DE2153232A1 - Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amylase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung und Verwendung von AmylaseInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amylase.
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
neuen Amylase mit vorteilhafter enzymatischer Wirksamkeit
und vorteilhaften Eigenschaften. Man erhält diese Amylase durch Züchten eines Stammes von verschiedenen Streptomyces-Arten,
wobei sich die neue Amylase in dem verwendeten Kulturmedium bildet und anhäuft und daraus gewonnen wird. Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Maltose durch Umsetzen der auf diese Weise gebildeten
neuen Amylase mit Stärkesubstraten. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Maltit durch
Umsetzen der Amylase mit Stärkesubstraten und Hydrierung
der dabei gebildeten Maltose in Gegenwart eines Nickelkatalysators .
Es wurde gefunden, daß man beim Züchten von Stämmen der
209820/1046 BAD ORIGINAL
Art Streptomycesarten, insbesondere Streptomyces al"bus,
Streptomyces aureofaciens, Streptomyces hygroscopicus,
Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces flavus und Streptomyces
tosaensis nov. sp. oder von deren natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten in einem Kulturmedium,
das übliche Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält,
wie sie üblicherweise zum Züchten von Actinomyceten unter ärobischen Bedingungen zur Verfügung stehen in dem Kulturmedium
eine neue Amylase erhält, die solche enzymatisehen Wirksamkeiten und Eigenschaften hat, daß der optimale pH-Wert
im Bereich von 4,5 - 5}0 für Stärkesub3träte liegt, wobei die
HydroIysegrenze der Stärke für dieses Enzym nicht weniger als
75 % der theoretischen Maltose beträgt und das Verhältnis von
G-lukose zu Maltose, die durch die Wirkung dieses Enzyms aus
Stärke gebildet wird nicht mehr als 0,06:1 Gewichtsteile beträgt, wobei die neue Streptomyces-Amylas.e, die in dem Kulturmedium
gebildet und angesammelt wird, in üblicher weise daraus gewonnen werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Amylase durch Züchten von Streptomyces-Stämmen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm von Streptomyces albus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces
hygroscopicus, Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces flavus und Streptomyces
tosaensis nov. sp. unter ärobischen Bedingungen in einem Kulturmedium züchtet, das bekannte Kohlenstoff- und Stickstof.fquellen
enthält, um in dem Kulturmedium eine iunylane zu bilden
und anzusammeln, die solche entzymatischoii „firksamkeitun und
Eigenschaften hat, daß der pH-Wert der optimalen Aktivität im Bereich von 4,5 - 5,0 für ein Stärkesubstrat liegt, wobei
209820/1046 BAD
die Grenze der Hydrolyse von Stärke durch dieses Enzym nicht weniger als 75 i° der theoretischen Maltose "beträgt und das
Verhältnis von Glukose zu Maltose, die aus Stärke durch die Wirkung dieses Enzyms gebildet wird, nicht weniger als 0,06:1
Gewichtsteile "beträgt und die Amylase aus dem Kulturmedium in "bekannter Weise anschließend gewonnen wird.
Für die Herstellung der neuen Amylase gemäß der Erfindung wurde es als vorteilhaft gefunden, einen der "besonderen Streptomyces-Stämme
zu verwenden, die in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt sind.
Stämme
P.R.I. * ATCC. ** Hinterle- Hinterlegungsnummer
ßungsnummer
601
602
21723
21722
Streptomyces tosaensis SF-1085 (dieser Stamm wurde zunächst aus Erde
isoliert. Seine Eigenschaften werden nachstehend näher beschrieben.)
Streptomyces hygroscopicus SF-I084 (Dieser Stamm entspricht Streptomyces
hygroscopicus, das in Wakman's "The Actinomycetes" Bd. 2 (1961) und in
»Applied Microbiology" Bd. 10, Seiten 258-263 (1962) beschrieben ist.)
Streptomyces viridochromogenes SF-1087
(Dieser Stamm entspricht Streptomyces viridochromogenes, das in Waksman's "The actinomycetes" Bd. 2 (1961) und im
»Journal of Bacteriology" Bd. 85, Seiten 676-690 (1963) beschrieben ist.)
Streptomyces albus SF-1089 (Dieser Stamm entspricht Streptomyces
albus, das in Waksman's "The Actinomycetes"
Bd. 2, (1961) beschrieben ist.)
Streptomyces flavus
603
21724
605
21725
209820/1046
BAD
Streptomyces aureofaciens 606
Streptomyces hygroscopicus
var. angustomycetes 607
In Tabelle 1:
* F.R.I, ist eine Abkürzung für "Fermentation Research Institute",
Agency of Industrial Science & Technology of Ministry of International Trade & Industry of Japan, Inage, Chlba City,
Japan.
** ATCC. ist eine Abkürzung für American Type Culture Collection,
Washington D.C, U.S.A.
Die vorstehend angegebenen Stämme können in wirksamer Weise die neuen Amylasen mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften
in einem Kulturmedium bilden und anhäufen, wenn sie unter ärobischen Bedingungen in bekannter »/eise gezüchtet werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung züchtet man zur
Herstellung der neuen Amylase einen Stamm von Streptomyces aureofaciens F.R.I. 606, Streptomyces flavus F.R.I. 605,
Streptomyees hygroscopicus F.R.I. 602, Streptomyces hygroscopicus var. angustemyceticus F.R.I. 607, Streptomyces
viridochromo-genes F.R.I. 603, Streptomyces albus F.R.I. 604
und Streptomyces tosaensis nov. sp. F.R.I. 601 in einem Kulturmedium, das bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
enthält, unter ärobischen Bedingungen und erhält in dem Kulturmedium eine Amylase mit solchen enzymatischen Eigenschaften
und ./irksamkeiten, daß der pH-Wert der optimalen Wirksamkeit
im Bereich von 4,5 - 5,0 für Stärkesubstrat liegt, wobei die Grenze der Hydrolyse von Stärke durch dieses Enzym nicht
weniger als 75 7" der theoretischen Maltose entspricht und das
209820/1046 BAD
Verhältnis von Glukose zu Maltose, wie sie durch hydrolytische i/irkung des Enzyms aus der Stärke gebildet wird,
nicht weniger als 0,06: 1 Gewichtsteile beträgt. Die Amylase wird aus dem Kulturmedium in bekannter Weise gewonnen.
Mit dem vorstehend erwähnten Ausdruck "die Grenzen der Hydrolyse von Stärke durch dieses Enzym beträgt nicht weniger
als 75 $> der theoretischen Maltose" soll bezeichnet werden,
daß bei Umsetzung einer ausreichenden Menge der neuen Amylase gemäß der Erfindung mit Stärkesubstrat in einem optimalen
pH-Bereich und optimalen Temperaturbereich der Grad der Hydrolyse der Stärke eine Grenze erreicht, bei der die Hydrolyse
der Stärke aufhört, wobei dann nicht weniger als 75 % der theoretisch erhaltbaren Maltose aus dem Stärkesubstrat gebildet
worden sind unter der Voraussetzung, daß der Anteil der reduzierenden Zucker aus der Stärke durch die Hydrolyse nach
dem Soniogyi-Titrationsverfahren bestimmt und als Maltose
berechnet worden ist.
Die besonderen enzymatischen Wirksamkeiten und Eigenschaften
der neuen Streptomyces-Amylasen, wie sie durch das Verfahren der Erfindung gebildet werden, sind in der nachstehenden
Tabelle 2 zusammengefaßt. Zu Vergleichszwecken sind Eigenschaften bekannter Amylasen aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen
und Tieren ebenfalls in Tabelle 2 erwähnt.
209820/1OAB
co co ro ο
| !Tabelle | 2 | Gew.-Ver hältnis von |
optimale | Aktivierung | durch : | |
| OOtimaler | Grenzen der Hydrolyse |
gebildeter Glukose zu Kaitose |
'.Temperatur | Oalcium- kation |
Ohlorid- anion |
|
| Amylasequellen | pH-Wert | von Stärke durch Amylase |
0,058:1 | 50-60 | negativ | negativ |
| Streptomyces albus | 4,5-5,0 | 78 | 0,058:1 | 5Ü-6O | negativ | negativ |
| Streptomyces aureoi'aciens | 4,5-5,0 | 76 | 0,055:1 | 50*60 | negativ | negativ |
| Streptomyces hygroscopicus | 4,5-5,0 | 82 | 0,053:1 | 50-60 | negativ | negativ |
| Streptomyces hygroscopicus var. angustomycetes |
4,5-5,0 | 80 | 0,051:1 | 50-60 | negativ | negativ |
| Streptomyces viridochromogenes |
4,5-5,0 | 79 | 0,058:1 | 50-60 | negativ | negativ |
| Streptomyces flavus | 4,5-5,0 | 76 | 0,053:1 | 50-60 | negativ | negativ |
| Streptomyces tosaensis nov. sp. |
4,5-5,0 | 79 | 0,71:1 | negativ | positiv | |
| Bacillus subtilis (Bakterie) |
5,5-6,8 | 70* | 0,64:1 | negativ | negativ | |
| Aspergillus oryzae (Pilz) ■ |
5,5-5,9 | 48* | positiv | negativ | ||
| keimende Gerste (Pflanze) |
4,7-5,8 | 80 | 0,024:1 | _ | negativ | positiv |
| Hog Panereas-Schwein (Her) |
6,9 | 80 | — | — | negativ | positiv |
| menschlicher Speichel | 6,9 | 80 | ||||
* berechnet als Glukose
Durch Vergleich der Eigenschaften der verschiedenen in
Tabelle 2 gezeigten Amylasen erkennt man, daß die neuen Amylasen von den vorstehend genannten sieben Streptomycesarten,
wie sie gemäß der Erfindung erhalten werden, nicht mit den bekannten Amylasen übereinstimmen, insbesondere hinsichtlich
ihres optimalen pH-Bereichs, der Grenzen in der Hydrolyse von Stärke, der Aktivierung durch das Calciumkation
lind das Chloridanion. Daß die neuen Amylasen aus den besonderen
sieben Streptomycesarten, wie sie gemäß der Erfindung gebildet
v/erden, einen relativ niedrigeren optimalen pH-Bereich und
einen höheren optimalen Temperaturbereich sowie einen verhältnismäßig höheren wert für die Grenzen der Hydrolyse von Stärke
in Verbindung mit ihrem niedrigeren Verhältnis von Glukose zu Maltose haben, ist besonders vorteilhaft bei ihrer Verwendung
zur handelsmäßigen Herstellung von Haitose aus Stärke. Das ist darauf zurückzuführen, daß der verhältnismäßig niedrige
optimale pH-Bereich und der höhere optiiaale Temperaturbereich die Stärkehydrolyse in einem solchen pH-3ereich und bei einer
solchen Temperatur ermöglicht, daS dabei die Verschmutzung der Verzuckerungsmisellung durch das .faohstum von unerwünschten
Mikroorganismen verhindert wird, weil der relativ höhere V/ert
für die Grenze der Stärkehydrolyse eine vollständigere und wirksamere Hydrolyse der Stärke ernöglicht und weil der niedrigere
»vert für das Verhältnis von ürlukose zu Haitose, die aus
der hydrolysieren Stärke erhalten wird, zu einer wirksameren
und bevorzugten Bildung von Haitose mit dem Ergebnis führt,
daß das Verfahren zur Herstellung von Ealtose aus Stärke sehr glatt«· durchgeführt v/erden kann und die Ausbeute an Maltose
im Vergleich zur Verwendung der bekannten Amylasen erheblich verbessert v/erden kann.
3a Streptomyces tosaensis nov. sp. (hinterlegt in P.R.I, unter
209820/1046
der F.R.I.-Hinterleerungsnummer 601 und unter der Al1CO.-Hinterlegung
snummer 21725; ein neuer Mikroorganismus ist, der aus
dem Boden von den Erfindern isoliert wurde, werden nachstehend
die mikrobiologischen eigenschaften dieses Stammes im einzelnen
beschrieben:
1. Morphologische Eigens chartert
(1) Flüchtiges Mycelium: flüchtiges Mycelium wird in syn
thetischen Kulturmedien wie Giukose-Asparagin-agar, Stärke-synthetisches
Agar usw. reichlich gebildet und ist im allgemeinen kurz, monopodial
verzweigt. IdLe Enden des flüchtigen Myceliums sind spiralförmig(geschlossen)
.
(2) Sporen: Die Sporen haben ovale oder elliptische bis
zylindrische Form. Die Sporengröße beträgt 0,6-0,7 Mikron^ : 0,8-1,0 Mikron.^. Die Oberflächenstruktur
der Sporen ist glatt.
2. Eigenschaften von verschiedenen Kulturmedien
lieocachtungen der Kulturen von Strcptomyces tosaensis
nov. sp. sind in der ne.chsteilenden Tabelle 3 erfaßt.
Kulturmedium
Wachstum
flüchtiges Mycelium
lösliches Pigment
Rohrzucker- sehr schlech- sehr spärlich, Czapek1s Agar tes Wachstum, weiß gefärbt
(bebrütet bei 280C) farblos
ohne
209820/1048
BAD
_ 9 —
G-lyeerin-
Czapek's Agar
(bebrütet "bei 28 C)
sehr schlech- sehr spärlich, tes Wachstum, weiß gefärbt ohne
farblos
Krainsky' s-G-lukose-Asparagin-agar
(bebrütet bei 28°C)
(bebrütet bei 28°C)
braun bis rötlich-braun gefärbt, die Keime dringen in das Agar
reichlich grün bis grau-grün
gefärbt, mit
weißgefärbten
Flecken
gefärbt, mit
weißgefärbten
Flecken
ohne
Ushinsky1s-Glukose-Asparagin-agar
(bebrütet bei 28°C)
(bebrütet bei 28°C)
gutes Wachstum, grün bis grau- schwach
rötlich-braun grün gefärbt, rötlich
gefärbt mit weiß bis rosa braun
gefärbten Flecken gefärbt
Calcium-maleat-agar (bebrütet bei 28O(j)
schlechtes
Wachstum,
farblos
spärlich,graugrün gefärbt
ohne
Grlycerin-Calcium- schlechtes spärlich, maleat-agar Wachstum, weiß gefärbt ohne
(bebrütet bei 28 C) cremig gefärbt
synthetischer gutes Wachstum, reichlich grün Stärke-agar braun bis rötlich- bis grau gefärbt
(bebrütet bei 28 C) braun gefärbt mit weißen und
rosa Flecken ohne
gewöhnliches Agar gelblich-braun ohne (bebrütet bei 28 C) gefärbt
ohne
Uähragar gutes wachstum, spärlich,
(bebrütet bei 28 C) schwach braun weiß gefärbt ohne
gefärbt bei
Faltenbildung
Pepton-G-lukose-agar helle, gelblich- ohne
(bebrütet bei 280C) braune Färbung
ohne
209820/1046 BAD ORIGINAL
- ίο -
Tyrosin-agar rötlich-braun grau gefärbt rötlich-(bebrütet
bei 28 G) gefärbt braun
gefärbt
Kartozfelschnitzel erhöht, gutes ohne ohne
(bebrütet bei 280G) wachstum, schwach
graue Cremefarbe,
jedoch rötlich-braun
gefärbt am oberen
Teil der Schräge
Karottenscheiben schwache graue grün bis grau- ohne
(bebrütet Dei 28 C) Cremefarbe grün gefärbt
entrahmte Milch ringförmiges ohne ohne
(bebrütet bei 37 C) Wachstum,
s chwachgelb-
braun gefärbt
Ei schlechtes ohne ohne
(bebrütet bei 37 C) Wachstum,
schwach gelb
gefärbt
Loeffler1s schlechtes ohne ohne
koaguliertes Wachstum,
Serum-medium schwach grau
(bebrütet bei 28°C) gefärbt
C*zä"pekTs" .
G-lukoselösung ringförmiges ohne ohne
(bebrütet bei 28°C) Wachstum,
Cremefarbe
Gelatine-medium schwache ohne ohne
(bebrütet bei 20 C) Cremefarbe
Cellulose-medium kein Wachstum - -
(bebrütet bei 28°C)
209820/1048
BAD ORJGINfAt
Melainiiibiluung : negativ
!bildung von Schwefelwasserstoff : negativ
Bildung von Tyrosinase : negativ
Verringerung von ITitrat : positiv
Hydrolyse von Stürke : positiv
Feptonieierung von entrahmter Milch: positiv
Koagulation von entrahmter KiIcn : negativ
Aui'lö ε ung von Lo of 11 er' s
]:oa&"ulicrtei:i Serum : negativ
Verflüssigung von Gelatine : positiv Hydrolyse von Cellulose : negativ
4. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
(1) Ausnutzung: Xylose, Glukose, G-alaktose, Maltose,
Lactose, Raffinose, Dextrin, Stärke, G-I yc erin, Ii:enn.it, liatriua-ac etat,
Ziatriumcitrat, Uatriumsuecinat,
SaIicin und Mannose.
(2) Zweifel an Ausnutzung bei: Araoinose und Saccharose.
(3) Keine Ausnutzung: iüianrtiose, fructose, Inulin,
Dulcit, Sortit, Inosit und
Cellulose.
die vorstehend erwähnten mikrobiologischen Eigenschaften des neuen Mikroorganismus, Streptomyces tosaensis nov. sp.
können wie folgt susamni enge faßt werden. Das flüchtige
Mycelium "bildet eine Anzahl von Spiralen und die Oberflächenstruktur
der Sporen ist glatt. Bei synthetischen Kulturmedien wird ein grün bis grau-grün gefärbtes flüchtiges Mycelium
209820/1046
BAD
auf einem "braun "bis rötlich-"braun gefärbten Untergrund gebildet,
ohne daß lösliches Pigment gebildet wird. Andererseits erhält man auf organischen Kulturmedien gelblich-braun
bis rötlich-braun gefärbtes Wachstum, jedoch nur in geringen Mengen mit der Ausnahme, daß auf Karottenschnitzeln grün
gefärbtes Wachstum beobachtet werden kann. Lösliches Pigment wird im allgemeinen nicht gebildet mit der Ausnahme, daß ein
rötlich-braun gefärbtes lösliches Pigment auf Tyrosin-Agar-Medium
gebildet wird. Das bedeutet, daß dieser Stamm nicht chromogen ist.
Der Stamm ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß
er nicht chromogen ist und grün gefärbtes flüchtiges Mycelium bildet. Bei bekannten Arten von EikrοOrganismen mit ähnlichen
mikrobiologischen Eigenschaften, wie sie in Waksman's "The
Actinomycetes" Band 2 (1961) beschrieben sind, sind besonders
Streptomyces prasinus, Streptomyces hirsutus, Streptomyces
prasinopilosus, Streptomyces viridans, Streptomyces alboviridis,
Streptomyces viridis und Streptomyces glaucus Stämme, die dem neuen HikroOrganismus Streptomyces tosaensis nov. sp.
sehr ähnlich sind. Der neue Mikroorganismus kann jedoch wie nachstehend beschrieben von äen bekannten Arten unterschieden
v/erden.
(1) I/ie Oberflächenstruktur der oporen von otreptomyces
prasinus und otreptomyces hirsutus sind stachelig, während
die von ourejjtomyces tosaensis nov. sp. glatt sind.
(2) Die Oberflächenstruktur der Sporen von Streutoiayces
prasinopilosus ist haarig, während die von Streptomyces tosaensis nov. sp. glatt ist.
(3) Strey-tonyces viridans zei~t grünes bis olivgrün gefärbtes
209820/1046 BAD
"wachstum auf Czapek's Glycerin-agar und "bildet ein grün
"ois olivgrün gefärbtes lösliches Pigment sowohl auf
Czapek1s Glycerin-agar als auch auf Kartoffelschnitzeln,
während Streptomyces tosaensis nov. sp. ein braun "bis
rötlich-braun gefärbtes Wachstum auf Agarmedium bildet, jedoch auf Kartoffelschnitzein kein lösliches Pigment
ergibt.
(4) Streptomyces alboviridis liefert gelb gefärbtes lösliches Pigment auf Giukose-Asparagin-agar und grün-braun gefärbtes
lösliches Pigment auf Gelatinemedium, führt zum Dunkelwerden von Kartoffelschnitzeln/zum Gerinnen von entrahmter Milch.
Demgegenüber erhält man aus Streptomyces tosaensis nov. sp. weder auf Glukose-Asparagin-agar noch auf Gelatinemedium
ein lösliches Pigment. Es werden auch Kartoffelschnitzel dadurch nicht dunkel und entrahmte Milch koaguliert nicht.
