DE2431297C3

DE2431297C3 - Biochemisches Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären ß- Galactosidase, welche säureaktiv und säurestabil ist

Info

Publication number: DE2431297C3
Application number: DE19742431297
Authority: DE
Inventors: Akira Kawaguchi Saitama Kiuchi; Yuji Tokio Tanaka
Original assignee: Tokyo Tanabe Co Ltd
Current assignee: Tokyo Tanabe Co Ltd
Priority date: 1974-06-27
Filing date: 1974-06-27
Publication date: 1978-06-01
Also published as: DE2431297B2; DE2431297A1

Description

Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären ß-Galaciosidase, welche säureaktiv und säurestabil ist.

/i-Galactosidase ist ein Enzym, welches die Hydrolyse von Lactose unter Bildung von Galactose und Glucose katalysiert. Die Lactose ist eine der Hauptbestandteile der Milch und von Milch abgeleiteten Produkten, welche schon immer wichtige Nahrungsstoffe von Mensch und Tier waren. Wenn auch Lactose im allgemeinen im lebenden Körper nach Hydrolysierung unter Bildung von Glucose und Galactose durch die /J-Galactosidase verdaut werden kann, welche normalerweise in den Darmsäften und der Mucose vorkommt, haben neuere Untersuchungen gezeigt, daß ein bedeutender Anteil der menschlichen Bevölkerung unter /ϊ-Galactosidase-Mangel oder Lactose-lntoleranz leidet, wobei im Falle der Aufnahme von Lactose-haltiger Diät Erbrechen oder Durchfall auftritt.

Eine /i-Galactosidase-Präparation ist anwendbar zur Erholung oder Verhinderung solcher Erbrech- oder Durchfallerscheinungen infolge dieses Enymmangcls oder der Lactose-Unverträglichkeit. Demzufolge ist es nötig, daß die Enzym-Präparation so säurestabil ist, daß die Aktivität derselben nicht durch die Azidität des Magensaftes im Falle der oralen Verabreichung dieser Präparation herabgesetzt wird.

Die obenerwähnte jS-Galactosidase ist seit langem bekannt; viele Studien berichten über die Herstellung derselben aus den Kulturmaterialien von Bakterien, Hefen und Pilzen und aus Pflanzen- oder Tierkörpern sowie über die Eigenschaften derselben. Die physikochemischen und enzymologischen Eigenschaften solcher j9-Galactosidasen unterscheiden sich jedoch voneinander je nach der Herkunft, aus welcher sie hergestellt worden sind, was für alle Arten von Enzympräparationen zutrifft.

Im einzelnen werden nach der Literatur verschiedene Arten von Mikroorganismen, wie

Saccharomyces fragilis, Torulopsis spherica,
Zygosaccharomyces lactis, Torulopsis lactis,
Torula utilis, Candida pseudotropicalis,
Lactobacillus bulgaricus, Aspergillus oryzae,
Aspergillus niger, Aspergillus flavus,
Penicillium notatum

und ähnliche als Ursprungsmaterial beschrieben, aus welchem jS-Galactosidasen stammen können, jedoch haben die meisten der hierdurch hergestellten 0-Galactosidasen ein optimales pH auf der alkalischen Seite oder im schwach sauren Bereich, und die meisten dieser herkömmlichen jS-Galactosidase-Präparationen enthalten ferner andere Enzyme im Gemisch mit dieser, zum Beispiel Proteasen und Amylasen, welche eher die vorherrschenden Komponenten in dem Gemisch sind.

40

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so

ho Neuerdings wurde geoffenbart, daß eine säurestabile /Ϊ-Galactosidase aus dem gezüchteten Material von Aspergillus niger hergestellt worden ist, welche /J-Galactosidase das optimale pH auf der sauren Seite hat (siehe US-PS 36 29 073). Es findet sich keine Beschreibung bezüglich der sich ansammelnden Enzymmenge in dem gezüchteten Material von Aspergillus niger in dieser Veröffentlichung, und außerdem ist anhand von hiermit durchgeführten Mikroversuchen erkannt worden, daß die sich ansammelnde Menge der 0-Galactosidase ziemlich niedrig liegt.

Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären /i-Galactosidase, welche säureaktiv und säurestabil ist, zu schaffen, das eine hohe Ausbeute liefert.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß man den Mikroorganismus Aspergillus oryzae ATCC 20 423 in einem festen oder flüssigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20-45⁰C züchtet und daß man die/i-Galactosidase aus diesem Material isoliert.

Die Erfindung geht im einzelnen aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen hervor, in welchen

Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäß hergestellten /9-Galactosidase und

F i g. 2 das Infrarotabsorptionsspektrum der erfindungLgemäß erhaltenen j9-Galactosidase im KBr-Preßling zeigt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Aspergillus oryzae-Stammes ATCC 20 423, welcher im erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommt, sind wie folgt: (I) Morphologische Eigenschaften:

Die Mycellen von 1 -2 mm Länge wachsen dicht. Die Conidiophorenspitze ist subglobulär und bildet ein Bläschen mit einer Breite von 20 — 40 μ. Das Bläschen trägt eine Anzahl Sterigmata einer Größe von 15 —25χ6-8μ; Conidia mit einer Größe von 6 — 8 μ werden auf den Sterigmataspitzen erhalten. Die Oberfläche der Conidia ist glatt, während die Oberfläche der Conidiopho~en rauh ist, insbesondere im Bereich nahe dem Bläschen. Es wird kein Perithecium gebildet.
(II) Züchtungscharakteristika (nach 10 Tagen Kultivierung bei 30⁰C, wenn nichts anderes angegeben ist):

(1) Malzextrakt-Agarmedium: Wächst gut, die Kolonie ist grünlich-braun und trägt reichlich samtartige Luftmycellen. Keine Erzeugung von löslichem Pigment.

(2) Czapeks Agarmedium: Wächst normal, die Kolonie ist braun und trägt reichlich samtartige Luftmycellen. Keine Erzeugung von löslichem Pigment.

(3) Kartoffeldextrose-Agarmedium: Wächst gut, die Kolonie ist grünlich-braun und trägt reichlich samtartige Luftmycellen. Keine Erzeugung von löslichem Pigment.

(4) Gelatinemedium (gezüchtet bei 25°C): Wächst normal oder schwach, die Kcionie ist tiefbraun. Langsame Verflüssigung.

(Ill) Physiologische Eigenschaften:

(1) Temperaturbereich zum Wachstum: 20-45⁰C.

(2) Optimaler Temperaturbereich zum Wachstum: 30- 35'C.

(3) Optimales pH zum Wachstum: pH 4-6.

(4) Gelatineverfliissigung: langsam.

(5) Nutzbarkeit von Äthanol: langsam.

(6) Zersetzung von Pektin: langsam.

(7) Zersetzung von Tannin: langsam.

(8) Nutzbarkeit von Kohlenstoffquellen: Nutzt Arabinose, Xylose, Glucofe, Mannose, Galactose. Fructose, Maltose, Saccharose, Melibiose, Trehalose, Raffinose, Inulin, Dextrin und Stärke, nutzt jedoch nicht Cellulose.

Die oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften werden verglichen mit den von K. B. R a ρ e r und D. I. Fe η η e 11 in »The Genus Aspergillus«, S. 370 (1965), und Kin-ichiro Sakaguchi und Koichi Yamada: Nippon Nogeikagaku Kaishi, Japan, 20, S. 65 und 141 (1944), beschriebenen Eigenschaften, woraus zu entnehmen ist, daß der dortige Stamm zur Gattung »Aspergillus oryzae« gehört. Der bedeutende Unterschied zu den herkömmlichen, zur Gattung »Aspergillus oryzae« zählenden Stämmen liegt jedoch in der Tatsache begründet, daß der erfinoungsrelevante Stamm eine merkliche Menge an säurestabiler /?-Galactosidase in seinen Kulturmaterialien ansammelt.

Die Züchtung des obenerwähnten Stamms Aspergillus oryzae ATCC 20 423 im erfindungsgemäßen Verfahren wird entweder als Submerskulutur unter Anwendung flüssiger Medien oder als Oberflächenkultür unter Anwendung fester Medien unter aeroben Bedingungen, beispielsweise bei einer Tempi, ratur von 25-30⁰C, durchgeführt. Als Kohlenstoffquellen im Falle der Anwendung flüssiger Medien werden vorzugsweise verwendet Glucose, Dextrin, Saccharose und ähnliche, und als Stickstoffquellen vorteilhafterweise solche organischen oder anorganischen Materialien, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Kartoffelextrakt, Malzextrakt, Casein, Ammoniumeitrat, Ammoniumtartrat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat und ähnliche. Außerdem können dem Medium geeignete mineralische Materialien, wie Natriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze, Magnesiumsalze, Phosphorsäuresalze und ähnliche, zugefügt werden.

