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Die Erfindung betrifft die neue Verbindung 3- (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrol,
die ein . neues wertvolles Antibiotikum ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums. Das neue Antibiotikum gemäß der
Erfindung wird Pyrrolnitrin genannt.
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In der Zeichnung stellt Fig. 1 die Kurve eines Infrarotabsorptionsspektrums
von Pyrrolnitrin, F i g. 2 die Kurve eines Ultraviolettabsorptionsspektrums von
Pyrrolnitrin und F i g. 3 die Kurve eines Kernresonanzspektrums (NMR-Spektrums)
von Pyrrolnitrin dar.
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Die für die mikrobiologische Erzeugung von Pyrrolnitrin gemäß dem
Verfahren verwendeten Stämme der Gattung Pseudomonas werden der Einfachheit halber
als Nr. 2327, hinterlegt unter Nr. ATCC 15 958, Nr. 103, hinterlegt unter Nr.
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IAM 18 003, und CB-416, hinterlegt unter Nr.
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FRI 79, bezeichnet. Alle diese Stämme wurden von den Erfindern aus
Erde isoliert. Auf Grund mykologischer Beobachtungen an diesen Stämmen, die nachfolgend
im einzelnen besprochen werden, wurde festgestellt, daß es sich bei den Stämmen
Nr. 103 und CB-416 um Pseudomonas ovalis bzw.
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Pseudomonas Schuylkilliensis handelt. Der Stamm Nr. 2327 wurde als
ein neuer Stamm identifiziert und Pseudomonas pyrrocinia benannt. Eine Kultur des
lebenden Mikroorganismus wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt
und ist dort erhältlich. Er wurde als ATCC 15 958 bezeichnet.
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Bei den anderen obenerwähnten Hinterlegungsnummern steht die Abkürzung
IAM für Institute of Applied Microbiology, Tokyo University ; und die Abkürzung
FRI für Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.
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Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die neue Verbindung 3- (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrol
sowie ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums 3- (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrol,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in an sich bekannter Weise Pseudomonas pyrrocinia,
hinterlegt unter der Nr. ATCC 15 958, Pseudomonas ovalis, hinterlegt unter der Nr.
IAM 18 003, oder Pseudomonas Schuylkilliensis CB-416, hinterlegt unter der Nr. FRI
79, in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, das Antibiotikum
aus dem Kulturfiltrat abtrennt und reinigt.
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Tabelle 1 Zellformen
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Stäbe (abgerundet) Stäbe (abgerundet) Stäbe (abgerundet) |
| 0, 5 bis 0, 8 x 0, 6 bis 0, 8 x 0, 6 bis 0, 75 x |
| 1, 2 bis 2, 0 u 1, 4 bis 2, 0 u 0, 9 bis 1, 35 u |
| Liegen einzeln vor Liegen meist einzeln vor Liegen meist einzeln
vor, aber |
| manchmal in Paaren und |
| kurzen Ketten |
| Beweglich durch Flagella Beweglich durch polare Flagella Beweglich
durch polare Flagella |
| Keine Sporenbildung Keine Sporenbildung Keine Sporenbildung |
| Gramnegativ Gramnegativ Gramnegativ |
Tabelle 2 Kulturmerkmale
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Agarnährboden-Nach 48 Stunden bei 37°C, Nach 48 Stunden bei
