DE3025424C2

DE3025424C2 - Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase

Info

Publication number: DE3025424C2
Application number: DE3025424A
Authority: DE
Inventors: Kazuo Machida Tokyo Aisaka; Osamu Terada
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-07-04
Publication date: 1983-12-22
Also published as: US4335213A; DE3025424A1; JPS568686A; JPS6243666B2

Description

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Die Erfindung betrifft das Verfahren zur Herstellung des Enzyms Galactoseoxidase gemäß den Maßnahmen J5 des Patentanspruchs 1. Die Patentansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Galactoseoxidase (EC 1.13.9) eignet sich zur Bestimmung von Galactose in Organismen und biologischen Flüssigkeiten, wie Serum. Es ist bekannt. Galactoscoxi- *o düse durch Züchtung eines Mikroorganismus der Art Polyporus circinalus (J. A. D. Cooper u. Mitarb.. |. Biol. Chcm.. Bd. 234 [1959]. S. 445. und |P-AS 5900/1966) herzustellen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase auf mikrobiologischem Wege zu entwikkeln. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß bestimmte Stämme der Gattung Gibberella dieses Enzym bilden (vgl. Anspruch 1).

Im erfindungsgemäßen Verfahren fällt das Enzym in hoher Ausbeute in der Kulturbrühe und insbesondere in der zellfrcicn Kulturbrühe an. Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Galactoseoxidase beschleunigt die Oxidation des Monosaccharids Gaidctose sowie w von Polysacchariden, wie Melibiose.

Die mikrobiologischen Eigenschaften der Arten Gibberella fujikuroi und Gibberella zcac sind in dem »Dictionary Fungi«. 6. Auflage, 1971, S. 241, beschrieben.

Als Nährrnediüfn kommen zur Züchtung der vorstehend genannten Stämme entweder natürliche Medien oder synthetische Medien in Frage, die Kohlenstoffquellen. Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthalten. ^&5

Spezielle Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Galactose, Glucose. Fructose, Saccharose. Maltose, Mannose, Melibiose, Raffinosestärke. Starkehydrolysatlösungen und Melasse. Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit, organische Säuren, wie Essigsäure. Milchsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure und Citronensäure. Alkohole, wie Methanol und Äthanol. Glykole, wie Äthylenglykol und Propyienglykol. Aminosäuren sowie Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexadecan. Bevorzugt sind Galactose. Glycerin, Fructose, Saccharose, Glucose. Melibiose und Raffinose, da die Ausbeute an Enzym erhöht ist.

Spezielle Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat. Ammoniumphosphat. Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff und Aminosäuren, stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Pepton, NZ-Amin, ein enzymatisches Hydrolyseprodukt von Casein. Fleischextrakt. Hefeextrakt, lösliche Pflanzenproteine, Maisquellwasser.. Caseinhydrolysate. Chrysalishydrolysate, Fischmehl oder seine Abbauprodukte, entfettete Sojabohnen oder ihre Abbauprodukte. Fleischextrakt, Hefeextrakt und lösliche Pflanzenproteine sind bevorzugt, da die Ausbeute an Enzym erhöht ist.

Als anorganische Salze kommen beispielsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat. Kaliumchlorid. Magnesiumsulfat. Mangansulfat. Eisen(ll)-sulfat. Natriumchlorid und Calciumcarbonat in Frage.

Die Ausbeute an Galactoseoxidase kann im erfindungsgemäßen Verfahren durch die Gegenwart von Zinkionen oder Kupferionen im Nährmedium stark erhöht werden. Beispiele für Quellen, die Zinkionen liefern, sind Zinkverbindungen, wie Zinkchlorid und Zinksulfat. Beispiele für Quellen, die Kupferionen liefern, sind Kupferverbindungen, wie Kupfersulfat und Kupfer(ll)-chlorid. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn eine Zinkverbindung in einer Menge von 0,0001 bis 0,005 Gewichtsprozent pro Volumen oder eine Kupferverbindung in einer Menge von 0,001 bis 0,05 Gewichtsprozent pro Volumen dem Nährmedium zugesetzt wird. Die Züchtung wird unter Belüften und Rühren bei 25 bis 35°C und einem pH-Wert von 6,0 bis 7.0 während 2 bis 3 Tagen durchgeführt.

