DE2153232B2 - Verfahren zur Herstellung einer Amylose - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer Amylose

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Description

15 net werden, umgewandelt ist, und welche die Fähigkeit hat, aus Stärke Glukose und Maltose im Gewichtsverhältnis von nicht mehr als 0,06:1 zu bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces albus mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 21 725, Streptomyces hygroscopicus mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 21 722, Streptomyces viridochromogenes mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 21 724 oder Streptomyces tosaensis mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 21 723 aerob in einem Kulturmedium, das bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet
Die Erfindung betrifft den im Anspruch definierten Gegenstand.
Es wurde gefunden, daß man beim aeroben Züchten der im Anspruch angegebenen Stämme der Gattung Streptomyces in einem Kulturmedium, das bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, eine Amylase herstellen kann, deren pH-Wert für die optimale enzymatische Wirksamkeit im Bereich von 4,5-5,0 bei Stärkesubstraten liegt, welche die Eigenschaft besitzt, daß bei der Umsetzung einer ausreichenden Menge derselben mit einem Stärkesubstrat in dem optimalen pH-Bereich und dem optimalen Temperaturbereich der
Tabelle 1
Grad der Hydrolyse der Stärke eine Grenze, bei der die Hydrolyse der Stärke aufhört, erreicht, wobei dann die Stärke zu nicht weniger als 75% in reduzierende Zucker, welche nach dem Somogyi-Titrationsverfahren bestimmt und als Maltose berechnet werden, umgewandelt ist, und weiche die Fähigkeit hat, aus Stärke Glukose und Maitose im Gewichtsverhältnis von nicht mehr als 0,06 :1 zu bilden.
Die für die Herstellung der Amylase gemäß der Erfindung verwendeten Streptomyces-Stämme sind mit einigen ihrer Kenndaten in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Stämme
ATCC-H interlegungsnummer*)
Streptomyces tosaensis SF-1085 21 723
(Dieser Stamm wurde zunächst aus Erde isoliert. Seine Eigenschaften werden nachstehend näher beschrieben.)
Streptomyces hygroscopicus SF-1084 21 722
(Dieser Stamm entspricht Streptomyces hygroscopicus, das in Wakmans »The Actinomycetes« Bd. 2 [1961] und in »Applied Microbiology« Bd. 10, Seiten 258-263 [1962] beschrieben ist.)
Streptomyces viridochromogenes SF-1087 21724
(Dieser Stamm entspricht Streptomyces viridochromogenes, das in Wakmans »The Actinomycetes« Bd. 2 [1961] und im »Journal of Bacteriology« Bd. 85, Seiten 676-690 [1963] beschrieben ist.)
Streptomyces albus SF-1089 21725
(Dieser Stamm entspricht Streptomyces albus, das in Wakmans »The Actinomycetes« Bd. 2 [1961] beschrieben ist.)
In Tabelle 1 bedeutet:
*) ATCC ist eine Abkürzung für American Type Culture Collection, Washington D.C., U.S.A.
Die besonderen enzymatischen Wirksamkeiten und Eigenschaften der neuen Streptomyces-Amylasen, wie sie durch das Verfahren der Erfindung gebildet werden, sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefaßt. Zu Vergleichszwecken sind Eigenschaften bekannter Amylasen aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren ebenfalls in Tabelle 2 erwähnt.
3 Optimaler 21 53 232 Optimale 4 Aktivierung durch:
pH-Wert Tempera f^alpiiiTTi- Chlorid-
Tabelle 2 tur
Amylasequellen der im Grenzen der Gew.-Verhält- (1C) Kation alULFll
Anspruch angegebenen 4,5-5,0 Hydrolyse von nis von gebil 50-60 negativ negativ
Stämme 4,5-5,0 Stärke durch deter Glukose 50-60 negativ negativ
Amylase zu Mal'ose
Streptomyces albus 4,5-5,0 78 0,058: 1 50-60 negativ negativ
Streptomyces 82 0,055 : 1
hygroscopicus 4,5-5,0 50-60 negativ negativ
Streptomyces 79 0,051 : 1
viridochromogenes 5,3-6,8 - negativ positiv
Streptomyces tosaensis 5,5-5,9 79 0,053: 1 - negativ negativ
nov. sp. 4,7-5,8 - positiv negativ
Bacillus subtilis 6,9 70*) 0,71:1 - negativ positiv
Aspergillus oryzae 6,9 48*) 0,64:1 - negativ positiv
Keimende Gerste: 80 -
Schweinepankreas 80 0,024:1
Menschlicher Speichel 80 -
*) Berechnet als Glukose.
Durch Vergleich der Eigenschaften der verschiedenen in Tabelle 2 gezeigten Amylasen erkennt man, daß die neuen Amylasen von den vorstehend genannten vier Streptomyces-Stämmen, wie sie gemäß der Erfindung hergestellt werden, nicht mit bekannten Amylasen Obereinstimmen, insbesondere hinsichtlich ihres optimalen pH-Bereiches, der Grenzen in der Hydrolyse von Stärke, der Aktivierung durch das Calciumkation und das Chloridanion. Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Amylasen aus den besonderen vier Streptomyces-Stämmen eignen sich insbesondere zur Verwendung bei der gewerbsmäßigen Herstellung von Maltose aus Stärke.
Da Streptomyces tosaensis nov. sp. (unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 21 723) ein neuer Mikroorganismus ist, der aus dem Boden von den Erfindern isoliert wurde, werden nachstehend die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stammes im einzelnen beschrieben:
1. Morphologische Eigenschaften
(1) Flüchtiges
Mycelium: Flüchtiges Mycelium wird in synthetischen Kulturmedien wie Glukose-Asparagin-agar, Stärke-synthetisches Agar usw. reichlich gebildet und ist im allgemeinen kurz, monopodial verzweigt Die Enden des flüchtigen Myceliums sind spiralförmig (geschlossen).
(2) Sporen: Die Sporen haben ovale Cu&i ellip
tische bis zylindrische Form. Die Sporengröße beträgt 0,6 - 0,7 Mikron : 0,8 -1,0 Mikron. Die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt
2. Eigenschaften von verschiedenen Kulturmedien
Beobachtungen der Kulturen von Streptomyces tosaensis nov. sp. sind in der nachstehenden Tabelle 3 erfaßt.
