DE2915135C2

DE2915135C2 -

Info

Publication number: DE2915135C2
Application number: DE2915135A
Authority: DE
Inventors: Stina Margareta Lund Se Gestrelius
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1978-04-19
Filing date: 1979-04-12
Publication date: 1988-09-01
Also published as: US4288552A; CH640882A5; IT1116501B; FR2423497B1; JPS6222599B2; DE2915135A1; DK141779A; DK146942C; ATA284879A; BE875657A; SE7903357L; AT364880B; FR2423497A1; DK146942B; JPS54163888A; NL7902860A; SE465965B; IT7948765A0

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Immobilisierung eines intrazellulären, gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzyms. Die Ansprüche 2 bis 9 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Der Anspruch 10 nennt dessen Verwendung. Zu intrazellulären, gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen zählen beispielsweise die Thiolenzyme, die im aktiven Teil des Enzymmoleküls oder sehr nahe an diesem eine -SH-Gruppe enthalten und daher durch thiolreaktive Agenzien, wie beispielsweise Glutaraldehyd, inaktiviert werden. Ein typisches Beispiel hierfür ist Urease.

In "Methods of Enzymology" Band 44 (1977) (Academic Press) werden verschiedene Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen beschrieben. Die meisten dieser Verfahren wenden spezielle Träger an, durch die sich der Nachteil hoher Kosten für den Träger und einer nicht vermeidbaren starken Verdünnung der Enzymaktivität ergibt.

Es wurde auch bereits beschrieben (US-PS 39 80 521), Glucose-Isomerase durch Quervernetzung von dieses Enzym enthaltenden Zellen mit Glutaraldehyd und einer weiteren Behandlung zu immobilisieren. Da Glucose-Isomerase gegen Glutaraldehyd nicht sehr empfindlich ist, stellt sich bei dieser Immobilisierung eine vergleichsweise hohe Immobilisierungsausbeute ein. Glutaraldehyd stellt aus verschiedenen Gründen ein bevorzugtes Vernetzungsmittel dar. Es wird von Gesundheitsbehörden zugelassen und ist heute auch aus herstellungstechnischen und wirtschaftlichen Gründen das beste bekannte Vernetzungsmittel.

Die vorliegende Erfindung ist jedoch auf die Immobilisierung von intrazellulären Enzymen gerichtet, die gegen Glutaraldehyd empfindlich sind. Bisher war es schwierig, Enzyme dieser Art nach der Glutaraldehydmethode unter Vermeidung eines unerwünscht hohen Verdünnungsgrades zu immobilisieren, weil die Behandlung des Enzyms mit Glutaraldehyd immer zu fast völligem Verlust der Enzymaktivität führte. Die Immobilisierung von gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen stellt somit eine völlig andere Situation dar als die Immobilisierung von Enzymen, die gegen Glutaraldehyd nicht empfindlich sind.

In der DE-OS 23 45 186 ist eine Vielzahl von immobilisierten Enzymaufbereitungen beschrieben, bei deren Herstellung das betreffende Enzym in einem wäßrigen Medium mit einem Vernetzungsmittel und einem nicht-proteinischen Bindemittel umgesetzt wird. Wenngleich sich unter den in der DE-OS genannten Enzymen auch solche befinden, die gegenüber Glutaraldehyd empfindlich sind (z. B. Urease) und in der Aufzählung verschiedener Vernetzungsmittel auch Glutaraldehyd enthalten ist, so wird in der DE-OS das Problem der Herstellung einer immobilisierten Enzymaufbereitung, die ein gegen Glutaraldehyd empfindliches Enzym enthält, nicht angesprochen und eine spezielle Kombination aus Binde- und Vernetzungsmittel, welche dieses Problem ohne größeren Aktivitätsverlust des Enzyms löst, nicht offenbart.

Hiernach besteht die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, ein Verfahren zur Immobilisierung von intrazellulären, gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen vorzuschlagen, bei dem Glutaraldehyd als Quervernetzungsmittel verwendet und das immobilisierte Enzym dennoch in sehr hoher Ausbeute erhalten werden kann. Dabei sollen relativ geringe Verfahrenskosten und eine vergleichsweise geringe Verdünnung der Enzymaktivität angestrebt werden, damit ein das immobilisierte Enzym enthaltendes Produkt mit besonderem Vorteil für industrielle Anwendungszwecke einsetzbar ist.

