DE1946682C

DE1946682C - Verfahren zur Herstellung und Gewin nung von Hyaluromdase

Info

Publication number: DE1946682C
Authority: DE
Inventors: Yasuyuki Prof Ohya Takai chi Nagoya Amano Genichi Nishikasugai Aichi Kaneko, (Japan)
Original assignee: Amano Seiyaku KK, City of Nagoya, Aichi (Japan)
Publication date: 1972-04-20

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Hyaluronidase durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in wäßrigen Nährmedien und Isolierung der Hyaluronidase aus dem Kulturfiltrat.

Die Hyaluronidase ist ein Enzym für die Depolymerisation \on Hyaluronsäure, wobei ein niedrigmolekulares Zuckerderivat erhalten wird. Es ist allgemein bekannt, daß das Enzym in der Hodensekretion von Säugern enthalten ist und daß es als »A.usbreitungsfaktor« bezeichnet wird. K. M e y e r et al haben ein Enzym von der kristallinen Linse eines Augapfels isoliert, und sie haben auch gefunden, daß ein autolysierles Produkt, welches durch die Einwirkung von Pneumococcus gebildet wird, die Viskosität von Mucopolysacchanden verringert und sie unter Bildung eines reduzierenden Zuckers depolymerisiert. Das Enzym wird von K. Meyer und seinen Mitarbeitern als Hyaluronidase bezeichnet, weiche dem Ausbreitungsfaktor entspricht.

Diese Hyaluronidase findet man in größeren Mengen in der Haut, der Milz, den Hoden und dem Samen von Tieren. Im Gift von Bienen und Schlangen und im Bindegewebe von Kaulquappen. Diese Hyaluronidase wird auch als Exoenzym von pathogenen Bakterien gefunden, wie z. B. bei Clostridium welchii. Streptococcus hemolyticus. Staphylococcus aures. Pneumococcus u. dgl. Dieses Enzym reguliert die Gewebedurchlässigkeit und die Fruchtbarkeit von Tieren und spielt auch eine Rolle bei der Eindringung von Gift, das durch Bakterien sekretiert wird, und bei der menschlichen Ernährung. Dieses Enzym, welches physiologisch und pathologisch wichtig ist. wird klinisch verwendet. Eine handelsübliche Hyaluronidase wird aus den Rinderhoden hergestellt, und deshalb ist die Herstellung von Hyaluronidase aus dieser Quelle beschränkt. Auch besitzt die Hyaiuronidasc. die unter Verwendung von Rinderhoden oder Bakterien hergestellt wird, den Nachteil, daß sie bei der Reinigung unstabil ist.

Es wird daraufhingewiesen, daß die Hyaluronidase bisher nicht in anderen Mikroorganismen als Bakterien gefunden wurde.

Es wurde nunmehr festgestellt, daß ein neue Mikroorganismenstamm, der aus dem Boden isolier wurde, in einem wäßrigen Nährmedium eine groß«. Menge stabile Hyaluronidase anhäufen kann. Dei neue Stamm, der zu Streptomyces gehört, wird al· Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18011 bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Hyaluronidase durch aerobe?

ίο Züchten von Mikroorganismen in wäßrigen Nähr medien und Isolierung der Hyaluronidase aus den Kulturfiltrat ist nun dadurch gekennzeichnet, dal man als Mikroorganismus Streptomyces hyaluro lyticus nov. sp. I. A. M. 181012 einsetzt.

is Die mycologischen Charakteristiken de* Strepto myces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 (I. A. M = Institute of Applied Microbiology der Universität Tokio. Japan) werden in der Folge aufgerührt. Sie wurden durch die Verfahren identifiziert, die in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« 7. Auflage (1957), und »The Actinemycetes«, Bd. Π (1961). von S. A. W a κ s m a n, beschrieben sind.

I. Morphologische Charakteristiken

1. Sporentragende Hyphen: Einfach, keine Wrrtel-

ständigkeit. gerade oder teilweise gebogene Spora-

phoren. keine Spiralen.
2. Sporen: Elliptisch. 1.0 χ 0.7 μ. glatte Oberfläche.

erzeugen Ketten von mehr als 10 Sporen.
3. i) Sphärische Sporangien: Keine.

ii) Peitschensporen: Keine.

iii) Sclerotia: Keine.