Andererseits können als feste Medien Materialien verwendet werden, die bisher schon allgemein Anwendung fanden, d. h. Weizenkleie, Sojabohnenmehl, Reiskleie und ähnliche; gegebenenfalls können die Stickstoffquellen und/oder die mineralischen Materialien, die im Falle der Verwendung flüssiger Medien Erwähnung fanden, dem festen Medium zugegeben werden. Die Oberflächenkuitur unter Benutzung des festen Mediums kann praktisch mittels entweder einer Festkulturapparatur vom Belüftungstyp oder einer Festkulturapparatur vom Rotationstrommeltyp ausgeführt werden. Eine solche Festkultur des Mikroorganismus ist erfindungsgemäß in 3 —7 Tagen von Beginn der Züchtung an beendet. Erfindungsgemäß ist die Festkultur der Flüssigkultur sowohl bezüglich des Organismenwachsturns als auch der Erzeugung von /?-Ga!actosidase überlegen. Zum Beispiel wird, wenn Weizenkleie mit dem Mikroorganismus inokuliert und nachfolgend der Mikroorganismus bei 30⁰C 5 Tage inkubiert wird, ein gutes Wachstum des Organismus und eine maximale Ansammlung von jS-Galactosidase im Kulturmaterial erreicht.

Die in dem Kulturmaterial sich sammelnde /J-Galactosidase kann im Falle der Flüssigkultur gewonnen werden, indem man das Filtrat der Kulturbrühe den Routineverfahren zur Abtrennung und Reinigung des Enzyms unterwirft. Im Falle der Festkultur wird Wasser dem Kulturmaterial in einer Menge zugegeben, die das 5—lOfache des Kuliurmaterials ausmacht; nachdem 1—5 Stunden gerührt wurde, wird die erhaltene Mischflüssigkeit filtriert oder zentrifugiert und das so erhaltene Filtrat den Routinevei fahren wie im Falle der Flüssigkultur unterworfen. Die /i-Galactosidase des vorliegenden Aspergillus oryzae ATCC 20 423 ist ein extrazelluläres Enzym, so daß mehr als 95% dieses Enzyms schnell mit Wasser extrahiert werden können ohne eine Zerstörung der Mikroorganismenzellen.

ίο Dieses Faktum bildet einen der Vorteile der vorliegenden Erfindung.

Als Routineverfahren zur Abtrennung und Reinigung des Enzyms, wie sie oben erwähnt wurden, kann angeführt werden entweder die Ausfällung von

is /?-Galactosidase aus der wäßrigen Lösung durch Hinzugabe eines hydrophilen organischen Lösungsmittels, wie Äthanol, Isopropanol. Aceton oder ähnliche, oder das Aussalzen des Enzyms aus der wäßrigen Lösung durch Hinzusetzen eines anorganischen Salzes.

ίο wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat oder ähnlichen. Diese Prozeduren können auch in der Weise durchgeführt werden, daß die wäßrige Lösung des Enzyms unter vermindertem Druck konzentriert wird und danach das Konzentrat mi: dem obener-

^s wähnten Zusatz von organischem Lösungsmittel oder anorganischem Salz behandelt wird.

Die so gebildete Fällung wird durch Zentrifugieren gesammelt und sofort lyophilisiert oder nachdem sie weiteren Reinigungsbehandlungen unterzogen wurde.