(5) Streptomyces viridis bildet keine Spiralen, zeigt jedoch ein grün gefärbtes Wachstum auf verschiedenen Agarmedien
und sein flüchtiges Mycelium ist üblicherweise grau gefärbt. Demgegenüber bildet Streptomyces tosaensis nov. sp. viele
Spiralen und zeigt ein braun bis rötlich-braun gefärbtes 'nfaehstum auf verschiedenen Agarmedien und sein flüchtiges
Mycelium ist grün bis grau-grün gefärbt.
(6) Streptomyces glaucus bildet braun gefärbtes lösliches Pigment auf Czapek's Rohrzucker-agar, bildet grün gefärbtes
flüchtiges Mycelium auf Nähragar und Kartoffelschnitzel und zeigt ein gutes Wachstum auf einem Gellulosemedium.
Demgegenüber bildet Streptomyces tosaensis nov. sp. kein lösliches Pigment auf Czapek1s Rohrzucker-agar, bildet
nur wenig flüchtiges Mycelium auf einem Nähragar und Kartoffelschnitzeln und zeigt auf Cellulosemedium kein
Wachstum.
209820/1046
Unter den "bekannten Stämmen, die zur Gattung Streptomyces
gehören, gibt es nur wenige Mikroorganismen, die nicht
chromogen sind, jedoch grün gefärbtes flüchtiges Mycelium bilden, ähnlich wie der Mikroorganismus Streptomyces tosaensis
nov. sp. Bei dem vorstehenden Vergleich zwischen den bekannten Stämmen und dem Mikroorganismus Streptomyces tosaensis
nov. sp. befindet sich kein Stamm, der mit dem Mikroorganismus Streptomyces tosaensis nov. sp. genau übereinstimmt.
Man muß daher annehmen, daß Strep^tomyces tosaensis nov. sp.
eine neue Gattung dargestellt. Aus diesem G-runde wurde der neue Mikroorganismus als Streptomyces tosaensis bezeichnet.
Dieser Stamm wurde von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert, die in Kouchi-perfecture, Japan, gesammelt wurde.
Bei der Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens der Erfindung wurde ein Stamm Streptomyces albus, Streptomyces
aureofaciens, Streptomyces hygroscopious, Streptomyces
hygroscopicus var. angustomycetieus, Streptomyces viridochromogenes,
Streptomyces flavus und Streptomyces tosaensis nov. sp. in einem bekannten Kulturmedium gezüchtet, wie es üblicherweise
zur Züchtung von Streptomycesarten verwendet wird und dabei die neue Amylase mit den vorstehend geschilderten enzymatischen
Eigenschaften gebildet und in dem Kulturmedium gesammelt.
Bas Herstellungsmedium für die Züchtung eines Stammes von
Streptomyces gemäß de» ersten Merkmal der Erfindung kann eine oder mehrere Stärkearten enthalten, auch lösliche Stärke,
Glukose, Roggenmehl usw, die als Kohlenstoffquellen dienen
und eine oder mehrere der nachstehend aufgeführten Stickstoffquellen: entfettetes Sejabohneiraehl, entfettetes Baumwollsamenmehl,
Weizenkeime, Erdnußmehl, Fermentmedium, Fischmehl,
209820/1046
d OFBGiNAt.
getrocknete Hefe, entrahmte Iüilch, Kasein, IIalzextrakt,
,c-feextrakt, natriumnitrat oder Kaliumnitrat usw. Darüber
hinaus ist es möglich, in das Kulturmedium eines oder mehrere anorganische üalse einzubringen, wis Kaliuindihydrogenp:iospliat,
Magnesiumsulfat, Mangansulfat, iöisen-III-Sulfat
oder Calciumcar"bon8,t usv/. und außerdem auch Spurenelemente,
um das V/achstum des Mikroorganismus zu fördern und die Bildung des Enzyms, wenn erforderlich, zu erhöhen.
leim Verfahren der Erfindung kann die Züchtung des Streptomyces-Starnmes
in "bekannter "v/eise durchgeführt v/erden unter geei nieten Zuehtbedingungen, wie sie üblich erweise zur Züchtung
von Streptomyces verwendet v/erden. So ist es möglich, entweder
in einem flüssigen oder einem festen Kedium zu züchten, um
die neue Amylase zu bilden und in einem flüssigen oder festen
Kulturmedium anzusammeln. j5s wird jedoch vorgezogen, eine
Plüssigkeitszüchtung,insbesondere eine Flüssigkeitszüchtung
unter ärobischeii 3edingixngen in der Flüssigkeit durchzuführen.
"..:enn einer der vorstehend erwäimten Stämme von Streptomyces
bei einer Temperatur von 25-57°C und bei einen pH-.vert im Bereich eines schwachen Säuregrades bis zu einer schwachen
Älkalinität unter ärobischeii iedingunren in σ sr Flüssigkeit
bei ielüftung \m& bewegung bebrütet v/ird, erreicht die 3il-,";r.nj
der neuen Ah;"laso ein Kaxirjum bei 3 bis 5 i'agen Brutzeit.
ijur jevfimiung der ^nyiase wird das Kulourmediuiii oder die
KuI tür "brühe, in dem die Streptomyces-G-attung bebrütet v/o r den
ist, in bekannter .."eise behandelt, -am die neue Amylase daraus
;:u gewinnen. So kann cum Beispiel die Kulturbrühe filtriert
werden, um den Kycelkuchen abzutrennen, wobei das anfallende
yiltrat anschließend behandelt werden kann entweder nach einen Aussalzverfahren durch Zugabe eines wasserlöslichen, ar.orj~ar.ischen
Salzes wie Ar;imoniumsulfat usv/. oder nach einem Au ε f Sl-
209820/104G
lungsverfahren durch Zugabe eines wassemnisdibaren organischen
Lösungsmittels wie Äthanol, Methanol, Isopropanol, Aceton usw.
oder durch ein Adsorptions-Eluierungsverfahren unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes usw. Die neue Amylase kann auf
diese Weise aus dem bebrüteten Kulturmedium abgetrennt werden. Die so abgetrennte neue Amylase kann durch Sprühtrocknen,
Heißlufttrocknen, Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen oder
Lyophilisieren weiterbehandelt werden, um eine rohe Fulvermasse
der neuen Amylase zu erhalten.
Die rohe Amylase kann auf eine Weise gereinigt werden, wie sie für die Reinigung von Enzymen bekannt ist. Ein elektrophoretisch
homogenes und reines Produkt der neuen Amylase gemäß der Erfindung kann durch Reinigen des vorstehend "beschriebenen
rohen Pulvers der neuen Amylase durch, folgendes Reinigungsverfahren erhalten werden. Die Kulturbrühe, in der
die flüssige Zucht von Streptomyces durchgeführt worden ist, wird filtriert und man erhält ein KuIturfiltrat (15 1), zu dem
Äthanol bis zu einer Athanolkonzentration von. 60 Vol.?£ zugegeben wird, um einen Niederschlag zu erhalten. Dieser Niederschlag
wird gereinigt und getrocknet und man erhält ein Pulver (100 g), das mit 2 1 Leitungswasser zur Extraktion
behandelt wird. Die Mischung wird filtriert und man erhält
ein Pil trat und einen Extraktionsrückstand, der verworfen,
wird. Das Piltrat wird mit Calciumacetat (44- g) versetzt
und die Mischung filtriert und man erhält ein Filtrat vnä
einen Niederschlag, der verworfen wird. Das Piltrat wird mil;
Ammoniumsulfat zu 30 °ß> gesättigt und die Mischung dann filtriert,
um ein weiteres Piltrat vom NiederseWLag zu trennen.
Dieses Piltrat wird wiederum zu 70 % mit Ammoniumsulfat
gesättigt, um einen Niederschlag zu erhalten- Dieser Niederschlag wird in 260 ml Leitungswasser eingegeben und gegen,
einen fließenden Strom Leitungswasser dialysiert. Die dialy-
209820/1046
sierte Lösung wird durch. Eindampfen unter verringertem Druck
eingeengt und anschließend lyophilisiert. Das lyophilisierte
pulverförmige Produkt (1,21 g) wird dann chromatographisch in einer Kolonne mit DEAE-Sephadex A-50 (Kolonnenkapazität:
4,8 cm χ 54 cm) behandelt. (DEAE-Sephadex A-50 ist ein im
Handel verfügbares G-el-Filtrierungsmittel, das von der Firma
Pharmacia Co. in Schweden hergestellt wird und ein Dextrangel enthält, das durch Epichlorhydrin vernetzt ist.) Das chromatographische
Trennverfahren wird durchgeführt, indem eine wässrige Lösung von 700 mg des lyophilisierten Pulvers auf
die Kolonne gebracht wird, die durch Zugabe einer Pufferlösung aus M/200 Tris-hydroxymethylaminomethan und Salzsäure zusammen
mit M/1000 Calcium (pH 8,5) abgepuffert ist und anschließend dann die Kolonne zunächst mit der gleichen Pufferlösung eluiert
wird. Danach wird nochmals mit der gleichen Pufferlösung eluiert, jedoch enthält diese 0,05M Natriumchlorid. Zum Schluß
wird mit der gleichen Pufferlösung nochmals eluiert, die jedoch 0,1M Natriumchlorid enthält. Die wirksamen Fraktionen,
die eine hohe Konzentration an der neuen Amylase enthalten, werden aus dem Eluat gesammelt und miteinander vereint (440 ml).
Die vereinten Fraktionen werden dann durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt und das gebildete Konzentrat
gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man
erhält ein lyophilisiertes Produkt (61 mg). Dieses lyophilisierte Produkt wird erneut in einer Kolonne mit DEAE-Sephadex
A-50 behandelt (Kolonnenkapazität: 1,15 cm χ 33 cm), indem eine wässrige Lösung von 45 mg des lyophilisierten Produktes
auf die Kolonne gebracht wird und die Kolonne zunächst mit einer Pufferlösung eluiert wird, die aus M/200 Tris-hydroxymethylaminomethan und Salzsäure besteht (pH 8,5). Anschließend
wird mit einer wässrigen Lösung von 0,05M Natriumchlorid und danach mit einer wässrigen Lösung von 0,1M Natriumchlorid
eluiert. Aktive !Fraktionen mit einer hohen Konzentration
209820/1048
an der neuen Amylase werden aus dem Eluat vereint. Die
vereinten Fraktionen (40 ml) werden durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt und das gebildete Konzentrat
gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um ein lyophilisiertes Produkt (24 mg) zu erhalten, das aus
einem elektrophoretisch homogenen und reinen Produkt der neuen Amylase besteht.
Daß dieses lyophilisierte Produkt der neuen Amylase eine einheitliche und reine Substanz ist, wird bei Durchführung
der Elektrophorese mit Celluloseacetatgel in der nachstehend erwähnten Weise bestätigt. Die Elektrophorese wurde unter
Verwendung von Celluloseacetatgel durchgeführt, das mit einer Pufferlösung gesättigt war, die aus Tris-hydroxymethylaminomethan
und Salzsäure (pH 8,7; 0,05 u) bestand, wobei ein elektrischer Strom von 0,6 mA/cm 65 Minuten hindurchgeführt wurde
und das enzymatisch^ Protein mit Schwartz Aminolösung gefärbt wurde. Es wurde gefunden, daß die Probe 2,2 cm gegen
den positiven Pol wanderte und ein einheitliches Band ergab.
Eigenschaften der neuen Amylase, die aus der Kultur von
Streptomyces hygroscopicus erhalten und nach dem vorstehend beschriebenen Eeinigungsverfahren gereinigt wurden, sind
nachstehend im einzelnen beschrieben.
1. Enzymatisehe Wirkung.
Wenn ein reines Produkt dieser neuen Amylase von Streptomyces
hygroscopicus mit Stärke bzw. Amylose umgesetzt wird, werden die Kohlehydrate wirksam hydrolysiert und man erhält eine
geringe Menge Glukose und eine erheblich größere Menge Maltose» wie nachstehend gezeigt wird.
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| Tabelle | 4 | Mengen an | Zuckerprodukten ** | |
| Relative | Maltose | Oligomalzzucker | ||
| Substrat | *Hydrolysegrad | Glukose | 58,2 $, 62,8 % |
38,6 % 34,9 # |
| Stärke Amylose |
74,8 0 78,6 £ |
3,2 # 0 |
||
Mit Bezug auf Tabelle 4:
* "Der Grad der Hydrolyse" wurde bestimmt, indem die Amylase
mit dem Substrat bei einem pH-Wert von 5,5-5,8 bei 500C
20 Stunden bei einer Substratkonzentration von 1 % umgesetzt
wurde (die Amylase war so bemessen, daß 500 verzuckernde Einheiten je Gramm des Substrats vorlagen), sodann die Gesamtmenge
des gebildeten reduzierenden Zuckers nach dem Titrationsverfahren von Somogyi bestimmt, die bestimmte Gesamtmenge der
reduzierenden Zucker als Maltose berechnet und dann der "Grad der Hydrolyse" nach folgender Gleichung bestimmt wurde:
"Grad der Hydrolyse"
Gesamtmenge der gebildeten reduzierenden a Zucker, berechnet als Maltose χ ^qq
Stärkemenge, berechnet als Maltose
wobei "der Anteil der als Maltose berechneten Stärke" durch vollständige Hydrolyse des Substrats bestimmt wmrde, indem
dieses mit einer ausreichenden Menge von 2N Salzsäure auf einem kochenden Wasserbad erhitzt wurde, die Eeaktionsmischung
mit Matronlauge neutralisiert, der Anteil der gebildeten
209820/1046
Glukose nach dem Ti trat ions verfahr en von Somogyi "bestimmt
und anschließend die "bestimmte Menge der Glukose als Maltose "berechnet-wurde, d. h. ein Produkt der gemessenen Menge
Glukose durch 0,95 als "Anteil der "berechneten Stärke als Maltose" entwickelt wurde.
Glukose durch 0,95 als "Anteil der "berechneten Stärke als Maltose" entwickelt wurde.
**"Relative Mengen von Zuckerproduktenw wurden "bestimmt durch
Fraktionierung des hydrolysieren Produkts des Substrats in einem chromatographischen Verfahren, getrennte Bestimmung
der Anteile jeder isolierten Zuckerkomponente und Beschreibung der Anteile davon in Gew.ji.
2. Spezifisches Substrat.
Wenn ein gereinigtes Produkt der neuen Amylase von Streptomyces hygroscopicus mit verschiedenen Substraten umgesetzt
wird, wie nachstehend gezeigt wird, werden die in Tabelle
angegebenen Ergebnisse erhalten:
gebildete Zucker**
Grad der a a a λ $
Substrate Verzuckerung* 12 5 4
lösliche Stärke 100 Jt + +++ ++ + +
Maisstärke 92,8 # + +++ -H- + +
Glykogen 45,8 % - +++ ++ + +
Amylose 106,5 # - +++ ++ - +
Dextrin 91,0 $ ± +++ ++ + +
ß-Cyclo dextrin --.-- +
*-Cyclodextrin - + -.- +
Maltohexaose - ++ + + -
20 98 20/1046
*1 »2 S G4 Maltopentaose - ++ ++ Z '
Maltotetraose + ++ +
mm mm
Maltotriose - ' -
Maltose
Mit Bezug auf Tabelle 5ί
♦ "Der Grad der Yerzuckerung" wurde tJestiauat auf eine Weise,
daß der "Grad der Hydrolyse" der löslichen Stärke durch die
Wirkung einer gegebenen Menge der gereinigten neuen Amylase
als 100 it angenommen wurde»
** "Gebildete Zucker« wurden analysiert durch Brtaittlung des
Vorliegens der entsprechenden Zucker durch Papierobromatographie
nach tJmsetzung dee Enzyms mit dem Substrat bei einem
pH-Wert Ton 5»5 bei einer Substratkonzentration ron 0,8 und
einer Bnzyadeonzentration von 0,00017 # bei 400O für 60 Minuten.
In Tabelle 5 bedeuten die Buchstaben G^, G2» G^, G^ und G^
jeweils Glukose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und
Maltopentaose. Die Zeichen haben folgende Bedeutung:
+++ J Bs liegt eine sehr große Zuckermenge vor. ++ : Bs liegt eine große Zuckermenge vor.
+ ί Bs liegt eine bedeutende Zuckermenge vor. + ί Bs liegen Spuren von Zucker vor und
j Bs läßt sich kein Zucker feststellen.
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Die neue Amylase gemäß der Erfindimg wurde in gleicher Weise mit dem anderen Substrat Glukan umgesetzt wie Laminaran
(Araban /3-1f3:ß~1,6=7:3), Paehyman (ß-1,3) und Dextran (verfügbar
als Sephadex G-100, ot-1,6) und es wurde dann gefunden,
daß dieses Glukan durch die Einwirkung der neuen Amylase gemäß der Erfindung nicht hydrolysiert werden konnte.
3. Optimaler pH-Bereich, stabiler pH-Wert und andere
Eigenschaften.
Die neue, reine Amylase aus Streptomyces hygroscopieus hat
einen optimalen pH-Bereich, eine pH-Stabilität, eine optimale
Temperatur und thermische Stabilität, ein Molekulargewicht und andere enzym-chemisehe und physikalische sowie chemische
Eigenschaften, wie sie in der nachstehenden Tabelle 6 zusammengestellt und graphisch in den !Figuren 1 bis 5 der beiliegenden
Zeichnungen dargestellt sind:
Wert
optimaler pH-Wert für die Aktivität
optimale !Temperatur für die Aktivität
pH-Stabilität
thermische Stabilität
4,5-5,0
50-6O0O
die enzymatisch^ Restaktivität ist nicht geringer als 90 %
der Anfangsaktivitä-tjnach Behandlung
des Enzyms bei 40°G für 60 Minuten bei einem pH-Wert von 4,5-9,8.
die enzymatisch^ Restaktivität beträgt mindestens 50 ?£ nach
Behandlung des Enzyms bei einem pH-Wert von 6,8 bei 3O°C-95 C
für 15 Minuten.
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Spezifische .Aktivität
Elementar-Analys e
Molekulargewicht Ultraviolett-Absorption
isoelektrischer Punkt
Elektrophorese
(in Oellulose-Acetatgel)
Yerflüssigungspotenz: 23100 μ/mg N
Yerzuckerungspotenz: 59600 μ/mg N
0 44,87 Ji, H 6,84 $, Ή 13,84 %
etwa 35,000 (bestimmt durch Gelfiltration)
®\ „„ = 13,1, bei 280 im
ι cm
(pH = 6,8)
etwa pH 4,3 (gemessen durch isoelektrische Punktelektrophorese)
Wanderung von 2,2 cm gegen den positiven Pol für 65 Minuten durch einen elektrischen Strom
von 0,8 mA/cm, gepuffert bei pH 8,7 durch Tris-Salzsäure-Pufferlösung
(μ = 0,05).
Mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen:
Figur 1 zeigt die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amyläse,
die aus Streptomyces hygroBcopicus gemäß der Erfindung erhalten wird, "bei verschiedenen pH-Werten.
Die Bestimmungsbedingungen: Die eiiymatische Wirksamkeit wurde
gemessen als Verzuckerungswirksamkeit unter solchen Bedingungen, daß die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 2-3
mit 0,1M Natriumacetat-Salzsäure-Pufferlösung, auf einen pH-Wert von 3,5-6,0 mit 0,1M Acetat-Pufferlösung und auf
einen pH-Wert von 6,5-8,0 mit 0,1M Phosphorsäure-Natriumphosphat-Pufferlösung
eingestellt wurde.
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Figur 2 zeigt eine Kurve der pH-Stabilität der enzymaticchen
Wirksamkeit der neuen Amylase, die nach der vorliegenden Erfindung
aus Streptomyces hygroscopicus erhalten wird.
Die J3ehandlungsbedingungen: Die enzymatische Wirksamkeit wird
als Verzuckerungswirksamkeit gemessen, die bestimmt wurde, nachdem das Enzym bei verschiedenen pH-Werten 60 Minuten bei
40 C gehalten und die Reaktionsmis
pH-Wert von 5,5 eingestellt wurde.
pH-Wert von 5,5 eingestellt wurde.
40 C gehalten und die Reaktionsmischung anschließend auf einen
Figur 3 zeigt eine Kurve der Teiriperaturabhängigkcit der enzymatisch
en Wirksamkeit der neuen Anyläse, die aus dtreptomyccs
hygroscopicus genäJ-i der Erfindung erhalten wird.
Die Bestimmungsbedingungen: Die enzymatische Wirksamkeit wurde als Verzuckerungswirksamkeit des Enzyms in Xür Amylase üblicher
Weise bestimmt, während das Enzym bei verschiedenen Temperaturen
gehalten wurde.
Figur 4 zeigt eine Kurve der Temperaturstabilität der enzymatischen
Wirksamkeit der neuen Ann/läse, die aus Streptomyces
Lygroscopicus (yeii.'-L· eier Lrfindunp; erhalten wird.
