leichter als die Hydroxylgruppen mit den bindungsaktiven Gruppen des Trägers reagiem. Beispiele dieses Verbindungstyps sind Monothioäthylenglykol und Monothiopropylenglykol.
  • Es ist eine Vielzahl von wasserunlöslichen Trägermaterialien mit gegenüber Proteinen bindungsaktiven Gruppen bekannt. Eine Übersicht über derartige Träger und ihre aktiven Gruppen findet sich in 0. Zaborsky, "Immobilized Enzymes", Cleveland 1973. Als wichtigste Trägermaterialien werden dort synthetische vernetzte Polymere auf Basis von Acrylamid, Maleinsäureanhydrid, Methacrylsäure, Styrol oder Polypeptiden genannt, Als natürliche Trägerstoffe werden Kohlenhydrate, wie Agarose, Cellulose, vernetztes Dextran oder Stärke erwähnt. Auch Glas und andere anorganische Stoffe kommen als Träger in Betracht. Als bindungsaktive Gruppen enthalten die aktivierten Träger z.B. Nitroarylfluorid-, Silylchlorid-, Carbonsäureanhydrid-, Carbonyl-, Imido- carbonat,- Isothiocyanat-, (Nitro-)Phenylester-, Acylazid-, Aryldiazonium- oder Cyanurchlorid-Gruppen. Methoden zur Einführung dieser Gruppen in die Trägermaterialien sind in dem erwähnten Buch sowie den do-rt zitierten Literaturstellen im einzelnen angegeben. Die Zahl der bindungsaktiven Gruppen soll groß genug sein, um wenigstens 10 mg, vorzugsweise 100 mg oder mehr Protein je Gramm Trägermaterial zu binden.
  • Die stabilisierende Wirkung lommt bei solchen Trägern besonders deutlich zum Ausdruck, die Oxiran- oder Amidocarbonatgruppen als bindungsaktive Grupgen enthalten. Oxirangruppen können schon bei der Herstel- lung eines vernetzten Acrylamidopolymerisats, vorzugsweise eines durch umgekehrte Suspensionspolymerisation erzeugten Perlpolymerisats, durch Mitverwendung glycidylgruppenhaltiger Comonomerer, wie Glycidyl-acrylat oder -methacrylat, eingebaut werden. In Trägerkörper mit Kohlehydratstruktur, wie Cellulose, Agarose oder Dextran, können Glycidylgruppen z.B. durch Umsetzung mit Epichlorhydrin oder 1,4-Bis-(2,3-epoxypropyl)-butan eingeführt werden. Durch Umsetzung der zuletzt genannten Trägerkörper mit Bromcyan erhält man Imidocarbonatgruppen. Perlförmige Trägerstoffe mit Perldurchmessern von 5 bis 5000 µm sind wegen ihrer.leichten Handhabbarkeit und ihrer Strömungsdurchlässigkeit besonders vorteilhaft.
  • Die Natur des zu bindenden Proteins richtet sich nach dem vorgesehenen Verwendungszweck des Verfahrensproduktes. Für Zwecke der Affinitätschromatographie wird ein Protein an den Träger gebunden, das in biospezifische Wechselwirkung zu einer Komponente eines aufzutrennenden Substratgemisches treten kann. Diese Komponente wird an dem trägergebundenen Protein vorübergehend festgehalten. Vorzugsweise werden Enzyme an den Träger gebunden, wie z.B. Penicillin- acylase, Ribonuclease, Amylase oder.Katalase. Im Sinne der Erfindung gebundene und stabilisierte Penicillinacylase hat besondere technische Bedeutung, weil erst dadurch eine wirtschaftliche Wiederverwendung dieses wertvollen Enzyms im technischen Maßstab möglich wird.
  • Einige Enzyme sind gegenüber Schwefelwasserstoff oder Merkaptanen empfindlich; sie eignen sich dann im allgemeinen nicht für das Verfahren der Erfindung Enzyme, die schon durch Schwefelwasserstoff oder freie Merkaptane stabilisiert oder reaktiviert werden, lassen sich durch das Verfahren der Erfindung in Enzymprodukte von erhöhter Stabilität überführen..
    • Beispiel 1 a) Herstellung von Oxiranacrylharzperlen
  • In einem Rundkolben (6000 ml), versehen mit Thermometer, Impeller-Rührer, Rückflußkühler und N2-Ein- leitungsrohr werden
    • 1740 g n-Heptan
    • 1100 g Perchloräthylen
    • 2 g Polymerisat der Zusammensetzung
      • 95 % n-Butylmethacrylat
      • 5 % 2-Trimethylammoniumäthylmethacrylat-chlorid

      vorgelegt. Unter Einleitung von Stickstoff wird bei ca. 55°C eine Mischung aus
    • 791 g Formamid
    • 60 g Methacrylamid
    • 60 g Allylglycidäther
    • 60 g Glycidylmethacrylat
    • 120 g Methylen-bis-methacrylamid
    • 6 g Benzoylperoxid

