DE2164018B2 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von uricase - Google Patents

Description

IO

ii) Zu Beginn der Züchtung werden pleomorphe Stäbchen beobachtet, die, bedingt durch das »Schnappen« bei der Zellteilung als Zellen mit keulenförmigen Verdickungen, als natürliche verzweigte Formen, schwach gekrümmte Stäbchen und gewinkelte oder palisadenartige Formen vorliegen.

iii) Beträchtliche Größenunterschiede: 0,8 bis 1,2 und 1 bis 5 Mikron.

2. Begeißelung: fehlt.

3. Kapseln: fehlen.

4. Beweglichkeit: fehlt.

5. Endosporen: fehlen.

6. Gramfärbung: positiv.

7. Säurefestigkeit der Färbung: negativ.

B. Kulturmerkmale

1. Agarkolonien (nach 24stündiger Züchtung bei 30° C auf einem Agar-Nährboden): kreisförmig, flach, glatt, zusammenhängend, schwach glänzend und undurchsichtig, 3 bis 4 mm Durchmesser.

2. Agar-Ausstrich (nach 24stündiger Züchtung bei 3O⁰C auf einem Agar-^ährboden): fadenförmiges Wachstum oder geringe Ausbreitung, mäßiges Wachstum. Cremigweiß in jungen Kulturen bis schwachgeld in alten Kulturen.

3. Kulturbrühe (nach 24stündiger Züchtung bei 3O⁰C): Spärliches Oberflächenwachstum mit Ring, keine Sedimente.

4. Gelatine-Stichkultur (nach 4- bis 5tägiger Züchtung bei 20'C): Bestes Wachstum am oberen Ende, fadenförmig. Gelatine wird unter Schichtenbildung verflüssigt.

5. Lackmusmilch (nach 24stündiger Inkubation bei 30^cC): Keine Reduktion, schwach alkalisch, keine Koagulation.

15. Verhallen gegen freien Sauerstoff: aerob oder schwach fakultativ-anaerob.

16. Hämolyse: negativ.

17. Pathogenität: fehlt.

Die Fähigkeit zur Spaltung von Zuckern Alkoholen und Glycosiden ist in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle I

30 Arabinose Xylose ... Glucose ..
Mannose .
Fructose .
Galactose
Maltose .
Saccharose
Lactose ..
Trehalose

Sorbit

Mannit ..
Inosit ...
Glycerin .
Stärke ...
Dextrin ..
Inulin ...
Raffinose
Glycogen
Salicin ..

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C. Physiologische Merkmale

Wirkung auf Nitrate: Reduktion. Methylrot-Test: negativ oder schwach positiv. Voges-Proskauer-Test: negativ. Indolbildung: negativ.
Schwefelwasserstoff bildung: positiv. Stärkehydrolyse: negativ oder schwache Hydrolyse.

Verwertung von Natriumeitrat (Medium nach K ο s e r und Christensen): positiv. Verwertung von organisch gebundenem Stickstoff: positiv. Pigmentbildung: Es werden wasserunlösliche, schwach gelbliche bis braune Pigmente gebildet. Urease: negativ.
Oxidase: positiv.
Katalase: positiv.

. pH-Bedingungen: Wachstum erfolgt im pH-Bereich 5 bis 9,5; pH-Optimum: 7 bis 8. . Temperaturbedingungen (Schüttelkultur in Nährlösung):
i) Temperaturoptimum des Wachstums: 27 bis 35⁰C.

ii) Maximaltemperatur: 37 bis 40"C; kein Wachstum bei 42°C.

iii) Minimaltemperatur: 15°C.

iv) Zum Abtöten notwendige Zeit (Schüttelkultur in entrahmter Milch): 10 Minuten bei 52⁰C ausreichend; 10 Minuten bei 5O⁰C nicht ausreichend.

19. Besondere physiologische Merkmale: Hohe Aktivität bezüglich der induktiven Bildung von Uricase und der Akkumulation des Enzyms im Nährboden.

Wenn die vorstehend beschriebenen Merkmale gemäß der Klassifikation in »Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe (1957)«, überprüft werden, ist es angebracht, den Mikroorganismus in die Gattung Corynebacterium einzuordnen. Der beim Verfahren der Erfindung aussetzbare Mikroorganismus mit der ATCC-Nummer 21 749 kann jedoch nicht als einer bekannten Art angehörig identifiziert werden. Der vorliegende Mikroorganismus wird deshalb als einer neuen Art angehörig betrachtet. Die > Gründe hierfür sind nachstehend im einzelnen erläutert: Der vorliegende Mikroorganismus ist ein grampositives, aerobes Bacterium, das in Form nicht sporenbildender kleiner Stäbchen mit metachromatischen Granulatoren vorkommt und Pleomorphismus und »Schnappen« bei der Zellteilung aufweist. Es ist somit in die Familie Corynebacteriaceae einzuordnen. Der vorliegende Mikroorganismus ist ferner nicht pathogen und wirkt nicht hämolytisch; er ist nicht begeißelt, nicht beweglich und hat keine Filamente bildenden Formen. Er kann ferner keine Cellulose abbauen, unterliegt keiner Änderung bei der Gramfärbung und hat die gewöhnliche Hitzeverträglichkeit. Der vorliegende Mikroorganismus kann somit in die Gattung Corynebacterium eingeordnet werden. Der Mikroorganismus wurde weiterhin nicht aus Tieren, sondern aus pflanzlichem Material isoliert; er kann Nitrat zu Nitrit reduzieren und Gelatine verflüssigen. Es hat somit den Anschein, daß der vorliegende Mikro-