Die _3ehandlungsbeaingungen: ±>le enzymatische Wirksamkeit v/urdc
als Verzuckerungswirksamkeit gemessen, die unmittelbar,nachdem das ünzym bei verschiedenen Temperaturen 15 Minuxen bei einem
pH-(jert von c,S gehalten und danach auf Raumtemperatur gekühlt
v/urde, bestiimii": v.airde.
Figur 5 zei2;t eine Kurve des Ultra-Violott-Atsorpticn^ppektrunis
der neuen Amylase,. die aus Streptomyces hydros?copious gemäß
der Erfindung erhalten wird.
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4. pH-Bedingungen, [Temperatur und andere Faktoren für die Inaktivierung.
(a) Wenn die neue Amylase, die aus Streptomyces hygroscopicus gemäß der Erfindung erhalten wird, bei einem pH-Wert
von nicht unter 11 bei 500O 60 Minuten behandelt wird, kann
sie inaktiviert werden.
■(b) Wenn diese neue Amylase bei einem pH-Wert von 10 30 Minuten bei 900O behandelt wird, kann sie inaktiviert
werden.
5. Inhibitoren.
Die nachstehende» Tabelle faßt die Wirkungen verschiedener Inhibitoren, anorganischer Salze und anderer chemischer
Stoffe auf die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amylase zusammen, die gemäß der Erfindung aus Streptomyces hygroscopicus
erhalten wird.
Wirkungen von Inhibitoren, anorganischen Salzen und anderen chemischen Stoffen auf
die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amylase, die gemäß der Erfindung aus Streptomyces hygroscopicus erhalten wird:
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Reagenz
Restverflüssi- Restverzuckerungsgunsaktivität des aktivität des
Jünzyms Enzyms \
Konzen- j£ der Konzen- °/d der
tration Anfangs- tration Anfangs-
des akti- des akti-
Anorganische Metallsalze Bariumchiο ri d
Calciumchlorid Kobaltchlorid
Chromchlorid Eisen-II-Sulfat Quecksirber-I-Chlorid
Ciuecksirber-II-Chlorid
Kaliumbromid Lithiumchlorid Magne siumsulfat
Manganchlorid Natriumchlorid Nickelchlorid Zinn-II-Chlorid
Strontiumchlorid Zinksulfat Ammoniununo Iy "b dat
Organische Reagenzien IJatriumoxalat Monojodessigsäure
L-Ascorbinsäure Cystin-hydrochlorid Harnstoff
| 10""2M | 97,6 | 10"2M | 109,8 |
| Il | 97,6 | Il | 103,9 |
| Il | 95,5 | Il | 99,7 |
| Il | 95,5 | η | 94,8 |
| Il | 102,3 | Il | 100 |
| Il | weniger | η | 0 |
| als 6 | |||
| It | 91,3 | η | 87,1 |
| Il | 100 | η | 100 |
| It | 102,3 | η | 96,9 |
| Il | 100 | η | 95,1 |
| It | 93,4 | η | 88,6 |
| Il | 93,4 | η | 95,1 |
| Il | 91,3 | η | 94,3 |
| Il | X | η | 8,2 |
| Il | 95,5 | π | 105,2 |
| Il | 85,8 | η | 89,9 |
| Il | 105,9 | U | 93,4 |
| 10"2M | 97,6 | 10"2M | 96,9 |
| Il | 96,5 | η | 97,0 |
| Il | X | Il | 107,4 |
| 10-4M | 98,6 | 10"4M | 96,6 |
| 10"2M | 101,0 | 10-2Μ | 95,8 |
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Äthanol
!I
Anilin
Glutathion (reduziert) A:ny las e-Iimibi tor
•Kthylenediamiii-
o-I
n^ntj-ro^ in
J■ lorbensoat (PCM3)
Antibiotika Uo jiri-avcir.
K vA?u.iy c in? ul-Tat
Penicillin G-Kr.liumsalz
Chloramphenicol
Jiiio rt e trac;; ? 1 in-Iiγ
J. ro ch 1 ο ri ä
| 20 ;> | 65, | 7 | 20 °/o | 51, | : 9 | 8 |
| 10 ^ | 93, | 9 | io io | 86, | X | 3 |
| 10"2M | 98, | 6 | 10"2M | 95, | 9C, | 1 |
| 10"4M 1 | 01, | 0 | 10"4M | 95, | 95, | 1 |
| 0,001 Ja | 85, | 8 | 0,001 ρ | 91, | 92, | 4 |
| 0,1M behandelt bei pH 6,7 bei 300C GO Minuten |
94, | 9 | ο,ιΐ·: 108, "behandelt bei pH 6,7 bei 300C 60 Minuten |
5 | ||
| 10" "Μ behandelt ν;ie o":en |
94, | 9 | 10""M 112, behandelt wie oben |
0 | ||
| 2,Γ;::10"ΛΙ·: behandelt v/i e ο".: en |
100 | ,0 | 2,-xiu I | 3 | ||
| 10--,. | 8ό, | 1 | 10"^·! | |||
| 10"4M 1 | 01, | 0 | 10"^M | |||
| ti ι | 01, | 0 | 11 | |||
| Il -j | 01, | 0 | M | — |
aei· e::^,;:;:cxisc;:\;:: "..irksaiikeit.
Die ensy::iatische «irksanilceit der neuen Amylase, die aus
Streptom3rces hygroscopicus erhalte:: wird, ist in den vorstehenden
Tabellen 4, ί und 6 .azei^z. Das Verfahren ;:ur
l<estim::iun.: der enzjnoaatisehen ,.'irhsankeit und das Ve:."-i'-5.:iren
:ur Darstel~-"'ig der Wirkung der reuen Amylr.se v/eri-n nach-
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BAD 0RK3INAI
stehend beschrieben.
(A) Bestimmung der Wirksamkeit von verzuckern-der Stärke.
2 ml einer wässrigen Lösung von 2$iger löslicher Stärke,
2 ml Mclllvaine's Pufferlösung mit einem pH-Vert von 5,5
und 1 ml einer wässrigen Lösung des Enzyms v/erden zusammengemischt und die entstehende Mischung 3 Minuten auf 40°
erhitzt, um die hydrolytische Umsetzung der Stärke zu erreichen. Danach wird 1 ml der Reaktionsmischung entnommen
und zu dem kupferhaltigen Reagenz beim Titrationsverfahren von Sornogyi hinzugegeben, um die umsetzung zu stoppen. Der
Anteil des gebildeten reduzierenden Zuckers in 1 ml der ReaktionsmiEchung wird nach dem Titrationsverfahren von
Somogyi bestimmt. Der Anteil der gebildeten reduzierenden Zucker, die in 5 ml der Reaktionsmisehung vorliegen, wird
auf diese V/eise berechnet und als Maltoseäquivalent ausgedrückt, wobei unterstellt wird, daß die gesamten vorliegenden
reduzierenden Zucker im wesentlichen aus Ma.ltose bestehen.
(S) !Darstellung der Wirksamkeit von verzuckernder Stärke.
Die Kraft der neuen Amylase wird als verzuckernde Wirksamkeit von Stärke ausgedrückt, wie sie auf die vorstehend
beschriebene Weise bestimmt wurae, wobei vorausgesetzt wird, daß eine derartige Enzymmenge, die 1 mg Maltose auf 5 ml der
Reaktionsmischung freigibt, wenn sie 60 Minuten auf die vorstehend
beschriebene V/eise umgesetzt wird, einer Einheit der neuen Amylase äquivalent ist.
(C) Bestimmung der Wirksamkeit von verflüssigender Stärke.
5 ml einer wässrigen Lösung von 2?oißer löslicher Stärke
(die darüber hinaus 10 ml 1K Acetatpufferlösung mit einem
(die darüber hinaus 10 ml 1K Acetatpufferlösung mit einem
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pH-Wert von 5,5 auf 100 ml enthält), 0,5 ml 1M Acetatpufferlösung
mit einem pH-Wert von 5,5, 1,5 ml destilliertes V/asser und 0,5 ml einer wässrigen Lösung des Enzyms werden zusammengemischt
und die gebildete Mischung auf 3O0C erwärmt, um die
hydrolytische Umsetzung der Stärke zu erreichen. Nach einer vorbestimmten Reaktionszeit werden 0,2 ml der Reaktionsmischung
entnommen und zu 2 ml einer Jodlösung Caurch Auflösen
von 88 mg elementarem Jod und 44 g Kaliumiodid je 1 destilliertes
Wasser hergestellt wird) gegeben. Die Farbe der so behandelten Jodlösung wird mit einer Standardfarbe einer Lösung
verglichen (die durch Mischen von 1 Yolumenteil einer Iiösung
von 25 g FeCl,.6HpO in 50 ml 2#iger Salzsäure mit 9 Volumenteilen
einer Lösung von 25 g CoCl2.6HpO in 50 ml 2^iger Salzsäure
erhalten wurde). Ss wird dann die Reaktionszeit der Reaktionsmischung
in Minuten bestimmt, die erforderlich ist, um die Farbe der vorstehend beschriebenen behandelten Jodlösung
identisch mit der Farbe der beschriebenen Standardlösung zu machen. Die Lösung des geprüften Enzyms wird reihenmäßig mit
einem Faktor η verdünnt auf einen solchen Verdünnungsgrad, bei dem die Reaktionszeit der Reaktionsmischung, die erforderlich
ist, um die Farbe der behandelten Jodlösung gleich der Standardfarbe zu machen, weniger als 5 Minuten beträgt.
(D) Darstellung der Wirksamkeit der verflüssigenden Stärke.
Die Wirksamkeit der neuen Amylase kann auch als Wirksamkeit
der verflüssigenden Stärke, wie sie nach dem vorstehend beschriebenen
Verfahren bestimmt wurde und mit Hilfe des Wertes von Wohlgemuth ausgedrückt werden, der durch folgende Gleichung
berechnet wird:
W.V. = A χ η χ 400,
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in der T die vorstehend beschriebene Reaktionszeit (in
Minuten) der Reaktionsmischung bedeutet, die erforderlich ist, um die vorstehend beschriebene behandelte Jodlösung
in der Farbe der Standardfarbe anzupassen, η bedeutet den Verdünnungsfaktor,bei dem die Lösung des geprüftem Bnzyms
verdünnt worden ist. Die Wirksamkeit wird dann ausgedrückt, vorausgesetzt, daß 1 W.V. einer Einheit der neuem Amylase
äquivalent ist als Wirksamkeit von verflüssigender Stärke.
Die Bedingungen für die Züchtung oder Bebrtttung eines Stammes
von Streptomyces zum Zwecke der Verbesserung der handelsüblichen Herstellung der neuen Amylase wurden untersucht und
es wurde gefunden, daß die Herstellung der neuem Asnylase verbessert
werden kann, wenn die bekannten Bedingungen für die Züchtung von Streptomyces wie nachstehend beschrieben modifiziert
werden.
(a) Die Zusammensetzung des Kulturmediums, das zum Züchten
von Streptomyces hygroscopieus zur Herstellung der neuen Amylase gemäß der Erfindung verwendet wurde, wurde in verschiedener
Weise modifiziert. Zur Züchtung von Streptomyces hygroscopieus wurde zunächst ein Kulturmedium folgender
Zusammensetzung verwendet: 1 % entfettetes Sojabohnenmehl,
3 % lösliche Stärke und 0,2 56 KH2PO^, wobei das ö«wichtsverhältnis
von Kohlenstoffgehalt zu Stickstoffgehalt etwa 13,5 betrug. Es wurden dann Kulturmedien verschiedener
Zusammensetzungen verwendet, wie sie nachstehend, beschrieben werden, wobei das C/N-Verhältnis auf verschiedene Werte im
Bereich von 1 bis 100 eingestellt wurde. Die en^pnatische
Wirksamkeit der KuIturfiltrate, die aus diesen Kulturmedien
erhalten wurden, wurde bei den verschiedenen Zusammensetzungen bestimmt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß -als KuItur-
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filtrate einen Maximalen Wert fir die enzymatisch^ 7/irksamkeit
haben, wenn das C/lT-Verhältnis des verwendeten
Kulturmediums Tbci 20 liect und daß der Maximalwert der
enzymatischem .,«Irksaisikeit etwa das Zweifache des "Jertes
der enzymatisch?!! Jirl-csanlceit "beträgt, die erhalten wird,
wenn ein Kiiltariaediuia mit einem C/ΐϊ-Verhältnis von 13,5
verwendet wire, jer Einfluß des C/N-Verhältnisses auf das
KuItürmedium ßei der Mex'steilung der neuen Amylase durch
Züchtung von Streptonyees Iiygroscopicus läßt sich aus den
rIestergebnisse:i erkennen, die in der nachstehenden Tabelle
8 zusammengefaßt sind.
labelIe 8
C/IT- Anteil von .anteil
Verhält- entfei^exe-a löslicher
nis im So j ^iT-C «men— Stärke im
Kultui-- mehl in Kulturmedium
KulturrraedinE medium
Lohlenstoffäehalt
Xjo) im Kulturmedium
Stickstoff ehalt
Kulturmedium
Index der enzymetischen Aktivität
im KuIturfiltrat
| 1 | 1 M | C,01 (fr) | 0,079 | 0,079 | 4,2 (fo) |
| 5 | 1 | 1,1 | 0,47 | 0,079 | 30,4 |
| 10 | 1 | 2,0 | 0,77 | 0,078 | 52,8 |
| 20 | 1 | * sy | 4,14 | 0,208 | 100,0 |
| Z'O | 1 | t"»4 | 2,23 | 0,075 | 49,2 |
| 40 | C,23 | 2,0 | 0,72 | 0,018 | 12,7 |
| 60 | 1 | 13,1 | 4,20 | 0,070 | 5,3 |
| 100 | 1 | 21 ,S | 6,49 | 0,065 | 0 |
Die vorstehend erwäiinten i'estergebnisse von Tabelle 8 wurden
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in folgendem Prüfungsverfahren erhalten: Jedes der Kulturmedien der verschiedenen Zusammensetzungen,wie sie vorstehend
"beschrieben wurden, wurde mit 0,2 $>
KHpPO, versetzt und 30 ml
Portionen dieser Kulturmedien wurden in konische Flaschen von 100 ml eingegeben und auf einen pH-Wert von 7.0-7,2 eingestellt.
Der Inhalt der Flaschen wurde dann 15 Minuten auf 1210C
erhitzt, um sterile Kulturmedien zu erhalten. Gleichzeitig wurde Streptomyces hygroseopicus zu einem Impfmedium gegeben,
das 2 io Stärke, 1 & Pep ton, 0,5 fi Fleischextrakt und 0,05 $
Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und einen pH-Wert von 7,0
hatte. Das Medium wurde dann einer Schüttelkultur 24 Stunden
"bei 28° C unterworfen, um eine Samenkultur zu erhalten. .
Diese Samenkultur wurde dann in einer Konzentration von 3 % jedem der vorstehend genannten sterilen Kulturmedien eingeimpft.
Diese "beimpften Kulturmedien wurden anschließend 90 Stunden bei 280C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung
bebrütet. Nach dieser Bebrütung wurde die enzymatische Wirksamkeit der KuItürfiltrate bestimmt.
(b) Es wurde auch beobachtet, wie die Konzentrationen der Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen in dem Kulturmedium
mit einem C/N-Verhältnis von 20 die Herstellung der neuen
Amylase durch Züchtung von Streptomyces hygroseopicus beeinflussen.
Es wurde festgestellt, daß das KuIturfiltrat
eine maximale enzymatische Wirksamkeit hat, wenn der Kohlenstoffgehalt (C-G-ew.^) des Produktionsmediums im Bereich von
2-6 und der Stickstoffgehalt (N-G-ew.^) des Produktionsmediums
im Bereich von 0,1-0,3 liegt. Der Einfluß der Konzentration der Stickstoffquellen im Herstellungsmedium mit einem C/N-Verhältnis
von 20 auf die Bildung der neuen Amylase durch Züchtung von Streptomyces hygroseopicus kann aus den Versuchsergebnissen
ersehen, die in der nachstehenden Tabelle 9 zusammenrief aßt sind.
209820/ 1046
BAD ORiGiNAL
Stickstoffquellen
Anteil an zugefügtem entfetteten So 2 abohnenmehl
| 0,019 | 0,24 ft |
| 0,037 | 0,47 |
| 0,076 | 1,0 |
| 0,145 | 2,0 |
| 0,208 | 3,0 |
| 0,317 | 5,0 |
| 0,525 | 10,0 |
| Anteil | zugegβ |
| Grf bener | ίο six- |
| * eher Stärke | |
| (*) | |
| 0,356 | 1,0 |
| 0,738 | 2,0 |
| 1,520 | 4-,2 |
| 2,885 | 8,4 |
| 4,138 | 12,7 |
| 6,325 | 21,1 |
| 10,503 | 42,3 |
Index der enzymatis chen
Aktivität
19 25 60 86 100 57 37
(c) Der Einfluß der Konzentration der Stickstoffquellen in
Kulturmedien mit einem O/ii-Verhältnis von 20 auf die Bildung
der neuen Aoylase durch Züchtung von Streptomyces hygroscopicus
kann auch aus den Yersuchserge"bnissen erkannt werden,
die in der nachstehenden Tabelle 10 zusammengefaßt sind.
Anteil der zugesetzten löslichen Stärke
Anteil an zugesetztem entfetteten Sojabohnenmehl
0,356
0,019 0,24
Index der enzymatischen Aktivität
($) des Kulturfiltrats
19 ■
209820/.1046 ..iifS
| 0,758 | 2 | 0,057 | 0,47 |
| 1,520 | 4,2 | 0,076 | 1,0 |
| 4,158 | 8,4 | 0,208 | 2,0 |
| 6,525 | 12,7 | 0,517 | 5,0 |
| 10,505 | 42,5 | 0,525 | 10,0 |
54 -
Die Versuchsergebnisse der Tabelle 9 und 10 wurden erhalten,
indem die Versuche in gleicher Weise wie die Testverfahren durchgeführt wurden, nach denen die Versuchsergebnisse von
Tabelle 8 erhalten wurden, wobei die Anteile der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die zugegeben wurden, in den Tabellen
9 und 10 angegeben Bind.
Aus den Versuchen wurde ermittelt, daß die optimale Zusammensetzung
der Herstellungsmedien für die Züchtung von Streptomyces hygroscopicus zur Herstellung und Anhäufung der neuen
Amylase bei einem C/l-Verhältnis in der Nähe von 20 liegt,
wobei die Kohlenstoffquellen bei einer Konzentration von 2-berechnet als #C und die Stickstoffquellen bei einer Konzentration
von 0,1-0,5 $ berechnet als $ΪΓ liegen sollen.
(d) Es wurde weiter die Wirkung der Zugabe von Aminosäuren zum Herstellungsmedium für die Züchtung von Streptomyces
hygroscopicus beobachtet und gefunden, daß die Zugabe von Tryptophan und Methionin eine Verbesserung der Ausbeute an
der neuen Amylase bewirkt.
Der Einfluß der Zugabe von Tryptophan auf die Herstellung der Amylase durch Züchtung von Streptomyces hygroscopicus
wird in der nachstehenden Tabelle 11 gezeigt.
209820/1046
- 35.-Tabelle 11
Anteil an zugesetztem Index der enzymatisehen
Tryptophan Aktivität des
(fo Produktionsmedium) Kulturfiltrats
| 0 | 100 |
| 0,005 | 110 |
| 0,01 | 120 |
| 0,05 | 150 |
| 0,1 | 146 |
(e) Die Wirkung der Zugabe von Methionin auf die Bildung der Amylase durch Züchtung von Streptomyces hygroscopicus
ist in der nachstehenden Tabelle 12 gezeigt.
| Anteil an zugesetztem Methionin (fo Produktionsmedium) |
Index der enzymatisehen Aktivität des Kulturfiltrats (#) |
| 0 | 100 |
| 0,02 | 190 |
| 0,05 | 185 |
| 0,1 | 195 |
2Q9820/KK6
Die in den Tabellen 11 und 12 gezeigten Versuchsergebnisse wurden erhalten, indem man eine Samenkultur von Streptomyces
hygroscopicus, wie sie beim Testverfahren für Tabelle 8 beschrieben
wurde, in ein Auegangsherstellungsmedium einimpfte, das 1 $>
entfettetee Sojabohnenmehl, 3 # lösliche Stärke und
0,2 i> Kaliumdihydrogenphosphat bei einem pH-Wert von 7,0
enthielt, wobei verschiedene Anteile der Aminosäure zugegeben wurden, 90 Stunden bei 280O bebrütet und anschließend
die enzymatische Wirksamkeit des Kulturfiltrats gemessen
wurde.