Nach 48 Stunden bei |
| kolonie erhaben, kreisfdrmig, unge-30°C, kreisförmig, 30°C,
erhaben, glatt, |
| fahr 4 bis 8 mm im Durch-glatt, gleichmäßiger vollständig oder
leicht |
| messer, gleichmäßiger Kreis-Kreisumfang, hellgelb gewellt,
durchscheinend, |
| umfang, opak, hellgrau bis glitzernd, hellgelb bis |
| cremefarbig hellrötlichgelb |
| Agarnährboden-Gutes Wachstum, sich aus-Mäßiges Wachstum, Mäßiges
Wachstum, |
| schrägkultur (nach breitend, dick, erhaben, faserformig bis
sich glatt, vollständig, |
| 48 Stunden bei vollständig, glänzend grau ausbreitend, durch-erhaben,
durch- |
| 30° C) bis cremefarbig scheinend, glitzernd scheinend, etwas |
| glitzernd, hellgelb |
| Nährbouillon Leicht trübe mit Haut, Stark trübe, mit dünner
Trübe, mit brüchiger Haut |
| (nach 48 Stunden keine Sedimentation Haut und dürftigem und
seidenglänzendem |
| bei 30°C) Sediment Sediment |
Fortsetzung
| -Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Glutamat agar Nach 48 Stunden bei 37°C, Nach 48 Stunden bei
Nach 48 Stunden bei |
| gutes Wachstum. 30°C, reichliches 30°C, mäßiges Wachs- |
| Kein Pigment gebildet Wachstum, grünlich-tum, hellgelblichbraun |
| weiß, Medium grünlich bis hellbraun, Medium |
| gelb schwachgelb |
| Glutamatbouillon Gutes Wachstum. Trübe mit brüchiger Stark
trübe, mit brüchiger |
| (nach 48 Stunden Kein Pigment gebildet Haut und leicht grün-Haut,
hellbraune Farbe |
| bei 30'C) lichgelber Farbe |
| Peptonwasser Gutes Wachstum, stark trübe, Trübe mit brüchigerer
Mäßig trübe mit creme- |
| (nach 48 Stunden mit seidig zähem Sediment. Haut und grünlich-artiger
Farbe und seidig |
| bei 30"C, pH 7, 0) Keine Haut, jedoch auf der gelber Farbe
zähem Sediment |
| gealterten Kultur bildete |
| sich eine brüchige Haut |
| Gelatinestich Gutes Wachstum, Schwaches Wachstum Gutes Wachstum, |
| (nach 7 Tagen bei Schichtbildung (stratiform), nahe der Oberflõche,
Schichtbildung (strati- |
| 15 bis 20°C) Verflüssigung. Kein Wechsel keine Verflüssigung
form), Verfl³ssigung mit |
| in der Farbe bräunlichweißem Sedi- |
| ment. Keine Anderung |
| in der Farbe |
| BCP-Milch Verflüssigung pH 6, 6 bis 6, 8 Schwache Verfl³ssigung,
Verfl³ssigung, leichte |
| (nach 7 Tagen bei alkalische Eigenschaften alkalische Eigenschaften |
| 30° C) zeigend zeigend |
| Kartoffel Im wesentlichen farblos, Dünn, gelblichbraun, Brõunlich,
sich aus- |
| (nach 48 Stunden leicht cremeartig. Feucht gefärbtes Wachstum
breitend, klebrig, dick |
| bei 30°C) dünnes Wachstum |
Tabelle 3-1 Physiologische Eigenschaften
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| wasserlöslich - |
| Pigmentbildung Gelegentlich hellgr³n Gr³nlichgelbe Fluoreszenz |
| wasserunl~slich - |
| Indolbildung - - - |
| Reduktion von Nitrat-- |
| Anaerobisches Wachstum |
| in Gegenwart von Nitrat |
| Bildung von Schwefelwasserstoff, + (nach - - |
| 5 bis 7 Tagen) |
| Hydrolyse von Stõrke - - - |
| Catalasenaktivität +-+ |
| Bildung von Acetoin |
Tabelle 3-2
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Glutamat- NaCl 0,2% +++ +++ +++ |
| Nõhrboden NaCl 0,5% +++ +++ +++ |
| Toleranz NaCl 1,0% ++ ++ ++~+++ |
| gegen NaCl 3,0% ~ ~ + ++ |
| Salz NaCl 5,0% - - ~ |
| (nach |
| 24 Stunden |
| bei 30°C) |
| Fleisch- NaCl 0,2% +++ +++ +++ |
| extrakt-NaCI 0, 5% +++ +++ +++ |
| Nährboden NaCI 1, 0°/o ++ ++ ++~+++ |
| NaCl 3,0% ~ ~~+ ++ |
| NaCl 5,0% - - ~ |
Fortsetzung