Zum Beispiel wird das Präzipitat in 0,05 M Tris-HCI-Pufferlösung oder 0,05 M Phosphatpufferlösung gelöst, die enthaltenen Verunreinigungen dialysiert und hiervon entfernt in die gleiche An Pufferlösung durch die Dialysemembran. Das Dialysat (oder die verbleibende Pufferlösung) kann weiter entweder einer lonenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung eines lonenaustauscherharzes, von lonenaustauschcellulose oder lonenaustausch-Dextran oder der Gelfiltration unter Verwendung von Dextran oder Agarose-Gel unterzogen werden. Durch Kombinieren der geeigneten, aus den oben beschriebenen ausgewählten Reinigungsverfahren können jS-Galactosidase-Präparationen mit verschiedenen Aktivitätsgraden erhalten werden.
In vorliegender Beschreibung wird die Aktivität der 0-Galactosidase abgeschätzt durch die Hydrolysie rungsaktivität dieses Enzyms in den entsprechenden Fällen unter Verwendung von o-Nitrophenyl-jS-D-galactopyranosid, p-Nitrophenyl-jS-D-galactopyranosid (diese Bezeichnungen seien in der folgenden Beschrei-

so bung als »ONPG« und »PNPG« entsprechend abgekürzt) und Lactose als die Substrate. Die entsprechenden Prozeduren sind wie folgt:

(a) Hydrolytische Aktivität des Enzyms
für ONPG oder PNPG:

Zu 3,5ml einer O.l-M-Citrat-Phosphat-Pufferlösung (pH 4,5), die 6 mg ONPG enthält, wtrden 0,5 ml Enzymlösung gegeben, und nach lOminütigem Inkubieren bei 3O⁰C wird die Mischflüssigkeit mit ! ml einer

to 1-M-Natriumcarbonatlösung versetzt, so daß die enzymatische Reaktion gestoppt wird. Die Menge des in der umgesetzten Lösung gebildeten o-Nitrophenols wird du.ch Vergleichen der Absorption bei einer Wellenlänge von 420 nm, gemessen mit einem Spektrophotome-

<>5 ter, mit der Standardkurve, die zuvor unter Verwendung von gereinigtem o-Nitrophenol aufgenommen wurde. bestimmt. Somit ist die /J-Galaciosidase-Einheit für ONPG definiert als dieieniee Rn7ymmpnpp Hip If) ^h

Mole o-Nitrophenol pro Minute bei 30°C erzeugt (eine solche Einheit ist durch die International Union of Biochemistry, Enzyme Committee, vorgeschrieben). Die /i-Galactosidase-Einheit für PNPG ist ähnlich wie für ONPG definiert, mit Ausnahme der Verwendung von PNPG als Substrat und einer Wellenlänge von 410 nm anstelle der entsprechenden 420 nm des ONPG.

(b) Hydrolytische Aktivität des Enzyms
für Lactose:

Zu 4,5 ml einer 0,1-M-Citrat-Phosphat-Pufferlösung (pH 4,8), die 272 mg Lactose enthält, werden 0,5 ml Enzymlösung zugegeben; nach Inkubation für 10 Minuten bei 30°C wird das flüssige Gemisch 2 Minuten auf einem siedenden Wasserbad erhitzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. 0,5 ml der umgesetzten Lösung werden abgenommen und zu 3,0 ml Glucostat-Reagens gefügt (bestehend aus Glucoseoxidase und Peroxidase); nach Inkubieren der Mischflüssigkeit 60 Minuten bei 37°C werden 0,5 ml N-HCI hinzugefügt, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Die in der Reaktionslösung gebildete Glucosemenge wird abgeschätzt durch Vergleichen der Absorption bei einer Wellenlänge von 400 nm, gemessen mit einem Spektrophotometer, mit der zuvor aufgenommenen Standardkurve. Somit ist die /i-Galactosidase-Einheit für Lactose als diejenige Enzymmenge definiert, welche 10-^hMoie D-Glucosepro Minute bei 30⁰C erzeugt.

Die physikochemischen Eigenschaften der im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten jS-Galactosidasesind wie folgt:

(1) Substratspezifität: Dieses Enzym hydrolysiert spezifisch /i-D-Galactopyranosyl-Verbindungen. Das heißt Lactose (oder /i-D-Galactopyranosyl-D-glucosid), ONPG, PNPG, Phenyl-jJ-D-galactopyranosid und ähnliche werden unter Bildung von Galactose zusammen mit einer Verbindung aus der Gruppe: Glucose, o-Nitrophenol, p-Nitrophenol und Phenol, hydrolysiert.