4. Luftmycel: Wird gebildet.

5. Vegatives Mycel: Dünner als Luftmycel. keine Segmentation, kein Septum.

II. Kulturcharakteristiken

Wenn nicht anderes angegeben ist. werden die Kulturcharaktcristiken nach einer zehntägigen Kuilivierung bei 30 C beobachtet. Die Angabe der Farbe bei den verschiedenen Kulturen wurde mit Hilfe des »Standard of Color«, herausgegeben vom Japan Color Research Institute, bestimmt.

Kulturcharaktcristiken

Medium

Nähragar')

Saccharose-Nitrat-Agarl
Synthetischer Agar¹)
Glucose-Asparagin-Agar⁴)

Wiichsliim

mäßig, bernsteinfarben, glänzend, hefeartige Oberfläche

mäßig, hefcarligc Oberfläche, gerunzelt (unter)

mäßig, weiß
mäßig, weiß, dünn

I u ft im cd

nichts
schwach, weiß

bräunlichweiß bis
blaßorange, spät

schwach, weiß bis
blaßorange

Lösliches Pigment
Gclblichbraim
Gelblichbraun
Blaßgelblichbraun
Blaßgelblichbraun

II. Physiologische Kigenschaften:
I ] Aerob oder anaerob: Aerob.

2) Temperaturbereich für das Wachstum und optimale Temperatur: IN bis 40 C 21 bis .10 ( . 3l pll-liereich für das Wachstum und optimaler pH: 5 bis 11. 7 his H. 4) Verbrauch von Kohlcnstoffijuellen:

Arabinosc K Xylose+-. Glucose -*-,

Mannose ^J . Lriictose ϊ . Lactose ^l .

Saccharose ^L . Inosit -. Rhamnose

Raftinosc t . Snlicin ^; . Mannit

Glycerin '. Stiirke »-. Dextrin '.

Inulin '. Galactose ». Maltose ^.

Fortsetzung

Medium	Wachstum	Luftmycel	Lösliches Pigmem
. Maleat-Agar⁵)	schwach, farblos	schwach, weiß	nichts
•' ,!cose-Papton-Agar")	mäßig, blaßgelblichbraun.	schwach, gräulich	Dunkelgelblich
	hefeartig, gerunzelt (unter)	weiß	braun
-,·. ragar⁷)	mäßig, creamfarbig bis braun,	mäßig, weiß	Bräunlichschwarz
	gerunzelte Oberfläche
,riüfTelschnitz⁸)	reichlich, gelblichbraun,	mäßig, gräulichweiß	Dunkelgelblich
	gewellt und gerunzelt		braun
irottenschnitz⁹)	nichts	nichts	nichts
iiforrnehlagar¹⁰)	reichlich, weiß, flach	reichlich, weiß bis	Gelblichbraun
		blaßorange und
		bis rosaweiß
i rosinagar")	schwach, farblos	nichts oder	Dunkelbraun
		schwach, weiß
C platine¹²)	farblos oder creamfarben,	nichts	Dunkelrötlichbraun
	kraterförmig oder schichten-
	iormig, starke Verflüssigung
Milch¹³)	reichlich, weiß oder cream	schwach, weiß	Dunkelgelb
	farben, ringförmige Ober
	fläche, Koagulation, lang
	same Peptonisierung, keine
	Lackmusreduktion
/dlulosemedium¹⁴)	nichts	nichts	nichts
pcptonlösung¹⁵)	reicnlich, membranös. weiß bis	nichts	Dunkelbraun
	gräulichweiß, keine Trübung
Nährlösung¹⁶)	reichlich, membranös, matt	nichts oder schwach	Hellbraun
	weiß, erzeugt ein Mycelge- flecht. keine Trübune

5) Verflüssigung von Gelatine (protcolytische Wirkung): Positiv (stark).

fi| Koagulicrung und Peptonisierung von Milch (proleolytischc Wirkung): Positiv (stark).

71 Hydrolyse von Starke (amylolytischc Wirkung): Positiv (s!;>rk|.

Sl Verbrauch von Zellulose l/ellulolytische Wirkung): Negativ.

'(I Nitratreduktion: Positiv.
1()| Tyrosiasc (Melaninbildung): Positiv.
111 Chromogenc Wirkung: Positiv.
12) Hämolysc: Negativ.
131 Schwcfchvassers'ioffbildung: Positiv.
141 Katalascbildung: Negativ.
15) Indolbildiing: Negativ.
Ifi) Abtiiüingstcmperatur: 55 C (10 Minuten).