    zugegeben und durch Rühren in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 6 g Dimethylanilin beschleunigt. Nach 10-stündiger Polymerisation wird auf Raumtemperatur abgekühlt, die Perlen absetzen gelassen und die überstehende flüssige Phase abdekantiert. Die Perlen werden durch Zugabe von ca. 2000 ml Aceton entquollen, abgesaugt und zweimal mit Aceton nachgewaschen. Anschließend werden sie über Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Ausbeute: ca. 90 % feine, leicht gelbl. Perlen. b) Immobilisierung der Penicillinacylase
  • 1,2 g Penicillinacylase (E.coli, spez. Aktivität 12,1 U/mg) werden in 40 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8, 0,02 % NaN3) gelöst und zu 10 g des Produkts (1a) gegeben. Man läßt bei 23°C 72 Stunden lang stehen und wäscht anschließend dreimal mit jeweils 1000 ml 1 M wäßriger NaCl-Lösung und zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5; 0,02 % NaN3).
  • Ausbeute: 37 g Feuchtprodukt (nach Absaugen auf Glasfritte). Enzymatische Aktivität: 237 U/g Feuchtprodukt.
    • c). Aktivitätsbestimmung
  • 2 g Penicillin-G (Kaliumsalz) werden in 90 ml Phosphatpuffer (pH 7,5; 0,05 M) gelöst und das Volumen mit diesem Puffer auf 100 ml gebracht.
  • 20 ml dieser Substratlösung und 250 mg (Feuchtgewicht!) des Produktes (1b) werden in einem Titrierstand (TTA 3, Fa. Radiometer, Kopenhagen) bei 37°C thermostatisiert gerührt. Die durch Hydrolyse freiwerdende Phenylessigsäure wird bei pH 7,8 mit 1 N NaOH aus einer Autobürette (ABU 12, Fa. Radiometer, Kopenhagen) automatisch titriert, über pH-Meter und Titrator-(Typ 11, Fa. Radiometer, Kopenhagen) gesteuert. Simultan wird der NaOH-Verbrauch mit Hilfe eines Schreibers (Titrigraph SBR 2c, Fa. Radiometer, Kopenhagen) regi-striert.
  • Die Aktivität wird aus dem linearen Anfangsbereich der Umsatzkurve graphisch ermittelt; 1 Enzymeinheit (U) entspricht 1 µMol gespaltenem Substrat pro Minute.
    • d) Aktivitätsverlust bei wiederholter Verwendung bei 95%
  • Umsatz von Substratlösungen einer Konzentration von 5 %
  • 2,0 g des Produktes (1b) und 20 ml einer 5%igen Substratlösung (5 % Penicillin-G-K in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 enthaltend 0,02 % NaN3) werden bei pH 7,5 und 37°C bis zu einem Substratumsatz von 95 - 98 % gerührt. Apparatur und . Registrierung der Umsatkurve wie unter (1c) beschrieben.
  • Dann werden die Enzymperlen auf einer Glasfritte abgesaugt und erneut gegen 20 ml Substratlösung eingesetzt. Diese Prozedur wird 20 mal hintereinander wiederholt.
  • Aktivitätsverlust nach 20 Verwendungen: 57 %.
    • Beispiel 2
  • . Zu 2 g der trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1(b) werden 10 ml einer wäßrigen Lösung von Dithioglykol (2 % mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt) gegeben. Man läßt das Gemisch bei 37°C 18 h lang stehen und wäscht mit Wasser (zehnmal jeweils 100 ml) und zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5).
  • Ausbeute: 1,95 g Feuchtprodukt.
  • Das Produkt wird wie in Beispiel 1 (a) geprüft.
  • Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen: 42 %.
    • Beispiel 3
  • 50 mg 1,4-Dithioerythrit werden in 1 ml H20 gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wird zu 2 g trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) gegeben und das Gemisch wird 48 h lang bei 23°C stehen gelassen. Dann wird es mit Wasser (fünfmal) und Puffer (zweimal) gewaschen.
  • Ausbeute: 1,98 g
  • Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen, durchgeführt wie im Beispiel 1 (d): 35 %.
    • Beispiel 4
  • 500 mg Dithioerythrit werden in 5 ml Wasser gelöst und durch NaOH-Zugabe wird ein pH von 7,8 eingestellt. Diese Lösung wird zu 2 g der trägergebundenen . Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) gegeben und das Gemisch bei 23°C 48 h lang stehen gelassen.
  • Dann wird es mit Wasser (fünfmal) und Puffer (zweimal) gewaschen.
  • Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen, durchgeführt wie im Beispiel 1 (d): 11 %.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen durch Umsetzung eines Proteins in wäßriger Lösung mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial, das gegenüber Proteinen bindungsaktive Gruppen enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß man auf das an einen merkaptogruppen-freien Träger gebundene Protein Schwefelwasserstoff oder eine Verbindung mit einem Molekulargewicht unter 5000, vorzugsweise unter 2000, mit wenigstens einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxy- oder primären oder sekundären Aminogruppe einwirken läßt.
2. Ver ahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial eingesetzt wird, das als gegenüber Proteinen bindungsaktive Gruppen Oxiran-oder Imidocarbonatgruppen enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial auf Basis eines Polyacrylamids oder von Kohlehydratderivaten verwendet wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß. ein perlförminges Trägermaterial mit einem Perldurchmesser zwischen 5 und 1000 um auf Basis eines vernetzten Poly- acrylamids mit Oxirangruppen als gegenüber Proteinen reaktiven Gruppen eingesetzt wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial cyanbromierte Kohlenhydrate, beispielsweise Cellulose, vernetzte Dextrane oder Agarose, eingesetzt werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung mit wenigstens einer Merkaptogruppe eine aliphatische Verbindung mit 2 bis 8 C-Atomen einsetzt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Protein ein Enzym ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Enzym Penicillinacylase ist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 0,03 Gew.-% (bezogen auf das Feuchtgewicht des Endprodukts) an freien Merkaptogruppen an das Trägermaterial angelagert werden.
EP78100312A 1977-07-16 1978-07-06 Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen Expired EP0000486B1 (de)

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