(2) Wirkung des pH auf die Aktivität: Die Aktivität des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten wird entsprechend mit Lactose, ONPG und PNPG als Substrate unter den Inkubationsbedingungen einer Temperatur von 30⁰C und Dauer von 10 Minuten studiert. Der Wert der relativen Aktivität wird aus dem Verhältnis der entsprechenden Aktivität zu derjenigen bei pH 4,8 (für Lactose) oder 4,5 (für ONPG und PNPG) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben, aus welcher man ersieht, daß die Werte des optimalen pHs auf der sauren Seite liegen.

Tabelle I

Relative Aktivität (%) Lactose ONPG

PNPG

2	16	4	2
3	47	73	72
4	86	97	99
4,5	95	100	100
4,8	100	93	99
5,0	99	84	97
6,0	66	26	49
7.0	29	3	12

(3) Wirkung der Temperatur auf die Aktivität: Tabelle II zeigt die Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Enzymaktivität unter Verwendung von ONPG als Substrat unter den Inkubationsbedingungen eines pH 4,5 und einer Dauer von 10 Minuten. Der Wert der relativen Aktivität wird aus dem Verhältnis der entsprechenden Aktivität zu derjenigen bei einer Temperatur von 5O⁰C berechnet. Die maximale Aktivität liegt bei 50⁰C.

Tabelle Il	Relative
Temperatur	Aktivität
	(o/o)
(⁰C)	Il
10	25
20	48
30	79
40	100
50	32
60	3
70

(4) Effekt des pH auf die Stabilität: Um die Wirkung von pH-Werten auf die Enzymstabilität zu untersuchen, werden die Enzymlösungen mit verschiedenen pH-Werten von 3,0 bis 9,5 1 Stunde bei 3O⁰C entsprechend stehengelassen, und die verbliebene jS-Galactosidase-Aktivität in jeder Lösung wird dann unter Verwendung von ONPG als Substrat abgeschätzt. Der Wert der zurückbehaltenen relativen Aktivität wird aus dem Verhältnis der entsprechenden zurückbehaltenen Aktivität zu jener bei' pH 6 berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle Il gezeigt, aus welcher man ersieht, daß das Enzym im pH-Bcreich von 3,5 bis 9,0 ziemlich stabil ist.

Tabelle III	Zurückbehaltene
pH	relative Aktivität (%)
	12
3	69
3.5	92
4	100
5	100
6	100
7	ICO
8	92
9	18
9,5

(5) Effekt der Temperatur auf die Stabilität: Um die Wirkung der Temperatur auf die Enzymstabilität zu

^₀ untersuchen, werden die Enzymlösungen mit pH 6,0 bei Temperaturen von 30⁰C bis 60⁰C 10 Minuten inkubiert. Die verbleibende Enzymaktivität wird unter Verwendung von ONPG als Substrat bestimmt und die zurückbehaltene relative Aktivität aus dem Verhältnis der entsprechenden zurückbehaltenen Aktivität zu der bei einer Temperatur von 30⁰C gefundenen berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle IV wiedergegeben; das Enzym ist bei 50° C über 10 Minuten ziemlich stabil.

Tabelle IV Temperatur

CQ

Zurückbehaltene relative Aktivität

30	100
40	100
50	88
60	15

(6) Inhibitor, Aktivator und Stabilisator: Die Hydrolysierungsreaktion durch das vorliegende Enzym wird inhibiert entweder durch eine 10-²-M-Konzentration von Cu^{+ 4} oder Ag⁺ oder durch eine 10~⁴-M-Konzentration von Hg ⁺ , während sie durch 10 ²- bis 10~⁴-M-Konzentrationen verschiedener anderer Metallionen weder inhibiert noch aktiviert wird. Die Enzymaktivität geht vollständig verloren entweder durch eine lCM-M-Konzentration von N-Bromsuccinimid oder durch eine 10 ²-M-Konzentration von Natriumlaurylsulfat. Eine 10 ^:-M-Konzentration des sogenannten ADTA, von Mercaptoäthanol, Wasserstoffperoxid, Natriumthiosulfat, Cystein, Ascorbinsäure oder ähnlicher, zeigt jedoch keine Wirkung auf die Aktivität des Enzyms. Im übrigen wird im Falle der is Lyophilisierung entweder des Präzipitats oder der aus den Kulturmaterialien im vorliegenden Verfahren stammenden gereinigten Flüssigkeit die Stabilität des Enzyms während eines solchen Lyophilisierungsschrittes durch die vorherige Zugabe von Maltose oder Glucose in einer 10 — 30% des festen Materials dieses Präzipitats oder dieser gereinigten Flüssigkeit entsprechender Menge verbessert.