Die Lösung der Erfindungsaufgabe besteht darin, daß man Mikroorganismenzellen, die intrazellulär ein gegen Glutaraldehyd sehr empfindliches Enzym enthalten, in wäßrigem Medium mit Glutaraldehyd in Anwesenheit eines Polyamins mit einem Gehalt an primären Aminogruppen von über 5% des Gesamtgehaltes an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen umsetzt und das erhaltene immobilisierte Enzym in bekannter Weise isoliert.

Unter "Mikroorganismenzellen" sollen in diesem Zusammenhang ganze Mikroorganismenzellen bzw. Mikrobenzellen, ein aus ganzen Mikroorganismenzellen bzw. Mikrobenzellen herstellbares Homogenisat, sowie jegliche dazwischenliegende Zustände, z. B. teilweise gesprengte Mikrooranismenzellen bzw. Mikrobenzellen verstanden werden.

Wenn im Zusammenhang mit der Erfindung von einem gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enyzm die Rede ist, so wird hiermit ein Enzym angesprochen, das mehr als 75% seiner ursprünglichen Aktivität verliert, wenn es durch eine Behandlung der das Enzym enthaltenden Zellen mit Glutaraldehyd gemäß den in der US-PS 39 80 521 und der DE-OS 22 23 340 beschriebenen Methoden immobilisiert wird, bei denen ein teilchenförmiges Produkt mit einer für industrielle Anwendungszwecke brauchbaren physikalischen Festigkeit erhalten wird.

Der mit der Erfindung erzielbare Erfolg ist insofern überraschend als aufgrund des Standes der Technik nicht damit gerechnet werden konnte, daß der Einsatz von Glutaraldehyd bei der Immobilisierung von gegenüber diesem Vernetzungsmittel gerade besonders empfindlichen Enzymen möglich sein würde, ohne einen größeren Enzymaktivitätsverlust in Kauf nehmen zu müssen.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es vorteilhaft sein, wenn das als Bindemittel verwendete Polyamin einen Gehalt an primären Aminogruppen von mindestens 20%, bezogen auf den Gesamtgehalt an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen, aufweist. In einem typischen Beispiel kann das Verhältnis von primären, sekundären und tertiären Aminogruppen bei 1 : 2 : 1 liegen, wenn ein verzweigtes Polyäthylenimin als Polyamin verwendet wird. Es wird davon ausgegangen, daß die primären Aminogruppen mit dem Glutaraldehyd reagieren, wodurch stabile Quervernetzungen gebildet werden, woraus auf die Bedeutung des Vorhandenseins von primären Aminogruppen geschlossen werden kann. Versuche, die mit Polyäthyleniminen durchgeführt wurden, die durch Reaktion der primären (und sekundären) Aminogruppen mit einer Epoxyverbindung modifiziert worden waren, zeigten, daß derartige modifizierte Polyäthylenimine nicht wirksam sind.

Da die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ablaufende Reaktion in einem wäßrigen Medium erfolgt, versteht sich, daß das erfindungsgemäß verwendete Polyamin wasserlöslich sein soll.

Überraschenderweise führt die Anwesenheit des Polyamins zu einer sehr hohen Ausbeute der Enzymaktivität. Ohne das Polyamin kann die Ausbeute an Enzymaktivität in der Größenordnung von etwa 0 bis 15% liegen, wohingegen die Ausbeute mit Polyamin in der Größenordnung von 30 bis 70% liegen kann. Es wird kein teilchenförmiger Träger benötigt und die Verdünnung der Enzymaktivität ist daher gering.

Bei Durchführung der Immobilisierung wird das Polyamin den Mikroorganismenzellen vor oder gleichzeitig mit dem Glutaraldehyd zugesetzt. Wird der Glutaraldehyd den Mikroorganismenzellen zuerst zugefügt, so verringert sich die Ausbeute an enzymatischer Aktivität in dem immobilisierten Produkt, falls die Polyaminzugabe nicht sehr bald nach der Glutaraldehydzugabe erfolgt, was mit dem pH-Wert, der Temperatur, der Konzentration und ähnlichen Parametern zusammenhängt.