5 6

Organismus analog zu Corynebacterium rathayi oder verflüssigung, sondern auch in anderen physiolo-Corynebacterium agropyri ist. Aus der nachstehenden gischen Merkmalen beträchtlich unterscheidet Die Tabelle Π ist jedoch ersichtlich, daß der vorliegende Fähigkeit zur Gelatmeverflüssigung ist ein wichtiges Mikroorganismus sich Λ>η den vorgenannten analogen Kriterium bei der Klassifikation der analogen MikroArten nicht nur bezüglich der Fähigkeit zur Gelatine- 5 Organismen.

Tabelle II Vorliegender Mikroorganismus

ATCC 21 Corynebacterium
rathayi

Corynebacterium
agropyri

Gelatineverflüssigung

Gram-Färbung

Wachstum in Nährlösung ..
Wachstum in Lackmusmilch

Spaltung von Zuckern:

Glucose

Lactose

Saccharose

Stärkehydrolyse

stark positiv

mäßig

wird alkalisch, reduzierend, braun, Ring.

langsam positiv
schwach

wird alkalisch, reduzierend, gelb, Ring.

nicht beschrieben

keine
variabel
mäßig
unverändert
Sediment.

Da die Klassifizierung des vorliegenden Mikroorganismus in eine der vorgenannten Arten schwierig ist und der Mikroorganismus, wie bereits beschrieben, Harnsäure mit hoher Aktivität oxydativ abbaut, wird dieser neue Mikroorganismus als Corynebacterium uratoxidans nov. sp. bezeichnet. Der Stamm U-23 erhielt die FERM-P-Nr. 789 und die ATCC Nr. 21749.

Aus der natürlichen Quelle wurden 3 weiter: neue, Uricase produzierende Mikroorganismen U-8. U-30 und U-125 isoliert. Diese sind als Corynebacterium uratoxidans ATCC 21 750, Corynebacterium uratoxidans ATCC 21 751 und Corynebacteri an uratoxidans ATCC 21 752 hinterlegt. Obwohl zwischen den Stämmen geringe Unterschiede in untergeordneten

Merkmalen bestehen, gehören sämtliche dieser Stämme zu den coryneformen Bakterien und weisen alle als besonderes Merkmal eine hohe Uricasebildung auf. Die taxonomischen Merkmale dieser Stämme sind in der Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle Hl

Stamm ATCC 21 749 stamm
ATCC 21 750

Stamm
ATCC 21 751

Stamm
ATCC 21 752

Beweglichkeit

Begeißelung

Wirkung auf Nitrate

Pigmentbildung auf Agar-Nährboden

Gelatineverflüssigung

Aussehen der Kolonien auf Agar-Nährboden

fehlt fehlt starke Reduktion

schwachgelb stark

kreisförmig, flach, schwach glänzend

fehlt
fehlt
starke Reduktion

schwach gelblichbraun
stark

kreisförmig,
erhöht,
schwach
glänzend

fehlt
fehlt
starke Reduktion

schwach

cremfarben
stark

kreisförmig,
erhöht,
glänzend

fehlt
fehlt
starke Reduktion

gräulichweiß
stark

kreisförmig,
flach,
glänzend
(butterartig)

Die Stämme ATCC 21 750, 21 751 und 21 752 unterscheiden sich in anderen taxonomisch wichtigen, physiologischen Merkmalen nicht von Corynebacterium uratoxidans ATCC 21749. Diese Uricasi produzierenden Stämme wurden deshalb ebenfalls al; zur Art Corynebacterium uratoxidans gehörendf

7 8

Bakterien identifiziert. Der Stamm Corynebacterium insbesondere während der ersten 5 Stunden nach dem

uratoxidans ATCC 21 749 ist ein typischer Vertreter Züchtungsbeginn der Hauptkultur erfolgen,

dieser neuen Art. Das Züchten kann bei jeder Temperatur durch-

Die Herstellung von Uricase mittels der vorgenann- geführt werden, bei der die Mikroorganismen wachsen

ten Stämme wird gewöhnlich in aerober Submers- 5 können. Die Züchtungstemperatur beträgt erfindungs-

kultur durchgeführt. Dem Nährmedium kann jede gemäß vorzugsweise 20 bis 40° C und insbesondere 32

Kohlenstoff- und Stickstoff quelle zugesetzt werden, bis 37° C. Im Hinblick auf die Bildung beträchtlicher

die von den genannten Uricase produzierenden Mengen stabiler Uricase wird die Züchtung vorzugs-