Auf Grund der Tatsache, daf Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I.A. M. 18012 Wachstum von Hyphen zeigt, vegetatives Mycelium ohne Segment bildet und kein Sporangium bildet, geht hervor, daß er zur so Familie Streptomycetaceae gehört. Weiterhin wächst Streplomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 nicht bei einer Temperatur oberhalb 50 C. erzeugt /elin oder mehr Sporen, die miteinander in einer Kette verbunden sind, und trägt ein Luflmycel: deshalb.gehört er zur Gattung Streptomyces. Weiterhin wird angenommen, daß Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 nach der Klassifizierung von Waksman zur Gruppe A Π gehört, da es sich hierbei um eine Mikrobe der chromogcnen Type handelt, die keine Wirtelständigkeit bildet. Diese Gruppe A II enthält 69 Arten, aber sie unterscheiden sich von Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I.A. M. 1X012 im Wachstum, in der Farbe und auch darin, daß die sporentragende Hyphc keine Spiralen bildet. f»s

Im Hinblick auf die obigen Betrachtungen und im Hinblick auf die Tatsache, daß Streptomyces hyaluro- !•.ixus nov. sn. I. A. M. 18012 I lyaluronidasc bildet.

kann man sagen, daß dies ein neuer Stamm ist. dem auf Grund der physiologischen Eigenschaften der Name Streptomyces hyalurolyticus gegeben wurde.

Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I.A. M. 18012 kann auf einem wäßrigen Medium, das für die Herstellung von Hyaluronidase verwendet wird, aerob kultiviert werden.

Das Kulturmedium enthält Glycerin. Glucose, lösliche Stärke. Saccharose oder Dextrin als Kohlen stoffquclle. Casaminosäurc. Pcplon. Fleischextrakt Malzextrakt. Maisquellwasser, entfettetes Soyaboh ncnpulvcr. Hefeextrakt. Harnstoff oder Ammonium salze als StickstolTquellc. verschiedene Phosphate Natriumchlorid oder MgSC)₄ ■ 7H₂O als anorganisch« Salze. Antischaummittel und andere Zusätze. Fs wire bevorzugt, lösliche Stärke oder Dextrin als Kohlen stoffquelle und Hefeextrakt. Casaminosäurc ode (NlU)₂SO₄ als StickstolTquellc zu verwenden.

Wenn ein solches Kulturmedium mit Streptomyce hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 geimpft um dann bei einer Temperatur von 27 bis 30 C 48 bi 96 Stunden lang unter Belüftung kultiviert wird, dam

• erreicht die Bildung von Hyaluronidase ein Maximum. Der pH-Wert einer Kulturlösung kann entsprechend dem verwendeten Kulturmedium verringert werden, aber Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 wird dadurch im Wachstum und in der Bildung von Hyaluronidase nicht beeinflußt. Wenn Calciumcarbonut einem Kulturmedium zugesetzt wird, dann wird die Bildung von Hyaluronidase gelegentlich verringert.

Zur Herstellung einer rohen Hyaluronidase werden zuerst die Zellen mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens vom Kulturmedium abgetrennt, und hierauf wird das resultierende Kulturfiltrat oder ein konzentriertes Kulturfiltrat. welches durch Konzentrierung des KuI-turfiltrats unter Vakuum erhalten wird, einer Lösungsmittelausfällung oder einer Aussalzung unterworfen.

Beispiele für organische Lösungsmittel, die verwendet werden können, sind Äthylalkohol, Methylalkohol und Aceton. Zum Aussalzen können beispielsweise Ammoniumsulfat und Magnesiumsulfat verwendet werden.

Die rohe Hyaluronidase enthält eine große Menge eines braunen Pigments des Melanintyps, welches durch Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 gebildet wird, und auch andere färbende Stoffe, die vom Kulturmedium stammen. Dieses Pigment und diese färbenden Stoffe können durch Fällungsmaßnahmen nicht vollständig abgetrennt werden. Außerdem wird die gereinigte Hyaluronidase nicht in hohen Ausbeuten erhalten.

Zur weiteren Reinigung der Roh-Hyaluronidase werden daher für die Reinigung von Enzymen an sich bekannte Methoden angewandt, bei weichen Anionenaustauschharze. adsorbierende synthetische Harze und Kationenaustauschharze für die Abtrennung der färbenden Stoffe verwendet werden. Dabei wird das Enzym in einer hohen Ausbeute erhalten. Die Anionenaustauschharze und die adsorbierenden synthetischen Harze können nach Waschen mit Säuren und Alkalien wieder verwendet werden. Diese Harze bedürfen keiner Pufferung.