Es versteht sich, daß die jeweiligen Mengen der Mikroorganismenzellen, von Glutaraldehyd und Polyamin derart gewählt werden sollten, daß das Produkt, welches das immobilisierte Enzym enthält, für industrielle Anwendungszwecke gut geeignet ist, d. h. daß das Produkt eine hohe Enzymaktivität, eine hohe Aktivitätsausbeute (im Vergleich mit der Enzymgesamtaktivität vor der Immobilisierung), eine hohe Enzymstabilität und eine hohe mechanische Stabilität aufweisen sollte.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt ganze Mikroorganismenzellen ein- bzw. umgesetzt.

Ein weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der Immobilisierung einer gegen Glutaraldehyd empfindlichen Penicillin-V-Acylase, hergestellt mittels des Bakterienstammes NRRL B-11240 (oder Stämmen, die damit im wesentlichen identisch sind, einschließlich der Mutanten oder Varianten davon). Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf die Immobilisierung von Urease, hergestellt mittels eines Stammes, der der Species Bacillus pasteurii angehört, von Lactase, hergestellt mittels eines Stammes, der der Spezies Kluyveromyces fragilis angehört oder mittels des Stammes NRRL B-11229, sowie auch von malolactischem Enzym, hergestellt mittels eines Stammes, der der Species Leuconostoc oenos angehört.

Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet vorzugsweise mit dem wäßrigen Teil der Fermentationsbrühe als wäßrigem Medium. Diese Ausführungsform umfaßt die direkte Behandlung der Fermentationsbrühe mit Glutaraldehyd und stellt daher eine äußerst einfache und wirtschaftliche Immobilisierungsmethode dar. Jedoch können die Zellen von der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, und anschließend erneut in Wasser oder einem geeigneten Puffer vom pH-Wert 5 bis 10 suspendiert werden, wobei der wäßrige Teil dieser Suspension das wäßrige Medium darstellt, das anschließend mit Glutaraldehyd behandelt wird. In gleicher Weise kann der wäßrige Teil der Zellaufschlämmung als wäßriges Medium verwendet werden, das anschließend mit Glutaraldehyd behandelt wird, wobei diese Zellaufschlämmung von der Fermentationsbrühe abgetrennt wurde, beispielsweise durch Zentrifugieren, und die Konsistenz einer Zahnpaste aufweist.

Zweckmäßig verwendet man als Polyamin ein Polyalkylenimin, vorzugsweise ein verzweigtes Polyalkylenimin, in dem der Alkylenteil 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Einem verzweigten Polyäthylenimin oder einem Polyalkylenpolyamin wird dabei der Vorzug gegeben.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung verwendet man als Polyamin ein verzweigtes Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von 500 bis 100 000 Dalton.

Das Verhältnis von primären Amin-Äquivalenten/Aldehyd-Äquivalenten liegt zweckmäßig im Bereich von 0,01 : 1 bis 10 : 1, vorzugsweise von 0,1 : 1 bis 1 : 1.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafter Weise so durchgeführt, daß man zunächst das Polyamin dem wäßrigen Medium mit den Mikroorganismenzellen und hiernach erst das Glutaraldehyd zusetzt.

Vorzugsweise kann beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Verhältnis von Glutaraldehyd/Mikroorganismenzellen (Gew./Gew.) von 0,01 : 1 bis 100 : 1, bevorzugt von 0,1 : 1 bis 10 : 1, angewendet werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die isolierten immobilisierten Zellen geformt, vorzugsweise durch Granulieren oder Strangpressen bzw. Extrusion. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden gewaschene und isolierter immobilisierte Zellen geformt durch Trocknen, Vermahlen und Sieben auf eine Teilchengröße im Bereich von 100 bis 1000 µm, vorzugsweise von 200 bis 700 µm.

Die nach der Erfindung erhaltene Enzymaufbereitung kann bei Verfahren eingesetzt werden, die diskontinuierlich oder kontinuierlich arbeiten. Im letzteren Falle befindet sich das Enzym vorzugsweise in einer Säule.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierte Penicillin-V-Acyllase wird, gemäß einem weiteren Erfindungsmerkmal, mit Penicillin-V in einem kontinuierlichen Verfahren in Kontakt gebracht.