Stämmen verwertet werden kann. Spezielle Beispiele weise nach Zugabe der Harnsäure noch weitere 30 bis

solcher Kohlenstoffquellen sind Glycerin, Glucose, io 50 Stunden durchgeführt. Die Züchtung erfolgt unter

Fructose, Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose, aeroben Bedingungen in Submerskultur oder in

Saccharose, Maltose, Lactose, Mannit, Dextrin, Schüttelkultur. Während des einstufigen Züchtens

Stärkehydrolysat und Melasse. Die Kohlenstoffquellen bilden die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorga-

können einzeln oder als Gemisch eingesetzt werden. nismen beträchtliche Mengen an Uricase und akku-

Spezielle Beispiele einsetzbarer Stickstoffquellen sind 15 mulieren diese nicht nur in den Zellen, sondern auch

Ammoniak, Harnstoff und verschiedene anorganische im extrazellulären Raum.

und organische Ammoniumsalze, wie Ammonium- Die Aktivität der aus den Zellen der erfindungs-

chlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat. gemäß eingesetzten Mikroorganismen erhaltenen Uri-

Ferner sind zur Züchtung der erfindungsgemäß ein- case (intrazelluläre Uricase) ist gleich oder höher als

gesetzten Mikroorganismen und zur Bildung beträcht- 20 die Aktivität der Uricase, die aus den nach den be-

licher Uricasemengen natürliche organische Nähr- kannten dreistufigen Verfahren erhaltenen Zellen

stoffe geeignet. Spezielle Beispiele solcher Nährstoffe erhalten wird. Somit kann auch die intrazelluläre

sind Hefeextrakt, Peptone, Fleischextrakt, Casein- Uricase in effektiver Weise isoliert werden,

hydrolysat, Maisquellflüssigkeit, Fischmehl oder ab- Wenn der vorstehend beschriebenen Nährlösung

gebautes Fischmehl und Quellwasser von Sojabohnen, »5 Alkohole mit 1 bis 8 C-Atomen zugesetzt werden, wird

Weizenkleie oder Humusboden. Diese Nährstoffe die Bildung von Uricase mit den im erfindungsgemäßen

können allein oder als Gemisch verwendet werden. Verfahren einzusetzenden Stämmen beträchtlich er-

Der Nährlösung werden ferner anorganische Salze, höht, und es werden große Mengen des gebildeten

wie einbasisches Kaliumphosphat, zweibasisches Ka- Enzyms von den Zellen ausgeschieden und in der

Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, 30 Nährlösung akkumuliert. Die Züchtung kann in der ^c;"»u(II)-chlorid oder Eisen(ill)- oder vorstehend beschriebenen Weise mit der Ausnahme

geeigneten Konzentrationen als durchgeführt

Hauptkultur

£5 ^^^SlÄ^r^cTinSn^ ³⁵ der l^Z^Z^Zjj^^f*

nicht immer erforderlich, die Nährlösung gleichzeitig

wird Es ist überraschend, dal) im einsumgca mit Harnsäure und den Alkoholen zu versetzen. Die „ . , j J·* „j,,« Frfindune unter Verwen- Züchtung der Mikroorganismen in den alkohol-

!"^^^A^S^S^^gS^ 40 haltigen Nährlösungen wird nach der Zugabe der dung der ^'^f^^^^J^^ _dieser Harnsäure noch 20 bis 40 Stunden durchgeführt,
die Uncasebildung bei ^Sm iSofquellen Durch die Zugabe der Alkohole wird, verglichen

anorganischen und/oder organischen Stickstottqueuen ^ ^ _Urjcasebif_{dung in} Abwesenheit von Alkoholen.

erhöht wird. _{d er}fi_ndungsgemäßen Ver- die Uricasebildung insgesamt beträchtlich gesteigeri

fa£ensTeeSi Äsung hat dif nachstehende 45 und die zur Züchtung benötigte Zeit verkürzt Fernei toSZSSSg (Swicht/Volumen): wird eine große Uncasemenge im extrazellulare,

0 1 bis 5% Ak Alkohole mit 1 bis 8 C-Atomen werden ζ. Β

Glycerin .""" V"1!V ηm hi*OS»/ Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Amylalkohol

einbasisches Kahumphosphat υ,υι ms v,j /„ ^ _{HexyIalkohol>} Heptylalkohol, Oktylalkohol und derer

Magnesiumsulfat ^υ>^{υι ms} y^l /0 Isomeren eingesetzt Vorzugsweise werden Alkohol«

Eisen(III)-chlorid 0,0005 bis 0,005% mit 3 bis 6 C-Atomen allein oder als Gemisch einge

TJ fwTtmlrt OiOl bis 1% setzt Vorzugsweise wird die Nährlösung mit 0,1 bi;

Heieex ι 3,0 Volumprozent Alkohol versetzt Wenn die Al

η _r „u VJ₁-Tt der Nährlösung beträgt 5,5 bis 9,0 55 koholkonzentration 3,0 Volumprozent übersteigt wire

J? T^'^SuSeSeta^tralen bis schwach das Wachstum der erfindungsgemäß eingesetzter

und hegt vorzugsweu*e im u Mikroorganismen gehemmt Das Temperaturoptimun

"¹SfSSdSSS*!: eÄgsgemäßen Verfah- »*****«"> in Gegenwart von Alkohol betrag

tens werden ^^S^L^SmSSSLZ 60 Der Einiuß des Alkoholzusatzes auf die Uricase

A*r vorstehend an- bildung ist in den nachstehenden Vergleichsversuchei [umsetzung gezüchtet Mit dieser beschrieben.