Die weitere Reinigung der rohen Hyaluronidase wird in der Folge erläutert.

Zuerst wird ein Anionenaustauschharz mit einer 2 η-Salzsäure und einer 2 n-Natriumhydroxidlösung gewaschen. Dann wird das Harzmit Wasser gewaschen, bis das rusfließende Wasser einen pH-Wert von 5 bis 6 aufweist. Das gewaschene Harz wird in eine Kolonne eingebracht, und dann wird eine Lösung, die die rohe Hyaluronidase enthält, durch die Kolonne hindurch-{eschickt. Der pH-Weirt des resultierenden Ablaufs ndert sich von 5 auf 9, und deshalb wird der pH-Wert tuf ungefähr 5.0 eingestellt, indem <;ine 1 n-Falzsäure turn Ablauf zugegeben wird.

Als zweites wird der Ablauf durch eine Schicht eines adsorbierenden Harzes hindurchgeführt, welches in eine Kolonne eingebracht und in der gleichen Weise wie oben mit Säure und Alkali behandelt warden ist. Auch hier wird der pH-Wert des resultierenden Ablaufs durch Zusatz von 1 η-Salzsäure auf ungefähr 5,0 eingestellt.

Abschließend wird der Ablauf durch eine Schicht eines gepufferten, schwach sauren Kationenaustauschharzes mit einem pH-Wert von 4 bis 5 hindurchgeführt, wodurch die Hyaluronidase auf dem Kationen-

austauschharz adsorbiert wird. Die adsorbierte Hyaluronidase kann vom Kationenaustauschharz abgetrennt werdf n, indem sie mit einer 0,5molaren Pufferlösung gelöst wird, die Essigsäure und ein Acetat enthält. Das Produkt ist dann eine gereinigte farblose Hyaluronidase.

Beispiele für Anionenau-'auschharze, die gemäß der Erfindung verwendet wenbn können, sind schwach alkalische Ionenaustauschharze mit Aminogruppen. Beispiele für Kationenaustauschharze, die gemäß der

Erfindung verwendet werden, sind schwach saure Ionenaustauschharze mit Carboxylgruppen. Geeignet sind auch modifizierte Phenolharze, die keine ionenaustauschende Gruppen aufweisen, die aber melaninartige färbende Verunreinigungen adsorbieren. Es soll

noch erwähnt werden, daß zuai Reinigen der rohen Hyaluronidase auch Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose) verwendet werden kann.

Dieses Enzympräparat spaltet Hyaluronsäure in ein Oligosaccharid, welches durch Reduktion von

Anilinhydrogenphthalat nachgewiesen wird. Das Enzympräparat bildet kein N-Acetylglucosamin und keine Glucuronsäure. Die Aktivität läßt sich ajch dadurch zeigen, daß das Vermögen von Hyaluronsäure, eine Proteintrübung hervorzurufen, aufgehoben wird, und auch dadurch, daß die hohe Viskosität der Substratlösung durch das Enzym verringert wird. Im Gegensatz zur aus Hoden gewonnenen Hyaluronidase kann dieses Enzym Chondroitin und Chondroitinsulfat nicht zersetzen.

Der optimale Wert des pH und die optimale Temperatur für die Enzymaktivität sind 5,0 bzw. 65 bis 70⁰C. Der stabile pH-Wertbereich während 24 Stunden bei 37° C liegt zwischen 4 und 10. Dieses Enzym ist gegenüber Wärme bemerkenswert stabil; es findet keine merkliche Verringerung der Aktivität durch eine 30 Minuten dauernde Wärmebehandlung bei bis zu 75 bis 8O⁰C statt. Eine gereinigte Enzymlösung kann mehrere Monate in Kühlschränken gelagert werden, ohne daß irgendeine Verringerung der Aktivität vor sich geht. Hg^{+ +} und Mn'' -Ionen inhibieren das Enzym, was im Gegensatz ^u der aus Hoden und aus Pneumococcen gewonnen Hyaluronidase steht. Ein Vergleich der enzymatischem Eigenschaften von Hoden-, Bakterien- und Streptomyces-Hyaluronidase ist in der folgenden Tabelle I gezeigt.