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Alkohol-Alkohol 0, 5% + + + |
| haltiger 1, 0% +++ |
| Fleisch-3, 0% |
| extrakt-5, 0% - |
| Nãhrboden |
| Widerstands-vollständig desgl. desgl. |
| fahigkeit abgetötet |
| gegen Hitæ |
| (80°C, |
| 5 Minuten) |
| Nr. 2327 Nr. 103 GB-416 |
| Wachstums-Temperatur 10#C C ~~+ - |
| temperatur Temperatur 26, 5#C. ++ +++ +++ |
| (nach 24 Stunden, Temperatur 30#C +++ +++ +++ |
| Nährbouillon und Temperatur 37°C + + + + + |
| Glutamatbouillon) Temperatur 42°C--- |
| Wachstums-pH pH3 - - -~ |
| (nach 24 Stunden pH4 + + ~ |
| bei 30#C, pH5 +++ ++ ++ |
| Peptonwasser) pH 6 +++ +++ ++ |
| pH7 +++ +++ +++ |
| pH8 ++ ++ ++ |
| pH9 + + + |
| Oxydations-Glukose + + + |
| aktivität Glukonsäure + + + |
| Glycerin--- |
| Chitochrom- -~~ + + |
| oxidase |
Tabelle 3-3
| Nr. 2327 Nr. 103 CH-416 |
| ABCABCABC |
| Peptonmedium Gtukose+-++-++-+ |
| (nach7Tagen Fructose+--+--+-- |
| bei 30°C) Maltose + - - + - - + - - |
| Trehalose +--+--+-- |
| Galactose + - + + - - + - - |
| Mannose +--+--+-- |
| Xylose ~ - - + - + + - + |
| Arabinose -~~ - - + - - + - ~ |
| Sucrose + - ~ + - - + - - |
| Lactose++--+--+-- |
| Rafnnose+--+--+-- |
| Mannitol+--+--+-- |
| Glycerin + - - + - - + - - |
| Stärke+--+--+- |
| Inulin + - - + - - + - - |
| Kontrolle + - - + - - + - - |
| Synthetisches Glukose+-++-++-+ |
| Medium Lactose--++--+-- |
| (nach7Tagen Sucrose+-++--+-- |
| bei 30°C) Glycerin + - + + - + + - |
| Xytose+-++-++-+ |
Bemerkung : In der zweiten Spalte der obigen Tabelle bedeuten die Symbole ~A½ Wachstum.
~B½ Gasentwicklung und ~C½ Sõurebildung.
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Tabelle 3-4 Zersetzung von Zuckern (Hugh-Leifson-Verfahren)
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Lactose C-- |
| O +-- |
| Glukose c- |
| O + + + |
Cgeschlossen ; 0= offen ;-bedeutet neutrale oder alkalische Reaktion ; bedeutet
schwach saure Reaktion ; + bedeutet starke Reaktion.
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Tabelle 3-5 Assimilation von Kohlenstoffverbindungen
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Glukose + + + |
| Glukonsäure + + + |
| 2-Keto-Glukonsäure + + + |
| 5-Keto-Glukonsäure--- |
| Zitronensäure-++ |
| Bernsteinsäure-++ |
| Äthanol++ |
| Phenol--- |
| Benzoesäure + + |
| Salicylsäure.--- |
| m-Hydroxybenzoesäure--- |
| p-Hydroxybenzoesäure + y + + |
| Protocatechussäure-++ |
| Gentisinsdure |
| Anthranilsäure ~ + |
| p-Aminobenzoesäure--- |
Tabelle 3-6 Wachstum auf den ausgewählten Media nach dem Verfahren von K. K o m
a g a t a
| Nr. 2327 Nr. 103 CB-416 |
| Glukose + Ammo-+ + + + + |
| nium-Salz |
| p-Hydroxybenzoat + + + + |
| Glukose + Nitrat + + |
| Succinat + Nitrat-+ + + |
| Glutamat + + + + + + |
| (nach 7 Tagen |
| bei 30°C) |
Im Hinblick auf die Kulturmerkmale, wie sie oben beschrieben sind, und unter Bezugnahme
auf Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage), wird der Stamm Nr.
2327 als zur Gattung Pseudomonas gehörend identifiziert. Er wird jedoch als ein
neuer Stamm angesehen und
Pseudomonas pyrrocinia genannt, wobei die folgenden Merkmale
in Betracht gezogen werden : 1. Weder wasserlösliche noch wasserunlösliche Pigmente
werden gebildet, aber aus Glukonsäure wird 2-Ketoglukonsäure gebildet.
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2. Die Ausnutzung von Sacchariden, insbesondere Disacchariden, ist
hochgradig, und aus Laktose wird eine Säure gebildet.