Tabelle 3
Kulturmedium
Wachstum Flüchtiges Mycelium
Lösliches Pigment
Rohrzucker - Czapeks Agar
(bebrütet bei 28' C)
Glycerin - Czapeks Agar
(bebrütet bei 28 C)
Krainskys-Glukose-Asparagin-agar
(bebrütet bei 28 C)
Ushinskys-Glukose-Asparagin-agar
(bebrütet bei 28 C)
Calcium-maleat-agar
(bebrütet bei 28 C)
sehr schlechtes Wachstum, farblos
sehr schlechtes Wachstum, farblos
braun bis rötlichbraun gefärbt, die Keime dringen in das Agar
gutes Wachstum, rötlichbraun gefärbt
schlechtes Wachstum, farblos
sehr spärlich, ohne
weiß gefärbt
sehr spärlich,
weiß gefärbt
reichlich grün bis graugrün gefärbt, mit weißgefärbten Flecken
grün bis graugrün gefärbt, mit weiß bis rosa gefärbten
Flecken
spärlich, graugrün gefärbt
ohne
ohne
schwachrötlichbraun gefärbt
ohne
Fortsetzung
Kulturmedium
Wachstum Flüchtiges Mycelium Lösliches Pigment
Glycerin-Calcium-maleat-agar (bebrütet bei 28°C) Synthetischer Stärke-agar (bebrütet bei 28CC)
Gewöhnliches Agar (bebrütet bei 28JC) Nähragar
(bebrütet bei 28 C)
Pepton-Glukose-agar (bebrütet bei 28 C) Tyrosin-agar (bebrütet bei 28 C) Kartoffelschnitzel (bebrütet bei 28 C)
Karottenscheiben (bebrütet bei 28C) Entrahmte Milch (bebrütet bei 37 C)
(bebrütet bei 37 C) Löefflers koaguliertes Serum-medium (bebrütet bei 281C) Czapeks Glukoselösung (bebrütet bei 28 C) Gelatine-medium (bebrütet bei 20' C) Cellulose-medium (bebrütet bei 28 C)
schlechtes Wachstum, cremig gefärbt
gutes Wachstum, braun bis rötlichbraun gefärbt
gelblichbraun gefärbt
gutes Wachstum, schwachbraun gefärbt bei Faltenbildung
helle, gelblichbraune Färbung rötlichbraun gefärbt
erhöht, gutes Wachstum, schwach graue Cremefarbe, jedoch rötlichbraun gefärbt am oberen Teil der Schräge schwache graue Cremefarbe
ringförmiges Wachstum, schwachgelbbraun gefärbt
schlechtes Wachstum, schwachgelb gefärbt
schlechtes Wachstum, schwachgrau gefärbt
ringförmiges Wachstum, Cremefarbe
schwache Cremefarbe spärlich, weiß
gefärbt
reichlich grün bis
grau gefärbt mit
weißen und rosa
Flecken
ohne
spärlich, weiß
gefärbt
ohne
grau gefärbt
ohne
grün bis graugrün
gefärbt
ohne
ohne
ohne
ohne
ohne
ohne ohne
ohne ohne
ohne
rötlichbraun gefärbt
ohne
ohne ohne ohne ohne
ohne ohne
kein Wachstum
3. Physiologische Eigenschaften
Melaminbildung: negativ Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ Bildung von Tyrosinase: negativ Verringerung von Nitrat: positiv Hydrolyse von Stärke: positiv Peptonisierung von entrahmter Milch: positiv
Koagulation von entrahmter Milch: negativ Auflösung von Löefflers
koaguliertem Serum: negativ
Verflüssigung von Gelatine: positiv Hydrolyse von Cellulose: negativ
4. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
(1) Ausnutzung: Xylose, Glukose, Galaktose, Maltose, Lactose, Raf finose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Natriumacetat, Natriumeitrat, Natriumsuccinat, Salicin und Mannose.
(2) Zweifel an Ausnutzung bei: Arabinose und Saccharose.
(3) Keine Ausnutzung: Rhamnose, Fructose, Inulin, Dulcit. Sorbit, Inosit und Cellulose.
Die vorstehend erwähnten mikrobiologischen Eigenschaften des neuen Mikroorganismus, Streptomyces tosaensis nov. sp. können wie folgt zusammengefaßt werden. Das flüchtige Mycelium bildet eine Anzahl vor Spiralen und die Oberflächenstruktur der Sporen isl glatt. Bei synthetischen Kulturmedien wird ein grün- bis graugrüngefärbtes flüchtiges Mycelium auf einen* braun- bis rötlichbraungefärbten Untergrund gebildet ohne daß lösliches Pigment gebildet wird. Andererseits erhält man auf organischen Kulturmedien gelblich braun- bis rötlichbraungefärbtes Wachstum, jedoch nui in geringen Mengen mit der Ausnahme, daß au Karottenschnitzeln grüngefärbtes Wachstum beobach tet werden kann. Lösliches Pigment wird im allgemei nen nicht gebildet mit der Ausnahme, daß eil rötlichbraungefärbtes lösliches Pigment auf Tyrosin Agar-Medium gebildet wird. Das bedeutet, daß diese: Stamm nicht chromogen ist.
Der Stamm ist im wesentlichen dadurch gekennzeich net, daß er nicht chromogen ist und grüngefärbte flüchtiges Mycelium bildet. Bei bekannten Arten voi Mikroorganismen mit ähnlichen mikrobiologische] Eigenschaften, wie sie in Waksmans »The Actino mycetes« Band 2 (1961) beschrieben sind, sind beson
ders Streptomyces prasinus, Streptomyces hirsutus, Streptomyces prasinopilosus, Streptomyces viridans, Streptomyces alboviridis, Streptomyces viridis und Streptomyces glaucus Stämme, die dem neuen Mikroorganismus Streptomyces tosaensis nov. sp. sehr ähnlich sind. Der neue Mikroorganismus kann jedoch, wie nachstehend beschrieben, von den bekannten Arten unterschieden werden.
(1) Die Oberflächenstruktur der Sporen von Streptomyces prasinus und Streptomyces hirsutus sind aiachelig, während die von Streptomyces tosaensis nov. sp. glatt sind.
(2) Die Oberflächenstruktur der Sporen von Streptomyces prasinopilosus ist haarig, während die von Streptomyces tosaensis nov. sp. glatt ist. '5
(3) Streptomyces viridans zeigt grünes bis olivgrüngefärbtes Wachstum auf Czapeks Glycerin-agar und bildet ein grün- bis oüvgrüngefärbtes lösliches Pigment sowohl auf Czapeks Glycerin-agar als auch auf Kartoffelschnitzeln, während Streptomyces tosaensis nov. sp. ein braun- bis rötlichbraungefärbtes Wachstum auf Agarmedium bildet, jedoch auf Kartoffelschnitzeln kein lösliches Pigment ergibt.
(4) Streptomyces alboviridis liefert gelbgefärbtes lösliches Pigment auf Glukose-Asparagin-agar und grünbraungefärbtes lösliches Pigment auf Gelatinemedium, führt zum Dunkelwerden von Kartoffelschnitzeln und zum Gerinnen von entrahmter Milch. Demgegenüber erhält man aus Streptomyces tosaensis nov. sp. weder auf Glukose-Asparagin-agar noch auf Gelatinemedium ein lösliches Pigment. Es werden auch Kartoffelschnitzel dadurch nicht dunkel und entrahmte Milch koaguliert nicht.
(5) Streptomyces viridis bildet keine Spiralen, zeigt jedoch ein grüngefärbtes Wachstum auf verschiedenen Agarmedien und sein flüchtiges Mycelium ist üblicherweise graugefärbt Demgegenüber bildet Streptomyces tosaensis nov. sp. viele Spiralen und zeigt ein braun- bis rötlichbraungefärbtes Wachstum auf verschiedenen Agarmedien und sein flüchtiges Mycelium ist grün- bis graugrüngefärbt.
(6) Streptomyces glaucus bildet braungefärbtes lösliches Pigment auf Czapeks Rohrzucker-agar, bildet grüngefärbtes flüchtiges Mycelium auf Nähragar und Kartoffelschnitzel und zeigt ein gutes Wachstum auf einem Cellulosemedium. Demgegenüber bildet Streptomyces tosaensis nov. sp. kein lösliches Pigment auf Czapeks Rohrzucker-agar, bildet nur wenig flüchtiges Mycelium auf einem Nähragar und Kartoffelschnitzeln und zeigt auf Cellulosemedium kein Wachstum.