Tabelle

VerfHch der erfindungsgemäß gewonnenen Hyaluronidase mit nach bekannten Verfahren gewonnenen

Hyaluronidasen

Siibstratspczifilät

Rinderhoden

Hyaluronsäure. Chondroitin, Chondroitinschwefelsäure

Quelle bzw. Krzcugcrorganisnius Clostridium wclchii.

Streptococcus hcmolyliciK

Staphylococcus aurcus

Hyaluronsäure,
Chondroitin

Slreptomyces hyalurolylicus nov. sp. IAM. 18012

Hyaluronsäure

Fortsetzung

	Rinderhoden	Quelle bzw. Erzeugerorganismus	Streptomyces hyalurolyticus no», sp. t.A.M. 1801.!
	eine Wärmebehandlung	Clostridium welchii. Streptococcus hemolyticus. Staphylococcus aureus	eine Wärmebehandlung
Wärmestabilität	bei 80⁰C während	Streptococcus: eine	bei 70⁰C und während
	30 Minuten ergibt eine	Wärmebehandlung	30 Minuten ergibt eine
	50% ige Restaktivität	bei 45° C während	100%ige Restaktivität
		15 Minuten ergibt eine
	eine Wärmebehandlung	Inaktivität	eine Wärmebehandlung
	bei 100° C während	Staphylococcus: eine	bei 80° C während
	5 Minuten ergibt eine	Wärmebehandlung bei	30 Minuten ergibt eine
	80%ige Restaktivität	55° C während	95%ige Restaktivität
		5 Minuten ergibt eine
	breiter Bereich	10% ige Restaktivität	pH 4,0 bis 11,0 (breiter
pH-Stabilität ,		unterhalb pH 5 und	Bereich)
		oberhalb pH 8 un
	5,5 bis 6,2	stabil	5,0
Optimaler pH	Fe, Cu, Zn**	5,5 bis 6,2	Mn, Hg; Zn**
Inhibitor		Fe, Zn	aktiviert

Aus den obigen Resultaten ist ersichtlich, daß die Hyaluronidase von Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 sich klar von den aus Rinderhoden oder Clostridium welchii, Streptococcus hemolyticus und Staphylococcus aureus gewonnen Hyaluronidasen unterscheidet Es ist das erste Mal, daß eine mikrobielle Hyaluronidase in anderen Quellen als patho- - genen Bakterien gefunden wurde.

Die erfindungsgemäß gewonnene Hyaluronidase wurde nach dem neuen Verfahren von Tolksdorf geprüft. Zunächst wurde Hyaluronsäure aus Nabelschnüren nach dem Dorfmanschen Verfahren hergestellt. Eine Lösung von Hyaluronsäure, die annähernd 1 mg/ml enthielt, wurde dadurch hergestellt, daß die Hyaluronsäure in einem 0,02 m McIIvaine-Puffer (pH 5,0), der 0,2 m NaCl enthielt, aufgelöst wurde. Für den Versuch wurden 0,5 ml Enzymlösung mit 0,5 ml Hyaluronsäurelösung (die Lösungen wurden vorher auf 60⁰C erwärmt) gemischt und 30 Minuten bei 60° C inkubiert. Hierauf wurden 4 ml saures Pferdeserum, das mit der 40fachen Menge Pufferlösung verdünnt worden war, rasch zugegeben, und genau 10 Minuten später wurde die optische Dichte in einem Spektralfotometer bei 660 mu gemessen. Es wurden Kontrollversuche mit deaktivierten Enzymlösungen (10 Minuten auf 100^cC erhitzt) nach dem gleichen Verfahren ausgeführt. Unter diesen Bedingungen verringert die 1 T. R. U. (Trübungsreduzierungseinheit). die der Enzymkonzentration entspricht, die Trübung um die Hälfte.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

" 10 1 eines Nährmediums (pH 7.2). das 3.0% lösliche Stärke. 0.5% Pepton. 0.5% Fleischextrakt 0.8% (NHJ₂SO₄. 0.15% Hefeextrakt und 0.1% K₂HPO* enthielt wurden in jeden von vier 201 fassenden Fermentierbehältern eingegossen. Nach einer 15 Minuten dauernden Sterilisierung bei 120" C wurde das Nährmedium mit 200 ml Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 geimpft, der auf dem gleichen Medium vor'iultiviert worden war, und hierauf wurde eine Submerskultivierung 40 Stunden lang bei 30° C unter Rühren (300 U/min) und Belüftung (15 l/min) ausgeführt. Das resultierende Kulturmedium wurde zum Abtrennen der Zellen filtriert, und dann konzentriert. Zum Konzentrat wurde Äthylalkohol zugesetzt, um das rohe Enzym zu isolieren, bis die Konzentration des Äthylalkohols 59 bis 77% erreichte. Hierauf wurde das rohe Enzym unter vermindertem Druck getrocknet Das rohe Enzym besaß die Hyaluronidaseaktivität von 1600 T. R. U./g.