(f) Außerdem wurde eine Reihe von Versuchen beim Bebrüten von Streptomyces hygroscopicus durchgeführt, um die Wirkung
der Bebrütungstemperatur auf die Herstellung der Amylase zu bestimmen. Die Versuche wurden bei verschiedenen Temperaturen
im Bereich von 28-400C durchgeführt und gefunden, daß im
Wachstum der Mikroorganismen keine bemerkenswerten Unterschiede zu beobachten sind, daß jedoch eine Bebrütungstemperatur
in der Nähe von 350C für die Herstellung des
Enzyms optimal ist. Die Wirkung der Bebriltungstemperatur
auf die Herstellung der Amylaee aus Streptomyces hygroscopicus
wird in der nachstehenden Tabelle 13 gezeigt.
Brut temperatur Myeelvo lumen Index der enzytsati-(0C)
(ml)* sehen Aktivität des Sultiirfiltratg (*)
28 4,7 60
35 4,4 100
40 4,2 O
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Bemerkung:
"Mycelvolumen" in Tabelle 13 wurde bestimmt durch Einbringen
von 10 ml der Kulturbrühe ;in ein Zentrifugenrohr, indem mit
3000 UpM. 10 Minuten zentrifugiert wurde. Das Volumen des ausgefällten Mycelkuchens wurde dann bestimmt.
Die Versuohsergebnisse von Tabelle 13 wurden erhalten, indem
3 $> einer Samenkultur von Streptomyces hygroscopicus, wie sie
bei dem Prüfverfahren von Tabelle 8 hergestellt wurde, in Teströhrchen eingebracht wurden, die jeweils ein Herstellungsmedium enthielten, das aus 4 $>
Maisstärke, 2 # entrahmte Milchpulver, 0,2 % KH2PO4, 0,2 # MgSO4.7H2O und 0,01 # MnSO4
bestand und auf einen pH-Wert von 7»0 eingestellt war. Es ■ wurde 90 Stunden bei verschiedenen Temperaturen in einer
Brutvorrichtung mit Temperaturgradientem bebrütet und die
enzymatisch^ Wirksamkeit des Kulturfiltrates gemessen.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsmerkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei einem Verfahren zur Herstellung
von Amylase durch Züchtung von Streptomyces ein Stamm Streptomyces hygrosoopicus bei einer Temperatur von etwa 350O unter
aerobischen Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet, das bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bei einer Kohlenstoffkonzentration
von 2-6 $> C und bei einer Stickstoffkonzentration
von 0,1-0,3 $> H enthält, wobei das C/N-Verhältnis
etwa 20:1 Gewiehtsteil beträgt. Dabei erhält man in dem Herstellungsmedium die Amylase, die solche enzymatischen
Wirksamkeiten und Eigenschaften hat, daß der optimale pH-Wert im Bereich von 415-5,0 liegt und die Grenzen der
Hydrolyse von Stärke durch diese Amylase 82 # von theoretischer Maltose beträgt. Das Verhältnis von Glukose zu aus
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Stärke durch die Wirkung dieser Amylase gebildeter Maltose "beträgt 0,055:1 Gewichtsteil und die Amylase wird aus dem
Herstellungsmedium in bekannter Weise gewonnen.
Von den vorstehend genannten besonderen sieben Arten von Streptomyees, die gemäß der Erfindung gezüchtet werden,
ergibt Streptomyces hygroscopious, die höchste Ausbeute an
Amylase.
Wie vorstehend festgestellt, sind die neuen Amylasen aus den besonderen Streptomyces-Stammen, die gemäß der Erfindung
erhalten werden, vorteilhaft und nützlich aufgrund der Kombination ihrer enzymatischen Wirksamkeiten und Eigenschaften,
weil ihr optimaler pH-Bereich im relativ stärker sauren Bereich von 4»5-5»O und die optimale Temperatur im relativ
hohen Bereich von 50-6O0C liegt und die Grenzen der Hydroly&e
von Stärke durch diese Enzyme nicht geringer als 75 "ß>
der theoretischen Maltose liegen und das Verhältnis von Glukose zu Maltose, die aus Stärke durch die Wirkung dieser Enzyme
gebildet wird, nicht unter 0,06:1 Gewichtsteil liegt. Diese vereinten vorteilhaften Eigenschaften der neuen Amylasen der
besonderen Streptomyces-Arten, die gemäß der Erfindung erhalten werden, sind besonders geeignet zur Herstellung eines
diätetischen und natürlichen Süßstoffs, der hauptsächlich aus Maltose besteht·
1819 wurde von De Sau Suure entdeckt, daß Maltose in den HydroIyseprodukten von Stärke vorliegt. 1847 erhielt dieses
Produkt von Dubruntant den Namen "Maltose". Maltose ist chemisch ein Disaccharid, in dem zwei Moleküle aus D-Glukose
in οι-Form miteinander verbunden sind. Reine Maltose liegt
in Form eines weiß gefärbten Pulvers vor, das in Wasser
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leicht löslich ist (wenn reine Maltose ein Molekül Wasser aufnimmt, kristallisiert das Hydrat), und Maltose hat einen
Süßegrad, der der Hälfte bis zu einem Drittel von Rohrzucker entspricht. Maltose hat jedoch eine sehr gut schmeckende
Süße und kann, als Zucker bezeichnet werden, der für die menschliche Gesundheit bei der Verhinderung von Gewichtszunahmen
und der Verhinderung von Zahnzerstörungen im Vergleich zu Rohrzucker günstiger ist. Maltose wird üblicherweise
durch Hydrolyse von Stärke unter der Wirkung von Malz hergestellt und wird daher häufig als Malzzucker bezeichnet.
Bei der Umsetzung von Malz mit Stärke ist jedoch die Ausbeute an Maltose relativ gering, so daß die Verwendung von Malz
zur handelsmäßigen Herstellung von Maltose nicht sehr günstig ist. Bei der Hydrolyse von Stärke unter Verwendung von
Malz werden üblicherweise Hydrolysate erhalten, die einen relativ geringen Maltosegehalt von etwa 40 $ auf !rockengewichtsbasis
bezogen enthalten. Unterwirft man dieses Hydrolysat einer besonderen Behandlung wie einer fraktionierung
oder einer Molekularaiebbehandlung, läßt sie sich mehr oder
weniger konzentrieren, jedoch nur bis zu einem Maltosegehalt von etwa 50 Ji.
Es besteht neuerdings eine große Nachfrage in der Konfektindustrie
und Hahrungsmittelindustrie nach Maltose, da diese
eine gut schmeckende Süße hat und als Süßstoff besonders günstig ist- Die nachfrage steigt auch nach Maltose als Ausgangsmaterial
fttr die Herstellung von Maltit. Maltit läßt
sich herstellen durch, katalytisch© Hydrierung von Maltose,
und die Machfrage nach Maltit steigt deshalb, weil Maltit selbst ein Zucker ist, der weder am menschlichen Stoffwechsel
teilnimmt noch zu eine« Gewichtsanstieg führt und darüber hinaus aufgrund seiner charakteristischen physikalischen,
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chemischen und "biologischen Eigenschaften auch andere
Anwendungen findet. Eine handelsmäßig wirksame Herstellung von Maltose dürfte daher große Zukunft haben.
Gemäß der Erfindung wurde auch ein diätetischer und natürlicher
Süßstoff hergestellt, der im wesentlichen aus kaitose
besteht und 70 oder mehr c/o Maltose auf i'rockengewichtsbasis
berechnet enthält, in dem Stärke als Äusgangsmaterial verwendet und mit Amylase umgesetzt wurde, die aus der Züchtung
der vorstehend genannten besonderen sieben Streptomyces-Stämme gemäß dem ersten Merkmal der Erfindung erhaltenwurde.
Gemäß einem zweiten Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Süßstoffen aus Stärke vorgesehen, die im
wesentlichen aus Maltose bestehen und als diätetische und natürliche Süßstoffe geeignet sind. Das Verfahren ist dadurch
gekennzeichnet, daß man Stärkematerial (einschließlich einer Amylose) in einer wässrigen Dispersion verflüssigt und verzuckert,
indem man in bekannter Weise eine Amylase damit umsetzt, die durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces
albus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus, Streptomyces
viridochromogenes, Streptomyces flavus und Streptomyces tosaensis erhalten wurde und solche enzymatischen
Wirksamkeiten und Eigenschaften hat, daß der pH-V/ert der optimalen Wirksamkeit im Bereich von 4,5-5,0, die Grenze
für die Hydrolyse von Stärke durch diese Amylase nicht unter 75 °/b von theoretischer Maltose und das Verhältnis von Glukose
zu Maltose bei ihrer Bildung aus Stärke durch Einwirkung dieser Amylase nicht mehr als 0,06:1 Gewichtsteil beträgt.
Die Umsetzung wird solange durchgeführt, bis eine wässrige Lösung der Verzuckerungsprodukte der Stärke vorliegt, die
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mindestens 70 °/o Maltose auf Trockengewichtsbasis berechnet
enthält.
Bei dem Verfahren gemäß dem zweiten Merkmal der Erfindung kann als Stärkeausgangsmaterial, das zur Umsetzung mit der
Amylase aus den Streptomyces-Stämmen verwendet wird, ein beliebiges Stärke- oder stärkehaltiges Material sein, das
aus 3üßen Kartoffeln, Kartoffeln, Maisstärke, Tapiokastärke,
Reis, Weizen oder Gerste usw. erhalten wird, und auch Amylosen. Die Amylase aus Streptomyces, die bei diesem Verfahren
der Erfindung verwendet wird, kann ein rohes oder gereinigtes Produkt der Amylase sein, die durch Züchtung eines Stammes
der vorstehend genannten sieben Streptomyces-Arten erhalten v/ird, wie es erfindungsgemäß bei dem ersten Verfahren beansprucht
wird, und durch Filtrieren der Kulturbrühe zur Entfernung des Mycels anfällt, wobei entweder ein wasserlösliches
anorganisches Salz wie Ammoniumsulfat zugegeben wird, um eine Rohamylase auszusalzen oder durch Zugabe eines wassermischbaren
organischen Lösungsmittels wie Äthanol, Methanol, Isopropanol oder Aceton zu dem KuIturfiltrat eine Rohamylase
ausgefällt wird. Die Rohamylase kann auch aus dem Kulturfiltrat auf einem Ionenaustauschharz vom adsorbierenden
Typ absorbiert und, wenn gewünscht, bei allen den vorstehend erwähnten Reinigungsverfahren anschließend in bekannter
Weise gereinigt, beispielsweise durch Chromatographie, und danach zu einem pulverförmigen Amylaseprodukt getrocknet
werden.
Für das zweite erfindungsgemäße Verfahren ist es vorteilhaft, die Amylase aus den Streptomyces-Stämmen in Form einer gereinigten
pulverförmigen Amylasemaase zu verwenden. Es ist jedoch auch möglich, das Kulturfiltrat selbst direkt oder
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eine wässrige Lösung einer Rohamylase oder einer gereinigten, jedoch nicht getrockneten Amyläse zu verwenden.
Das Verfahren gemäß dem zweiten Merkmal der Erfindung wird nun im einzelnen b e schrieb en: Die verwendete Ausgangs stärke
wird in V/asser auf eine geeignete Konzentration dispergiert, nachdem sie mit Wasser gewaschen wurde, um Fremdstoffe zu
entfernen. Eine Amylase aus Streptomyces kann dann unmittelbar mit der gewaschenen Stärke in der wässrigen Dispersion
umgesetzt werden, wobei es jedoch vorgezogen wird, die Stufe der Verflüssigung der Stärke durch Umsetzung einer bekannten
verflüssigenden Amylase, zum Beispiel bakterieller^ -Amylase, vor der Verzuckerungsbehandlung der Stärke mit der Streptomycesamylase
durchzuführen. Um die Verflüssigung der Stärke durchzuführen, wird die Stärke bei einem pH-tfert von 5-6 und
bei 70-900O mit einer bekannten Amylase (zum Beispiel einer ·
bakteriellen verflüssigenden Amylase, wie sie im Handel unter der Bezeichnung "Spitase SP-1" handelsmäßig vertrieben wird)
umgesetzt. Es wird vorgezogen, eine wässrige Stärkedispersion mit einer Stärkekonzentration von 30-40 Gewichts-$ zu verwenden.
Nach dieser Verflüssigung wird die verflüssigende Amylase durch Erwärmen inaktiviert. Anschließend wird die
verflüssigte Stärke in der wässrigen Dispersion oder Lösung einer Verzuckerungsstufe mit der Streptomycesamylase, die
zugegeben wird, unterworfen. Die Streptomycesamylase kann
in Form des KuIturfiltrats als aus dem Kulturfiltrat ausgefällte
Rohamylase oder als Lösung einer teilweise gereinigten Amylase, die bei der Rehigung des KuIturfiltrats
anfällt, oder als ausgefällte Amylase, die bei der Reinigung des KuIturfiltrats ausfällt, oder als gereinigte und
getrocknete pulverförmige Amylase verwendet und zugegeben
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v/erden. Es ist günstig, wenn die Streptomycesamylase zu
der verflüssigten Stärke in Anteilen von 100 Ms 1000 Versuckerungseinheiten vorzugsweise in einer Menge von
200-400 Verauckerungseinheiten je 1 g Stärke zugegeben
wird, wobei die Verzuckerungsstufe bei einem pH-Wert von
4-6 und bei 50-60 C durchgeführt werden sollte. Die Verzuckerung
sums et zung kann durchgeführt werden, bis eine v/ässrige Lösung des Verzuckerungsproduktes der Stärke mit
einera I-altosegehalt von 70 oder mehr G-ew.$ (auf Trockenbasis)
vorliegt, wobei dann die Verzuckerungsumsetzung abgebrochen v/erden kann, da der Endpunkt erreicht ist.
Anschließend \vird das Enzym durch Erhitzen der verzuckert3ii
Stürkelösung inaktiviert. Die inaktivierte Reaktionsini c chung, d. h. die verzuckerte Stärkelösung, die mindestens
70 liew.jj Hai tose enthält, kann dann als solche als
Süßstoff, wenn gewünscht, verwendet werden. Es kann jedoch anschließend ein Filterverfahren durchgeführt werden und/
oder ein Konzentrierungsverfahren, dem sich ein Entfärbungsverfahren und/oder ein Entsalzungsverfahren, wenn erforderlich,
anschließt. x
Das Verfahren der Entfärbung der Lösung der verzuckerten Stärk2,in der die Amylase durch Erhitzen inaktiviert ist,
kann einfach durch Verwendung von Aktivkohle erfolgen. 3ei der Entfärbung und auch bei der Entsalzung jedoch ist
es im allgemeinen möglich, irgendeines der bekannten Ionenavis tauscherharze zu verwenden, die üblicherweise zur Entfärbung
und Entsalzung verwendet werden. Die entfärbte und entsalzte Suckerlösung, die auf diese Weise erhalten wird,
kann anschließend durch Eindampfen eingeengt und, wenn erforderlich, getrocknet werden, um ein pulverförmiges
Produkt zu ergeben, das im wesentlichen aus Maltose besteht.
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Dieses Produkt kann als geschmackvoller natürlicher Süßstoff in der Konfektindustrie, Nahrungsmittelindustrie,
pharmazeutischen Industrie und für andere Anwendungszwecke
verwendet werden.
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Bin Beispiel für die Analyse einer Zusammensetzung eines Süß
stoffs, der unter Verwendung von Amylase aus Streptomyces hygroscopicus gemäß dem zweiten Merkmal der Erfindung hergestellt
worden ist,wird nachstehend gegeben:
| Maltose | 75 | .4 Gew. |
| Glukose | .1 Gewo | |
| Oligo-Zucker | ||
| (einschließlich von MaIz- | ||
| triose, | 10 | el Gew. |
| Maltotetraose usw.) | ||
| Dextrin | 11 | .4 Gewo |
Ds wurden weiterhin die Bedingungen untersucht, die für die
Verzuckerungsreaktion geeignet sind, wenn die Verzuckerungsstufe von Stärke unter Verwendung der Amylase aus Streptomyces
hygroscopicus gemäß dem zweiten Merkmal der Erfindung durchgeführt wird.
(1) Untersuchung über den Einfluß der Reaktionstemperatur auf die Verzuckerung.
Stärke aus süßen Kartoffeln wurde zunächst unter folgenden Verflüssigungsbedingungen verflüssigt:
Stärkekonzentration : 30 oß>
süße Kartoffelstärke Anteil an bakterieller : 0<>2 u/>
verflüssigender Amylase (im Handel als "Spitase SP-I") zugegeben in °/ö Stärke
pü : 6 ο
l'emperutur : 84-870C
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Die verflüssigte Stärke wurde dann bei einem An£angs-pH-Wert
von 6oO 48 Stunden bei verschiedenen '.Temperaturen und 55°C,
65°C und 7O0C in Gegenwart von 400 Einheiten der Amylase aus
Streptomyces hygroscopieus je 1 g Stärke verzuckert. Die Versuchsergebnisse
sind in der nachfolgenden !Tabelle aufgeführt«
!Tabelle 14
Veränderung der Stärkehydrolyse (nachstehend MH abgekürzt) in Abhängigkeit von der Zeit bei verschiedenen
Reaktionstemperaturen
Zeit
| Tempe | 16 Stdo | 22 Std. | 26 Std. | 40 Std. | 44 Std. |
| ratur | 75 | 86 | 87 | 90 | 90 |
| 550C | 80 | 85 | 87 | 88 | 85 |
| 650C | 52 | 53 | 50 | 46 | 45 |
| 700C | |||||
Bemerkungen: Die Verzuckerungsreaktion wurde bei 400C durchgeführt,
üs erfolgte jedoch keine Bestimmung des Grades der Stärkehydrolyse (MH), da unerwünschte Mikro-Organismen heftig
gebildet wurden.
Aus den vorstehend beschriebenen Versuchen kann man erkennen, dais eine Reaktionstemperatur von 55°C für das Verzuckerungsverfahren
geeignet ist. Der Grad der Stärkehydrolyse (MH)
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wird durcn folgende Gleichung angegeben: -
Reduzierende Gesamtwirkung der ^, berechnet als Maltose
ü-esamtzuckerinenge
V/obei in dieser ü-leichun^ "die Gesamtzuckermenge" der gesamten
reduzierenden Wirkung der vollständig hydrolysierten Stärke, berechnet
als ülukose, entspricht, v/obei die reduzierende Wirkung
nach dem i'itrationsverfahren von Somogyi bestimmt wurde0
( . )üntersucim%en über den Einfluß der Konzentration des Enzyms
bei aer Versuciierungsreaktiono
Stärke aus süßen Kartoffeln wurde zunächst unter folgenden Bedingungen
verflüssigt:
Svärkekonzentration : 3 >
Anteil der bakteriellen : 0«1 -Jo
verflüssigenden Amyläse
(ira r-iii-aei als "Spitase
Sx1-!") zugegeben in ^ Stärke
pri : 6 ο 0
vemperstur : 84-87°C
Die verflüssigte Stärke wurde anschließend bei einer iemperatur
von 550C und einem Anfangs-pH-Wert von 6.0 48 Stunden verzuckert,
indem die Amylase aus Streptomyces hygroscopicus in so verschiedenen
Anteilen wie 50 Einheiten, 100 Einheiten, 200 Einheiten, 400 Einheiten und 800 Einheiten je g der Stärke umgesetzt
wurde. In Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und MH
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bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle aufgeführt.
Tabelle aufgeführt.
gabeile
Wert MH in Zeitintervallen bei verschiedenen Mengen Amylase bei der Verzuckerung
| Zeit | 24 Stunden | 40 Stunden | • | |
| Anteil an ver | 44 | 67 | ||
| zuckernder Amylase | 63 | 77 | ||
| (Einheiten) | 17 Stunden | 72 | 73 | 48 Stunden |
| 50 u. | 40 | 81 | 82 | 64 |
| 100 Uo | 57 | 99 | 104 | 69 |
| .200 u. | 70 | 74 | ||
| 400 u. | 81 | 82 | ||
| 800 u. | 96 | 106 | ||
Aus den vorstehenden Ergebnissen kann man erkennen, daß der Anstieg
der MH bei einer Amylasekonzentration von 800 u./g. Stärke maximal ist» Aus wirtschaftlichen Gründen wird es jedoch vorgezogen,
eine Konzentration von 400 u«/g Stärke als praktische
Konzentration der verzuckernden Amylase aus Streptomyces
hygroscopicus zu verwenden
Konzentration der verzuckernden Amylase aus Streptomyces
hygroscopicus zu verwenden
(3) Untersuchungen über den Einfluß der Stärkekonzentration auf die Verzuckerungsreaktion.
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Es wurden Versuche unter Verwendung von Stärke aus süßen Kartoffeln als Ausgangsmaterial durchgeführt, wobei die Stärke
bei verschiedenen Konzentrationen von 30 Gew.^, 34 Gew.^,
40 Gew.io und 45 Gew.?£>
der wässrigen Dispersion , in die die Stärke dispergiert wurde, eingeführt wirde.