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3. Im BCP-Milchtest wird Milch mit schwach saurem pH-Wert verflüssigt.
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4. Der optimale pH-Wert für das Wachstum liegt bei etwa 5 bis 6.
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Unter Bezugnahme auf das Handbuch von B e r g e y wird der Stamm
Nr. 103 als Pseudomonas ovalis identifiziert.
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Unter Bezugnahme auf das Handbuch von B e r g e y wird der Stamm
CB-416 als Pseudomonas Schuylkilliensis identifiziert.
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Das Fermentationsverfahren zur Erzeugung von Pyrrolnitrin kann auf
bequeme Weise als Schüttel-oder Submerszüchtung in einem üblichen flüssigen Nährboden
durchgeführt werden. Als Nährboden-Media können natürliche Media und synthetische
Media verwendet werden. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glycerin,
Glukose, Stärke, Rohrzucker, und geeignete Stickstoffquellen sind Peptonwasser,
Fleischextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate.
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Andere anorganische Salze, z. B. Phosphate, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat,
Calciumcarbonat, können zugefügt werden. Salze, die Ferri-oder Ferro-Ionen (z. B.
Ferrisulfat, Ferrosulfat) enthalten, können wirksam als anorganische Salze verwendet
werden, um die gewünschte Substanz in hoher Ausbeute zu erhalten. Geeignete Entschäumer,
z. B.
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Sojabohnen~l, Silikon usw., k~nnen, falls erforderlich, benutzt werden.
Die Bestandteile eines Nõhrmediums können wahlweise in Abhängigkeit von der Art
des Stammes, der gezüchtet wird, bestimmt werden. In der Regel kann die Züchtung
bei etwa 25 bis 37°C ausgeführt werden, und bei diesen Temperaturen erreicht die
Bildung des gewünschten Antibiotikums nach 2 bis 5 Tagen ein Maximum.
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Das in der Fermentationsbrühe angereicherte Pyrrolnitrin kann beispielsweise
dadurch isoliert werden, daß es mit einem geeigneten Lösungsmittel aus den Zellen
extrahiert wird, Verunreinigungen entfernt werden und die erhaltene Lösung auf geeignete
Weise konzentriert wird. Es können die allgemein auf dem Gebiet der Antibiotika-Industrie
verwendeten Extraktions-und Reinigungsverfahren angewandt werden, z. B. das Lösungsmittel-Extraktionsverfahren,
das Kohleverfahren und das Verfahren der chromatographischen Absorption. Nach beendeter
Züchtung werden beispielsweise mit einem Filter oder einer Zentrifuge die Zellen
von der Fermentationsbrühe abgetrennt, und die abgetrennten Zellen werden dann mit
Aceton oder einem ähnlichen Lösungsmittel unter Rühren extrahiert.
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Der Extrakt wird mit Aktivkohle gereinigt und dann unter vermindertem
Druck konzentriert. Das Konzentrat wird wiederum mit einem anderen Lösungsmittel,
z. B. Butylacetat oder Petrolbenzin, extrahiert. Der Extrakt wird mit wäßrigem Alkali
oder Säure gewaschen, filtriert und dann konzentriert.
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Die rohe ölige Substanz wird der Chromatographie unter Verwendung
von Aluminiumoxid unterworfen,
und die absorbierte Substanz wird
mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert, wobei eine konzentrierte Fraktion erhalten
wird, aus der mit Methanol-Cyclohexan oder einem ähnlichen gemischten Lösungsmittel
ein rohes kristallines Produkt erhalten werden kann. Nach Umkristallisation aus
einem Lösungsmittel wird das reine kristallisierte Produkt erhalten.
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Das erhaltene Produkt kristallisiert in Form von schwachgelben Plättchen
oder Nadeln. Es besitzt einen Schmelzpunkt von 125°C. Es ist die neue chemische
Verbindung 3- (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrol mit der Strukturformel
Das Molekulargewicht der Verbindung ist 257.
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Dieses Produkt zeigt keine Schmelzpunktemiedrigung, wenn es mit einer
Probe von 3- (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrol, die synthetisch hergestellt
wurde, gemischt wird. Andere physikalische und chemische Eigenschaften der Verbindung
werden weiter unten genannt.