Zur Veranschaulichung des überraschenden, die Aktivität konservierenden Effekts von Polyamin in Kombination mit den gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen wird auf die folgenden Vergleichsversuche Bezug genommen:

a) 2 g sprühgetrocknete Urease enthaltende Zellen von Bacillus pasteurii ATCC 11859 (6200 IU/g bzw. IE/g bei pH 7) wurden in 98 ml Wasser mit 10 µMol β-Mercaptoäthanol suspendiert. Der pH-Wert der Zellsuspension betrug beim Zusatz von 1,6 ml 25% Glutaraldehyd unter Rühren 7,7. Nach 20minütigem Rühren bei Raumtemperatur fiel der pH-Wert auf 6,9 ab. Die immobilisierten Zellen wurden filtriert und zweimal mit 0,5 l 1-m-molarer β-Mercaptoäthanol-Lösung in Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum (90 Minuten bei etwa 50°C) wurden 0,7 g immobilisiertes Präparat mit einer Aktivität von 64 IE/g (bzw. IU/g) gemessen unter optimalen Bedingungen für eine Teilchengröße von 125 bis 300 µm (bzw. µ) erzielt. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 0,3%.
b) Eine Zellsuspension, identisch mit der vorstehend unter a) beschriebenen, wurde an Stelle der vorstehend unter a) beschriebenen Behandlungsweise mit 4 ml 10% Polyäthylenimin (Molekulargewicht 60 000, Dow Chemicals PEI 600) behandelt, auf den pH-Wert 7 eingestellt und anschließend mit 2,75 ml 25% Glutaraldehyd versetzt. Es wurde weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren, Waschen und Trocknen wie vorstehend unter a) beschrieben, wiesen die resultierenden 0,75 g der immobilisierten Zellen eine Aktivität von 5600 IE/g (bzw. IU/g) 125-300 µm bzw. µ) auf, was einer Aktivitätsausbeute von 34% entsprach.

Die Definitionen der Einheiten und ursprünglichen enzymatischen Aktivitäten der Enzyme in den folgenden Beispielen sind aus der folgenden Tabelle I ersichtlich:
EnzymBestimmung der ursprünglichen Enzym-Aktivitäten

UreasepH-Stat-Titration mit 1-n-HCl bei pH 7,0 und 30°C; 3% (0,5 Mol) Harnstoff in 0,2 M Phosphatpuffer wurden als Substrat verwendet: 1 Einheit ist 1 µMol Harnstoff hydrolysiert/Minute. Penicillin-V- AcylaseInkubierung bei 40°C mit 3% Penicillin-V in 0,2 M Phosphatpuffer vom pH 7,5. Nach Entfernung der Zellen wurde das erhaltene 6-APA mit p-Aminobenzaldehyd nach Balasingham et al. (1972), Biochem. Biophys. Acta 276, 250-56 bestimmt; 1 Einheit=1µMol 6-APA, erzeugte/Minute. Nicht-immobilisierte Zellen werden zunächst durch Behandlung bei Raumtemperatur mit etwa 8% 1-Butanol in 0,1 M Phosphatpuffer vom pH 7 während 20 Minuten geöffnet. Inkubation (bei 37°C für die Kluyveromyces fragilis Lactase and bei 60°C für die NRRL B-11229 Lactase) mit 4,75% (Gew./Vol.) Lactose in Milchpuffer vom pH 6,5 (Das große Molkerei Lexikon, Schultz 1965, Band 2, M-Z, Seite 740). Nach Entfernen der Zellen wurde die erzeugte Glucose mit Boehringer Mannheims Blutzuckerreagens (GOD-Perid Methode) bestimmt.
1 Einheit = 1 µMol Glucose, erzeugt/Minute. malolactisches EnzymInkubation bei 30°C mit 33 mMol L-Malat, 1,67 mMol NAD⁺ und 0,7 mMol MnCl₂ in 0,1 M Phosphatpuffer vom pH 5. Nach Entfernen der Zellen wurde das erzeugte Lactat mit LDH + NAD⁺ nach I. Gutmann und A. W. Wahlefeld (1974) in Methods of Enzymatic Analysis, 2. Ed., Bd. 3 (H. U. Bergmeyer Ed.) Academic Press, Seite 1463 bis 67 bestimmt. 1 Einheit=1 µMol Lactat, erhalten/Minute.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Hauptgegenstände der Beispiele sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich.

Das Beispiel 12 zeigt einen Vergleichsversuch ohne Polyäthylenimin.

In allen folgenden Beispielen wurde der pH-Wert des Polyäthylenimins vor der Zugabe auf etwa 7 eingestellt. Jedoch können auch zufriedenstellend immobilisierte Enzyme mittels Polyäthyleniminen mit anderen pH-Werten, z. B. im Bereich von etwa 4 bis etwa 9, erhalten werden.