Die Stärke wurde zunächst bei einem pH-Wert von 6.0 und bei einer Temperatur von-84-87°C unter Verwendung einer bakteriellen
verflüssigenden Amylase (Spitase SP-I) in einer Menge von 0.1 Gew./o der Stärke (10 u./g Stärke) verflüssigt.
Die verflüssigte Stärke wurde anschließend bei 550O und einem
Anfangs-pH-V/ert von 6.0 48 Stunden unter Verwendung der Amylase
aus Strept<i)myces hygroscopicus in Anteilen von 400 u. je g
Stärke verzuckert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden labeile gezeigt.
V/ert MH in Zeitintervallen bei verschiedenen Konzentrationen Stärke bei der Verzuckerung
| 17 ί | Zeit | 24 | Stunden | 40 Stunden | 48 Stunden | |
| Stärkekonzen tration (OreWo>i) |
Stunden | 83 87 80 |
(66) (71) (51) |
88(69) 91 (71) 84 (63) |
88(69) 85(66) 84(67) |
|
| 30 ψ 34 7o 40 io |
76(66) 78 (61) 81 (61) |
|||||
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- 5ο -
Die in Klammern gegebenen Werte zeigen den bestimmten Gehalt an Maltose in Gewichtsprozent, bezogen auf Trockengewichts-
Aus den Ergebnissen von Tabelle 16 kann man erkennen, daß eine Stärkekonzentration von 34 i° günstige Ergebnisse gibt, und daß
eine Stärkekonzentration von 40 cfo zur Verringerung des Anstiegs
der MH und des Maltosegehalts führt.
(4) Untersuchungen über den Einfluß der Reaktionszeit auf die Verzuckerung.
Stärke wurde bei Temperaturen von 84-87°C und bei verschiedenen Stärkekonzehtrationen von 30 Gewofs, 34 Gew.% und 40 Gew.^ unter
Verwendung von 0.1 c/o einer bakteriellen verflüssigenden Amy]aBe
(Spitase SP-I) in üblicher Weise verflüssigt und anschließend bei einem Anfangs-pH-Vfert von 6.0 und bei 550C unter Verwendung
der Amylase von Streptomyces hygroscopicus in Anteilen von 400 u./g Stärke verzuckert. Die Beziehung zwischen der Verzuckerungszeit
(in Stunden) und MH ist grafisch in Pig. 6 der
beigefügten Zeichnung erfaßt.
Aus ?ig. 6 kann man erkennen, daß die MH nicht ansteigt oder
sogar nach 40 Stunden Umsetzung bei jeder der Stärkekonzentrationen etwas abfällt. Daher wird angenommen, daß eine Verzuckerungszeit
von 40 Stunden für die Verzuckerung von Stärke, die unter Verwendung der Amylase aus Streptomyces hygroscopicus
aufgearbeitet wird, geeignet ist.
Wie vorstehend gezeigt, kann ein Stärkematerial in eine wässrige
Lösung des Stärkehydrolysats umgewandelt werden, das sind
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die Verzuckerungsprodukte der Stärke, die 70 oder mehr Gewichtsprozent
Maltose auf Trockengewichtsbasis berechnet enthalten, indem man die verflüssigte Stärke in einer wässrigen Dispersion
mit einer Amy3ase behandelt, die durch Züchtung eines Stammes
der vorstehend gerannten besonderen Streptomyces-Arten gebildet wird. Diese Lösung des Stärkehydrolysate mit einem so hohen
Maltoseg; ehalt kann als Maltosematerial verwendet werden.
Wenn Maltose katalytisch mit Wasserstoff in Gegenwart eines Nickelkatalysators, insbesondere Raney-Nickelkatalysators,
hydriert wird, kann sie in Maltit umgewandelt werden, d. h. in 4-0-fo(. -D-GlucopyranosylJ-D-glucit. Dieser Maltit hat einen
Süßegrad, der dem von Rohrzucker entspricht, ist jedoch im Gegensatz zu Rohrzucker als diätetisches Mittel anzusehen. Das bedeutet,
daß man bei Verwendung von Maltit bei Menschen und Tieren nur eine geringe Assimilation im Körper feststellen kann.
Darüber hinaus hat Maltit verschiedene Vorteile, die darin bestehen, daß er durch Nikro-Organismen nur wenig fermentierbar
ist, jedoch eine hohe Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit besitzt. Dieser Zuckeralkohol-Maltit wird daher voraussichtlich
eine umfangreiche Anwendung in der Ernährung, in der Pharmazie und bei Kosmetika usw. finden» Zur Herstellung von
Maltit hat man bisher einfach Waren verwendet, bei den hochreine Haitose katalytisch mit Wasserstoff in bekannter Weise 2Häuziert
wurde. Die Verwendung von hochreiner Maltose als Ausgangsmaterial und der für die katalytische Hydrierung der Haitose
verwendete Mckelkatalysator sind jedoch beide kostspielig, so
da^ es bisher schwierig war, mit toerin_en Kosten Maltit,der
derartig vorteilhafte xii^enschaften hat, herzustellen =
Maltose wird bisher üblicherweise durch Hydrolyse eines Stärkematerials
mit Malz oder dessen Enzymen hergestellt. Es sei all-
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2153252
gemein darauf hingewiesen, daß ein solches Stärkehydrolysat,
das durch Verzuckerung von Stärke mit Malz erhalten wird, einen Maltosegehalt von 40 ?ό oder weniger hat ο Bs wurde folgender
Versuch durchgeführt: 1000 Teile süßer Kartoffelstärke und 2 Teile einer bekannten bakteriellen Amylase wurden zu 1200 Teilen
Wasser gegeben, die Mischung gut bewegt und langsam zu 400 Teilen heißem Wasser zugegeben, das unter Rühren auf
85-9O0C erwärmt worden war. Die Mischung wurde 30 Minuten bei
Temperaturen von 85-87°C gehalten, anschließend auf 55-6O0C
gekühlt, mit 5 Teilen pulverisiertem Malz versetzt und anschließend bei einem pH-Wert von 5 unter gleichen Temperaturen
2 Stunden gehalten, um die Verzuckerung der Stärke zu beenden. Bei diesem Versuch enthielt die Zuckerzusammensetzung des so
gebildeten Stärkehydrolysate 0.2 % Glukose, 26.1 °/a Maltose,
27 > 2 % Oligo-Zucker und 66 «5 i° Dextrin» Der Maltosegehalt war
sehr viel geringer. Daraus kann man entnehmen, daß alle Stärkehydrolysate, die bisher zu Vereuckerung von Stärke mit Malz
zur Verfügung standen nur einen sehr geringen Maltosegehalt hatten, so daß komplizierte Verfahren, die kostspielig waren,
erforderlich gewesen sind, um die erforderliche hochreine Maltose aus solchem rohen Stärkehydrolysat durch irgendwelche
Reinigungsverfahren zu erhalten.
Die Lösung des Stärkehydrolysate, die mindestens 70 Gew.'/o
Maltose auf Trockenbasis berechnet enthält, wie sie gemäß
dem zweiten Merkmal der Erfindung durch Umsetzung eines Stfirkematerials
mit einer Amylase aus dem besonderen Streptomyces stammen,nach dem ersten Merkmal der Erfindung erhalten wird,
hai üblicherweise eine typische Zusammensetzung und enthält 75»4 -,3 Maltose, 3,1 /= Glukose, 10,1 Γ/ί>
Oligo-Zucker und 11,4 "/<>■
Dextrin. Es wurde nun gefunden, daß die Lösung des Stärkehy-
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drolysats einer solchen typischen Zusammensetzung oder einer
ähnlichen Zusammensetzung in geeigneter Weise mit Wasserstoff in G-egenwart eines Nickelkatalysators hydriert werden kann, um
die Umwandlung von Maltose in Maltit ohne Schwierigkeiten zu erreichen, sogar wenn die Maltose vorher nicht in hochreinem
Zustand isoliert worden ist. Es wurde ferner gefunden, daß aus der derart hydrierten Stärkehydrolysat-Lösung leicht eine
Mischung von Zuckeralkoholen abgetrennt werden kann, die 70 oder mehr y° Maltit und 5 oder weniger σ/ο Sorbit auf Trockengewichtsbasis
berechnet enthält. Diese Mischung von Zuckeralkoholen ist als diätetischer Süßstoff insgesamt geeignet, weil
die anderen Bestandteile in dieser Mischung Sorbit, Maltotriit, Maltot^etait usw. sind, die selbst ebenfalls diätetische Süßstoffe
sind. Erfindungsgemäß wird daher eine handelsmäßige,
billige Herstellung einer Mischung von Zuckeralkoholen möglich, die im wesentlichen aus haitit besteht, das als diätetischer
Süßstoff geeignet ist. Bei diesem Verfahren geht man von Stärke aus, wandelt diese in ein maltosehaltiges Material um, indem
man Amylase aus den besonderen Streptomyces-Arten verwendet, und hydriert anschließend das maltosehaltige Material in Gegenwart
eines liickelkatalysators.
Gremäß dem dritten Merkmal der vorliegenden Erfindung ist das
Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Zuckeralkoholen, die im wesentlichen Maltit enthält, dadurch gekennzeichnet, daß
man ein Stärkematerial verzuckert, das vorher mindestens teil- weise mit einer bekannten verflüssigenden Amylase hydrolysiert
worden ist, oder mit Amylose, indem man die Stärke mit einer wässrigen Dispersion einer Amylase umsetzt, die durch Züchtung
eines Stammes von Streptomyces albua, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces hygroscopicus var.
anguatomyceticu3, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces
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flavus und Streptomyces tosaensis erhalten worden ist und deren enzymatisch^ Eigenschaften und Wirksamkeiten so sind, daß der
pH-Wert der optimalen Wirksamkeit im Bereich von 4,5 bis 5,5, die Grenzen für die Hydrolyse von Stärke durch diese Amylase
nicht unter 75 % des theoretischen Wertes von Maltose und das Gewichtsverhältnis von Glukose zu Maltose, die durch Einwirkung
dieser Amylase aus Stärke gebildet werden, nicht unter 0,06 : 1 betragen, wobei eine Stärkehydrolysat-Lösung erhalten
wird, die 70 oder mehr $ Maltose und 4 oder weniger # Glukose
auf Irockengewichtsbasis berechnet enthält, anschließend die
Stärkehydrolysat-Lösung mit Wasserstoff in Gegenwart eines Nickelkatalysators katalytisch hydriert wird und d?r Nickelkatalysator
aus der Stärkehydrolysat-Lösung,die hydriert worden
ist, abgetrennt wird, um den Nickelkatalysator zurückzugewinnen und eine wässrige Lösung einer Mischung von Zuckeralkoholen zu
erhalten, die mindestens 70 */o Maltit und bis zu 5 P Sorbit auf
Trockengewichtsbasis enthält, die,wenn gewünscht, zu einem
Sirup eingeengt oder getrocknet werden kann.
Gemäß dem dritten Merkmal der Erfindung kann die Verzuckerungsreaktion der Stärke, bei dem die vorstehend genannten Streptomyces-Amylasen
mit einem Stärkematerial umgesetzt v/erden, in gleicher Weise wie bei dem erfindungsgemäßen zweiten Merkmal,
durchgeführt werden. So kann als Ausgangsmaterial, mit dem die Streptomyces-Amylase umgesetzt wird, jede verfügbare Stärke
oder Stärkematerial verwendet werden, wie süße Kartoffeln, Kartoffeln, Malzstärke, Tapioka-Stärke, Reis und lösliche
Stärken daraus. Amylosen von verschiedenem Molekulargewicht können ebenfalls als Ausgangsstärkematerial,das verzuckert
werden soll, verwendet werden. Die Herstellung der Streptmmyces-Amylase,
die gemäß dem dritten Merkmal der Erfindung verwendet werden kann, erfolgt wie beim ersten Merkmal für die vorliegende
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!Erfindung beschrieben. Darüber hinaus kann die Verwendung der
Streptomyces-Amylase und deren Umsetzung mit einem Stärkematerial zur Verzuckerung der Stärke in gleicher Weise wie bei den zweiten
erfindungsgemäßen Merkmal durchgeführt werden.
Gemäß dem dritten Merkmal der Erfindung kann die Verzuckerungsstufe üurcn Umsetzung der Streptomyces-Amylase mit Stärke so
lange durchgeführt werden, bis eine wässrige Lösung der Verzuckerungsprodukte der Stärke vorliegt, d. h. bis als Reaktionsmischung eine Stärkehydrolysat-Iiösung erhalten wird, die 70 fo
oder mehr oder weniger Maltose (Trockenbasis) enthält. Die Verzuckerungsreaktion
wird dann abgebrochen, weil sie vollendet ist, und die Stärkehydrolysat-Lösung erhitzt, um das Enzym zu
inaktivieren. Die Stärkehydrolysat-Lösung kann dann filtriert
oder zentrifugiert weraen, um die unlöslichen, festen Bestandteile, wenn gewünscht, daraus zu entfernen. Die verzuck_erte
Stärkelösung kann auch, wenn gewünscht, eingeengt werden» Die Stärkehydrolysat-Lösung kann weiter einer Entfärbungs- und/oder
■critsalzungsbehandlung unterworfen werden, beispielsweise unter
Verwendung von Aktivkohle und/oder bekannten Entfärbungs- und/ oder i;ntsalsunusionen-Austauscherharzen. Zwar kann die Stärkehydrolysat-Lösung
aus der Verzuckerungsstufe gemäß der Erfindung direkt in die katalytische Hydrierung überführt werden.
Es wird jedoch vorgezogen, zunächst zu entsalzen, zu entfärben und die Stärkehydrolysat-Lösung auf einen Peststoffgehalt von
50-60 Sew«.,-· einzuengen, ehe die Lösung erfindungsgemäß hydriert
wird. V/enn gewünscht, kann die Stärkehydrolysat-Lösung einer
solchen Behandlung unterworfen v/erden, daß der Maltosegehalt ansteigt, ehe sie in die anschließende katalytische Hydrierungsstufe überführt wird. Zum Zwecke des Anhebens des Maltosegenalts
in der Stärkehydrolysat-Lösung kann man beispielsweise ein Verfahren anwenden, bei dem ein organisches Lösungsmittel,wie
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Methanol, Äthanol usw. zu der Stärkehydrolysat-Lösung gegeben wird, um die Oligo-Zucker und Dextrin daraus auszufällen, oder
ein Verfahren, bei dem die Lösung mit Aktivkohle behandelt wird, oder ultrafiltriert wird, oder in anderer bekannte? geeigneter
Weise behandelt wird. Wenn eine solche Stärkehydrolysat-Lösung, deren Maltosegehalt angehoben worden ist in die anschließende
katalytisch^ Hydrierungsstufe gemäß der Erfindung übergeführt wird, hat die Endmischung der Zuckeralkohole, die erhalten
wird, natürlich einai erhöhten Maltitgehaltο
Nachstehend wird nun die katalytisch^ Hydrierungsstufe gemäß
dem dritten&erkmal der Erfindung erläutert.
Zu der Stärkehydrolysat-LÖsung, die aus der vorstehend beschriebenen
Verzuckerungsstufe erhalten wird, und die gegebenenfalls durch geeignete Mittel entsalzt, entfärbt und/oaer eingeengt
worden ist, wird nun ein wickeln^, drier ungs-Kataly sat or
gegeben, geeigneterweise in Anteilen von 5 G-ew./ί des Zuckergehaltes
der Lösung. Als für diesen Hydrierungszweck verfügbaren jNickelkatalysator verwendet man vorzugsweise Kaney-ilickel T-1,
das nach einem Verfahren von Dominguez et al hergestellt worden ist, wie es im "Journal of Organic Chemistry" Band 26, Seite
1635 (1961) beschrieben worden ist ο
Außer äaney-I\fic„el können auch Mckel auf Jjia.tomaen-jc.rde,
liickelf ormiat und andere Produkte als katalytisch^ Hydrierungskatalysatoren bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung
gelangen. Bei Verwendung von Raney-riicK.el ϊ-1 ist es
günstig, wenn die Stärkehydrolysat-Lösung zunächst auf einen Anfangs-pH-Wert von 9»0 eingestellt wird und die katalytische
Hydrierungsreaktion bejyeiner Keaictionstemperatur von 100-15O0C
2 bis 4 Stunden unter einem Wasserstoffdruck von 100-150 kg/cm2
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(Gauge) in bekannter Weise durchgeführt wirdo Geeignete Hydrierungsbedingungen
für die anderen Arten von ITickelkatalysatoren
können durch einfache Vorversuche ermittelt werden.
Nach beendeter Hydrierung wird die hydrierte Stärkehydrolysatlösung
filtriert oder zentrifugiert, um den Mckelkatalysator
daraus abzutrennen und wieder zu gewinnen«, Der gewonnene Katalysator
kann zu einem weiteren Ansatz der Stärkehydrolysat-Iiösung
gegeben werden, die beim nächst/Durchgang der katalytischen Hydrierung reduziert werden soll. Auf diese Weise kann
der ITickelkatalysator gewonnen und wiederholt 5 bis 6 Mal für aufeinanderfolgende Durchsätze bei der Hydrierung verwendet
werden«. Der zurückbleibende Anteil reduzierender Zucker, wie sie später definiert werden, der am Ende der Hydrierungsstufe
in der hydrierten Stärkehydrolysat-Iösung bestimmt wird, liegt üblicherweise bei 0,2 ^ beim ersten Durchgang der Hydrierungsstufe, die mit frischem Nickelkatalysator durchgeführt wird,
und steigt dann allmählich auf 1,0 beim fünten bis sechsten Durchgang, der mit wiedergewonnenem und wiederverwendetem
ilickelkatalysator arbeitet.
Die vollständig hydrierte Stärkehydrolysat-Iösung, die auf diese Weise erhalten und vom Kickelkatalysator befreit ist, kann dann
durch bekannte entsalzende Ionenaustauscherharze entsalzen und durch Abdampfen von V/asser eingeengt werden, um einen wässriHgen
Sirup zu erhalten, der die Mischung der Zuckeralkohole mit einem Gehalt von 70 oder mehr -p Maltit und 5 f° oder weniger Sorbit
auf Trockengewichisbais berechnet enthalte Wenn gewünscht, kann
diese Konzentrierung bis zu einem solchen Grad durchgeführt werden, daü eine Trockenmischung der Zuckeralkohole erhalten
wird.
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Um die Gesamtmenge Nickelkatalysator, die bei der katalytischen
Hydrierungsstufe erforderlich ist während aufeinanderfolgenden Durchgänge gemäß dem dritten Merkmal der Erfindung zu verringern,
ist es wünschenswert, daß dsr einmal verwendete Katalysator aus der Reaktionsmischung nach einem Durchgang wiedergewonnen und
anschließend im nächsten Durchgang wieder verwendet wird» Bei der Wiederverwendung des zurückgewonnenen Katalysators jedoch,
+, wenn der Anteil der Katalysatorbelastung in der Stärkehydrolysat-Lösung
zu gering ist, um die gewünschte Hydrierung der Maltose und Glukose zu bewirken, können unerwünschte
Hebenreaktionen aufgrund der Tatsache auftreten, daß die angewendeten Reaktionsbedingungen dann relativ hohe Temperatur
und Drucke sein müssen, durch die die Qualität des Endproduktes des erfindungsgemäßen Verfahrens zerstört wird. Wenn dagegen
die Katalysatorbelastung zu groß ist, ist der Verlust an Katalysator bei der Wiedergewinnung zu groß und hat wirtschaftliche
Nachteile«. Während der Wiederverwendung des zurückgewonnenen Katalysators ist es daher wünschenswert, daß die Anteile der
Katalysatorbelastung der Stärkehydrolysatesung in einem Durchgang
eine notwendige Minimalgröße hat« Wenn der Katalysator zurückgewonnen und wiederholt wiederverwendet v/ird, fallen die
Wirksamkeit und der Anteil an wiedergewonnenem Katalysator allmählich mit der Zeit der Wiederverwendung ab.Wem der zurückgewonnene
Katalysator einige Male in einigen aufeinanderfolgenden Durchgängen wiederverwendet worden ist, ist der zurückgewonnene
Katalysator erschöpft und hat midestens eine verringerte katalytische Wirksamkeit, die nicht ausreicht, um die gewünschten
Reaktionen mit einer befriedigenden Geschwindigkeit herbeizuführen, wodurch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten, die au
einer Zerstörung der Qualität des Endproduktes führen« Wenn der zurückgewonnene Katalysator erschöpft ist und eine solche
verringerte Aktivität aufweist, muß natürlich die Wiederver-
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wendung solchen Katalysators ausgeschlossen werden. Dieser ersciiöpfte,
zurückgewonnene Katalysator hat jedoch noch eine restliche katalytisch^ Wirksamkeit und es ist daher unwirtschaftlich,
einen solchen erschöpften zurückgewonnenen Katalysator unmittelbar als Abfall wegzuwerfen. Es wurde nun gemäß
der Erfindung überraschenderweise festgestellt, daß die Hydrierungsstufe
des erfindungsgemäßen Verfahrens normal und erfolgreich über viele aufeinanderfolgende Durchgänge mit einer
befriedigenden Geschwingikeit durchgeführt werden kann, ohne daß die unerwünschten liebenreaktionen auftreten, wenn man einen geringen
Anteil frischen Hickelkatalysators zu dem erschöpften zurückgewonnenen Katalysator gibt und den auf diese Weise
reaktivierten wiedergewonnenen Katalysator in anschließenden Durchgängen der Hydrierungsphase wieder verwendete Das bedeutet
mit anderen Worten, da,: man durch Zugabe eines geringen Anteils
an xrisc-iein i^iCicelkatalysators zu dem zurückgewonnenen Katalysator,
der erscnäpft ist aufgrund der Wiederverwendung in
mehreren aufeinanderfolgenden Durchgängen der Kydrierungsstufe, eine befriedigende Durchführung dieser Hydrierungsstufe auf
normale V/eise in weitmehr aufeinanderfolgenden Durchgärjpn erreichen
kann, wobei eine minimale Menge des Kickelkatalysators verwendet wird, der wiederholt zurückgewonnen, wiederverwendet
und durch Zufaabe eines geringen Anteils an Ijicktlicatalysator reaktiviert wird.