Unter den bekannten Stämmen, die zur Gattung Streptomyces gehören, gibt es nur wenige Mikroorganismen, die nicht chromogen sind, jedoch grUngefärbtes flüchtiges Mycelium bilden, ähnlich wie der Mikroorganismus Streptomyces tosaensis nov. sp. Bei dem vorstehenden Vergleich zwischen den bekannten Stämmen und dem Mikroorganismus Streptomyces tosaensis nov. sp. befindet sich kein Stamm, der mit dem Mikroorganismus Streptomyces tosaensis nov. sp. genau übereinstimmt. Man muß daher annehmen, daß Streptomyces tosaensis nov. sp. eine neue Gattung (,5 darstellt Aus diesem Grunde wurde der neue Mikroorganismus als Streptomyces tosaensis bezeichnet. Dieser Stamm wurde von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert, die in Kouchi-perfecture, Japan, gesammelt wurde.
Das Herstellungsmedium für die Züchtung eines Stammes von Streptomyces gemäß der Erfindung kann eine oder mehrere Stärkearten enthalten, auch lösliche Stärke, Glukose, Roggenmehl usw., die als Kohlenstoffquellen dienen und eine oder mehrere der nachstehend aufgeführten Stickstoff quellen: entfettetes Sojabohnenmehl, entfettetes Baumwollsamenmehl, Weizenkeime, Erdnußmehl, Fermentmedium, Fischmehl, getrocknete Hefe, entrahmte Milch, Kasein, Malzextrakt, Hefeextrakt, Natriumnitrat oder Kaliumnitrat usw. Darüber hinaus ist es möglich, in das Kulturmedium eines oder mehrere anorganische Salze einzubringen, wie Kaliumdihydrogcnphcsphat, Magnesiumsulfat, Msngar.sulfat, . Eisen(ll!)-Sis!fat oder Calciumcarbonat usw. und außerdem auch Spurenelemente, um das Wachstum des Mikroorganismus zu fördern und die Bildung des Enzyms, wenn erforderlich, zu erhöhen.
Beim Verfahren der Erfindung kann die Züchtung des Streptomyces-Stammes in bekannter Weise durchgeführt werden unter geeigneten Zuchtbedingungen, wie sie üblicherweise zur Züchtung von Streptomyces verwendet werden. So ist es möglich, entweder in einem flüssigen oder einem festen Medium zu züchten, um die neue Amylase zu bilden und in einem flüssigen oder festen Kulturmedium anzusammeln. Es wird jedoch vorgezogen, eine Flüssigkeitszüchtung, insbesondere eine Flüssigkeitszüchtung unter aerobischen Bedingungen in der Flüssigkeit durchzuführen. Wenn einer der vorstehend erwähnten Stämme von Streptomyces bei einer Temperatur von 25—37° C und bei einem pH-Wert im Bereich eines schwachen Säuregrades bis zu einer schwachen Alkalinität unter aerobischen Bedingungen in der Flüssigkeit bei Belüftung und Bewegung bebrütet wird, erreicht die Bildung der neuen Amylase ein Maximum bei 3 bis 5 Tagen Brutzeit
Das Kulturmedium oder die Kulturbrühe, in dem der Streptomaces-Stamm bebrütet worden ist, wird direkt als amylasehaltiges Enzympräparat verwendet, gegebenenfalls kann eine in bekannter Weise durchzuführende Behandlung angeschlossen werden, um die neue Amylase daraus zu gewinnen. So kann zum Beispiel die Kulturbrühe filtriert werden, um den Mycelkuchen abzutrennen, wobei das anfallende Filtrat anschließend behandelt werden kann entweder nach einem Aussalzverfahren durch Zugabe eines wasserlöslichen anorganischen Salzes wie Ammoniumsulfat usw. oder nach einem Ausfällungsverfahren durch Zugabe eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels wie Äthanol, Methanol, Isopropanol, Aceton usw. oder durch ein Adsorptions-Eluierungsverfahren unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes usw. Die neue Amylase kann auf diese Weise aus dem bebrüteten Kulturmedium abgetrennt werden. Die so abgetrennte neue Amylase kann durch Sprühtrocknen, Heißlufttrocknen, Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen oder Lyophilisieren weiterbehandelt werden, um eine rohe Pulvermasse der neuen Amylase zu erhalten.
Die rohe Amylase kann auf eine Weise gereinigt werden, wie sie für die Reinigung von Enzymen bekannt ist. Ein elektrophoretisch homogenes und reines Produkt der neuen Amylase kann durch Reinigen des vorstehend beschriebenen rohen Pulvers der neuen Amylase durch folgendes Reinigungsverfahren erhalten werden. Die Kulturbrühe, in der die flüssige Zucht des Streptomyces durchgeführt worden ist, wird nitriert und man erhält ein Kulturfiltrat (151), zu dem Äthanol bis zu
ίο
einer Äthanolkonzentration von 60 Vol.-% zugegeben wird, um einen Niederschlag zu erhalten. Dieser Niederschlag wird gereinigt und getrocknet und man erhält ein Pulver (100 g), das mit 21 Leitungswasser zur Extraktion behandelt wird. Die Mischung wird filtriert und man erhält ein Filtrat und einen Extraktionsrückstand, der verworfen wird. Das Filtrat wird mit Calciumacetat (44 g) versetzt und die Mischung filtriert und man erhält ein Filtrat und einen Niederschlag, der verworfen wird. Das Filtrat wird mit Ammoniumsulfat ι ο zu 30% gesättigt und die Mischung dann filtriert, um ein weiteres Filtrat vom Niederschlag zu trennen. Dieses Filtrat wird wiederum zu 70% mit Ammoniumsulfat gesättigt, um einen Niederschlag zu erhalten. Dieser Niederschlag wird in 260 ml Leitungswasser eingegeben und gegen einen fließenden Strom Leitungswasser dialysiert Die dialysierte Lösung wird durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt und anschließend lyophilisiert. Das lyophilisierte pulverförmige Produkt (1,21 gj wird dann chromatographisch in einer Kolonne mit DÄAÄ-Dextrangel, das durch Epichlorhydrin vernetzt ist (Kolonnenkapazität: 4,8 cm χ 54 cm), behandelt Das chromatographische Trennverfahren wird durchgeführt, indem eine wäßrige Lösung von 700 mg des lyophilisierten Pulvers auf die Kolonne gebracht wird, die durch Zugabe einer Pufferlösung aus M/200 Tris-hydroxymethylaminomethan und Salzsäure zusammen mit M/1000 Calcium (pH 8,5) abgepuffert ist und anschließend dann die Kolonne zunächst mit der gleichen Pufferlösung eluiert wird. Danach wird w nochmals mit der gleichen Pufferlösung eluiert, jedoch enthält diese 0,05 M Natriumchlorid. Zum Schluß wird mit der gleichen Pufferlösung nochmals eluiert, die jedoch 0,1 M Natriumchlorid enthält. Die wirksamen Fraktionen, die eine hohe Konzentration an der neuen r> A my läse enthalten, werden aus dem Eluat gesammelt und miteinander vereint (440 ml). Die vereinten Fraktionen werden dann durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt und das gebildete Konzentrat gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert Man erhält ein lyophilisiertes Produkt (61 mg). Dieses lyophilisierte Produkt wird erneut in einer Kolonne mit dem obigen Dextrangel behandelt
Tabelle 4
(Kolonnenkapazität: 1,15 cm χ 33 cm), indem eine wäßrige Lösung von 45 mg des lyophilisierten Produktes auf die Kolonne gebracht wird und die Kolonne zunächst mit einer Pufferlösung eluiert wird, die aus M/200 Tris-hydroxymethylaminomethan und Salzsäure besteht (pH 8,5). Anschließend wird mit einer wäßrigen Lösung von 0,05 M Natriumchlorid und danach mit einer wäßrigen Lösung von 0,1 M Natriumchlorid eluiert. Aktive Fraktionen mit einer hohen Konzentration an der neuen Amylase werden aus dem Eluat vereint. Die vereinten Fraktionen (40 ml) werden durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt und das gebildete Konzentrat gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um ein lyophilisiertes Produkt (24 mg) zu erhalten, das aus einem elektrophoretisch homogenen und reinen Produkt der neuen Amylase besteht.