(7) Elementaranalyse:

C: 46,42%, H: 6,76%, N 12,21 %.

(8) Molekulargewicht: Das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wird abgeschätzt vermittels Anwendung des bekannten Gelfiltrationsverfahrens mittels modifizierter Dextrane und des entsprechenden Saccharose-Dichtegradientenzentrifugationsverfahrens und ergibt in beiden Fällen einen Wert von annähernd 105 000.

(9) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Fig. I zeigt das Uitravioiett-Absorptionspektrum des Enzyms, aus welchem man eine maximale Absorption bei der Wellenlänge von 280 nrn abliest.

(10) Infrarot-Absorptionspektrum: Das Infrarot-Absorptionsspektrum mit KBr ist in F i g. II abgebildet.

(11) Farbe und Zustand: Weißes Pulver.

Die im vorliegenden Verfahren hergestellte 0-Galactosidase besitzt die oben beschriebenen physikochemischen Eigenschaften. Das vorliegende Enzym unterscheidet sich von den meisten der herkömmlichen ß-Galactosidasen in dem Punkt, daß das optimale pH der letzteren nahe am Neutralpunkt liegt, und ferner von dem bei Verwendung von Aspergillus niger hergestellten Enzym, da es das optimale pH auf der sauren Seite hat, sowie hinsichtlich der Arten der verwendeten Mikroorganismen, dem pH-Bereich der Stabilität, dem optimalen pH und ähnlichen. Außerdem ist die Akkumulierungsausbeute des Enzyms erfindungs- gemaß bedeutend höher, wenn man mit jenen Ausbeuten bei der Herstellung der üblichen Enzyme vergleicht. Diese einzigartige Eigenschaft des vorliegenden Enzyms macht es, nachdem ihm auch noch die andere Eigenschaft zu eigen ist, nämlich säurestabil zu sein, leicht und einfach, das Verfahren dieser Erfindung industriell anzuwenden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. *o

Beispiel 1

20 g Weizenkleie und 20 ml Leitungswasser werden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und sterilisiert Nach Abkühlen wird das Medium mit einer Platinschleife voll Sporen des Stammes Aspergillus oryzae ATCC 20 423 inokuliert, der auf Kartoffel-Dextrose-Agar gezüchtet worden war; der Mikroorganis mus wird 5 Tage bei etwa 30°C inkubiert. tine solche Züchtung des Mikroorganismus, wie oben beschrieben, wird unter Benutzung von 10 Kolben ausgeführt, und die Kulturmaterialien derselben werden gesammelt (ca. 232 g). Zu diesem Material werden 2 Liter Leitungswasser gegeben, und nach 2stündigem Rühren wird die Mischflüssigkeit filtriert und ergibt 1914 ml l'iltrat, dessen /J-Galactosidase-Aktivität 57,4 ONPG-Einheiten/ml oder 43,3 Lactose-Einheiten/ml beträgt. Dieses Filtrat wird mit Aktivkohle entfärbt und das erhaltene Filtrat auf 15^CC gekühlt. Zum Filtrat wird Isopropanol, welches auf 10°C vorgekühlt worden war, unter Rühren zugegeben, und der gebildete Fällungsniederschlag wird filtriert. 20 ml Leitungswasser werden zu diesem Präzipitat gegeben und das erhaltene Flüssigkeitsgemisch bei Temperaturen von -30^cC bis +20⁰C lyophilisiert unter Drücken von 0,1-0,2 Torr, wobei 4,3 g weißes Enzympulver erhalten werden und die ,8-Galactosidaseaktivität dieses Pulvers 16 300 ONPG-Einheiten/g oder 12 400 Lactose-Einheiten/g beträgt.