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Die Verbindung ist löslich in Methanol, Äthanol, n-Propanol, n-Butanol,
Pentanol, Methylacetat, Athylacetat, Butylacetat, Pentylacetat, Aceton, Ather, Chloroform,
Eisessig, Essigsäureanhydrid, Petroläther, Petrolbenzin und Ligroin und wenig löstich
in Wasser und Cyclohexan.
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In bezug auf die Farbreaktionen des Produktes wird folgendes bemerkt
: Es ist positiv in der Ninhydrin-Reaktion (braun) und in der Tollens-und Pauly-Reaktion
(rot) und negativ gegenüber Fehlingscher Lösung (heiß oder kalt), alkoholischer
Silbernitrat-, Ferrichlorid-und 2, 4-Dinitrophenylhydrazin-Lösung. Konzentrierte
Schwefelsäure wird nicht verfärbt, wenn sie mit der Verbindung bei Zimmertemperatur
24 Stunden lang aufbewahrt wird. Die biologische Aktivität der Verbindung zeigt
keine Anderung, wenn sie in Benzol 30 Minuten lang auf 80°C erhitzt wird.
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Die Infrarotabsorption bei 3480 cm I bestätigt das Vorhandensein
eines Pyrrolkernes in der Verbindung. Dies wird ebenfalls bestätigt durch die Purpurverfärbung
der Verbindung bei der Ehrlich-Reaktion und durch das Kernresonanzspektrum.
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Weiterhin zeigt die bei 1530 und 1375 cm 1 erscheinende Infrarotabsorption
das Vorhandensein einer Nitrogruppe, Die ultraviolette Absorption der Verbindung
in Athanol ist A.., = 252 mli (p = 7500) (vgl. F i g. 1, 2 und 3).
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Zersetzungstests der Verbindung ergeben folgendes : 1. Oxydation
mit Chromtrioxyd und Ozonisierung der Verbindung ergeben ein Säureimid mit der Summenformel
C1oH404N2Cl2 und dem Schmelzpunkt 172°C.
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2. Oxydation der Verbindung mit Permanganat ergibt eine Karbonsäure
mit der Summenformel C7H404NCI und einem Schmelzpunkt von 232"C.
| Wachstumshemmende |
| Mindestkonzentration |
| y/ml |
| Staphylococcus aureus |
| 209 P................. 6, 2 |
| Bacillus subtilis PCI 219... 12, 5 |
| Escherichia coli.......... 250 |
| Pseudomonas aeruginosa.. 250 |
| Mycobacterium SP 607.... 250 |
| Aspergillus niger......... 12, 5 |
| Penicillium chrysogenum.. 0, 2 |
| Trichophyton asteroides... 0, 05 |
| Torula utilis............. 15, 0 |
| Candida albicans.......... 15, 0 |
Bei der Bioprüfung der Wirksamkeit einer Kultur sind Trichophyton asteroides und
Penicillium chrysogenum bevorzugte Mikroorganismen. Sabougraud Agar (Glukose 40/o,
Pepton 1%, Agar 1, 5"/o, pH 6, 5) wird als ein Schrägkulturmedium in ein Reagenzglas
gegeben. Nach Impfung wird 7 Tage lang bei 30°C bebrütet. Es werden 2, 5 ml steriles
Wasser zugefugt und die Zellen mit einer Platinschlinge abgekratzt, um eine Zellsuspension
zu bilden. Eine geeignete Menge der Zellsuspension wird zu Sabougraud Agar gegeben
und gleichmäßig verrührt. In an sich bekannter Weise werden Agarplatten für den
Bioversuch vorbereitet, wobei diese Suspension als obere Schicht verwendet wird.
Die Bebrütung für den Bioversuch wird bei 28 bis 30°C 40 Stunden lang durchgeführt.
Anschließend wird die antibiotische Wirksamkeit geprüft. Eine Verunreinigung mit
infizierenden Bakterien, die gelegentlich während der ziemlich langen Bebrütungszeit
möglich ist, kann durch Verdünnen der Testflüssigkeit mit einer 0, 1°/o Chloramphenikol
enthaltenden phosphorsäuregepufferten Lösung (pH 6, 0), wenn das Schalenverfahren
angewendet wird, oder, falls ein Pulpenverfahren angewandt wird, durch Verwendung
einer trockenen Pulpenscheibe, die vorher mit einer 0, 1°/o Chloramphenikol enthaltenden
methanolischen Lösung imprägniert wurde, verhindert werden.