Eine 10%ige Lösung dieses rohen Enzyms wurde durch eine Schicht eines schwach alkalischen Ionenaustauschharzes mit Aminogruppen mit einer Ge- schwindigkeit von 500 ml/st hindurchgeführt, welches vorher mit einer Säure und einem Alkali gewaschen worden war. Hierauf wurde das Harz mit Wasser gewaschen. Da der pH-Wert des resultierenden AIy laufs sich auf 9,0 änderte, wurde der pH-Wert durch Zusatz von 1 η-Salzsäure auf 5,0 nachgestellt Durch diesen Vorgang wurden mehr als 90% der färbenden Stoffe aus der Lösung des rohen Enzyms entfernt

Hierauf wurde die gereinigte Lösung durch .äie Schicht eines modifizierten Phenolharzes ohne ionen austauschende Gruppen hindurchgeführt, welches vor her mit einer Säure und einem Alkali gewaschen worden war. und hierauf wurde das Harz mit Wasser in der gleichen Weise wie vorher gewaschen. Der pH-Wert des resultierenden Ablaufs veränderte sich auf ungefähr 8.5 und wurde durch 1 n-Salzsäure wieder auf 5.0 eingestellt Durch diesen Vorgang wurden ungefähr 99.0% oder mehr der färbenden Stoffe entfernt, die in der ursprünglichen Lösung des rohen Enzyms vorhanden waren. Das Enzym wurde mit einer Ausbeute von ungefähr 73% gewonnen. Die spezifische Aktivität des Enzyms stieg auf das 4fache der ursprünglichen Aktivität

Abschließend wurde der Ablauf in einer 0.1 molaren Pufferlösung (pH = 5.0). die Essigsäure enthielt bei 5^C C 24 Stunden lang dialysiert und dann durch eine Schicht eines schwach sauren Ionenaustauschharzes mit Carboxylgruppen hindurchgeführt, dai vorher mit der gleichen Pufferlösung gepuffert worden war.

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um das Enzym am genannten Harz zu adsorbieren. Das adsorbierte Enzym wurde aus dem Harz herausgelöst, indem eine 0,2- bis 0,5molare Pufferlösung, die Essigsäure enthielt, durch die Harzschicht hindurchgeflihrt wurde Hierbei wurden alle färbenden Stoffe entfernt, und er, wurde ein klares Eluat erhalten. Das klare Eluat wurde bei niedrigen Temperaturen dialy-

siert, unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei ungefähr 5 g des gereinigten Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von 2297 T. R. U./mg erhalten wurden. Das Enzym wurde mit einer Ausbeute von 64% gewonnen. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle Art des Enzyms Lösung des rohen Enzyms 400000 Lösung, die durch das schwach alkalische 355000 Ionenaustauschharz hindurchgeschickt

worden ist Lösung, die durch das schwach saure Ionen- | 293000

austauschharz hindurchgeschickt worden ist Eluat aus dem schwach sauren Ionenaus- | 257250 tauschharz

B e i s ρ i e 1 2

Gesam !aktivität (TRU.)