Vergleichsversuch 1

SS to]»*Ϊ ftSSKStaSiS ^6S Kne 1 Gewichts / Volumprozent Fleischextrakt

Nährlösung nut W>1 b* ^JJ^SS^ ₀,l Gewichts/Volumprozent einbasisches Kaliumphos

rmmsäuTSn^ren? S ersten 8 Stunden, phat, 0,02 Gewichts/Volumprozent Magnesiumsulfat

0,001 Gewichts/Volumprozent Eisen(IlI)-chlorid und 0,2 Gewichts/Volumprozent Hefeextrakt enthaltende Nährlösung vom pH 7,0 wird mit Corynebacterium uratoxidans ATCC 21 749 beimpft und 20 Stunden bei 30°C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Mit der so erhaltenen Anzuchtkultur wird in einer Konzentration von 1 Volumprozent eine 1 Gewichts/Volumprozent Glycerin, 0,10 Gewichts/Volumprozent einbasisches Kaliumphosphat, 0,02 Gewichts/Volumprozent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts/Volumprozent Eisen(IIl)-chlorid und 0,2 Gewichts/Volumprozent

IO

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Hefeextrakt enthaltende Nährlösung vom pH 7,0 beimpft. Die beimpfte Nährlösung wird bei 32° C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Nährlösung mit 0,3 Gewichts/Volumprozent Harnsäure versetzt. Eine andere Nährlösung wird ebenfalls 3 Stunden nach Beginn der Inkubation mit 0,3 Gewichts/Volumprozent Harnsäure und gleichzeitig mit 0,3 Volumprozent Pentanol-2 versetzt. Die Inkubation wird insgesamt 23 bzw. 40 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Uricaseaktivität pro ml Kulturbrühe, Einheit*)

mit Pentanol-2

insgesamt 23stündige

Inkubation ohne Pentanol-2

insgesamt 23stündige
Inkubation

insgesamt 40stündige
Inkubation

Uricase im Kulturnitrat

Uricase in den Zellen (zellfreier Extrakt)**)

Summe

2,3 (97,9 °/₀)

0,05 (2,1 o/₀) 2,35 (100 °/₀) 0,7 (87,5 o/o)

0,1 (12,5 °/„)
0,8 (100 °/₀)

1,20 (96 °/o)

0,05 (4°/₀)
1,25 (loo⁰/«)

*) 1 Einheit der Uricaseaktivität ist die Enzymmenge, die in 1 Minute bei 30⁰C in einem Boratpuffer (pH 9,0) 1 Mikromol Harnsäure

zu AHantion oxydiert.
**) Gesamtaktivität der intrazellulären Uricase in 1 ml der ursprünglichen Kulturbrühe.

Tabelle V

Wirkung des Zusatzes von 0,3 Volumprozent

eines Alkohols auf die Bildung extrazellulärer

Uricase, Uricase-Einheiten/ml Kulturnitrat

Aus der Tabelle IV ist ersichtlich, daß die Alkoholzugabe folgende Effekte hat:

1. Die Uricasebildung wird auf etwa das Doppelte erhöht.

2. Die Abscheidung der Uricase aus den Zellen in den extrazellulären Raum wird beträchtlich verstärkt.

40

Durch die Alkoholzugabe wird somit die Uricasemenge im extrazellulären Raum beträchtlich erhöht, und die Isolierung der im extrazellulären Raum akkumulierten Uricase kann folglich wesentlich leichter erfolgen.

Es hat den Anschein, daß die Zellen der Mikroorganismen durch den Alkoholzusatz in gewisser Weise verändert werden, wodurch die Permeation der Harnsäure, die ein Induktor für Uricase ist, in die Zellen erhält wird. Hierdurch wird die induktive Urocasebildung verstärkt und die Abscheidung der Uricase aas den Zellen erhöht.

Es ist bekannt, daß organische Lösungsmittel, wie Toluol, Chloroform und Essigsäureäthylester, und oberflächenaktive Mittel die Oberflächenschichten von Zellen von Mikroorganismen verändern und den Austritt von Zeilinhaltsstoffen bewirken. Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen sind diese Verbindungen jedoch nicht wirksam; nur die vorgenannten Alkohole üben eine bemerkenswerte Wirkung aus.