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Wenn Pyrrolnitrin Mäusen intraperitoneal injiziert wird, hat es einen
LDso-Wert von 500 mg/kg.
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Wenn Pyrrolnitrin Ratten in einer Menge von 30 mg/kg täglich über
einen Zeitraum von 3 Monaten verabreicht wird, ist keine wesentliche Anderung in
der Kondition und in der Gewichtszunahme festzustellen.
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Pyrrolnitrin kann in verschiedenen medizinischen Anwendungsformen,
z. B. als Spraylösungen, Tinkturen, Salben, verwendet werden. Am bequemsten ist
die Anwendung in Form einer alkoholisch-wäßrigen Lösung. In dieser Form ist die
Verbindung stabil, sogar auch dann noch, wenn sie über 1 Jahr bei Zimmertemperatur
aufbewahrt wird. Zur örtlichen Anwendung ist Pyrrolnitrin in Konzentrationen von
0, 25 bis 3°/o ausreichend wirksam. .
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Wie Versuche gezeigt haben, weist Pyrrolnitrin gegenüber Griseofulvin
eine überlegene Wirkung auf. So hemmt es das Wachstum von Kulturen von Trichophyton,
Microsporum, Epidermophyten und Penicillium sps. in stärkerem Maße als Griseofulvin
(vgl.
The Journal of Antibiotics, Ser. A, Bd. 18, Nr. 5 [1965], S. 211 bis 219).
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Beispiel 1 Pseudomonas pyrrocinia Nr. 2327 wird auf ein Agarschrägnährkulturmedium
aufgeimpft, und die Bebrütung wird 48 Stunden lang bei 37°C durchgeführt. Unabhängig
davon werden 100 ml eines Kulturmediums, das durch Lösen von 1°/o Glukose, 5°/o
Fleischextrakt, 5% Polypepton und 2% Natriumchlorid in einer wäßrigen Lösung, enthaltend
Kaliumdihydrogenphosphat in 0, 2molarer und Natriumhydrogenphosphat in 0, 2molarer
Menge, hergestellt wurde, in einen 500-ml-Schüttelkolben gegeben und dann 15 Minuten
lang bei 120°C sterilisiert. Das durch die Schrägkultur erhaltene Inokulat wird
mit einer Platinschlinge in den Schüttelkolben eingeimpft. Das Schütteln der Kultur
des Inokulats wird bei 30°C 40 Stunden lang durchgeführt. Die so hergestellte Kulturbouillon
wird in einer Menge von 5 Volumprozent in einen Schüttelkolben eingeimpft, der das
sterilisierte Kulturmedium wie oben enthält. Diese Kultur wird 3 Tage lang bei 30°C
geschüttelt. Die Fermentationsbrühe wird durch Zentrifugieren bei 6500 U/Min. in
die Zellen und die überstehende Flüssigkeit getrennt. Der gebildete Zellkuchen wird
von der überstehenden Flüssigkeit entfernt und dazu 60%igues wäßriges Aceton in
einer Menge von einem Zwanzigstel des Volumens der Brühe gegeben. Es wird etwa 3
Stunden lang bei 50°C gerührt, wobei die gewünschte antibiotische Substanz durch
das Aceton extrahiert wird. Der Acetonextrakt wird durch Filtrieren gewonnen und
dann mit Aktivkohle versetzt. Es wird kurze Zeit gerührt, um die Verunreinigungen
an der Aktivkohle zu absorbieren. Nach Filtrieren wird der erhaltene Extrakt bei
etwa 40°C unter vermindertem Druck auf ein Fünftel seines Volumens eingedampft.
Die konzentrierte Flüssigkeit wird dreimal mit jeweils dem gleichen Volumen Butylacetat
extrahiert. Die Butylacetatschicht wird mit wäßrigem Alkali von pH-Wert 10 gewaschen
und dann konzentriert, wobei 100 mg öliges Material erhalten werden. Dieses wird
in Methanol gelöst und die erhaltene Lösung mit dem fünffachen Volumen Cyclohexan
versetzt. Die erhaltene Mischung wird im Eisschrank aufbewahrt. Das gewünschte Produkt
wird als gelber Niederschlag erhalten.