Daß dieses lyophilisierte Produkt der neuen Amylase eine einheitliche und reine Substanz ist, wird bei Durchführung der Elektrophorese mit Celluloseacetatgel in der nachstehend erwähnten Weise bestätigt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von Celluloseacetatgel durchgeführt, das mit einer Pufferlösung gesättigt war, die aus Tris-hydroxymethylaminomethan und Salzsäure (pH 8,7; 0,05 μ) bestand, wobei ein elektrischer Strom von 0,6 mA/cm 65 Minuten hindurchgeführt wurde und das enzymatische Protein mit Schwartz-Aminolösung gefärbt wurde. Es wurde gefunden, daß die Probe 2,2 cm gegen den positiven Pol wanderte und ein einheitliches Band ergab.
Eigenschaften der neuen Amylase, die aus der Kultur des Streptomyces hygroscopicus erhalten und nach dem vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren gereinigt wurden, sind nachstehend im einzelnen beschrieben.
1. Enzymatische Wirkung
Wenn ein reines Produkt dieser neuen Amylase des Streptomyces hygroscopicus mit Stärke bzw. Amylose umgesetzt wird, werden die Kohlehydrate wirksam hydrolysiert und man erhält eine geringe Menge Glukose und eine erheblich größere Menge Maltose, wie nachstehend gezeigt wird.
Substrat
Hydrolysegrad*) Relative Mengen an Zuckerprodukten**)
Glukose Maltose
Oligomalzzucker
Stärke
Amylose
74,8%
78,6%
3,2 %
0
58,2 %
62,8 %
38,6%
34,9 %
Mit Bezug auf Tabelle 4:
*) »Der Grad der Hydrolyse« wurde bestimmt, indem die Amylase mit dem Substrat bei einem pH-Wert von 5,5-5,8 bei 50 C 20 Stunden bei einei Substratkonzentration von 1 % umgesetzt wurde (die Amylase war so bemessen, daß 500 verzuckernde Einheiten je Gramm des Substrats vorlagen), sodann die Gesamtmenge des gebildeten reduzierenden Zuckers nach dem Tilrationsverfahrcn von Somogyi bestimmt, die bestimmte Gesamtmenge der reduzierenden Zucker als Maltose berechnet und dann der »Grad der Hydrolyse« nach folgender Gleichung bestimmt wurde:
»Grad der Hydrolyse«
Gesamtmenge der gebildelen reduzierenden Zucker, berechne! als Mallose
Stärkcmcngc, berechnet uls Maltose '
wobei »der Anteil der als Maltose berechneten Stärke« durch vollständige Hydrolyse des Substrats bestimmt wurde, indem dieses mit einer ausreichenden Menge von 2N-Salzsäure auf einem kochenden Wasserbad erhitzt wurde, die Reaktionsmischung mit Natronlauge neutralisiert, der Anteil der gebildeten Glukose nach dem Titrationsverfahren von Somogyi bestimmt und anschließend die bestimmte Menge der Glukose als Maltose berechnet wurde, d. h. ein Produkt der gemessenen Menge Glukose durch 0,95 als »Anteil der berechneten Stärke als Maltose« entwickelt wurde.
♦*) »Relative Mengen von Zuckerprodukten« wurden bestimmt durch Fraktionierung des hydrolysicrten Produkts des Substrats in einem chromatographischen Verfahren, petrennte Bestimmung der Anteile jcdci isolierten Zuckerkomponente und Beschreibung der Anteile davon in Gew.-%.
12
2. Spezifisches Substrat
Wenn ein gereinigtes Produkt der neuen Amylase des Streptomyces hygroscopicus mit verschiedenen Substraten umgesetzl: wird, wie nachstehend gezeigt wird, werden die in Tabelle 5 angegebenen Ergebnisse erhalten:
Tabelle S
Substrate
Grad der
Verzuckerung*)
Gebildete Zucker**)
Gi G2
G4
G5
Lösliche Stärke 100%
Maisstärke 92,8 %
Glykogen 45,8 %
Amylose 106,5%
Dextrin 91,0%
jö-Cyclodextrin
»-Cyclodextrin
Maltohexaose
Maltopentaose
Maltotetraose
Maltotriose
Maltose
Phenyl-a-D-glucosid
Mit Bezug auf Tabelle 5:
*) »Der Grad der Verzuckerung« wurde bestimmt auf eine Weise, daß der »Grad der Hydrolyse« der löslichen Stärke durch die Wirkung einer gegebenen Menge der gereinigten neuen Amylse als 10 ι % angenommen wurde.
**) »Gebildete Zucker« wurden analysiert durch Ermittlung des Vorliegens der entsprechenden Zucker durch Papierchromatographie nach Umsetzung des Enzyms mit dem Substrat bei einem pH-Wert von 5,5 bei einer Substratkonzentration von 0,8 und einer Enzyrnkonzentration von 0,00017 % bei 40 C für 60 Minuten.
In Tabelle 5 bedeuten die Buchstaben Gi, Gi, Gi, G4 und G5 jeweils Glukose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und Maltopentaose. Die Zeichen haben folgende Bedeutung:
+++: Es liegt eine sehr große Zuckermenge vor.
++: Es liegt eine große Zuckermenge vor.
+ : Es liegt eine bedeutende Zuckermenge vor.
+: Es liegen Spuren von Zucker vor.
-: Es läßt sich kein Zucker feststellen.
Die neue Amylase gemäß der Erfindung wurde in
gleicher Weise mit dem anderen Substrat Glukan umgesetzt wie Laminaran (Araban j9-l,3 : /3-1,6 = 7 :3), Pachyman (j3-l,3) und Dextran (λ-1,6) und es wurde dann gefunden, daß dieses Glukan durch die Einwirkung der neuen Amylase gemäß der Erfindung nicht hydrolysiert werden konnte.