Die Isolierung und Reinigung der Galactoseoxidase aus der Kühlflüssigkeit erfolgt nach üblichen Methoden, beispielsweise folgendermaßen:

Die Kulturflüssigkeit wird filtriert oder zentrifugiert, um die Mikroorganismenzellen abzutrennen. Sodann wird das Filtrat bzw. der Überstand auf etwa Ά seines ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird mit Ammoniumsulfal bis zu 60prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene haltung wird abfiltriert und in einem 0,01 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird zum Entsalzen dialysiert. Das Retentat wird der Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose und Sephadex G-150 unterworfen. Die erhaltene gereinigte Enzymlösung wird gefriergetrocknet. Es wird Galactoseoxidase in Pulverform erhalten.

Die Eigenschaften der aus Gibberella fujikuroi NRRL 12 168 erhaltenen Galactoseoxidase sind nachstehend angegeben. Die aus Gibberella fujikuroi NRRL 12 169 und Gibberella zeae FERM BP-252 erzeugten Galactoseoxidasen haben praktisch die gleichen Eigenschaften.

Die enzymatische Aktivität der Galactoseoxidase wird durch Umwandlung von Galactose in Gegenwart von Galactoseoxidase und Sauerstoff in Galactohexodialdose und Wasserstoffperoxid. Umsetzung des

entstandenen Wasserstoffperoxids mit 4-Aminoantipy- mung des Chinonimins bestimmt. Die ablaufenden rin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase unter Verfahren werden durch folgende Reaktionsgleichun-Bildung eines Chinonimins und anschließende Bestim- gen (I)und (2) wiedergegeben.

CH₂OH

CHO

HO Λ \ OH

l\ OH H

+ O₂

Galactoseoxjdase

HO A ^\ OH

(\ OH H

+ H₂O₂

H OH

Galactose

H OH
GaJactohexodialdose

Peroxidase

H₃C NH₂

4-Aminoantipyrin

Die Reaktionsgleichung (2) und die Bestimmung von Wasserstoffperoxid wurden von CC Mlain u. Mitarb, Clin. Chem, Bd. 20 (1974), S. 470, beschrieben.

Die Maßnahmen zur Bestimmung von Galactose >^r> unter Verwendung von Galactoseoxidase und ein Verfahren zur Berechnung der Enzymaktivität sind nachstehend wiedergegeben:

(A) Reagens ■«

(1) Substrat:

0,5molare wäßrige Lösung von Galactose 03 ml

(2) Puffer:

0.25molarer Phosphatpuffer. pH-Wert 7 1.0 ml

(3) 4-Aminoantipyrin:

24millimolarc wäßrige Lösung 0.5 ml

(4) Phenol:

42millimolare wäßrige Lösung

(5) wäßrige Lösung von Peroxidase: (Protein 2 mg/ml:
spezifische Aktivität 100)

0.5 ml

60

0,1 ml

(6) Wasser: 0.3 ml

(7) Enz;;mlösung:

(wäßrige Lösung von Galactoseoxidase) 0.1 ml

(B) Versuchsmethodik

Die Reagcniicn (I) bis (b) werden in ein Reagcnsglas gegeben. Der Inhalt des Reagcnsglascs wird 5 Minuten bei 25"C geschüttelt. Sodann wird das Gemisch mil der Enzymlösung (7) auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird 10 Minuten bei 25"C unter Schütteln durchgeführt. Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben wird wiederholt, jedoch wird Wasser als Kontrolle anstelle des Substrats verwendet. Die Absorption der Reaklionslösung und der Kontroilösung bei 500 nm wird gemessen. Der Unterschied in der Absorption wird ausgedrückt durch Δ OD.

(C) Berechnung der Aktivität

Eine Einheit von Galactoseoxidase ist diejenige Enzymmenge, die 1 μΜοΙ Galactose bei 25°C innerhalb I Minute zersetzt.

Der Absorptionskoeffizient von 1 mMol des Chinonimins beträgt 5,33: vgl. Clin. Chem.. Bd. 20 (1974), S. 470. Die Absorption (AOD) von 3 ml der Reaktionslösung bei 500 nm. berechnet nach der Versuchsmethodik (B). wird durch »a« wiedergegeben. Die Aktivität (A) von 1 ml der Enzymlösup.g wird somit nach folgender Formel berechnet:

A = α x

= α x 0,056 (Einheiten/ml).

Verschiedene Eigenschaften der erfindungsgemäLl hergestellten Galactoseoxidase sind nachstehend angegeben.

(I) Wirkung

Galactose wird in Gegenwart des Enzyms und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und Galactohexodiilldose oxidiert.