Beispiel 1

Zu 1 l Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240, enthaltend etwa 1% trockene Zellen und 1,5 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml wurden unter Rühren 30 ml 10% Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht 60 000 PEI 600 der Dow Chemical) und 5 Minuten später 25 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurden weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und die immobilisierten Zellen wurden anschließend abfiltriert, mit Phosphatpuffer (50-m-molar, pH 7) gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhielt 14,2 g getrocknete immobilisierte Zellen mit einer Aktivität von 71 Einheiten/g für eine Teilchengröße von 180 bis 420 µm (bzw. µ). Das heißt die Aktivitätsausbeute betrug 65%.

Beispiel 2

Zu 1,5 l Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 (0,68 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml) wurden unter Rühren 45 ml 10% Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht 600, PEI 6 der Dow Chemical) und 30 ml 25% Glutaraldehyd bei 4°C gefügt. Es wurde weitere 60 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt und die gebildeten Multizellteilchen wurden abfiltriert, mit Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 gewaschen und an der Luft getrocknet. Das getrocknete Präparat (21 g) wies eine Penicillin-V-Acylase-Aktivität von 14,5 Einheiten/g für eine Teilchengröße von 200 bis 700 µm (bzw. µ) auf, d. h. die Aktivitätsausbeute betrug 30%.

Beispiel 3

380 l Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 (2,5 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml) wurden auf etwa 15°C gekühlt und 40 l 10% Polyäthylenimin (Polymin P. BASF) wurden unter Rühren zugesetzt, worauf 9,4 l 25% Glutaraldehyd zugefügt wurden. Es wurde weitere 45 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf β-Mercaptoäthanol auf eine Endkonzentration von 25 mMol zugesetzt wurde und die immobilisierten Zellen wurden auf einer Filterpresse abgetrennt. Der nasse Filterkuchen wurde granuliert und die Granulate wurden in einem Wirbelschichtbett (Fluidbett) bei 50-55°C getrocknet. Man erhielt 7,1 kg eines trockenen Präparats mit 55 Einheiten/g (nicht-fraktionierte Teilchen), was einer Aktivitätsausbeute von 41% gleichkommt.

Beispiel 4

Eine Reihe von immobilisierten Präparaten aus der gleichen Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 wie in Beispiel 3 zeigt den Einfluß von Konzentrationsänderungen des Polyäthylenimins bei konstanter Zugabe von Glutaraldehyd. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II aufgeführt.
PolyäthyleniminPenicillin-V-Acylase-Aktivität (Polymin P) % Gew./Vol.Einheiten/g Trockenprodukt (200-400 µm bzw. µ)

0,27 0,536 0,858 1,071 1,270

In jedem Falle wurde die angegebene Menge an Polyamin P (BASF) unter Rühren als 10%ige Lösung zu 0,5 l der Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 (2,5 Penicillin-V-Acylase-Einheiten/g) gefolgt von 10 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere 60 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf die Zellen abfiltriert wurden, mit 25-m-molarem β-Mercaptoäthanol in 50-m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gewaschen und an der Luft getrocknet wurden. Man erhielt etwa 9 g Trockenmaterial aus jeder Herstellung.

Beispiel 5

Zu 2 l Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 (2,0 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml) wurden 200 ml 10% Polyäthylenimin (Polymin P BASF) gefügt und die Zellen wurden anschließend auf etwa 1/10 des ursprünglichen Volumens konzentriert. 6 ml 25% Glutaraldehyd wurden unter Rühren zu der Zellaufschlämmung gefügt, die weitere 60 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt wurde. Die immobilisierten Zellen wurden anschließend filtriert und mit 25-m-molarem β-Mercaptoäthanol in 50-m-molarem Phosphatpuffer vom pH 7,5 auf einem Glasfilter gewaschen. Nach dem Trocknen an der Luft bei Raumtemperatur wurden 20 g Präparat mit 65 Einheiten/g (200 bis 400 µm bzw. µ) erhalten. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von etwa 33%.

Es wurde eine Reihe von immobilisierten Präparaten in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben hergestellt, jedoch unter Variation der Mengen an Glutaraldehyd, was den Einfluß der Änderung der Glutaraldehydkonzentration nach konstanter Zugabe von Polyäthylenimin und anschließender Konzentration zeigt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
GlutaraldehydPenicillin-V-Acylase-Aktivitätseinheiten/g % Gew./Vol.Trockenpräparat (200-400 µm bzw. µ)

0,5106 0,7565 1,056 1,537 5,03

Aus jedem Ansatz erhielt man 9 bis 11 g Trockenmaterial pro Liter Fermentationsbrühe.