Eigenschaften
Wen
pH-Stabilität
3. Optimaler pH-Bereich, stabiler pH-Wert
und andere Eigenschaften
Die neue, reine Amylase aus Streptomyces hygroscopicus ATCC 21 722 hat einen optimalen pH-Bereich, eine pH-Stabilität, eine optimale Temperatur und thermische Stabilität, ein Molekulargewicht und andere enzym-chemische und physikalische sowie chemische Eigenschaften, wie sie in der nachstehenden Tabelle 6 zusammengestellt und graphisch in den Fig. t bis 5 der Zeichnungen dargestellt sind:
Tabelle 6
Eigenschaften
Wert
Optimaler pH-Wert 4,5-5,0
für die Aktivität
Optimale Temperatur 50-60 C."
für die Aklivitiit
Thermische Stabilität
Spezifische Aktivität
Elemcnlar-Analysc
Molekulargewicht
Ultraviolett-Absorption
die enzymatische Restaklivität ist nicht geringer als 90% der Anfangsaktivität nach Behandlung des Enzyms bei 40 C Tür 60Minuten bei einem pH-Wert von 4,5-9,8.
die enzymatische Restaktivitäl betrügt mindestens 50% nach Behandlung des Enzyms bei einem pH-Wert von 6,8 bei 30 (.'-95 (." für 15 Minuten. Verflüssigungspotcnz:
23 ΙΟΟμ/rngN
Verzuckerungspotenz:
59 600 μ/mg N
C 44,87%, H 6,84%,
N 13,84%
etwa 35,000 (bestimmt durch Gelfiltration)
E!'.': = 13,1
(pH = 6,8)
bei 280 ιημ
Fortsetzung
Eigenschaften
Wert
Isoelektrischer Punkt
Elektrophorese
(in Cellulose-Acetat-
etwa pH 4,3 (gemessen durch isoelektrische Punkttlektrophorese)
Wanderung von 2,2 cm gegen den positiven Pol für 65 Minuten durch einen elektrischen Strom von 0,8 mA/cm, gepuffert bei pH 8,7 durch Tris-Salzsäure-Pufferlösung (μ =0,05).
Mit Bezug auf die Zeichnungen:
F i g. 1 zeigt die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amylase, die aus dem Streptomyces hygroscopicus ATCC 21722 hergestellt wird, bei verschiedenen pH-Werten.
Die Bestimmungsbedingungen: Die enzymatische Wirksamkeit wurde gemessen als Verzuckerungswirksamkeit unter solchen Bedingungen, daß die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 2-3 mit 0,1M Natriumacetat-Salzsäure-Pufferlösung, auf einen pH-Wert von 3,5-6,0 mit 0,1 M Acetat-Pufferlösung und auf einen pH-Wert von 6,5-8,0 mit 0,1M Phosphorsäure-Natriumphosphat-Pufferlösung eingestellt wurde.
Fig.2 zeigt eine Kurve der pH-Stabilität der enzymatischen Wirksamkeit der neuen Amylase, die nach der vorliegenden Erfindung mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird.
Die Behandlungsbedingungen: Die enzymatische Wirksamkeit wird als Verzuckerungswirksamkeit gemessen, die bestimmt wurde, nachdem das Enzym bei verschiedenen pH-Werten 60 Minuten bei 40° C gehalten und die Reaktionsmischung anschließend auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt wurde.
F i g. 3 zeigt eine Kurve der Temperaturabhängigkeit der enzymatischen Wirksamkeit der neuen Amylase, die mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird.
Die Bestimmungsbedingungen: Die enzymatische
b Wirksamkeit wurde als Verzuckerungswirksamkeit des Enzyms in für Amylase üblicher Weise bestimmt, während das Enzym bei verschiedenen Temperaturen gehalten wurde.
F i g. 4 zeigt eine Kurve der Temperaturstabilität der ίο enzymatischen Wirksamkeit der neuen Amylase, die mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird.
Die Behandlungsbedingungen: Die enzymatische Wirksamkeit wurde als Verzuckerungswirksamkeit gemessen, die unmittelbar, nachdem das Enzym bei verschiedenen Temperaturen 15 Minuten bei einem pH-Wert von 6,8 gehalten und danach auf Raumtemperatur gekühlt worden war, bestimmt wurde.
Fig.5 zeigt eine Kurve des Ultra-Violett-Absorptionsspektrums der neuen Amylase, die mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird.
4. pH-Bedingungen, Temperatur und andere Faktoren für die Inaktivierung
(a) Wenn die neue Amylase, die mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird, bei einem pH-Wert von nicht unter 11 bei 5O0C 60 Minuten behandelt wird, kann sie inaktiviert werden.
(b) Wenn diese neue Amylase bei einem pH-Wert von 10 30 Minuten bei 90° C behandelt wird, kann sie
jo inaktiviert werden.
5. Inhibitoren
Die nachstehende Tabelle 7 faßt die Wirkungen verschiedener Inhibitoren, anorganischer Salze und anderer chemischer Stoffe auf die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amylase zusammen, die gemäß der Erfindung mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird.
Tabelle 7
Wirkungen von Inhibitoren, anorganischen Salzen und anderen chemischen Stoffen auf die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amylase
Reagenz
Restverflüssigungsaktivität des Enzyms
Konzentration des % der Anfangs-
Reagenz aktivität
Restverzuckerungsaktivität des Enzyms
Konzentration des % der An
Reagenz fangsaktivität
Anorganische Metallsalze 10"2M 97,6
Bariumchlorid 10"2M 97,6
Calciumchlorid 10"2M 95,5
Kobaltchlorid 10"2M 95,5
Chromchlorid 10"2M 102,3
Eisen(II)-Sulfat 10"2M weniger als 6
Quecksilber(I)-Chlorid 10"2M 91,3
Quecksilber(II)-Chlorid 10"2M 100
Kaliumbromid 10"2M 102,3
Lithiumchlorid 10"2M 100
Magnesiumsulfat 10"2M 93,4
Manganchlorid 10"2M 93,4
Natriumchlorid 10"2M 91,3
Nickelchlorid 10"2M X
Zinn(II)-chlorid
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
10"2M
109,8
103,9 99,7 94,8
100 0 87,1
100 96,9 95,1 88,6 95,1 94,3 8,2
Fortsetzung
Rsagenz
Restverflüssigungsaklivitäl des Enzyms
Konzentration des % der Anfangs-
Reagenz aktivität
RestverzuckerungsaklivitiU des Enzyms
Konzentration des % der An
Reagenz fangsaktivität
Anorganische Metallsalze 10"2M bei pH 95,5 10"2M bei pH 105,2
Strontiumchlorid 10"2M C 60 Minuten 85,8 10"2M C 60 Minuten 89,9
Zinksulfat 10"2M 105,9 10"2M 93,4
Ammoniummolybdat wie oben wie oben
Organische Reagenzien 10"2M M 97,6 10"2M M 96,9
Natriumoxalat 10"2M wie oben 96,5 10"2M 97,0
Monojodessigsäure 10"2M X 10"2M 107,4
L-Ascorbinsäure 10"4M 98,6 10"4M 96,6
Cystin-hydrochlorid 10"2M 101,0 10"2M 95,8
Harnstoff 20% 65,7 20% 51,8
Äthanol 10% 98,9 10% 86,3
Äthanol 10"3M 98,6 ΙΟ"2 Μ 95,1
Anilin 10"4M 101,0 10"4M 95,1
Glutathion (reduziert) 0,001 % 95,8 0,001 91,4
Amylase-Inhibitor 0,1 M 94,9 0,1 M 108,5
Äthylendiamintetra- behandelt behandelt
Essigsäure 6,7 bei 30 6,7 bei 30
10"3 M 94,9 10"3M 112,0
o-Phenanthrolin behandelt behandelt
2,5 X 10"4 100,0 2,5 x 10"4 93,0
Quecksilber-Chlorbenzoat behandelt
(PCMB)
Antibiotika 10"2M 80,1 10"2M x')
Nojirimycin 10"4M 101,0 10"4M 96,5
Kanamycinsulfat
Penicillin G 10"4M 101,0 10"4M 96,5
Kaliumsalz 10"4M 101,0 10"4M 92,5
Chloramphenicol 10"4M 101,0 10"4M 95,6
Chlortetracyclin-
hydrochlorid
') Kein Test durchgeführt.