In wirtschaftlicher hinsieht ist es zweckmäßig, wenn der Anteil
an frischem ergänztem Lickelkatalysator so klein wie möglich
gehalten wird und nur die erforderliche Menge beträgt,*um eine
befriedigende wiederholte Verwendung des zurückgewonnenen Katalysators bei kontinuierlicher Gewinnung eines Endproduktes guter
Qualität herzustellen, ist es notwendig, in etwa die Zeit für
und sodann,
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- 6ο -
die Ergänzung des frischen Katalysators zu bestimmen. Es wurde festgestellt, daß bei der katalytischen Hydrierung die Stärkehydrolysat-Lösung
unter Verwendung des vorstehend erwähnten Raney-Nickels T-1 die minimale ero^frderliche Menge an Nickelkatalysator,
die dem Verfahren zugeführt werden muß sowie die erforderliche Menge an frischem HicKelkatalysator zur Ergänzung
und die Zeit für die Zugabe der ergänzenden Menge an frischem Katalysator dadurch bestimmt werden kann, daß man die Restmenge
an reduzierenden Zuckern, wie sie nachstehend für die Stärkehydrolysat-Lösung
definiert wird, die vollständig hydriert worden ist, prüft. Die restliche an reduzierenden Zuckern, wie'
sie vorstehend erwähnt wurden, wird durch folgende Gleichung berechnet:
"Kestmenge reduzierender Zucker" = (Anteil reduzierender Zucker in der Stärke)
(Hydrolysatlösung nach der katalytischen Hydrierung) χ 100
Anteil reduzierender Zucker in der Stärke)
(Hydrolysatlösung vor der katalytischen Hydrierung)
wobei "der Anteil an reduzierendem Zucker" die Gesamtmenge an reduzierenden Zuckern bedeutet, berechnet als Maltose, wie sie
nach dem Titrationsverfahren von Somogyi gemessen wird.
Der Grad der katalytischen Hydrierung kann auch als "Umwandlungsgrad
(fo)" bestimmt werden, der wie folgt definiert wird:
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"Umwandlungsgrad (#)" = 100 - (# "Restmenge reduzierender Zucker"
wie vorstehend definiert).
Die ¥erte der Untersuchung sind grafisch in Eig. 7 gezeigt,
die die Beziehung des Anteils des zugegebenen Katalysators (Gew.fo, bezogen auf den Anteil an reduzierenden Zuckers, der
in der Stärkehydrolysat-Iiösung vorliegt) zu dem Umwandlungsgrad (?έ) zeigt, bei dem die Hydrierung im wesentlichen bis zu
einem Maximum in drei Stunden bei einer !Temperatur von 1300C
bei der katalytischen Hydrierung der Stärkehydrolysat-Lösung
gemäß dem dritten Merkmal der vorliegenden Erfindung durchgeführt ist. Aus der Kurve von Fig. 7 kann man erkennen, daß das
Verhältnis der Katalysatorbelastung mindestens 4 Gew./o des
Anteils der reduzierenden Zucker in der Stärkehydrolysat-Iiösung entsprechen muß, um die Hydrierung bis zu einem "Umwandlungsgrad"
von 99 i° durchzuführen (d'. h., daß dann die
"restliche Menge an reduzierenden Zuckern" 1 $ beträgt), und daß ein Belastungsanteil an Katalysator minimal erforderlich ist,
um einen Umwandlungsgrad von etwa 100 fö zu ergeben (d. h., daß
dann die "restliche Men^e an reduzierenden Zuckern" gleich 0,2 $
ist). Es kann dann keine Verbesserung im Grad der Umwandlung mehr erreicht werden, sogar, wenn die Belastungsmenge an Katalysator
über 5 ;'° beträgt. Wenn daher die katalytische Hydrierung
der Stärkehydrolysat-Lösung mit einem Belastungsanteil an Katalysator von über 5 Gew./o der Menge der reduzierenden Zucker
durchgeführt wird, kann im wesentlichen keine Verbesserung gegenüber einer 5 ?&igen Belastung mit Katalysator erreicht
werden. Daraus ergibt sich, daß die erforderliche Minimalbelastung an Katalysator 5 Gew.^ der Menge der reduzierenden
Zucker entsprechen soll, die in der zu hydrierenden Stärkehydrolysat-Lösung vorliegen.
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Bs wurden nochveitere Reihen von Versuchen durchgeführte \ieim.
der Katalysator mit dem erforderlichen minimalen Belastungsanteil von 5 f° in den ersten Durchgang der kataly ti sehen Hydrierung
der Stärkehydrolysat-Lösung eingegeben wird, anschließend zurückgewonnen und in den anschließenden aufeinanderfolgenden
Durchgängen der Hydrierungsphase unter Zurückge— winnung des Katalysators so weit wie möglich bei jedem Durchsatz
wieder verwendet wird, wurde gefunden, daß die Wiederverwendung des zurückgewonnenen Katalysators beispielsweise für
die 5 bis 6 nächstfolgenden Durchgänge der Hydrierungsphase wiederholt werden kann, ohne daß ein merklicher Abfall des
ümwandlungsgrades der Stärkehydrolysat-Lösung während der
Hydrierung erfolgt,und ohne daß ein JLnteil an frischem Katalysator
zugegeben wird, obwohl etwas Katalysator während der Wiedergewinnung in jedem Durchgang verloren_gehtο
Zum Beispiel*die restliche Menge der reduzierenden Zucker in der Stäriehydrolysat-Iiösung nach beendeter katalytischer Hydrierung
etwa 1 fo oder weniger. Wenn dann frischer Katalysator
in einenjgeringen Anteil von 1 bis 3 Gew.f&, bezogen auf den
Anteil an reduzierendem Zucker, in der zu hydrierenden Stärkehydrolysat-Lösung
zugegeben wird, wird der erschöpfte zurückgewonnene Katalysator durch die Zugabe de» Ergänzungsanteils
reaktiviert und dieser frische Katalysator kann dann wieder in weiteusi Durchgängen der katalytischen Hydrierungsphase wiederverwendet
werden, ohne daß sich ein Abfall im Umwandlungsgrad unter 99 >ö in den weiteren Durchgängen zeigt. Wenn beispielsweise
die Ergänzung an frischem Katalysator in einem Anteil von 1 (iew.yb durchgeführt wird, steigt die Zeit für die mögliche
Wiederverwendung des zurückgewonnenen Katalysators, der durch
die Zugabe an frischem Katalysator reaktiviert worden ist, mit dem Anteil an frischem Katalysator, der auf diese Weise er-
*erreicht im 6. Durchgang
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gänzt wird» üin solcher erschöpfter zurückgewonnener Katalysator,
zu dem der frische Katalysator gegeben worden ist, beispielsweise in einem Anteil von 1 Gewo$o,kann für zwei weitere Durchgänge
wieder verwendet werden, während ein solcher erschöpfter zurückgewonnener Katalysator, zu dem frischer Katalysator gegeben
worden ist, beispielsweise in einem Anteil von 3 Gew.Va für
vier bis fünf weitere Durchgänge wiederverwendet werden kann. Auf diese weise wiyd es möglich, zurückgewonnenen Katalysator
lange nacheinander wieder zu verwenden, wenn man den frischen Katalysator mit Anteilen von 1 '/& zu dem erschöpften zurückgewonnenen
Katalysator gibt, um den letzteren zu reaktivieren, und dann zweimal den so reaktivierten zurückgewonnenen Katalysator
wiederverwendet, dann wieder frischen Katalysator in einem weiteren Anteil von 1 >■->
zu dem zurückgewonnenen Katalysator gibt, der bereits einmal reaktiviert wurde, jedoch durch die
zweimalige Wiederverwendung erschöpft ist, so daß der Grad der umwandlung beider nachfolgenden Wiederverwendung unter 99 7=
abfallen würde, daß dann der wieder reaktivierte zurückgewonnene Katalysator zweimal wiederverwenaet und dann wieder 1 ^
Anteil an frischem Katalysator zugegeben und wieder der zurückgewonnene
Katalysator, zu dem frischer Katalysator gegeben wurde, zweimal verwendet wird usw.
Ss wurde darüeer hinaus auch noch überraschenderweise gefunden,
daß die katalytische Hydrierung uer Stärkehydrolysat-Lösung
bis su einem solchen Grad fortgeführt werden muß, daß der Umwandlungsgrad
bei 99 ρ oder mehr bei beendeter Hydrierungsphase
liegen muß, damit ein Endprodukt mit einer guten Qualität erhalten
wird. Es ist daher notwenig, frischen Katalysator zu dem erschöpften zurückgewonnenen Katalysator zu geben, wenn
der Umwandlungsgrad unter 99 % oder etwa dabei liegt«
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Aus den vorstehenden Untersucliungen kann man schließen, daß
es für eine wiederholte Zurückgewinnung und Wiederverwendung
des Uxckelkatalysators in wirksamer und wirtschaftlicher Weise
vorteilhaft ist, den frischen Hickelkatalysator zu Beginn in
dem ersten Durchgang der katalytischen Hydrierung del? Stärkehydrolysat-Lösung
in einer Menge von 5 Grew.?£ auf der Basis
des Anteils an reduzierenden Zuckern dieser Lösung einzugeben» dann den Katalysator wiederholt zurückzugewinnen und wiederzuverwenden
(in aufeinanderfolgenden fünf bis sechs Durchgängen der katalytischen Hydrierungsphase), um aufeinanderfolgende
Ansätze der Stärkehydrolysat-Lösung katalytisch zu hydrieren,
wobei frischer Katalysator in einer Menge von 1 bis 3 &ew.?»
(auf der Basis des Anteils an reduzierenden Zuckern in der Stärkehydrolysat-Lösung) zu dem zurückgewonnenen Katalysator
gegeben wird, wenn dieser zurückgewonnene Katalysator in einem solchen Ausmaß erschöpft ist, daß der damit erreichte Umwandlungsgrad
auf einen Prozentsatz von 99 ¥> oder etwa dabei abgefallen
ist, d. h· in einem solchen Grad erschöpft ist, daß die restliche Menge der reduzierenden Zucker etwa 1 $ in der Stärkehydrolysat-Lösung
entspricht, wenn sie bei vollendeter Hydriennga phase gemessen wird. Der zurückgewonnene Katalysator, zu dem
frischer Katalysator gegeben worden ist, kann dann wieder verwendet werden und diese Zurückgewinnung, Ergänzung und WieLerverwendung
des Katalysators kann- wiederholt werden.
Das vorstehend beschriebene Verfahren wird durch die nachfolgende Beschreibung erläutert. Es wurde versucht festzustellen,
welche Beziehung zwischen verschiedenen Mengen des frischen zugegeben Katalysators (in Gew./& auf der Basis der Menge an
reduzierenden Zuckern in der Stärkehydrolysat-Lösung, gemessen nach dem Titrationsverfahren von Somogyi) und dem erschöpften
zurückgewonnen Katalysator besteht. Es wurde weiter untersucht,
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wie groß die Anzahl der weiteren Durchgänge bei der katalytisches
Hydrierung der Stärkehydrolysat-Iiösung ist, die möglich
sind, um ein "befriedigendes Ergebnis unter "Verwendung des zurückgewonnenen
Katalysators,-der reaktiviert wurde durch frischen Katalysator. Weiter wurde die durchschnittliche Katalysatorbelastung
für jeden Durchgang des Verfahrens bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
zusammengefaßt·
Ergänzter Anteil Anzahl weiterer mittlere Katalysatoran frischem Kataly- möglicher Durch- belastung für jeden
sat or (Gew. ^) Sätze Durchgang (Gew.#)
0,5 *
1,0 $
2,0 Io
3,0 *
4,0 £
5,0 $
1,0 $
2,0 Io
3,0 *
4,0 £
5,0 $
0 2 3 4 5 6
0,91
0,75
0,78
0,80
0,82
0,83
Mit Bezug auf Säbelle 17 wurde die mittlere Katalysatorbelastung für jeden Durchgang nach folgender Gleichung berechnet:
(das ist die Anfangsbe-) (lastung des Katalysators) (für den ersten Durchgang)
(ergänzter Anteil frischer) (Katalysator in fi)
(das ist die Anzahl der) (Durchgänge ohne Ergänzung) + (durch frischen Katalysator)
(Anzahl weiterer möglicher) (Durchgänge)
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ORfGiNAL. INSPECTED
Aus den Ergebnissen, von Tabelle 17 kann man erkennen, daß bei
einem Ergänzungsanteil an frischem Katalysator im Bereich von 1,0 bis 3,0 fo die mittlere Katalysator belastung für jeden Durchgang
auf einem Minimum gehalten werden kann, im Vergleich zu anderen Fällen, wo der frische Katalysator in kleineren und
höheren Anteilen τοη 0,5 und 4 % zugegeben worden war.
Bei der Durchführung der katalytischen Hydrierung der Stärkehydrolysat-Iiösung
gemäß dem dritten Merkmal der Erfindung, ist es daher wirtschaftlich äußerst vorteilhaft, wenn man den
frischen NickelkataVsator zu Beginn in einem Anteil von 5 Gew»^
auf der Basis des Anteils an reduzierenden Zuckern in der Stärkehydrolysat-Iösung in den ersten Durchgang der katalytischen
Hydrierungsphase dieses Verfahrens gibt, um die Hydrierung des ersten Ansatzes der Stärkehydrolysat-Lösung für
den ersten Durchgang zu bewirken, dabei den zurückgewonnenen und wiedarverwendeten üickelkatalysator in dem zweiten und anschließenden
mehreren Durchgängen der katalytis*hen Hydrierung wiederverwendet und frischen Katalysator in Anteilen von 1 bis
Gew.% (auf der Basis des Anteils an reduzierenden Zuckern in der Stärkehydrolysat-Iösung) zu dem zurückgewonnenen Katalysator
gibt, wenn dieser zurückgewonnene Katalysator in einem solchen
Ausmaß erschöpft ist, daß dienstliche Menge an reduzierenden
Zuckern etwa 1 °ß> in der Stärkehydrolysat-Lösung bei Beendigung
der Hydrierungsphase in einem Durchgang beträgt und dann den nächsten Hydrierungsansatz unter Verwehdung des wiederaktivierten
zurückgewonnenen Katalysators durchführt, zu dem der frische Katalysator zugegeben worden ist·
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des dritten Merkmalsder
vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
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einer Mischung von Zuck er alkoholen, die im wesentlichen. Maltit
enthält, dadurehgekennzeichnet, daß man ein Stärkematerial
verzuckert, wobei man ein Stärkematerial verwendet, das vorher durch bekannte verflüssigende Amylase verflüssigt worden ist,
oder eine Amylose verwendet, indem man mit dieser in wässriger Dispersion einer Amylase umsetzt, die durch Züchtung eines
Stammes Streptomyces albus, Streptomyces aureofaciens Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces hygroscopicus var»
angustomyceticus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces flavus oder Streptomyces tosaensis hergestellt worden ist und
deren enzymatische Wirksamkeit und Eigenschaften so sind, daß der pH-Wert der optimalen Wirksamkeit im Bereich von 4*5 bis
5,0 liegt, wobei die Grenze der Hydrolyse von Stärke durch diese Amylase mehr als 75 £ des theoretischen Wertes für
Maltose entspricht und das Gewientsverhältnis von Glukose zu
Maltose, die aus dieser Stärke durch die Wirkung dieser Amylase gebildet werden, unter 0,06 : 1 liegt. Die Umsetzung wird so
lange durchgeführt, bis eine Stärkehydrolysat-Löeung vorliegt,
die mindestens 70 cp Haitose und bis zu 4 i° Glukose auf Trockengewichtsbasis
enthält, wobei dann ein Bückelkatalgtsator in
einem Anteil von etwa 5 Gew«#, bezogen auf den Anteil an reduzierenden
Zuckern, in der im ersten Durchgang der katalytischen
Hydrierung zu hydrierenden Stärkehydrolysat-Lösung zu
Beginn zugibt, diesen ersten Ansatz der Stärkehydrolysat-Lösung im ersten Durchgang in Gegenwart des eingeführten Kickelkatalysators
katalytisch hydriert, den Nickelkatalysator aus der
hydrierten Stärkehydrolysat-Lösung abtrennt, um den Kickelkatalysator zurückzugewinnen, und eine wässrige Lösung einer
Mischung von Zuderaliioholen zu erhalten, die mindestens 70 $
Maltit und bis zu 5 ?° Sorbit auf Trockengewichtsbasis berechnet
enthält, den zurückgewonnenen Katalysator zur Wiederverwendung
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die In einem zweiten Durchhang der Hydrierung hydriert werden
soll, zuzugeben, nach dem zweiten Durchgang der Hydrierung in
gleicher V/eise wie beim ersten Durchgang ansehlieüende mehrere
weitere Durchgänge der katalytischer. Hydrierung mit weiteren
Ansätzen der Stärkehydrolysat-Lö.'mng durchführtt während die
Zurückgewinntmg und Wiederverwendung des Hlckelkatalysators
in jedem zweiten Durchgang und diesen weiteren Durchgängen durchgeführt wird. Wenn ein aus diesen letzten Durchgängen
dieser weiteren Durchgänge zurückgewonnener Katalysator in
einem solchen Ausmaß erschöpft 1st, dav die restliche Menge eier reduzierenden Zucker In der hydrierten Stärkehydrolysatlösung
etwa 1 $> entspricht, wenn sie bei beendeter Hydrierung
dieses letzten Durchgangs bestimmt wird, wird dieser erschöpfte zurückgewonnene Katalysator durch einen Anteil von frischem
Katalysator in einer Menge von 1 bis 5 G-ew.$, bezogen auf die
Men^e an reduzierenden Zuckern, in der zu hydrierenden Stärkehydrolysat-Lösung
ergänzt. Der zurückgewonnene Katalysator, der erschöpft war und durch diese Ergänzung mit frischem
Katalysator wieder aktiviert woraer ist, wird in einem nächsten Ansatz aer Stärkehvdrolysat-Lösung, die in einem folgenden
Durchgang zu dem vorstehend erwähnten letzten Durchgang hydriert werden soll, eingeführt, dieser nächste Durchgang der
katalytischen Hydrierung durchgeführt und anschließend weitere Durchgänge der Hydrierung nacneinander für mehrere weitere Ansätze
der Stärkehydrolysat-Lösung durchgeführt, während die Zurückgewinnung und Wiederverwendung des Katalysators in den
mehreren weiteren Durchgängen der katalytischen Hydrierung wiederholt wird, wobei gelegentlich eine ^rgjinzung i:iit frischem
Katalysator zu dem zurückgewonnenen Katalysator jederzeit dann
stattfinden kann, wenn der zurückgewonnene Katalysator, wie er in einem Durchgang abgetrennt worden ist, in einem solchen Ausmaß
209820/ 1 OAG
BAD ORI
exschöpft ist, daß die restliche Menge an reduzierenden Zuckern
der hydrierten Stärkehydrolysat-Lösung etwa 1 0Ja entspricht, wenn
die naeli beendigter Hydrierung in diesem Durchgang bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert. Die Beispiele 1 Ms 8 erläutern das erste beanspruchte
Verfahren gemäß der Erfindung. Die Beispiele 9 bis 16 erläutern das Verfahren .gemäß dem zweiten Merkmal der Erfindung
und die Beispiele 17 bis 23 erläutern das dritte erfindungsgemäß beanspruchte Verfahren«
Ein Stamm von Stre ptomyces hygroscopicus mit der Nummer
3P.U.I. 602 oder der A.T.C.C. Nummer 21722 wurde in 9 Liter
eines Saatmediums geimpft, das 2 (}o Maismehl, 1 % Weizenkeime
und O1 1J ,<- üOrinentiiiediuni enthielt und auf einen pH-Wert von
7,0 eingestellt war. Es wurde 24 Stunaen bei 280C in eitern
iilasfermentator unter Bewegen und Belüftung bebrütet, um eine
Saaticultur herzustellen. Gleichzeitig wurden 3'->0 Liter eines
Herstellungumediums folgender Zusammensetzung: 3 c/° Maisstärke,
1 >fc entrahmte Milch, 0,2 '/J KaliumdihydrogenphcEphat, 0,05 /ο
Magnesiumsulfat una 0,01 c/a Mangansulfat sowie eine kleine Menge
eines Entschäumungsmittels in einen Fermentator von 600 Liter
Kapazität eingegeben, 30 Minuten bei 1210G sterilisiert und gekühlt.