Vergleichsversuch 2

Die Wirkungen der Zugabe verschiedener Alkohole Ähnliche Wirkungen der Alkoholzugabe werd

zu der Nährlösung werden unter denselben experimen- 65 auch mit den anderen erfindungsgemäßen Miki teilen Bedingungen wie im Vergleichsversuch 1 unter- Organismen erhalten.

sucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammen- Die Uricase kann nach beendeter Züchtung aus c

gestellt. Kulturbrühe nach jeder bekannten Methode isoli

Alkohol	Insgesamt 23stündige Inkubation	Insgesamt 4Ostündige Inkubation
n-Propanol iso-Propanol n-Buianol iso-Butanol sek.-Butanol tert.-Butanol η-Amylalkohol iso-Amylalkohol 3-Methylbutanol sek.-Amylalkohol (Diäthylcarbinol) sek.-n-Amylalkohol (Pentanol-2) sek.-iso-Amylalkohol tert.-Amylalkohol sek.-Hexanol (Methyl-iso- butylcarbinol) Keine Alkoholzugabe (Kontrolle)	0,9 0,9 1,0 1,2 1,3 1,0 2,0 2,2 0,8 2,2 2,3 1,5 0,9 1,3 0,7	1,3 1,5 1,2 1,2 1,3 1,5 2,1 2,1 1,3 2,2 2,4 1,6 1,3 1,4 1,2

11 * 12

werden. Da im erfindungsgemäßen Verfahren die Beispiel 2

Uricase hauptsächlich als extrazelluläres Enzym vorliegt, wird eine Rohenzymlösung durch Entfernen der 700 ml einer Nährlösung, die 1 Gewichts/Volum-Zellen aus der Kulturbrühe erhalten. Die so erhaltenen prozent Glycerin, 0,1 Gewichts/Volumprozent ein-Kulturfiltrate oder die daraus hergestellten lyophili- 5 basisches Kaliumphosphat, 0,02 Gewichts/Volumprosierten Pulver können als Rohenzym verwendet zent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts/Volumprozent werden. Eisen(III)-chlorid und 0,2 Gewichts/Volumprozent

Die Rohenzymlösung wird, falls notwendig, konzen- Hefeextrakt enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat, triert und dann zur Ausfällung des Enzyms mit einem werden in einem 5 1 fassenden konischen Gefäß wie im Lösungsmittel, wie Aceton oder einem Alkohol, ver- xo Beispiel 1 sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung wird setzt oder z. B. mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, mit 3,5 ml einer Anzuchtkultur von Corynebacterium wobei ein Rohenzympräparat erhalten wird. uratoxidans ATCC 21 749 beimpft, dir durch 12stün-

Zur Extraktion der intrazellulären Uricase werden diges Vorinkubieren in einer Nährlösung der vordie Zellen in üblicher Weise aufgebrochen oder mit stehenden Zusammensetzung hergestellt wurde. Die bakteriolytischen Enzymen behandelt. Die Zellen 15 Inkubation wird bei 30⁰C auf einer Rotationskönnen auch mit Toluol geschüttelt oder zusammen Schüttelmaschine (150 UpM) durchgeführt,
mit Toluol stehengelassen werden, wobei Autolyse 2 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die

eintritt. Die so erhaltene Lösung wird zur Entfernung Kulturbrühe mit einer Suspension von 2,1 g Harnsäure der festen Bestandteile filtriert oder zentrifugiert. Falls in 10 ml 70volumprozentigem Äthanol und 2,1 ml isonotwendig, werden die Nucleinsäuren in bekannter ao Amylalkohol versetzt. Die Inkubation wird weitere Weise aus der erhaltenen Lösung entfernt. Die Lösung 22 Stunden fortgesetzt, wobei dann 650 ml eines Kulturwird dann zur Fraktionierung z. B. mit Ammonium- filtrats mit einer Uricaseaktivität von 2,3 Einheiten/ml sulfat, einem Alkohol oder Aceton versetzt. Das aus- erhalten werden.

gefallene Material wird gesammelt und gegen eine 6,5 1 des so erhaltenen Kulturnitrats mit einer Uri-

Pufferlösung, z. B. gegen einen Boratpuffer, dialysiert. »5 caseaktivität von 2,3 Einheiten/ml werden auf eine Das Dialysat wird lyophilisiert, wobei ein Rohenzym- vorher mit 1/25-m-Boratpufferlösung (pH 9,0) gepräparat erhalten wird. Zur weiteren Reinigung dieses pufferte Diäthylaminoäthylcellulose-Säule (4 · 50 cm) Rohenzympräparats bieten sich dem Fachmann die gegeben. Die Säule wird mit der vorgenannten Puffernachstehenden Methoden allein oder in Kombination lösung gewaschen und dann mit einem Natriuman: Chromatographie an einem Ionenaustauscher, wie 30 chloridgradienten (0 bis 0,7 m) eluiert, wobei die Uri-Diäthylaminoäthylcellulose oder Triäthylaminoäthyl- case bei einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 cellulose. Gelfiltration an einem üblichen Molekular- bis 0,45 m erhalten wird. Die aktiven Fraktionen sieb, Adsorption-Elution an Hydroxyapatit oder Elek- werden vereinigt, wobei 540 ml einer Enzymlösung trophorese mit Polyacrylamidgel. Auf diese Weise mit einer Uricaseaktivität von 19,4 Einheiten/ml erkann ein hochgereinigtes Enzympräparat hergestellt 35 halten werden,
werden. Diese Enzymlösung wird der Acetonfällung unter-