Beispiel 6

350 l Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 (2,4 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml) wurden auf etwa 15°C gekühlt und 24,5 l 10% Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht etwa 700, PEI 15P der Taihei Sangyo Kaisha) wurden unter Rühren, gefolgt von 3,5 l 50% Glutaraldehyd zugesetzt. Anschließend wurde weitere 45 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf β-Mercaptoäthanol auf eine Endkonzentration von 25-m-molar zugesetzt wurde und die immobilisierten Zellen auf einer Membranpresse abgetrennt wurden. Der Filterkuchen wurde stranggepreßt (Öffnung von 500µm bzw. µ) und die Teilchen wurden in einem Wirbelschichtbett bei 50-55°C getrocknet. Die Ausbeute betrug 6,2 kg trockenes Präparat mit 85 Penicillin-V-Acylase Einheiten/g (Teilchengröße unter 500µm bzw. µ) entsprechend einer Aktivitätsausbeute von 63%.

Beispiel 7

Eine Reihe immobilisierter Präparate aus der gleichen Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 wie in Beispiel 3 und 4 zeigt den Einfluß verschiedener Arten von Polyäthyleniminen.

In jedem Falle wurde die angegebene Menge an Polyäthylenimin unter Rühren als 10%ige Lösung zu 0,5 l Fermentationsbrühe des Stammes NRRL B-11240 (2,5 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml) gefolgt von 10 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere 45 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf die Zellen abfiltriert, mit 25-m-molarem β-Mercaptoäthanol in 50-m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gewaschen und an der Luft getrocknet wurden.

Beispiel 8

10 g der wie in Beispiel 1 beschrieben immobilisierten Zellen wurden zu 200 ml 3% (Gew./Vol.) rohem K-Penicillin-V- in 50-m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gefügt. Es wurde bei 40°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM und bei einem konstantem pH-Wert von 7,5 (durch Titrieren mit 4 n-NaOH) entacyliert. 95% des Penicillins wurden in 6-APA während 2½ Stunden umgewandelt. Die Verfahrensweise konnte mit frischem Penicillin-V mindestens 20mal wiederholt werden, ohne eine wesentliche Verringerung der Umwandlung. Der Umwandlungsgrad wurde durch HPLC (Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie), Trennung des Reaktionsgemischs an der Waters-µ-Bondpak C-18-Säule (eluiert mittels eines Gradienten von 20% Methylalkohol in Wasser auf 50% Methylalkohol in Wasser, Ionenpaarbildung mit Waters Pic A-Reagens) und anschließende UV-Darstellung, bestimmt. Es sei hierzu hingewiesen auf das Informationsbuch Paired-Ion-Chromatography, D 61, Mai 1976 der Waters Associates, gedruckt in USA (Maple Street, Milford, Mass.). Die Umwandlungsergebnisse von 3% (Gew./Vol.) K-Penicillin-V in 6-APA bei 40°C sind in der Tabelle IV aufgeführt.
AnsatzUmwandlungsgrad (%)

196 297 398 498 598 698 797 897 998 1097 1196 1297 1397 1497 1596

Beispiel 9

9,7 g der immobilisierten Zellen des Beispiels 2 wurden zu 100 ml 3% (Gew./Vol.) K-Penicillin-V in 50-m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gefügt. Die Entacylierung wurde bei 40°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM und einem mittels pH-Stat konstant gehaltenen pH-Wert von 7,5 durchgeführt. Über 90% des Penicillins wurden in 3 Stunden in 6-APA umgewandelt. Nach 10 aufeinanderfolgenden Ansätzen war die Umwandlungszeit auf 3,5 Stunden und nach 20 Ansätzen auf 4 Stunden angestiegen.