Wie vorstehend beschrieben hergestelltes Saatkultur wurde darm zu dem sterilisierten Herstellungsmedium gegeben und das
Heratellungsmediuia wurue 85 Stunden bei 280C unter Belüftung
und Bewegung bebrütet. Die anfallende Kulturbrühe wurde filtriert und man erhielt das Kulturfiltrat, das anschließend
unter 40 Cunter verringertem Druck auf ein flüssiges Volumen
von einem Fünftel des ursprünglichen Volumens eingeengt wurde. Zu dem Konzentrat wurdo dann ein Z-fach größeres Volumen an
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kaltem Äthanol gegeben, wodurch die AmyJaBe, die gebildet
worden war und sich in der Kulturbrühe angesammelt hatte,
ausgefällt wurae. Beim Trocknen des l-iiedersehlags erhielt man
341 g eines rohen iaizyms, das eine Wirksamkeit von 43,800 Einheiten/g
hatte»
100 ml Anteile eines Mediums der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung wurden in Schuttelflascnen von 500 ml Kapazität
eingebracht und sterilisiert. Streptomyces hygroscopicus (ATCC. 21722) wurde in diese Flaschen eingeimpft und 24 Stunden
bei 28 C einer Schüttelkultur unterworfen, um eine Samenkultur
herzustellen· Gleichzeitig wurden 20 1 eines Produktionsmediums, das 12 I'o lösliche Stärke, 3 i» entfettetes Sojabohnenmehl
und 0,2 ρ Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und auf einen
pH-Wert von 7»0 eingestellt war, in einem Glasgärbottich von
30 1 Kapazität eingefüllt, sterilisiert und gekühlt. Zu diesem sterilisierten Produktionsmedium wurde die Samenkultur gegeben
und 90 Stunden bei 35°C gezüchtet. Die erhaltene Kulturbrühe
wurde dann in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt und man erhielt 77 g rohe Amylase, die eine Wirksamkeit von
45,000 u./g hatte.
Ein Stamm von Streptomyces viridochromogenes mit der F.H.I.
iMummer 603 und der ATIEC. Nummer 21724 wurde,v/ie im Beispiel 2
beschrieben,in einem Herstellungsraedium gezüchtet, aas 8,4 λ>
Maismehl, 2 Yo Polypepton und 0,2 c/o Kaliumdihydrogenphosphat
enthielt und auf einem pH-Wert von 7,0 eingestellt war. Aus der sich ergebenden Kulturbrühe wurden 28 g eines rohen iinzyma
gewonnen,-"'-das eine Wirksamkeit von 22,000 u./g hatte.
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BAD OflIGJNÄt.
■Beispiel 4
Jiin Stamm von Streptomyces albus mit der J?.λ. I. Nummer 604
und der Ai1CG. Kummer 21725 wurde, wie im 3eispiel 2 beschrieben,
in einejii Produktionsmedium gezüchtet, das 9t4 ';» lösliche
Stance, Λ t'j ,. i'ischmehl und 0,2 /·>
Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war.. Aus
der kulturtrüne wurden dann 53 g eines rohen üJnayins erhalten,
aas eine Wirksamkeit von 10,000 u./g aufwies.
.Beispiel 5
.Din Stamm von Streptomyces hygroscopicus var. angustomycetes
mit uer F. ii. I. iiumner 607 vmrde in der im Beispiel 2 beschriebenen
Flüssigkeit, wie dort beschrieben, gezüchtet und man ernielt 55g eines rohen Enzyms, das eine Wirksamkeit von
1:>, UOO 'J.ο/i. aufwies.
Streptomyces tosaensis nov. sp. mit der Ai1CC Hummer 21723
v/urde,wie im Beispiel 2 bescnr^ieben, gezüchtet. I-Ian erhielt
71-' έ; eines rohen jiiinyms, das eine V/irksamkeit von 3ö,000 u./g
auiVi es.
Ein Sta.u::: von Stre^toiuyces aureofaciens mit der F.R.I, hummer
bCu wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, gezüchtet und man
erhielt 26 g eines pulverförraigen rohen Enzyms mit einer V/irksamkeit
von 29,000 u./fi.
iiin Stai.li.: von Streptomyces flavus mit der i'.-T-olo Kummer 605
wurde in einer: Kulturmedium der Zusammensetzung wie im Beispiel 4 gezüchtet und man erhielt 36 g eines pulverförmi^en rohen
209820/1046 BADQ^GtNAL ■
Enzyms mit einer Wirksamkeit von 30,000 u./g.
Zu einer wässrigen Dispersion von 9 kg Kartoffelstärke in 12 Leitungswasser, die auf einen Anfangs-pH-Wert von 6,0 durch.
Zugabe von Natronlauge eingestellt worden war, wurden 0,1 $ einer bekannten bakteriellen verflüssigenden Amyläse (im Handel
verfügbar als 'Spitase", vertrieben von der Nagase Sangyo Co.
Ltd., Japan) zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde dann tropfenweise zu 13 1 heißen Wassers gegeben, während die Temperatur
bei 7O-73°C gehalten würde, so daß die Verflüssigung der
Stärke vollendet werden konnte. Die verflüssigende Amyläse
wurde dann durch 5 Hinuten Erhitzen der Lösung auf 100 C nach
der vollendeten Verflüssigung inaktiviert. Nach Abfüllen der Lösung auf eine JTüssigkeitstemperatur von ί;·5°0 wurde rohe
Amylase aus Streptomyces, wie sie im Beispiel 1 hergestellt worden ist, in Anteilen von 400 Einheiten je g der Stärke zugegeben,
Die Mischung wurde dann auf einen Anfangs-pH-Wert von 6,0 eingestellt und 40 Stunden bei 55°C gehalten, um die Verzuckerung
vollständig zu machen. Nach beendeter Verzuckerung wurde die iteaktionsmischung filtriert,in üblicher Weise mit
Aktivkohle entfärbt und dann mit Hilfe eines bekannten entsalzenden
Ionenaustauscherharzes entsalzt. Die so behandelte Mischung wurde anschließend durch Abdampfen von Wasser im
Vakuum so eingeengt, daß man 10 kg eines klaren und farblosen Sirups aus Stärkehydrolysat erhielt, der 3,6 ψ Glukose, 72,5 #
Maltose, 10,3 ψ Maltotriose und 13,6 i<>
Dextrin enthielt (der Wassergehalt betrug 25 Gew./£>), die als flüssiger natürlicher
Süßstoff geeignet war, der hauptsächlich Maltose enthielt.
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9 leg süße Kartoffelstärke wurden in 12 1 Leitungswasser dispergiert.
Zu der Dispersion aus S1ö:ke wurden 0,1 fo einer bekannten
"bakteriellen verflüssigenden Amylase gegeben, nachdem der pH-Wert auf 6,0 eingestellt worden war» Die Stärkedispersion
wurde dann tropfenweise zu 18 1 heißen Wassers gegeben, während die 'temperatur der Mischung bei 84-87°C gehalten
wurde, so daß die Dextrinisierung der Stärke Tollendet wurde.
Die bakterielle verflüssigende Amylase wurde dann durch 5 Minuten Erhitzen auf 1000C inaktiviert. Nach Abkühlen der
verflüssigten Stärkelösung auf 55°C wurde die rohe Amylase aus Streptomyces, wie sie im Beispiel 1 hergestellt worden ist,
in Anteilen von 400 Einheiten je g Stärke zugegeben. Die Mischung wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und dann
40 Stunden bei 550C gehalten, um die Verzuckerung zu erreichen.
Nach beendeter Verzuckerung wurde die Reaktionsmischung filtriert,
in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt und mit einem bekannten entsalzenden Ionenaustauscherharz entsalzt. Die so
behandelte Mischung wurde durch Abdampfen von Wasser unter Vakuum weiter eingeengt, so daß man 9,6 kg eines klaren und
farblosen Sirups aus dem Stärkehydrolysat erhielt, der 3,1 5^
Glukose, 73,6 '/o Maltose, 9,8 fo Mältotriose und 13,6 fo Dextrin
enthielt (der Wassergehalt betrug 25 Gew.fo), der als flüssiger
natürlicher Süßstoff, der hauptsächlich Maltose enthielt, geeignet ist.
9 kg Kornstärke wurden in 12 1 Leitungswasser dispergiert und
zu der erhaltenen Dispersion wurden 0,3 cfc einer bekannten
bakteriellen verflüssigenden Amylase gegeben, nachdem der pH- Wert auf 6,0 eingestellt worden war. Die Stärkedispersion
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wurde dann auf einen pH-Wert von 6,3 unter Zugabe von 0,02 ρ
Kalziumhydroxyd eingestellt und bei 92-93 C gehalten, um eine
erste Verflüssigung zu bewirken, llach Beendigung dieser ersten
Verflüssigung wurde die Dispersion 10 Hinuten bei 121 G Wärme
behandelt und anschließend mit 0,05 ?° der bakteriellen verflüssigenden
Amylase versetzt. Dann wurde eine zweite Verflüssigung bewirkt. Mach der beendeten Verflüssigung wurde
die verflüssigende Amylase durch 5"Minuten Erhitzen auf 10O0C
inaktiviert. Nach Abkühlen der verflüssigten Stärkelösung auf 55 C wurde rohe Amylase aus Streptomyces, wie sie im Beispiel 1
hergestellt worden ist, in Anteilen von 400 u./g Stärke zugegeben. Die Verzuckerungsreaktion wurde cei einem pH-Wert von
6,0 40 Stunden bei 55°C durchgeführt.
Nach beendeter Verzuckerung wurde die Reaktionsmischung filtriert,
in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt und mit einem entsalzenden Ionenaustauscherharz entsalzt und schließlich so
weit eingeengt, bis 10,5 kg eines klaren und farblosen Sirups aus dem Stärkehydrolysat vorlagen, der 4,1 $>
Glukose, 71,3 ϊ Maltose, 11,7 CJ>
Maltotriose und 12,9 $ Dextrin enthielt (der Wassergehalt betrug 25 (Gew.)fo), der als flüssiger natürlicher
Süßstoff geeignet v/ar, der hauptsächlich. Maltose enthielt.
15 kg süßer Kartoffelstärke wurden in Wasser dispergiert und in einer Menge von 1 i>
eine: bakterielle verflüssigende Amylase zugegeben. Die Verflüssigung wurde bei einer '.temperatur von
84-870C und bei einem pH-Wert von 6,0 durchgeführt und anschließend
Amylase aus Streptomyces hygroscopicus in einer Menge von 400 u./g Stärke zugegeben. Die Verzuckerungsreaktion
wurde bei einem Anfangs-pH-Wert von 6,0 40 Stunden bei 550C
durchgeführt und die anfallende Verzuckerungsmischung dann fil-
209820/1046
trierto Han erhielt 78 1 des Stärkehydrolysate«
Das Piltrat (78 l) wurde auf ein Volumen von 42 1 eingeengt
und durch eine Kolonne eines entfärbenden Ionenaustauscherharzes mit einer Geschwindigkeit von SV=2 für die Entfärbung
hinaurchgeführt. Anschließend wurae das Kulturfiltrat durch
Hindurchführen durch eine Kolonne eines Ionenaustauscherharzes entsalzt, so daß 4ö 1 der entsalzten Lösung erhalten wurden.
Die Lösung wurde auf 26 1 eingeengt und sprühgetrocknet, eo
daß man 17 kg eines trocknen pulverartigen Produktes mit einem Gehalt von 5|2 -,'= Glukose, 70,6^1-Ialtose, 9,7 "a>
Maltotriose, 10,5 's Dextrin und 4,0 <-i Wasser erhielt, die als diätetischer
und natürlicher Süßstoff, der im wesentlichen Maltose enthielt, geeinget ist.
9 kg süße Kartoffelstärke wurden in 12 1 Leitungswasser dispergiert, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und mit
0,1 ·,-· einer bakteriellen verflüssigenden Amylase versetzt. Die Kicchunt, wurde dann tropfenweise in 16 1 heißes Wasser
gegeben, während die Iemperatur der Mischung bei 84-87 C gehalten
wurde. Auf diese Weise wurde die Verflüssigung der stärke vollendet. Anschließend wurde die bakterielle verflüssigende
Amylase durch 5 Minuten Erhitzen auf 100 C inaktiviert. Bei einer Temperatur der Lösung von 65°C beim
Abstehen wurde die Lösung mit einem Eulturfiltrat versetzt,
das die Amylase aus Streptomyces toygroscopicus in einer Henge
von 400 u. je g Stärke enthielt. Uachdem die Temperatur der
Lösung auf 55°C eingestellt worden war, wurde die Verzuckerungsreaktion bei einem Anfangs-pH-Wert von 6,0 40 Stunden bei 55 C
durchgeführt.
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Das Kulturfiltrat, das die Amylase aus Streptoinyces hygroscopicus
enthielt, wurde auf folgende V/eise hergestellt. Streptomyces
hygroscopieus (ATCC. Hummer 21722) wurde bei 280C 24 Stunden
in 900 ml eines Mediums mit einem Gehalt von 2 /ö Maismehl,
1 /ο Weizenkeime, 0,5 f° Fermentmedium. bei einem pH-¥ert von 7,0
in einem 2 1 Glas-Gär bottich, unter Belüftung und Bewegung
einer Schüttelkultur unterworfen, um die Samenkultur herzustellen.
Gleichzeitig wurden 30 1 eines Produktionsmediums, das 3 ρ
Kaisstärke, 1 -(ό entfettete* entrahmte Milch, 0,2 $ Kaliumdi—
hydrogenphosphat» 0,05 ϊ° Magnesiumsulfat, 0,01 % Mangansulfat,
zusa mien mit einer geeigneten Menge eines Entschäumungsmittels
enthielt, in einen 60 1 Fermentierungsbehälter eingegeben, 30 Hinuten bei 1210C sterilisiert und gekühlt. Zu diesem
sterilisierten Herstellungsmeidum wurde die vorstehend beschriebene
Samenkultur gegeben und bei 280C 85 Stunden unter iael'iftung und Bewegung bebrütet. Die anfallende Kulturbrühe
wurde filtriert und man erhielt 27 1 eines Kulturfiltrats, das eine Wirksamkeit von 2000 u./ml hatte.
Die vorstehend beschriebene Yerzuckerungsreaktion wurde auf
die genannte V/eise vollendet und die anfallende Heaktionsmischung
filtriert und in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt und mit einem entsalzenden lonenaustauscherharz entsalzt.
Die entfärbte und entsalzte Reaktionsmischung wurde durch Abdampfen von Wasser eingeengt und man erhielt 10,6 kg
eines farblosen und klaren Sirups, der 4}2 fo Glukose, 74,2 >Maltose,
9,8 fo Maltotriose und 11,8 C,O Dextrin enthielt (der
Wassergehalt betrug 25 (Gew^s) und der als diätetischer und
natürlicher Süßstoff geeii^et war, der hauptsächlich Maltose
enthielt.
209820/1046
Das Verfahren von Beispiel 13 wurde mit der Ausnahme wiederholt,
daß das Kulturfiltrat aus der Kultur aus Streptomyces
hygroscopicus durch eine gereinigte Amylasepreparation ersetzt
wurde, die aus Streptomyces "hygroscopicus durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu dem Kulturfiltrat erhalten worden ist, wobei
die rohe Amylase ausfiel und einer elektrodialyse unterworfen wurde, i^s wurden 10,2 kg eines farblosen,klaren Sirups erhalten,
der'·3,2 ;i G-lukose, 74,2 fo Maltose, 8,8 c/o Maltotriose und H9O f>
Dextrin enthielt (Wassergehalt 25(Gew<^°), der als diätetischer
und natürlicher Süßstoff geeignet war, der hauptsächlich Maltose enthielt.
Die gereinigte Amylaseherstellung aus Streptomyces hygroscopicus, die in diesem Beispiel verwendet wurde, wurde in folgender
Weise hergestellt: 10 1 des Kulturfiltrats, das im Beispiel 13 erhalten wurde, wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung
von 60 V0 versetzt und der gebildete Niederschlag durch
Zentrifugieren entnommen und dann in 2 1 Wasser eingegeben. Die erhaltene wässrige Lösung wurde einer elektrischen Dialyse
mit einem Ionenaustauscherharz bei 50C unter solchen Dialysebedingungen
unterworfen, daß der elektrische Strom 3 Stunden bei einer konstanten Spannung von 10 V und bei einer maximalen
Ampereleistung von 5»2 A hindurchgeführt wurde ο Auf diese Weise
wurde das Ammoniumsulfat entfernt und man erhielt eine Lösung der gereinigten Amylase<,
Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die trockne, pulverförmige Anrnylase aus Streptomyces
hygroscopicus durch die ausgefällte Amylase ersetzt wurde,
209820/1046 BADORIQfNAt
die durch Zugabe von Äthanol su den Kulturfiltrat aus
Streptomyces hygroscopicus erhalten wird. Diese ausgefällte
Araylase v/urde zu aer Stärkedispersion in einem Anteil von 400 u./g Stärke gegeben. Man erhielt 17»4 g eines pührerförmigen
Produktes, das 3,0 /s ü-lukose, 72,5 ,'■· Maltose, ö,5 'Φ
Haitotriose, 12,0 ;i Dextrin und 4,0 ;i Wasser enthielt. Dieses
Produkt war ein geeigneter diätetischer und natürlicher Süßstoff, der hauptsächlich Maltose enthielt.
Die in diesem Beispiel verwendete ausgefällte Amylase wurde
nicht getrocknet una wurde in folgender Weise hergestellt: 10 1 des Kulturfiltrats, das in Beispiel 15 erhalten wird,
wurden auf ein Volumen von einem Fünftel des Originalvolumens
eingeengt und dann ein doppeltes Volumen kaltes Äthanol zugegeben, um einen Mieder schlag zu erhalten» Der liieder schlag
wurde als Enzympräparat ohne vorhergehendes Trocknen verwendet,
12 kg Kartoffelstärke v/urden in 14 1 Leitungswasser dispergiert,aif
einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und dann unmittelbar Amylase aus Streptomyces hygroscopicus in einer Menge von
200 Einheiten je g Stärke zugegeben. Die wässrige Lösung
wurde dann tropfenweise zu 14 1 heißem Wasser gegeben, während eine Temperatur von 7O-72°G eingehalten wurde, um die Verflüssigung
der Stärke zu beenden.. Danach wurde die Mischung auf 55°C abkühlen gelassen und dann mit einer weiteren Menge
von Amylase aus Streptomyces hygroscopicus mit einer Wirksamkeit von 200 Einheiten je g Stärke versetzt. Die Verzuckerungsreaktion
wurde bei 35°C 48 Stunden durcngeführt.
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BAD ORfGfNAL
-TS-
Lach beendeter* Verzuckerung wurde die Heaktionsmisehung filtriert,
in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt und mit einen entsal^er-iei; lonenaustausciaerharz entsalzt. Die entfärbte
unftentsalzte Lösung wurde eingeengt und man erhielt
einen klaren und farblosen Sirup, der 4,9 -Glukose, 70,0 %
lualtose, 9,2 ,·- Haltotx^iose und 15,9 ',=>
Dextrin enthielt (Wassergehalt 25 (uew«)l·), tier a.ls diätetischer und natürlicher Süßstoff
mit eii.e.: wesentlichen gehalt an Maltose geeignet ist»
c ki, i-iaissüUrke wuraeix in c 1 Leitungswasser dispergiert,auf
eiiieii o^-wert von 6,0 eingestellt una dann mit 0,2 % der bekannten
bakteriellen verflüssigenden Aaylase versetzte Die wässrige Ki. ciiuii^ v/urde auf einen prl-V/ert von 6,0 durch Zugabe
von iialsiuiiirijdroxyd eingestellt und dann tropfenweise zu 6
Iieiieiu V/asser ^egebe^e jjine erste Yerflüssigung v/urde bei
S'2-93°C durchgeführte Kach vollendeter erster Dextrinisierung
wurae ^ie vei-fiüssi^te Stäritelösung bei 1200C in der Wärme
behandelt;, jiine zweite Verflüssigung v.rurde dann unter Zugabe
von C, 05 .- aer gleichen bakteriellen verflüssigenden Amylase
dur caL: ei uhr t.