6. Bestimmung der enzymatischen Wirksamkeit
Die enzymatische Wirksamkeit der neuen Amylase, die mit dem Streptomyces hygroscopicus hergestellt wird, ist in den vorstehenden Tabellen 4,5 und 6 gezeigt. Das Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Wirksamkeit und das Verfahren zur Darstellung der Wirkung der neuen Amylase werden nachstehend beschrieben.
(A) Bestimmung der Wirksamkeit von
verzuckernder Stärke
2 ml einer wäßrigen Lösung von 2%iger löslicher Stärke, 2 ml Mclllvaines Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 und 1 ml einer wäßrigen Lösung des Enzyms werden zusammengemischt und die entstehende Mischung 3 Minuten auf 40° erhitzt, um die hydrolytische Umsetzung der Stärke zu erreichen. Danach wird 1 ml der Reaktionsmischung entnommen und zu dem kupf erhaltigen Reagenz beim Titrationsverfahren von S ο m ο g y i hinzugegeben, um die Umsetzung zu stoppen. Der Anteil des gebildeten reduzierenden Zuckers in 1 ml der Reaktionsmischung wird nach dem Titrationsverfahren von Somo'gyi bestimmt.
Der Anteil der gebildeten reduzierenden Zucker, die in 5 ml der Reaktionsmischung vorliegen, wird auf diese Weise berechnet und als Maltoseäquivalent ausgedrückt, wobei unterstellt wird, daß die gesamten vorliegenden reduzierenden Zucker im wesentlichen aus Maltose bestehen.
(B) Darstellung der Wirksamkeit von
verzuckernder Stärke
55 Die Kraft der neuen Amylase wird als verzuckernde Wirksamkeit von Stärke ausgedrückt, wie sie auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt wurde, wobei vorausgesetzt wird, daß eine derartige Enzymmenge, die 1 mg Maltose auf 5 ml der Reaktionsmischung freigibt, wenn sie 60 Minuten auf die vorstehend beschriebene Weise umgesetzt wird, einer Einheit der neuen Amylase äquivalent ist.
(C) Elestimmung der Wirksamkeit von
verflüssigender Stärke
5 ml einer wäßrigen Lösung von 2%iger löslicher Stärke (die darüber hinaus 10 ml IM Acetatpufferlö-
sung mit einem pH-Wert von 5,5 auf 100 ml enthält), 0,5 ml 1 M Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5,1,5 ml destilliertes Wasser und 0,5 ml einer wäßrigen Lösung des Enzyms werden zusammengemischt und die gebildete Mischung auf 300C erwärmt, um die hydrolytische Umsetzung der Stärke zu erreichen. Nach einer vorbestimmten Reaktionszeit werden 0,2 ml der Reaktionsmischung entnommen und zu 2 ml einer Jodlösung (die durch Auflösen von 88 mg elementarem Jod und 44 g Kaliumiodid je 1 destilliertes Wasser hergestellt wird) gegeben. Die Farbe der so behandelten Jodlösung wird mit einer Standardfarbe einer Lösung verglichen (die durch Mischen von 1 Volumenteil einer Lösung von 25 g FeCl3 · 6 H2O in 50 ml 2%iger Salzsäure mit 9 Volumenteilen einer Lösung von 25 g CoCl2 · 6 H2O in 50 ml 2%iger Salzsäure erhalten wurde). Es wird dann die Reaktionszeit der Reaktionsmischung in Minuten bestimmt, die erforderlich ist, um die Farbe der vorstehend beschriebenen behandelten Jodlösung identisch mit der Farbe der beschriebenen Standardlösung zu machen. Die Lösung des geprüften Enzyms wird reihenmäßig mit einem Faktor π verdünnt auf eine solchen VerdUnnungsgrad, bei dem die Reaktionszeit der Reaktionsmischung, die erforderlich ist, um die Farbe der behandelten Jodlösung gleich der Standardfarbe zu machen, weniger als 5 Minuten beträgt
(D) Darstellung der Wirksamkeit der
verflüssigenden Stärke
Die Wirksamkeit der neuen Amylase kann auch als Wirksamkeit der verflüssigenden Stärke, wie sie nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt wurde und mit Hilfe des Wertes von Wohlgemuth ausgedrückt werden, der durch folgende Gleichung berechnet wird:
W. V. = 4- ■ η ■ 400 ,
in der T die vorstehend beschriebene Reaktionszeit (in Minuten) der Reaktionsmischung bedeutet, die erforderlich ist, um die vorstehend beschriebene behandelte Jodlösung in der Farbe der Standardfarbe anzupassen, π bedeutet den Verclünnungsfaktor, bei dem die Lösung des geprüften Enzyms verdünnt worden ist Die Wirksamkeit wird dann ausgedrückt, vorausgesetzt, daß 1 W.V. einer Einheit der neuen Amylase äquivalent ist als Wirksamkeit von verflüssigender Stärke.
Die Herstellung der neuen Amylase kann verbessert werden, wenn die bekannten Bedingungen für die Züchtung von Streptomyces, wie nachstehend beschrieben, modifiziert werden.
(a) Die Zusammensetzung des Kulturmediums, das zum Züchten des Streptomyces hygroscopicus zur Herstellung der neuen Amylase verwendet wurde, wurde in verschiedener Weise modifiziert Zur Züchtung des Streptomyces hygroscopicus wurde zunächst ein Kulturmedium folgender Zusammensetzung verwendet: 1% entfettetes Sojabohnenmehl, 3% lösliche Stärke und 0,2% KH2PO4, wobei das Gewichtsverhältnis von Kohlenstoffgehalt zu Stickstoffgehalt etwa 13,5 betrug. Es wurden dann Kulturmedien verschiedener Zusammensetzungen verwendet wie sie nachstehend beschrieben werden, wobei das C/N-Verhältnis auf verschiedene Werte im Bereich von 1 bis 100 eingestellt wurde. Die enzymatische Wirksamkeit der Kulturfiltrate, die aus diesen Kulturmedien erhalten wurden, wurde bei den verschiedenen Zusammensetzungen bestimmt Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Kulturfiltrate
jo einen maximalen Wert für die enzymatische Wirksamkeit haben, wenn das C/N-Verhältnis des verwendeten Kulturmediums bei 20 liegt und daß der Maximalwert der enzymatischen Wirksamkeit etwa das Zweifache des Wertes der enzymatischen Wirksamkeit beträgt die
Μ erhalten wird, wenn ein Kulturmedium mit einem C/N-Verhältnis von 13,5 verwendet wird. Der Einfluß des C/N-Verhältnisses auf das Kulturmedium bei der Herstellung der neuen Amylase durch Züchtung von Streptomyces hygroscopicus läßt sich aus den Testergebnissen erkennen, die in der nachstehenden Tabelle 8 zusammengefaßt sind.