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Beispiel 2 In vier Glasgefäße (15 ml Inhalt) werden jeweils 8 ml
eines Kulturmediums gegeben, das 0, 5% Fleischextrakt, 0, 5°/o Pepton, 0, 2°/n Natriumchlorid
und 1% Glukose enthält und einen pH-Wert von 6, 0 aufweist, und es wird bei 120°C
20 Stunden lang sterilisiert. Das Inokulat (Pseudomonas pyrrocinia Nr. 2327), das
von dem gleichen wie im Beispiel 1 verwendeten Kulturmedium durch Schütteln einer
Kultur bei 30°C iiber 24 Stunden erhalten wurde, wird in einer Menge von 5 Volumprozent
in jedes der Gefäße eingeimpft. Die Bebrütung wird bei 28°C unter Rühren mit einer
Geschwindigkeit von 330 U/Min. durchgeführt, wobei sterilisierte Luft in die Gefäße
eingeleitet wird. Lebhafte Schaumbildung wird durch die tropfenweise Zugabe von
sterilisiertem Sojabohnenöl verhindert. Nach 48 Stun-
den wird die Fermentationsbrühe
abgetrennt, und die Zellen werden mittels einer Sharples-Zentrifuge gesammelt. Zu
dem erhaltenen Zellkuchen wird 70°/oiges wäßriges Aceton gegeben, wobei dessen Volumen
dem fünffachen Naßgewicht der gesammelten Zellen entspricht. Die erhaltene Mischung
wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann werden die Zellen
abfiltriert. Der Acetonextrakt wird unter vermindertem Druck konzentriert, wobei
ein weißes, trübes, flüssiges Konzentrat erhalten wird, das mit dem gleichen Volumen
Petrolbenzin extrahiert wird. Der erhaltene Extrakt wird nacheinander mit wäßrigem
Alkali, wäßriger Säure und Wasser gut gewaschen und dann konzentriert. Der erhaltene
konzentrierte Extrakt wird getrocknet und dann durch eine mit Aluminiumoxid gefüllte
Säule geschickt. Die am Aluminiumoxid absorbierte gewünschte antibiotische Substanz
wird gewaschen, indem Petrolbenzin und n-Hexan durch die Säule geschickt wird. Das
Eluieren wird mittels Benzol durchgeführt. Die Eluate, die gegen Trichophyton aktiv
sind, werden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein Sirup
erhalten wird. Dieser wird in Methanol gelöst.
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Die methanolische Lösung wird durch Filtrieren von Verunreinigungen
befreit. Dann wird Cyclohexan in einer Menge von 3 Teilen pro 1 Teil der methanolischen
Lösung zugegeben. Die Mischung wird in einem Eisschrank aufbewahrt, wobei ein gelber
Niederschlag erhalten wird. Dieser wird aus Methanol-Cyclohexan umkristallisiert.
Das reine kristalline Produkt wird in einer Menge von 50 mg erhalten.
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Beispiel 3 Pseudomonas ovalis Nr. 103 wird in ein Agarschrägnährkulturmedium
eingeimpft, und die Bebrütung wird bei 30° C 48 Stunden lang durchgeführt. 100 ml
eines flüssigen Kulturmediums, das 3% Glycerin, 1% Sojabohnenmehl, 0, 05°/0 Magnesiumsulfat,
0, 3°/o Natriumchlorid, 2, 18°/o Kaliumdihydrogenphosphat und 1, 43°/o Dinatriumhydrogenphosphat
(12 H20) enthält, werden in mehrere Schüttelkolben von jeweils 500 ml Inhalt gegeben.
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Bei 120°C wird 15 Minuten lang sterilisiert. In diese Kolben wird
eine auf einer Platinschlinge befindliche Menge des Inokulats der obigen Schrägkultur
eingeimpft. Die Schüttelkulturen werden 24 Stunden auf 30°C gehalten.