Lach beendeter Verflüssigung der stärke wurde das Enzym durch
5 iiinutöi) i,rhit-sen auf 1OCCC inaktiviert. L"ach Abkühlen der
verflüssi^ton Stärkelösung auf eine Plüssigkeitstemperatur
von 55°C wurde die Lösuno mit einem trocknen pulverförmigen
Amylc-sepräparat aus Streptomyces iiygroscopicus versetzt, das
v/ie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Der Anteil betrug 4-C Einheiten je g Stärke.
Die Verzuckerungsreaktioii wurde bei einem Anfangs-pH-Viert von
:l bei eil
führt.
führt.
6,0 urxL bei einer Temperatur von rö°C -IC Stunden durch-e-
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BAD ORKSiNAt.
- 8ο -
Nach beendeter Verzuckerung auf die vorstehend beschriebene V/eise wurde die Reaktionsmischung filtriert una man erhielt
24 1 eines Filtrats, das anschließend in üblicher Weise entfärbt und entsalzt wurdeβ Durch Einengen der entfärbten und
entsalzten Lösung auf einen 3?eststoffgehalt von 50 c/o wurde
ein Sirup aus dem Stärkehydrolysat erhalten, uer 4,1 fo Glukose,
71,3 % Maltose, 11,7 # Oligo-Zucker und 12,9%Dextrin enthielt.
Zu uem Sirup wuraen 250 g eines Raney-Wickelkatalysators gegeben
una der Anfangs-pH-Wert des Sirups auf einen pH—./ert
von 9,0 eingequellt. Der Sirup wurae in einen Autoklaven mit
einer Kapazität von 30 1 eingebracht, tier mit einem Rührwerk ' versehen war. In aen Autoklaven wurue /cseerstoff eingeführt,
so aaß aer Sirup der katalyti&chen Klarierung bei 130° G
3 Stunden unter einem Viasseratoffaruck von 100 kg/cm unterworfen
v;uraeo Nach beenaeter Hyarierung v/urde aer Katalysator
aus der Reaktionsnischung entfernt» ijer abgetrennte oaer zurückcevionntne
Katalysator v/urde einem zweiten Ansatz aes Sirups aus dem Stärkehydrolysat züge-eben, α== ε beim nächsten
Verfahren aer Stärkeverzuckerung hergestellt worden war, und
die katalyti&che rl3rarierung wurae uit aem zweiten Sirupanstitz
uieaerholt unter aen gleichen Hyarierungsbeain^un^en, v/ie sie
vorstehen j. beschrieben v/oräen sind«
Von aem i'iiarat aer Reaktionsmiechung auc aem Hyarierungsvcrfahren
wurde der x:est^ehalt aer reauzierenaen Zacker nach dem Verfahren von Somogyi bestimmt« Es V/urae gefunden, aaß aer
Restanteil der reauzierenden Zucker wie vorstehend definiert 0,21 ^ im Filtrat betrug, das ist die katt.lysatorfrtie
Reaktionsmischung, aie beim ersten Durchhang des Hi'arierungsverf
ahrens erhalten vurae. Vieitere Ans .uze aes Sirups aus dem
Stärke hy ar ο I0V s at wuraen in aufeinanderfolgenden Durchgc'riäen
unter den gleichen H^arierungsbuain^un^en hydriert una der
zurückgewonnene und v/iej.erver\/en.,ete Katalysator v/urde bei
aiesen
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BAD ORIGINAL
- 3i -
aufeinanderfolgenden Ansätzen der Hydrierung wieder verwendet. Die Restmenge an reduzierenden Zuckern steigt allmählich
mit fortlaufenden Ansätzen und erreicht einen Wert von 1,o3 $>
in der katalysatorfreien Reaktionsmischung, die nach dem sechsten Durchgang der Hydrierung erhalten wird.
Fach diesem sechsten Durchgang der Hydrierung wurden 50 g frischer Raney-Nickelkatalysator zu dem zurückgewonnenen
Katalysator gegeben und der auf diese Weise reaktivierte zurückgewonnene Katalysator beim siebten Durchgang des
Hydrierungsverfahrens wieder verwendet. Die Zurückgewinnung und die Wiederverwendung des Katalysators wurde in weiteren ·
Durchgängen des Hydrierungsverfahrens durchgeführt.
Die Reaktionsmischung, die bei aufeinanderfolgenden Durchgängen des Hydrierungsverfahrens erhalten wurde, wurde
jedesmal filtriert, entsalzen und eingeengt, um eine wässrige, klare und farblose Zusammensetzung der Zuckeralkohole
zu erhalten, die einen Feststoffgehalt von 75 $>
feesitzt und nicht weniger als 70 # Maltit und geringere Mengen an Sorbit, Maltotriit und' anderen Produkten enthält.
Diese wässrige Zusammensetzung besteht hauptsächlich aus
Maltit und wird in einer Ausbeute von etwa 6,6 kg bei jedem Durchgang des vorstehend beschriebenen Hydrierungsverfahrens
erhalten.
Das Verfahren von Beispiel 17 wird mit derAusnahme wiederholt, dass anstelle von Maisstärke eüße Kartoffelstärke verwendet
wurde, die in üblicher Weise verflüssigt wurde. Die Ver-
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- o2 -
zuclcerung wurde mit einem trocknen, pulverförmigen Präparat
der Amylase aus Streptomyces hygroscopieus durchgeführt. Ls wurde ein wässriger Sirup des Stärkehydrolysate erhalten, der
3,1 i» Glukose, 73,6 />
Maltose, 10,2 $ Oligo-Zucker und 13,4 >'»
Dextrin enthielt. Dieser Sirup wurde katalytisch hydriert, filtriert, entsalzt und in der im Beispiel 17 beschriebenen
Weise eingeengt, um eine wässrige, klare und farblose Mischung von Zuckeralkohol mit einem hohen Maltitgehalt zu ergeben,
die 70 yo Maltit und geringere Anteile an Sorbit, I-Ialtotriit
und anderen Produkten enthielt, und deren Feststoffgehalt bei
75 fo lag.
Das Verfahren von Beispiel 17 wurde unter Verv/endung von Kartoffelstärke anstelle von Maisstärke durchgeführt. Die
Stärke wurae in üblicher Weise verflüssigt und die verflüssigte Stärke mit der Amylase von Streptomyces hygroscopicus verzuckert.
Es wurde ein wässriger Sirup erhalten, der das Stärkehydrolysat enthielt, das im wesentlichen aus Maltose bestand und 3,6 }&
Glukose, 72,5 /° Maltose, 10, 3 $£ Oligo-Zucker und 13,6 f»
Dextrin enthielt« Dieser Sirup wurde katalytisch hydriert, filtriert und in gleicher Weise wie im Beispiel 17 eingeengt.
Man erhielt wine wässrige, klare und farblose Mischung von Zuckeralkoholen, die 72 >
Maltit und geringere Anteile an Sorbit, Maltotriit und anderen Produkten enthielt und einen
Feststoff gehalt von 75 Gew.>& besaß.
Das Verzuckerungsverfahren von Beispiel 17 wurde mit der Ausnahme
wiederholt, daß das trockne, pulverförmige Präparat der
209820/1048
Aiayla.se aus Streptomyces hygroscopicus durch, ein Kulturfiltrat
ersetzt wurde, das durch bloßes Filtrieren der Kulturbrühe von
Streptom^ces hygroscopicus erhalten worden ist. Es wurde ein
wässriger Sirup erhalten, der das Stärkehydrolysat enthielt,
das im wesentlichen aus Maltose bestand und 4,1 y- (ilukose,
72,3 >o i-altose, 10,1 >o Qligo-Zucker und 13»5 ρ Dextrin enthielt.
Durch katalytische Hydrierung dieses Sirups unter den
im Beispiel 17 beschriebenen Bedingungen erhielt man eine Zusammensetzung
von Zuckeralkoholen, die 71 V° ^aitit und geringere
Anteile an Sorbit, Haltotriit und anderen Produkten enthielt.
Die katalytische Hydrierung des Sirups aus dem Stärkehydrolysat wurde nach den Bedingungen des Beispiels 17 durchgeführt,
wcbei der erste Durchgang der Hydrierung unter einer Belastung mit Haney-itickelkatalysator in einer Hen^e von 5 &ew.;c auf
der Basis deu Anteils an reduzierenden Zuckern in dem Sirup
aurchgeführt wurde· Der Katalysator wurde zurückgewonnen und nacheinander in sechs Durchgängen des Hydrierungsverfahrens
wieder verwendet una die weitere Wiederverwendung des zurückgewonnenen
Katalysators dann beendet. Diese aufeinanderfolgenden sechs Durchgänge ergaben wässrige Mischungen der Zuckeralkohole
mit etwa jeweils der gleichen Zusammensetzung.
.Beispiel £2
Bei der katalytisehen Hydrierung des Sirups aus dem Stärkehydrolysat
wie im Beispiel 17 wurde der erste Durchgang des Hydrierungsverfahrens mit einer Belastung von 5 Gew.>j Haney-Eickelkatalysators,
bezogen auf die Henge der reduzierenden /jucker des Sirups durchgeführt und der Katalysator zurückge-
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- 64 -
wonnen und in aufeinanderfolgenden sechs Durchgängen der
Hydrierung wieder verwendet. Der zurückgewonnene Katalysator aus dem sechsten Durchgang wurde durch Zugabe von 3 >$ (150 g)
frischem Haney-JKickelkatalysator, bezogen auf die Menge der
reduzierenden Zucker in Sirup, ergänzt, bevor er für den siebten Durchgang wieder verwendet wurde. Der Katalysator
wurde dann wieder zurückgewonnen und in v/eiteren Durchgängen
der katalytischen Hydrierung wiederverwendet, wobei jeder Durchhang v/ässrige Mischungen von Zuckeralkoholen ergab mit
etwa der gleichen Zusammensetzung, wie sie im Beispiel 17 erhalten
wurde.
10Og einer Amylose wurden in 5 1 0,2 II wässriger Natronlauge
unter Erhitzen gelöst, dann auf 65 C gekühlt, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und anschließend die Ämylase von Strep tonyces
hygroscopicus in Anteilen von 1000 Einheiten je g Amylose
zugegeben. Die Verzuckerungsreaktion wurde 40 Stunden bei 62 C durchgeführt. Wach beendeter Verzuckerung wurde das i,nzym durch
erhitzen inaktiviert. Die Reaktionsmischung wurde in üblicher V/eise filtriert, entfärbt, entsalzt und dann auf einen Feststoff
gehalt von 50 c,o eingeengt. Man erhielt einen wässrigen
Sirup oder eine Lösung, die das Stärkehydrolysat enthielt und 1,0 >
ü-lukose, 82,5 /<- Maltose und 16,5 V Oligo-Zucker auf
i'rockengev/ichtsbasis aufwiegt. Dieser Sirup (0,2 1) wurde mit
4,5 g xianey-Hickelkatalysator versetzt, auf einen Anfangs-pri-V/ert
von 9,0 eingestellt und anschließend bei einer Reaktionstemperatur von 1300G 3 Stunden unter einem Wasserstoffdruck
von 100 kg/cm katalytisch hydrierte Die Üeaktionsmischung
wurde durch filtrieren vom Katalysator getrennt, entsalzt und
anschließend eingeengt, so daß man 120 g einer wässrigen Zu-
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saimnensetzung von Zuckeralkoholen erhielt, die im wesentlichen
aus tialtit bestand, deren Peststoff gehalt 75 ,'"■ betrug, und die
80 >ij liaitit, 2,5 '/i Sorbit und den Rest Maltotriit und andere
Alkohole enthielt.
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Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Amylase mit einem pH-V,rert
für die optimale enzymatisch^ Wirksamkeit im Bereich von 4 »5-5» O bei Stärkesubstraten, einer HydroIysegrenze für
Stärke von wenigstens 75 V° des theoretischen Wertes für
Maltose und einem Gewichtsverhältnis von G-lukose zu kalt öse
bei der Bildung aus Stärke unter Verwendung dieses iinzyms von nicht mehr als Ο,ΰο : 1 durch Züchten von Streptomycesstärumen
unter aerobischen Bedingungen in kulturmedien, die bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces albus,
Streptomyces aureofaciens, Streptomyces hygroscopicus,
Streptornyces hygroscopicus var. angustomyceticus, Streptomyces
viridochromogenes, Streptomyces flavus oder Streptomyces tosaensis züchtet und die Amylase in bekannter Weise aus dem
Kulturmedium abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm Streptomyces tosaensis mit der ATCC-Hummer
21723 züchtet und aus dem Kulturmedium eine Amylase abtrennt, deren Hydrolysegrenze für Stärke 79 $>
des theoretischen Wertes für Maltose und deren Gewichtsverhältnis von Glukose zu Maltose
bei deren Bildung aus Stärke 0,053 : 1 beträgt»
3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen Stamm von Streptomyces hygroscopicus mit der AICC-Nummer
21722 züchtet und aus dem Kulturmedium eine Amylase abtrennt, deren Hydrolysegrenze für Stärke 82 % des theoretischen
Wertes für Maltose und deren Gewichtsverhältnis von Glukose zu Maltose bei deren Bildung aus Stärke 0,055 : 1
beträgt.
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— Of —
4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen .Stcann von Streptomyces albus mit der ATCC-liummer
21725 suchtet und aus aem Kulturmedium eine Amylase abtrennt,
aeren Hydrcl;rsegrenze für Stärke 78 % des theoretischen V/ertes
für Maltose und deren 3-ewichts verhältnis von G-lukose zu Maltose
bei deren Bildung aus Stärke 0,05ö : 1 beträgt.
5ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
nan einen otarnm Streptoiayces viridochromogenes mit der A1I1CC-Lummer
21724 züchtet und aus dem Kulturmedium eine Aniylase abtrennt, deren Hyurolysegrenze für Starke 79 i- des theoretischen
Wertes für Maltose und deren Gewichtsverhältnis von
Glukose zn Maltose bei deren Bildung aus Stärke 0,051 : 1
betrügt.
ο« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dai
man einen Stigma Streptcmyces aurecfc.ciens züchtet und aus dem
xiulturmediuii: eine Amylase abtrennt, deren Eydrolysegrenze für
Stärke 76 .- aes theoretischen Wertes für Haitose und deren
o-ewichtsverhiiltnis von Glukose zu Maltose bei deren Eildung
aus Stärke 0,05t : 1 beträgt.
7ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3
man einen Stamm von Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus
züchtet und aus dem Kulturmedium eine Amylase abtrennt, deren Hydro Iy se grenze für Stärke 80 >!· des theoretischen
Wertes für Maltose und deren Gewichtsverhältnis von Glukose zu Haitose bei deren Bildung aus Stärke 0,053 ί 1
beträgtο
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BAÖ ORIGfNAL
bo Verfahren nach. Ansrjruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen Stamm von Streptomyces flavus züchtet und aus dem kulturmedium eine Amylase abtrennt, deren Hydrolysegrenze für
Stärke 76 fi des theoretischen Wertes für Maltose und deren Gewichtsverhältnis
von Glukose zu Maltose bei deren Bildung aus Stärke 0,05b : 1 beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g ekennz ei clone t, daß
man einen Stanm von Streptomyces hygroscopicus bei Temperaturen von etwa 35°C in einem Kulturmedium mit einer Kohlenstoffkonzentration
von 2-60$ und eine Stickstoffkonzentration von
0,1 - 0,3 iiy<- und einem C/N-Gewichtsverhältnis von 20 : 1
züchtet.
10. Verfahren zur Herstellung von im v/esentlichen aus Maltose
bestehenden Verzuckerungsprodukten von Stärke, die geeignete diätetische und natürliche Süßstoffe darstellen, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Stärkematerial einschließlich von Ariylosen in wässriger Dispersion in bekannter V/eise mit
Amylase, hergestellt nach den Verfahren der Ansprüche 1 bis 9» umsetzt, bis die erhaltene wässrige Lösung aer Verzuckerungsprodukte mindestens 70 °,ό Maltose,auf 'irockengewichtsbasis
berechnet, enthält.
11 ο Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
man eine bekannte verflüssigende Amylase in wässriger Dispersion zur Verflüssigung der Stärke verwendet, die anfallende
Lösung der verflüssigten Stärke zur Inaktivierung der Amylase* aus den besonderen Streptomycesstämmen behandelt, zur Inaktivierung
dieser Amylase die dabei erhaltene Lösung erhitzt und gegebenenfalls filtriert, entfärbt und/oder entsalzt.
♦erhitzt, dann mit der Amylase
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BADORlGiNAi.
- ο 9 -
12» Verfahren nach Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man die nach dem Verfahren des Anspruchs 3 erhaltene ümylase 40 Stunden bei etwa 550C umsetzt»
13· Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Zuckeralkoholen, die im wesentlichen aus Maltit besteht, und die als
diätetischer Süßstoff geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Stärkematerial, ein mindestens teilv/eise hydrolysiertes
Stärkeiiiaterial und eine^ Amylose durch Umsetzung in einer
wässrigen dispersion mit einer Amylase, die nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt worden ist, verzuckert, bis eine
Stärkehydrolysat-Lösung mit einem Gehalt von mindestens 70 ,i
Maltese und bis zu 4 ?<> Glukose,auf Trockengewichtsbasis berechnet,
vorliegt, diese Stärkehydrolysat-Lösung dann mit Wasserstoff in Gegenwart eines Mckelkatalysators katalytisch
hydriert, den Hickelkatalysator von der hydrierten Stärkehydrolysat-Lösung
abtrennt und eine wässrige Lösung einer Hischung von Zuckeralkohoien gewinnt, die mindestens 70 yj
kaitit und bis zu 5 /- Sorbit,auf Trockengewichtsbasis berechnet,
entnält, die gewünschtenfalls zu einem Sirup oder zur Trockne
eingedampft wird.
14· Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Stärkehydrolysat-Lösung aus der Verzuckerungsstufe
iJickelkatalysator in einer Menge von 5 Gew«/?, bezogen auf den
Anteil an reduzierenden Zuckern in der Stärkehydrolysat-Lösung, die im ersten xiUrchganb eier icatalytischen Hydrierung hydriert
wird, zugibt, den ersten Ansatz der Stärkehydrolysat-Lösung im ersten Durch,: ung in Gegenwart des Mckeikatalysators hydriert,
den i\iicicelkM.talysator aus der hydrierten Stärkehydrolysat-Lösung
abtrennt und zu einem zweiten Ansatz, der im zweiten
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BAD ORIGINAL
Durciagang der Hydrierung zu hydrierenden Stärkehydrolysat-Losung
zugibt und auf diese V/eise mehrere ϊ-iale den /.analysator
in weiteren Anaätzen Stärkehydrolysat-Lcsun^ verwendet,
bis der aus dem letzten Durchhang dieser weiteren Ansätze abgetrennte Katalysator so erschöpft ist, daß die üeDt:,:on^e
der reduzierenden Zucker in der hydrierten Stärkehydrolysutlösung
etwa 1 70 entspricht, dann zu diesem erschöpften zurückgewonnenen
Katalysator einen Anteil frischen Mickelkatalysator von etwa 1—3 dew.'/i, bezogen auf den Anteil an reduzierenden
Zuckern in der zu hydrierenden Stärkehydrolysat-lösun^
zugibt, den zurückgewonnenen, erschöpften und reaktivierten Katalysator in einen nächsten Ansatz Stärkehydrolysat-Lösun^.,
die hydriert wird, ^ibt und dieses Verfahren beliebig oft
wiederholt.
15= Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
man Araylase aus Streptorayces h^groscopicus, hergestellt nach
dem Verfahren von Anspruch 3, mit dem Stärk ei.^at er ial umsetzt.
Pur die Anmelderin: Meissner α. ^olte
Patentanwalt e 22. 1Oo 1971
Anmelder;
1 jjilJI SEIKA KAISHA, Li1D.
LIo. 8, 2-chome, Kyobashi,
Chuo-ku,
Chuo-ku,
fJokyot Jayan
Prioritäten werden beansprucht! Japan 93951/70 vom 27.10.1970
Japan 117752/70 vom 25.12.m70
Japan 48773/70 vom 5· 7. 1971
209820/1046
Lee rs e ι te
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