Die Beispiele erläutern die Erfindung. worfen. Die bei einem Acetongehalt von 50 bis

75 Volumprozent erhaltenen Niederschläge werden

Beispiel 1 isoliert und dann in einer 1/25-m-Boratpufferlösung

40 (pH 9,0) gelöst. Nach dem Abzentrifugieren unlös-

800 ml einer Nährlösung, die 1 Gewichts/Volum- licher Bestandteile werden 15 ml einer Enzymlösung prozent Glycerin, 0,1 Gewichts/Volumprozent ein- mit einer Uricaseaktivität von 627 Einheiten/ml erbasisches Kaliumphosphat, 0,02 Gewichis/Volumpro- halten.

zent Magnesiumsulfat, 0,001 Gewichts/Volumprozent Die so erhaltene Enzymlösung wird der Gelfiltration

Eisen(lli)-chiorid und 0,2 Gewichts/Volumprozent 45 an einer Säule aus vernetzten! Dextran (4 -95 cm) Hefeextrakt enthält und einen pH-Wert von 7 hat, unterworfen. Die aktiven Fraktionen werden verwerden in einem 51 fassenden konischen Gefäß 15 Mi- einigt, wobei 156 ml einer gereinigten Enzymlösung nuten bei einem Druck von 1 atü sterilisiert. Die mit einer Uricaseaktivität von 41,14 Einheiten/ml sterilisierte Nährlösung wird mit 8 ml einer Anzucht- und einer Gesamturicaseaktivität von 6573 Einheiten kultur beimpft, die durch 24stündiges Vorinkubieren 50 erhalten werden. Die Ausbeute der Uricaseaktivität von Corynebacterium uratoxidans ATCC 21 749 in in der gereinigten Enzymlösung beträgt etwa 44 Proeiner Nährlösung der vorstehend angegebenen Zu- zent, bezogen auf die Uricaseaktivität des Kultursammensetzung erhalten wurde. Die Inkubation wird filtrats. Die spezifische Aktivität der so hergestellten bei34°CineinerRotationsschüttehnaschine(150UpM) Uricase beträgt 23,36 Einheiten/mg Protein,
durchgeführt. 55

3Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Beispiel 3

Kultarbrühe mit einer Suspension von 2,4 g Harnsäure

in 30 ml sterilem Wasser versetzt. Die Inkubation wird 151 einer Nährlösung, die 1 Gewichts/Volumprozent

weitere 40 Stunden fortgesetzt, wobei dann 750 ml Glycerin, 0,1 Gewichts/Volumprozent einbasisches Kaeines Kulturfiltrates mit einer Uricaseaktivität von 60 liumphosphat, 0,02 Gewichts/Volumprozent Magne-1,2 Einheiten/ml erhalten werden. siumsulfat, 0,001 Gewichts/Volumprozent Eisen(III)-

Das Kulturnitrat wird auf 150 ml eingeengt und chlorid und 0,2 Gewichts/Volumprozent Hefeextrakt dann der Acetonfällung unterworfen. Die bei einem enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat, werden in Acetongehalt von 50 bis 70 Volumprozent erhaltene einem 301 fassenden Fermenter aus Glas 15 Minuten Fällung wird isoliert, wobei 155 mg rohe Uricase in 65 bei einem Druck von 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Pulverform erhalten werden. Das Präparat hat eine Nährlösung wird mit 200 ml einer Anzuchikultur be-Uricaseakttvität von etwa 4,1 Einbeiten/mg Protein impft, die durch Vorinkubieren von Corynebacterium and eine Gesamturicaseaktivität von 630 Einheiten. uratoxidans ATCC 21 749 in einem konischen Gefäß,

das eine Nährlösung der vorstehenden Zusammensetzung enthält, erhalten wurde. Die Inkubation wird bei 30⁰C unter Rühren mit 200 UpM und einer Belüftung von 10 Liter/Minute durchgeführt.

3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Kulturbrühe mit einer Suspension von 30 g Harnsäure in 100 ml 70volumprozentigem Äthanol und 45 ml iso-Amylalkohol versetzt. Die Inkubation wird weitere 20 Stunden fortgesetzt, wobei dann 14,21 eines Kulturfiltrats mit einer Uricaseaktivität von 2,2 Einheiten/ml erhalten werden. Die Gesamtmenge der erhaltenen Zellmasse beträgt 5,6 g, bezogen auf das Trockengewicht. Die Zellen werden einer 5minutigen Ultraschallbehandlung (20 kHz) unterworfen. Die so erhaltene intrazelluläre Uricaseaktivität beträgt 120 Einheiten/g Zellmasse, bezogen auf das Trockengewicht.