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In vier Glaskolben werden jeweils 81 des gleichen oben beschriebenen
Kulturmediums gegeben, und es wird 30 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Zu dem
so erhaltenen Kulturmedium wird das wie vorstehend beschrieben erhaltene Inokulat
mit einem Impfvolumen von 2°/o eingeimpft. Die Kultivierung' wird 24 Stunden lang
bei 30°C unter Rühren durchgeführt, wobei sterilisierte Luft in einer Menge von
etwa 8 I/Min. eingeleitet wird. Unter sterilen Bedingungen werden 301 der aus den
vier Gefäßen gewonnenen Kulturbouillon in 25001 des gleichen oben beschriebenen
Kulturmediums eingeimpft, das sich in einem 4000-1-Fermentationsgefaß aus rostfreiem
Stahl befindet. Das erwähnte Kulturmedium war 40 Minuten lang bei 120°C sterilisiert
und dann auf 30°C abgekühlt worden. Die Kultivierung wird 60 Stunden lang bei 30'C
unter Propellerrührung
mit einer Geschwindigkeit von 180 U/Min.
durchgefuhrty wobei sterilisierte Luft in das Gefäß in einer Menge eingeblasen wurde,
die in jeder Minute der Menge des Kulturmediums entspricht.
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Zu der Fermentationsbrühe werden etwa 2"/o Diatomeenerde gegeben.
Dann wird die Brühe in einer Filterpresse filtriert. Die gesammelten Zellen werden
mit 3001 Aceton versetzt. Die Extraktion wird durch 3 Stunden langes Rühren bei
40° C bewirkt. Diese Extraktion wird zweimal wiederholt.
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Der erhaltene Acetonextrakt wird unter vermindertem Druck bei 40°C
auf ein Zehntel seines Volumens eingedampft. Die konzentrierte Flüssigkeit wird
dreimal mit 160 1 Petrolbenzin extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird mit dem gleichen
Volumen Wasser gewaschen und mit Aktivkohle entfärbt. Dann wird er bei 40°C unter
vermindertem Druck eingedampft, wobei 700 g eines öligen Konzentrats erhalten werden.
Dieses wird mit 3 1 Athylacetat extrahiert. Der Extrakt wird zu einem öligen Produkt
konzentriert, das dann in 1500 ml n-Hexan gelöst wird. Die erhaltene Lösung wird
mit n-Hexan über 1600 g eines 100-mesh-Silikagels entwickelt, das sich in einer
Glaskolonne von 10 x 70cm befindet. Das Eluieren der wirksamen Substanz wird durch
Verwendung einer n-Hexan-Benzol-Mischung bewirkt.
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Die gegen Trichophyton aktiven Fraktionen werden gesammelt. Etwa 500
ml der gesammelten Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene
ölige Material wird mit n-Hexan versetzt, und die Mischung wird stehengelassen,
so daß etwa 11 g rohes kristallines Produkt erhalten werden. Dieses wird in etwa
200 ml Benzol gelöst und die erhaltene Lösung unter Verwendung von aktiviertem Magnesiumsilikat
der Säulenchromatographie unterworfen. Es wird mit Benzol eluiert.
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Die gelben Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck
eingeengt, wobei 10 g reines kristallines Produkt vom Schmelzpunkt 125°C erhalten
werden.
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Beispiel 4 Pseudomonas Schuylkilliensis CB-416 wird in eine Glycerin-Hefeextrakt-Agar-Schrägkultur
eingeimpft. Es wird bei 30°C 48 Stunden lang bebrütet.
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100 ml eines Kulturmediums, das 3°/o Glycerin, 1°/o Glutenmehl, 1°/o
getrocknete Hefe, 0, zozo Maisquellwasser (pH 7, 0) und 0, 025°/o FeSO4 7H20 enthält,
werden jeweils in zwei 500-ml-Schüttelkolben gegeben und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.
Das der Schrägkultur entnommene Inokulat wird mit der Flachspitze einer Platinschlinge
in die Kolben eingeimpft, und die Kultur wird 48 Stunden lang bei 30°C geschüttelt.
Die so erhaltene Kulturbouillon wird in 81 eines oben beschriebenen Kulturmediums
eingeimpft, das sich in einem 15-1-Fermentationsgefäß befindet, wobei das erwähnte
Kulturmedium 30 Minuten lang bei 120°C sterilisiert und dann abgekühlt worden ist.
Die Züchtung wird bei 30°C 96 Stunden lang unter Propellerrühren mit einer Geschwindigkeit
von 330 U/Min. durchgeführt, wobei sterilisierte Luft eingeleitet wird. Die so erhaltene
Fermentationsbrühe wird auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise behandelt, wobei
138 mg. reines kristallines Produkt vom Schmelzpunkt 125°C erhalten werden.