250 1 des Reichen Nährfhediums wie im Beispiel 1 wurden in einen 500 1 fassenden Fermentierbehälter eingeführt, und das Nährmedium wurde mit Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. I. A. M. 18012 geimpft und 45 Stunden unter Rühren (200 U/min) und Belüftung (1:1) bei 30° C kultiviert. Es wurden ungefähr 1,3 kg eines gräulichweißen rohen Enzympulvers erhalten. Das rohe Enzym besaß die Hyaluronidaseaktivität von 2,5 T. R. U./mg. 160 g des rohen En- zyms wurden in Wasser aufgelöst, um eine 10%ige Lösung herzustellen. Die Lösung wurde durch eine Schicht eines schwach alkalischen Ionenaustauschharzes hindurchgeführt, welches vorher mit einer Säure und einem Alkali gewaschen worden war, und hierauf mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 500 ml/st mit Wasser gewaschen. Der pH-Wert des resultierenden Ablaufs wurde durch Zusatz von 1 η-Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Dann wurde der Ablauf durch eine Schicht eines modifizierten Phenolharzes ohne ionenaustauschende Gruppen hindurchgeführt, welches vorher mit einer Säure und einem Alkali gewaschen worden war. Hierauf wurde das Harz mit Wasser gewaschen. Der pH-Wert des resultierenden Ablaufs wurde auf 4.1 eingestellt, und der Ablauf wurde gegen eine 0.05molare Pufferlösung (pH = 4.1). die Essigsäure enthielt, bei 5" C dialysiert. Der dialysierte Ablauf wurde durch eine Schicht eines schwach sauren Kationenaustauschharzes hindun:h-Oesamtes

Protein

(Tyrosin, mg)

7600 2200

1200 112

Spezifische Aktivität

(T. R. U./mg Tyrosin)

53 161

244 2297

Ausbeute

100 89

73 64

Entfärbungsgrad

0 92

99,5 100

geführt und mit einer 0,05molaren Pufferlösung (pH = 4,1), die Essigsäure enthielt, gepuffert, um die Hyaluronidase auf dem Harz zu adsorbieren. Die Hyaluronidase wurde aus dem Harz mit einer 0,5molaren Pufferlösung (pH = 6,0), die Essigsäure enthielt, eluiert. Die Hyaluronidase enthaltende Lösung wurde 24 Stunden gegen eine 0,01 molare Pufferlösung (pH = 4,1) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch eine Schicht Diäthylaminoäthylcellulose hindurchgeführt, die vorher mit der O.Olmolaren Pufferlösung gepuffert worden war, um Verunreinigungen auf der Cellulose zu adsorbieren. Hierbei wurde ein Ablauf erhalten, der die Hyaluronidase enthielt. Der Ablauf wurde gegen eine 0.005molare Pufferlösung (pH = 8.0). die Phosphorsäure enthielt, dialysiert. und hierauf wurde der dialysierte Ablauf durch eine Schicht Diäthylaminoäthylcellulose hindurchgeführt, die vorher mit der 0.005molaren Pufferlösung gepuffert worden war. um die Hyaluronidase auf der Cellulose zu adsorbieren. Die adsorbierte Hyaluronidase wurde aus der genannten Diäthylaminoäthylcellulose mit einer O.OSmolareu Pufferlösung, die Phosphorsäure enthielt, eluiert. Durch dieses Verfahren wurden alle färbenden Stoffe entfernt und eine klare Lösung hergestellt. Die spezifische Aktivität der klaren Lösung wurde auf das 80fache der ursprünglichen Aktivität gesteigert. Das Enzym wurde mit einer Ausbeute von ungefähr 30% erhalten.

Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle

An des Enzyms

Gesamt jkti\itat 1T.R.U.1 Gesamtes

p-ntein

iTvivmti. mgi

spezifische
Aktivität

iT.R.U. mg
Tyrosin*

Ausbeute Entiarhuna
grad

Lösung des rohen Enzyms 395000

Lösung, die durch ein schwach alkalisches · 323900

Ionenaustauschharz hindurchgeschickt

wurde j

Lösun2. die durch ein modifiziertes Phenol- ; 262359

harvTohne ionenaustauschende Gruppen !

hindurchgeschickt wurde !

7540
236/

52
137

227

100
82

66

0
91.0

99.3

2244

Fortsetzung

Art dus Enzyms	Gesamtaktivität (T. R. U.)	Gesamtes Protein (Tyrosin, mg)	Spezifische Aktivität (T.R.U./mg Tyrosin)	Ausbeute	Enllärbungs- grad
Eluat aus dem schwach sauren Kationen- austauschharz Lösung, die durch DEAE Cellulose (pH = 4) hindurchgeführt wurde Eluat aus der DEAE-Cellulose (pH = 8,0)	230876 176389 121709	150 84 30	1539 2099 4057	59 45 31	99,8 99,8 99,9

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Hyaluronidase durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in wäßrigen Nährmedien und Iso-

lierung der Hyaluronidase aus dem Kulturfiltrat, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces hyaluroiyticus nov. 3p. I. A. M. 18012 einsetzt.

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