141 des Kulturfiltrats werden auf eine vorher mit einer 1/25-m-Boratpufferlösung (pH 9,0) gepufferte DiäthylaminoäthylceÜulose-Säule (4 · 90 cm) gegeben. Die Säule wird mit etwa 51 einer Pufferlösung der vorstehenden Zusammensetzung gewaschen und dann mit einem Natriumchloridgradienten (0 bis 0,7 m) eluiert, wobei die Uricase bei einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 bis 0,45 m erhalten wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, wobei eine gereinigte Enzymlösung mit einer Uricaseaktivität von 8,5 Einheiten/mg Protein und einer Gesamturicaseaktivität von 26180 Einheiten erhalten wird. Die gereinigte Lösung wird dann gegen eine 1/50-m-Boratpufferlösung (pH 9,0) dialysiert und dann lyophilisiert, wobei etwa 3 g rohe Uricase in Pulverform erhalten werden.

Beispiel 4

Die Stämme Corynebacterium uratoxidans ATCC

ίο 21750, — 21751 und — 21752 werden jeweils in Gegenwart oder in Abwesenheit von Pentanol-2 oder isoAmylalkohol inkubiert. Die Inkubation wird in 800 ml einer sterilisierten Nährlösung mit der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung in einem 51 fassenden konischen Gefäß durchgeführt. Die Nährlösung wird mit jeweils 8 ml Anzuchtkultur der vorgenannten Stämme beimpft. Die Inkubation wird in sämtlichen Fällen auf einer RotationsschüUelmaschine (150UpM) bei der in der nachstehenden Tabelle VI

ao angegebenen Inkubationstemperatur und Inkubationszeit durchgeführt. 3 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die jeweilige Kulturbrühe mit Harnsäure oder mit Harnsäure und Alkohol in Mengen von 2,4 g Harnsäure bzw. 2,4 ml Alkohol versetzt. Die

as Uricaseaktivitäten im Kulturfiltrat der vorgenannten Stämme sind in der Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Alkohol

Pentanol-2

Corynebacterium uratoxidans

ATCC 21 750

iso-Amylajkohol

Corynebacterium uratoxidans

ATCC 21 751

Pentanol-2

iso-Amylalkohol

Corynebacterium uratoxidans
ATCC 21 752

iso-Amyl-Pentanol-2 alkohol

Inkubationstemperatur,

^eC

Inkubationszeit, Stunden
Uricaseaktivität, Einheiten/ml Kulturfiltrat..

30 24

1.8

30 24

1,6

34 40

30 24

1,5

30 24

1,9

34 40

1,2

30 24

1,9

30 24

1,2

34 40

Claims (3)

1 2 Demgegenüber ist ein mikrobiologisches Verfahren Patentansprüche: im Vorteil, das zur Produktion von Uricase in guter Ausbeute in einem Nähnnedivm bei üblichen Tempe-

1. Verfahren zur Herstellung von Uricase durch raturen befähigt ist, wobei die Herstellung von Uricase aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem 5 nach einem einstufigen Verfahren erfolgt, d. h. bei dem Harnsäure enthaltenden Nährmedium bei hierfür die aerobe Zellzüchtung, die induktive Produktion des üblichen Temperaturen und pH-Werten und durch Enzyms und die Abgabe des Enzyms in den extraIsolierung der Uricase in an sich bekannter Weise, zellulären Raum gleichzeitig erfolgt- Ein solches eindadurch gekennzeichnet, daß man stufiges Verfahren ist jedoch bereits bekannt Vor als Mikroorganismus Corynebacterium uratoxi- io kurzem wurde nämlich ein einstufiges Verfahren zur dans — ATCC 21 749, — ATCC 21 750, — Herstellung von Uricase mittels Bacillus fastidiosus ATCC 21751 oder — ATCC 21 752 einsetzt. (Analytical Biochemistry, Bd. 38, 1970, S. 65) be-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- schrieben. Zur Durchführung dieses Verfahrens sind zeichnet, daß man dem Nährmedium noch min- jedoch große Mengen an Nährstoff en und an Harnsäure destens einen Alkohol mit 1 bis 8 C-Atomen, vor- 15 und lange Züchtungszeiten erforderlich. Ferner ist die zugsweise mit 3 bis 6 C-Atomen, zusetzt Ausbeute an Uricase gering.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- Ausgehend von diesem Stand der Technik besteht zeichnet, daß man eine Nährlösung einsetzt, die die Erfindung nun in einem Verfahren zur Her-0,1 bis 3,0 Volumprozent Alkohol enthält. stellung von Uricase durch aerobes Züchten eines

ac Mikroorganismus in einem Harnsäure enthaltenden

Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und

pH-Werten und durch Isolierung der Uricase in an sich bekannter Weise, das dadurch gekennzeichnet ist,