Beispiel 10

Immobilisierte Zellen, entsprechend einem Trockengewicht von 100 g aus dem Produkt von Beispiel 6 wurden in 50-m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5, der 5-m-molares β-Mercaptoäthanol enthielt, gefüllt in eine Säule mit einem Durchmesser von 10 cm (Bettvolumen 400 ml) wieder aufgequollen. 65 g rohes K-Penicillin-V in 1,5 l des gleichen Mercaptoäthanol enthaltenden Puffers wie vorstehend beschrieben, wurden durch einen Vorerwärmer zu der (bei 35°C gehaltenen) Säule und zurück zu einem Behälter (gehalten bei 12°C) rezirkuliert, wo der pH-Wert kontinuierlich durch Titrieren mit 4 m-NaOH auf 7,5 eingestellt wurde. Bei einer Zirkulierungsgeschwindigkeit von 14 Bettvolumina pro Stunde, erzielte man nach 4 Stunden eine 98%ige Umwandlung des Penicillin-V in 6-APA. Nach 10 aufeinander folgenden Ansätzen war die Reaktionszeit auf 6 Stunden angestiegen.

Beispiel 11

Zu 500 ml Fermentationsbrühe von Kluyveromyces fragilis NRRL Y 1109 (pH-Wert eingestellt auf 7,5) wurden unter Rühren 40 ml 10% Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht 700, PEI 15 T der Taihei Sangyo Kaisha) gefolgt von 16 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Nach 60minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden die Teilchen filtriert, granuliert und an der Luft getrocknet. Die erhaltenen 6,5 g Trockenmaterial wiesen eine Lactase-Aktivität von etwa 500 Einheiten/g auf, was etwa 30% der ursprünglichen Aktivität entspricht.

Beispiel 12

Zu 500 ml Fermentationsbrühe von NRRL B-11229 mit 5,1 Lactase-Einheiten/ml wurden 25 ml 10% Polyäthylenimin (PEI 15 T der Taihei Sangyo Kaisha Co.) unter Rühren, gefolgt von 10 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt, worauf die immobilisierten Zellen abfiltriert und an der Luft getrocknet wurden. 4,0 g getrocknetes Präparat enthielten 209 Lactase-Einheiten/g was einer Ausbeute von 33% entspricht.

Um die Wirkung des Polyäthylenimins zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch ohne Polyäthylenimin folgendermaßen durchgeführt.

Zu 500 ml Fermentationsbrühe von NRRL B-11229 mit 5,1 Lactase-Einheiten/ml wurden 10 ml 25% Glutaraldehyd unter Rühren gefügt. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die behandelten Zellen wurden mit 0,5% Superfloc (12,5 ml 20% Superfloc C 521, kationisches Ausflockungsmittel) ausgeflockt, filtriert und an der Luft getrocknet. 3,7 g getrocknetes Präparat enthielten 109 Lactase-Einheiten/g, entsprechend einer Ausbeute von 15%.

Beispiel 13

Zu 500 ml Fermentationsbrühe von NRRL B-11229, enthaltend intrazelluläre Lactase, wurden 50 ml 10% Polyäthylenimin (T 15, Taihei Sangyo Kaisha), gefolgt von 14 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere 30 Minuten gerührt und das Präparat wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Die getrockneten Teilchen enthielten etwa 30% der ursprünglichen Lactase-Aktivität und sie konnten für wiederholte ansatzweise Umwandlungen von 4% Lactose bei 60°C verwendet werden.

Beispiel 14

Zu 300 ml 6fach konzentrierter Fermentationsbrühe von Bacillus pasteurii ATCC 11 859 (6,3 g Trockenzellen, 9300 Ureaseeinheiten/g) wurden unter Rühren 18 ml 10% Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht 60 000, PEI 600 der Dow Chemical), gefolgt von 20 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Nach weiterem 60minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden die immobilisierten Zellen abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhielt 13,8 g trockene immobilisierte Zellen mit einer Ureaseaktivität von 1900 Einheiten/g für eine Teilchengröße von 300 bis 700 µm (bzw. µ). Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von etwa 45%.

Beispiel 15

Zu 100 ml einer 4% (Gew./Vol.) wäßrigen Suspension von Bacillus pasteurii ATCC 11 859 mit 230 Ureaseeinheiten/ml wurden 32 ml 10% Polyäthylenimin (Polymin HS, BASF) unter Rühren, gefolgt von 5 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde eine weitere Stunde bei 4°C gerührt, worauf die Zellen abfiltriert und an der Luft getrocknet wurden. 2,3 g trockenes Präparat enthielten eine Ureaseaktivität von 3100 Einheiten/g (Teilchengröße 300-700 µm bzw. µ) entsprechend einer Aktivitätsausbeute von 31%.