Tabelle 8 Anteil von entfette Anteil löslicher Kohlenstoffgehalt Stickstoffgehalt Index der enzymeti-
C/N-Verhältnis tem Sojabohnenmehl Stärke im Kultur im Kultur im Kultur schen Aktivität im
im Kultur im Kulturmedium medium medium medium Kulturfiltrat
medium 1 0,01 0,079 0,079 4,2
1 1 1,1 0,47 0,079 30,4
5 1 2,0 0,77 0,078 52,8
10 1 4,2 4,14 0,208 100,0
20 1 6,4 2,23 0,075 49,2
30 0,23 2,0 0,72 0,018 12,7
40 1 13,1 4,20 0,070 3,3
60 1 21,9 6,49 0,065 0
100
Die vorstehend erwähnten Testergebnisse von Tabelle 8 wurden in folgendem Prüfungsverfahren erhalten: Jedes der Kulturmedien der verschiedenen Zusammensetzungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, wurde mit 0,2% KH2PO4 versetzt und 30-ml-Portionen dieser Kulturmedien wurden in konische Flaschen von 100 ml eingegeben und auf einen pH-Wert von 7,0-7,2 eingestellt. Der Inhalt der Flaschen wurde dann 15 Minuten auf 121°C erhitzt, um sterile Kulturmedien zu erhalten. Gleichzeitig wurde Streptomyces hygroscopicus zu einem Impfmedium gegeben, das 2% Stärke, 1% Pepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte. Das Medium wurde
dann einer Schüttelkultur 24 Stunden bei 280C unterworfen, um eine Samenkultur zu erhalten. Diese Samenkultur wurde dann in einer Konzentration von 3% jedem der vorstehend genannten sterilen Kulturmedien eingeimpft Diese beimpften Kulturmedien wurden anschließend 90 Stunden bei 28° C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet. Nach dieser Bebrütung wurde die enzymatische Wirksamkeit der Kulturfiltrate bestimmt
(b) Es wurde auch beobachtet, wie die Konzentrationen der Kohlenstoffquellen und Stickstoff quellen in dem Kulturmedium mit einem C/N-Verhältnis von 20 die Herstellung der neuen Amylase durch Züchtung des
Streptomyces hygroscopicuj beeinflussen. Es wurde festgestellt, daß das Kulturfiltrat eine maximale enzymatische Wirksamkeit hat, wenn der Kohlenstoffgehalt (C-Gew.-%) des Produktionsmediums im Bereich von 2-6 und der Stickstoffgehalt (N-Gew.-%) des ProQuktionsmediums im Bereich von 0,1 —03 liegt Der Einfluß der Konzentration der Stickstoffquellen im Herstellungsmedium mit einem C/N-Verhältnis von 20 auf die Bildung der neuen Amylase durch Züchtung des Streptomyces hygroscopicus kann aus den Versuchsergebnissen ersehen, die in der nachstehenden Tabelle 9 zusammengefaßt sind.
Tabelle ' Anteil an zugefügtem
entfettetem Soja
bohnenmehl
9 0,24
Stickstoffquellen 0,47
N% 1,0
0,019 2,0
0,037 3,0
0,076 5,0
0,145 10,0
0,208
0,317
0,525
Kohlenstoffquellen
C% Anteil zugegebener
löslicher Stärke
Index der
enzymatischen
Aktivität
0,356 1,0
0,738 2,0
1,520 4,2
2,885 8,4
4,138 12,7
6,325 21,1
!0,503 42,3
19
25
60
86
100
57
37
(c) Der Einfluß der Konzentration der Stickstoffquellen in Kulturmedien mit einem C/N-Verhältnis von 20 auf die Bildung der neuen Amylase durch Züchtung von Streptomyces hygroscopicus kann auch aus den j> Versuchsergebnissen erkannt werden, die in der nachstehenden Tabelle 10 zusammengefaßt sind.
Tabelle I 0 Anteil der zugesetzten Stickstol'l'quellen Anteil an zugesetztem Index der
Kohlenstoffquellen löslichen Stärke N% entfettetem Soja
bohnenmehl		 enzymatischen
C% 1 0,24 Aktivität des
Kulturfiltrats
2 0,019 0,47 19
0,356 4,2 0,037 1,0 25
0,738 8,4 0,076 2,0 60
1,5/0 12,7 0,208 3,0 100
4,138 42,3 0,317 10,0 57
6,325 0,525 37
10,503
Die Versuchsergebnisse der Tabelle 9 und 10 wurden erhalten, indem die Versuche in gleicher Weise wie die Testverfahren durchgeführt wurden, nach denen die Versuchsergebnisse von Tabelle 8 erhalten wurden, wobei die Anteile der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die zugegeben wurden, in den Tabellen 9 und 10 angegeben sind.
Aus den Versuchen wurde ermittelt, daß die optimale Zusammensetzung der Herstellungsmedien für die Züchtung des Streptomyces hygroscopicus zur Herstellung und Anhäufung der neuen Amylase bei einem C/N-Verhältnis in der Nähe von 20 liegt, wobei die Kohlenstoffquellen bei einer Konzentration von 2 — 6%
berechnet als %C und die Stickstoffquellen bei einer Konzentration von 0,1 —0,3% berechnet als %N liegen sollen.
(d) Es wurde weiter die Wirkung der Zugabe von Aminosäuren zum Herstellungsmedium für die Züchtung des Streptomyces hygroscopicus beobacntet und gefunden, daß die Zugabe von Tryptophan und Methionin eine Verbesserung der Ausbeute an der neu°n Amylase bewirkt.
Der Einfluß der Zugabe von Tryptophan auf die Herstellung der Amylase durch Züchtung des Streptomyces hygroscopicus wird in der nachstehenden Tabelle 11 gezeigt
Tabelle 11 Index der enzymatischen
Anteil an zugesetztem Aktivität des Kulturfiltrats
Tryptophan (%)
(% Produktionsmedium) 100
0 110
0,005 120
0,01 130
0,05 146
0,1
(e) Die Wirkung der Zugabe von Methionin auf die Bildung der Amylase durch Züchtung des Streptomyces hygroscopicus ist in der nachstehenden Tauclie 12 gezeigt.
Tabelle 12
Anteil an zugesetztem
Methionin
(% Produktionsmedium)
Index der enzymatischen Aktivität des Kulturfiltrats
100
190
185
195
20
25
Die in den Tabellen 11 und 12 gezeigten Versuchsergebnisse wurden erhalten, indem man eine Samenkultur jo des Streptomyces hygroscopicus, wie sie beim Testverfahren für Tabelle 8 beschrieben wurde, in ein Aüsgangsherstellungsmedium einimpfte, das 1 % entfettetes Sojabohnenmehl, 3% lösliche Stärke und 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat bei einem pH-Wert von 7,0 enthielt, wobei verschiedene Anteile der Aminosäure zugegeben wurden, 90 Stunden bei 28° C bebrütet und anschließend die enzymatische Wirksamkeit des Kulturfiltrats gemessen wurde.
(f) Außerdem wurde eine Reihe von Versuchen beim Bebrüten des Streptomyces hygroscopicus durchgeführt, um die Wirkung der Bebrütungstemperatur auf die Herstellung der Amylase zu bestimmen. Die Versuche wurden bei verschiedenen Temperaturen im Bereich von 28—400C durchgeführt und gefunden, daß im Wachstum der Mikroorganismen keine bemerkenswerten Unterschiede zu beobachten sind, daß jedoch eine Bebrütungstemperatur in der Nähe von 35° C für die Herstellung des Enzyms optimal ist. Die Wirkung der Bebrütungstemperatur auf die Herstellung der Amylase mit dem Streptomyces hygroscopicus wird in der nachstehenden Tabelle 13 gezeigt.