Uricase (Urate: (^-oxidoreductase EC 1.7.3.3) ist daß man als Mikroorganismus Corynebacterium

ein Enzym, das Harnsäure oxidativ in Allantoin über- 35 uratoxidans — ATCC 21 749, — ATCC 21 750, —

führen kann. Dieses Enzym ist in der Medizin und ATCC 21 751 oder — ATCC 21 752 einsetzt,

insbesondere in der auf biochemischen Befunden Uricase wird in diesem einstufigen Verfahren der

basierenden Diagnose von Wichtigkeit, da es zur Erfindung mit guten Ausbeuten hergestellt,

quantitativen Bestimmung von Harnsäure im Serum Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hat, ver-

oder im Urin verwendet werden kann. 30 glichen mit dem bekannten einstufigen Verfahren, die

Uricase wurde bisher hauptsähclich aus tierischen Vorteile, daß die als Induktor dienende Harnsäure Organen gewonnen, und bei der Extraktion und und die Nährstoffe in geringen Konzentrationen einReinigung des Enzyms traten zahlreiche Schwierig- gesetzt werden können und daß die Züchtungszeit verkeiten auf. Es wurde dehalb versucht, Uricase unter kürzt wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung von Mikroorganismen herzustellen. Als 35 werden beträchtlich hohe Uricaseausbeuten erhalten. Mikroorganismen wurden z. B. Hefen der Gattung Erfindungsgemäß kann somit Uricase bei kurzer Züch-Candida (Agricultural and Biological Chemistry, tungszeit in hoher Reinheit und mit guten Ausbeuten Bd. 31, 1967, S. 1256), Bakterien der Gattungen hergestellt werden. Die erhaltene Uricase ist stabil.
Micrococcus und Brevibacterium (Journal of Fermen- Bei der genauen Untersuchung der Bedingungen, tation Technology [Japan], Bd. 44, 1966, S. 789), 40 unter denen die erfindungsgemäß eingesetzten neu Bakterien der Gattung Arthrobacter (japanische aufgefundenen Stämme Uricase produzieren, wurdt. Patentveröffentlichung Nr. 8062/69), Bakterien der festgestellt, daß sich die Leistungsfähigkeit des erfin Gattung Pseudomonas (Journal of General Micro- dungsgemäßen Verfahrens durch den Zusatz minbiology, Bd. 17, 1957, S. 1), Bakterien der Gattung destens eines Alkohols mit 1 bis 8 C-Atomen, vor-Streptomyces (Journal of the Agricultural Chemical 45 zugsweise mit 3 bis 6 C-Atomen, zum Nährmedium Society of Japan, Bd. 41, 1967, S. 540) und Pilze der noch beträchtlich erhöhen läßt. Die Durchführung Gattung Neurospora (Archives of Biochemistry and des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem solchen Biophysics, Bd. 70, 1957, S. 603) eingesetzt. Alkoholzusatz stellt somit eine bevorzugte Ausfüh-

Die aus diesen Mikroorgan'smen stammende Uricase rungsform dar. Die erfindungsgemäß eingesetzten

ist ein Enzym, dessen Biosynthese durch Harnsäure 50 Mikroorganismen akkumulieren beträchtliche Mengen

induziert wird, und im allgemeinen wird die Bio- von Uricase im extrazellulären Raum, so daß sich das

synthese der Uricase leicht durch die Kulturbedin- Enzym in vorteilhafter Weise aus dem Kulturfiltrat

gungen beeinflußt. Ferner akkumulieren diese Mikro- gewinnen läßt.

Organismen Uricase im wesentlichen in den Zellen. Der Stamm Corynebacterium uratoxidans ATCC

Zur Isolierung des Enzyms müssen die Zellen deshalb 55 21 749 ist ein neuer, aus Humus isolierter Stamm,

aufgebrochen oder lysiert werden. dessen mikrobiologische Eigenschaften nachstehend

Die Herstellung von Uricase mittels der vor- beschrieben sind. Diese Eigenschaften werden gemäß

genannten Mikroorganismen basiert auf einem drei- den Testverfahren in »Manual of Microbiological

stufigen Verfahren, wobei in der ersten Stufe die Züch- Methods« (Society of American Bacteriologists,

tung der Zellen, in der zweiten Stufe nach dem Ernten 60 McGraw—Hill Book Company, Inc., New York, 1957)

der gezüchteten Zellen die induzierte Produktion von bestimmt.

Uricase in Gegenwart von Harnsäure und in der _{A Mikrosk ische} Beobachtungen (bis 48stün-

dr.tten Stufe schließlich die Abtrennung und Reinigung _{dj Züchtu}J _{auf Agar}__Nänrb*_den bei 30° Q

der in den Zellen produz,e*-n Uricase erfolgt. Die ⁸ e, β

dritte Stufe ist mit. beträchtlichen Schwierigkeiten ver- 65 1· Zellmorphologie:

bunden, da in den Zellen zahlreiche Proteinarten und i) Gerade bis leicht gekrümmte oder ellipsenandere Enzyme in großen Mengen enthalten sind. Die förmige Stäbchen mit metachromatischen Leistungsfähigkeit dieses Verfahrens ist somit gering. Granulaten.