Beispiel 16

0,5 g der wie in Beispiel 14 beschrieben immobilisierten Zellen wurden in eine Säule (1 cm Durchmesser × 10 cm) gefüllt und ein 1% Harnstoff enthaltendes Substrat, (0,01% MgCl₂, 10-m-molares β-Mercaptoäthanol), eingestellt auf den pH-Wert 9, wurde bei 40°C durch das Bett geleitet. 98% des Harnstoffs konnten bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde hydrolysiert werden und die Halbwertszeit der Enzymaktivität betrug etwa 1000 Stunden.

Beispiel 17

Zu 0,25 l Fermentationsbrühe von Leuconostoc oenos DSM 20252, eingestellt mit NaOH auf den pH-Wert 6,5, mit 14 malolactischen Aktivitätseinheiten/l, wurden unter Rühren 3 ml 10% Polyäthylenimin (Polymin P, BASF), gefolgt von 1 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere 30 Minuten bei 4°C gerührt, worauf die immobilisierten Zellen abfiltriert, mit 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und mit Wasser gewaschen und anschließend gefriergetrocknet wurden. Die getrockneten Zellen wiesen eine malolactische Aktivität von 3,4 Einheiten/g, entsprechend einer Aktivitätsausbeute von etwa 40% auf.

Beispiel 18

1 g nasse Zellen Leuconostoc oenos DSM 20252 mit 96 Einheiten malolactischer Aktivität/g wurden in 16 ml Wasser suspendiert und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. 1,7 ml 10% Polyäthylenimin (Polymin P, BASF) wurden unter Rühren zugesetzt, gefolgt von 1,5 ml 25% Glutaraldehyd. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt, worauf die immobilisierten Zellen filtriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wurden. Das Trockenprodukt (0,5 g) wies eine malolactische Aktivität von 53 Einheiten/g auf, was einer Aktivitätsausbeute von 28% entspricht.

Beispiel 19

4 g Trockengewicht von Zellen, immobilisiert wie in Beispiel 17 beschrieben, wurden zu 50 ml 25-m-molarem L-Malat in 0,1 M Phosphat vom pH-Wert 5,0 zusammen mit 85 µMol NAD⁺ und 35 µMol MnCl₂ gefügt. Die Gesamtumwandlung des Malats in Lactat erzielte man in 3 Stunden. Die Arbeitsweise konnte mindestens fünfmal ohne Zunahme der Reaktionszeit wiederholt werden.

Beispiel 20

0,35 g des in Beispiel 18 erhaltenen Präparats wurden zu 10 ml 33-m-molarem L-Malat in 0,1 M Phosphat vom pH-Wert 4,0 zusammen mit 17 µMol NAD⁺ MnCl₂ gefügt. Die Gesamtumwandlung des Malats in Lactat erzielte man während 6 Stunden und das Verfahren konnte mit frischem Malat, NAD⁺ und MnCl₂ mindestens fünfmal wiederholt werden, ohne Zunahme der Reaktionszeit.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung eines intrazellulären, gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismenzellen, die intrazellulär ein gegen Glutaraldehyd sehr empfindliches Enzym enthalten, in wäßrigem Medium mit Glutaraldehyd in Anwesenheit eines Polyamins mit einem Gehalt an primären Aminogruppen von über 5% des Gesamtgehaltes an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen umsetzt und das erhaltene immobilisierte Enzym in bekannter Weise isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismenzellen den Stamm NRRL B-11240 einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismenzellen den Stamm NRRL B-11229 einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Gehalt an primären Aminogruppen in dem Polyamin von über 20% des Gesamtgehaltes an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen ausgeht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyamin ein Polyalkylenimin, in dem der Alkylenteil 2 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, vorzugsweise ein verzweigtes Polyalkylenimin, einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyamin ein verzweigtes Polyäthylenimin einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyamin ein Polyalkylenpolyamin einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Verhältnis von primären Amin-Äquivalenten/Aldehyd-Äquivalenten im Bereich von 0,01 : 1 bis 10 : 1, vorzugsweise von 0,1 : 1 bis 1 : 1 ausgeht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verhältnis von Glutaraldehyd/Mikroorganismenzellen (Gew./Gew.) im Bereich von 0,01 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise von 0,1 : 1 bis 10 : 1, einsetzt.

10. Verwendung des gemäß Anspruch 1 hergestellten immobilisierten Enzymprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß man immobilisierte Penicillin-V-Acylase mit Penicillin-V in einem kontinuierlichen Verfahren in Kontakt bringt.