Tabelle 13
Bruttemperalur Mycelvolumen
Index der enzymatischen Aktivität des Kulturnitrats
(ml)*)
4,7 4,4 4,2
60
100
55
bO
*) »Mycelvolumen« in Tabelle 13 wurde bestimmt durch Einbringen von 10 ml der Kulturbrühe in ein Zentrifugenrohr, indem mit 3000UpM. 10 Minuten zentrifugiert wurde, Das Volumen des ausgefällten Mycelkuchcns wurde dann bestimmt.
Die Versuchsergebnisse von Tabelle 13 wurden erhalten, indem 3% einer Samenkultur des Streptomyces hygroscopicus, wie sie bei dem Prüfverfahren von Tabelle 8 hergestellt wurde, in Teströhrchen eingebracht wurden, die jeweils ein Herstellungsmedium enthielten, das aus 4% Maisstärke, 2% entrahmtes Milchpulver, 0,2% KH2PO4, 0,2% MgSO4 · 7 H2O und 0,01% MnSO4 bestand und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war. Es wurde 90 Stunden bei verschiedenen Temperaturen in einer Brutvorrichtung mit Temperaturgradienten bebrütet und die enzymatische Wirksamkeit des Kulturftitrates gemessen.
Der Streptomyces hygroscopicus kann auch bei einer Temperatur von etwa 35° C unter aerobischen Bedingungen in einem K.u!turrücuiurri gezüchtet werden, das bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bei einer Kohlenstoffkonzentration von 2 —6%C und bei einer Stickstoffkonzentration von 0,1 -0,3% N enthält, wobei das C/N-Verhältnis etwa 20 :1 Gewichtsteil beträgt. Dabei erhält man in dem Herstellungsmedium die Amylase, die solche enzymatischen Wirksamkeiten und Eigenschaften hat, daß der optimale pH-Wert im Bereich von 4,5—5,0 liegt und die Grenzen der Hydrolyse von Stärke durch diese Amylase 82% von theoretischer Maltose beträgt. Das Verhältnis von Glukose zu aus Stärke durch die Wirkung dieser Amylase gebildeter Maltose beträgt 0,055 :1 Gewichtsteil und die Amylase wird aus dem Herstellungsmedium in bekannter Weise gewonnen.
Von den vorstehend genannten besonderen sieben Stämmen von Streptomyces, die gemäß der Erfindung gezüchtet werden, ergibt Streptomyces hygroscopicus die höchste Ausbeute an Amylase.
Beispiel 1
Ein Stamm von Streptomyces hygroscopicus mit der ATCC-Nummer 21 722 wurde in 9 Liter eines Saatmediums geimpft, das 2% Maismehl, 1% Weizenkeime und 0,5% Fermentmedium enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war. Es wurde 24 Stunden bei 280C in einem Glasfermentator unter Bewegen und Belüftung bebrütet, um eine Saatkultur herzustellen. Gleichzeitig wurden 300 Liter eines Herstellungsmediums folgender Zusammensetzung: 3% Maisstärke, 1% entrahmte Milch, 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,01% Mangansulfat sowie eine kleine Menge eines Entschäumungsmittels in einen Fermentator von 600 Liter Kapazität eingegeben, 30 Minuten bei 1210C sterilisiert und gekühlt. Wie vorstehend beschrieben hergestelltes Saatkultur wurde dann zu dem sterilisierten Herstellungsmedium gegeben und das Herstellungsmedium wurde 85 Stunden bei 28° C unter Belüftung und Bewegung bebrütet. Die anfallende Kulturbrühe wurde filtriert und man erhielt das Kulturfiltrat, das anschließend unter 4O0C unter verrringertem Druck auf ein flüssiges Volumen vor einem Fünftel des ursprünglichen Volumens eingeengt wurde. Zu dem Konzentrat wurde dann ein zehnfach größeres Volumen an kaltem Äthanol gegeben wodurch die Amylase, die gebildet worden war und sich in der Kulturbrühe angesammelt hatte, ausgefällt wurde Beim Trocknen des Niederschlages erhielt man 341 j eines rohen Enzyms, das eine Wirksamkeit von 43 801 Einheiten/g hatte.
Beispiel 2
100 ml Anteile eines Mediums der in Beispiel
beschriebenen Zusammensetzung wurden in Schütte!
flaschen von 500 ml Kapazität eingebracht und sterilisiert. Streptomyces hygroscopicus ATCC 21 722 wurde in diese Flaschen eingeimpft und 24 Stunden bei 28° C einer Schüttelkultur unterworfen, um eine Samenkultur herzustellen. Gleichzeitig wurden 201 eines Produktionsmediums, das 12% lösliche Stärke, 3% entfettetes Sojabohnenmehl und 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war, in einem Glasgärbottich von 301 Kapazität eingefüllt, sterilisiert und gekühlt. Zu diesem sterilisierten Produktions":;Jium wurde die Samenkultur gegeben und 90 Stunden bei 35° C gezüchtet. Die erhaltene Kulturbrühe wurde dann in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt und man erhielt 77 g rohe Amylase, die eine Wirksamkeit von 45 000 Einheiten/g hatte.
Beispiel 3
Ein Stamm von Streptomyces viridochromogenes mit der ATCC-Nummer 21 724 wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, in einem Herstellungsmedium gezüchtet, das 8,4% Maismehl, 2% Polypepton und 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und auf einem pH-Wert von 7,0 eingestellt war. Aus der sich
ergebenden Kulturbrühe wurden 28 g eines rohen Enzyms gewonnen, das eine Wirksamkeit von 22 000 Einheiten/g hatte.
Beispiel 4
Ein Stamm von Streptomyces albus mit der ATCC-Nummer 21 725 wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, in einem Produktionsmedium gezüchtet, das 9,4"/o lösliche Stärke, 1,3% Fischmehl und 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war. Aus der Kulturbrühe wurden dann 53 g eines rohen Enzyms erhalten, das eine Wirksamkeit von 10 000 Einheiten/g aufwies.
Beispiel 5
Streptomyces tosaensis nov. sp. mit der ACTT-Nummer 21 723 wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, gezüchtet. Man erhielt 72 g eines rohen Enzyms, das eine Wirksamkeit von 38 000 Einheiten/g aufwies.
Auf die Gewinnung der Amylase aus dem fermentierten Medium wird in vorliegender Anmeldung kein Wert gelegt.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung einer Amylase, deren pH-Wert für die optimale enzymatische Wirksamkeit im Bereich von 4,5-5,0 bei Stärkesubstraten liegt, welche die weitere Eigenschaft besitzt, daß bei der Umsetzung einer ausreichenden Menge derselben mit einem Stärkesubstrat in dem optimalen pH-Bereich und dem optimalen Temperaturbereich der Grad der Hydrolyse der Stärke eine Grenze, bei der die Hydrolyse der Stärke aufhört, erreicht, wobei dann die Stärke zu nicht weniger als 75% in reduzierende Zucker, welche nach dem Somogyi-Titrationsverfahren bestimmt und als Maltose bezeich-
    10
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