Beispiel 2

20 g Weizenkleie und 12 ml Leitungswasser werden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und sterilisiert. Nach Abkühlen wird das Medium mit einer Platinschleife voll Sporen der Mikroorganismen inokuliert, die auf Kartoffel-Dextrose-Agar kultiviert worden waren; die Mikroorganismen werden 7 Tage bei 30⁰C inkubiert. Eine solche Kultivierung des Mikroorganismus wie oben beschrieben, wird ausgeführt unter Verwendung von 10 Kolben, wobei die kultivierten Materialien derselben aseptisch gesammelt und nachfolgend dieselben zu dem sterilisierten Medium gegeben werden, das aus 61 kg Weizenkleie und 84 Litern Leitungswasser besteht, welches Medium in einer Festkulturapparatur der Belüftungstype gehalten wird. Das inokulierte Medium wird 3 Tage bei etwa 30⁰C gehalten, während feuchte Luft hindurchstreicht Zu dem Kulturmaterial werden 500 Liter Leitungswasser gegeben und die Mischflüssigkeit nach 3stündigem Rühren filtriert, um 469 Liter Filtrat zu erhalten. Die /J-Galactosidase-Aktivität des Filtrats beträgt 48,6 g ONPG-Einheiten/ml oder 36,7 Lactose-Einheiten/ml.

20 Liter aus diesem Filtrat werden mit Aktivkohle entfärbt und das erhaltene Filtrat unter reduziertem Druck auf etwa 4 Liter konzentriert. Das Konzentrat wird auf 15°C abgekühlt und mit 4 Litern kaltem Isopropanol (10⁰C) unter Rühren versetzt. Das gebildete Präzipitat wird zentrifugiert, zum Präzipitat werden dann 12 g Maltose und 250 ml Leitungswasser gegeben. Die erhaltene Mischflüssigkeit wird lyophilisiert und ergibt 47,7 g weißes Enzympulver, dessen jJ-Galactosi- dase-Aktivität 17 200 ONPG-Einheiten/g oder 13 000 Lactose-Einheiten/g beträgt

Beispiel 3

20 g des in Beispiel 2 erhaltenen Rohenzympulvers werden in 1 Liter Leitungswasser gelöst und die Lösung mit Aktivkohle entfärbt Das Filtrat wird auf 15° C abgekühlt und mit 500 ml kaltem Isopropanol (10⁰C) unter Rohren versetzt Das gebildete Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt, zur überstehenden Flüssigkeit werden weiter 700 ml kaltes Isopropanol gegeben, wonach der wiederum gebildete Niederschlag zentrifugiert wird. Zum letzteren Präzipitat werden 2,5 g Maltose und 50 ml Leitungswasser gegeben; das erhaltene flüssige Gemisch wird lyophilisiert und ergibt 10,6 g weißes Enzympulver, dessen /J-Galactosidase-Ak-

tivität 25 300 ONPG-Einheiten/g oder 19 200 Lactose-Einheiten/g beträgt.

Beispiel 4

5 g des in Beispiel 3 erhaltenen Enzympulvers werden in 100 ml 0,05 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gelöst, und nach Entfernung des unlöslichen Materials durch Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit einer Dialyse zwecks Dialysierung der darin enthaltenen Verunreinigungen unter Verwendung der gleichen Art von Pufferlösung ohne Enzym unterworfen. Das Dialysat wird auf eine Säule (4,8 χ 90 cm) von Diäthylaminoäthyl-Dextran aufgetragen, wobei diese

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Säule zuvor mit der gleichen Art Pufferlösung äquilibriert worden war. Nachdem die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen wurde, wird das absorbierte Enzym in der Säule mit der gleichen Art

s Pufferlösung eluiert, jedoch mit allmählich ansteigender NaCI-Konzentration im Bereich von 0 — 0,5 M. Die eine /J-Galactosidase-Aktivität zeigenden Eluatfraktionen werden gesammelt und wiederum der Dialyse unter Verwendung der gleichen Art von Pufferlösung

ίο unterworfen. Die so erhaltene gereinigte Enzymlösung wird lyophilisiert und ergibt 1,6 g weißes Pulver, dessen jJ-Galactosidase-Aktivität 68 400 ONPG-Einheiter./g oder 51 800 Lactose-Einheiten/g beträgt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Biochemisches Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären /J-Galactosidase, welche säureaktiv > und säurestabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Aspergillus oryzae ATCC 20 423 in einem festen oder flüssigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20—45^CC züchtet und daß man die /?-Gaiactosidase aus diesem Material isoliert.