(2)Substratspc/ifitiit

Das Enzym ist spezifisch für Galactose Lind wirkt unter anderem auch auf Mclibiose. Raffinose und iJihydroxyaeeton. jedoch nich' auf Glucose und Glycerin. Dies gehl aus Tabelle I hervor.

Tabelle I

(8) Molekulargewicht

Substrat

Relative Aktivität, %

Galactose	100
Galactonolacton	5
Galacturonsäure	0
Glucose	0
Mannose	0
Fructose	4
Rhamnose	1
Inosit	0
Xylose	0
Lactose	1
Mellbiose	68
Raffinose	98
Glycerin	1
Dihydroxyaceton	135
(3) pH-Optimum

Das Molekulargewicht des Enzyms beträgt etwa 45 000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethoüe an Sephadex G 75.

(9) Metallanalyse

Das Enzym enthält etwa 1 Grammatom Kupfer pro to Mol. Die Analyse erfolgt durch Atomabsorptionsspektroskopie.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 6,0 bis 7,0 bei 1 Ominütiger Umsetzung bei 25"C.

(4)Stabili!ät

Das Enzym ist im pH-Bereich von 5,0 bis 8.0 während der 15 Minuten bei 45°C durchgeführten Reaktion stabil.

(5) Temperaturoptimum

Das Temperaturoptimum des Enzyms liegt bei 20 bis 30°C während der 10 Minuten bei einem pH-Wert von 7,0 durchgeführten Reaktion.

(6) Wärmestabilität

Das Enzym ist bei Temperaturen bis zu 50° C und bei einem pH-Wert von 7,0 während 15 Minuten stabil. Es verliert etwa 90% seiner Aktivität bei 60°C.

(7) Inhibitoren

Das Enzym wird durch die in Tabelle Il aufgeführten Inhibitoren bei 25°C und einem pH-Wert von 7.0 inhibiert.

Tabelle II

Inhibitor

Konzentration, Hemmung,
Mol %

AgNO₃	10-	100
NaNj	ΙΟ'³	94
PCMB*)	ΙΟ"³	57
NH₂OH	ΙΟ'⁴	100
EDTA**)	ΙΟ"³	52
o-Phenanthrolin	ΙΟ"³	68
DDC***)	ΙΟ'⁵	69,3
DDC***)	ίο-	84,3
DDC***)	1(Γ³	100

Anmerkungen:

*) PCMB: p-Chlormercuribenzoat.
**) EDTA: Äihylendiamintetraessigsäure.
***) DDC: Diiithyldithiocarbamat; Chelatbildner speziell
fur Kupf'rionen.

Gibberella fujikuroi NRRL 12 168 wird in 300 ml eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Das Nährmedium hat einer. ph-Wert von 6.0. und es entfwit 1 g Galactose/dl. 1 g lösliches Pflanzenprotein/dl und 0.Ol g ZnCIVdI.

Hierauf werden 600 ml der erhaltenen Kulturflüssigkeit in einen 30 Liter fassenden Fermenter überführt, der 15 Liter Nährmedium der gleichen Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben, enthält. Die Züchtung wird unter Belüftung mit 15 Liter/Minute Luft bei 3O⁰C während 48 Stunden und einer Rührgeschwindig-J₀ keit von 300 U/min durchgeführt. Danach wird die gesamte Kulturbrühe durch einen großen Büchner-Trichter filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf etwa '/4 seines Volumens eingedampft. Hierauf wird das erhaltene Konzentrat mit Ammoniumsulfat versetzt, und die bei 90prozentiger Ammoniumsulfatsättigung erhaltene Fällung wird abgetrennt. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität an Galactoseoxidase in der Fällung, beträgt etwa 70%, und die spezifische Aktivität wird auf etwa das Dreifache erhöht.

Die erhaltene Fällung wird in etwa 100 ml eines 0.01 molaren Phosphatpuffers vom pH 7,0 gelöst. Diese Lösung wird gegen 10 Liter des gleichen Puffers während 24 Stunden dialysiert. Das Retentat wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm gegeben, die mit 1 Liter DEAE-Cellulose gefüllt ist, und die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Galactoseoxidase wird an der DEAE-Cellulose nicht adsorbiert. Das Eluat wird in Fraktionen entnommen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit Ammoniumsulfat versetzt. Die bei 90prozentiger Ammoniumsuli'atsättigung erhaltene Fällung wird abzentrifugiert (20 Minuten bei 12 000 g) und in 10 ml eines 0.01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 }5 gelöst. Die Lösung wird gegen 5 Liter des gleichen Puffers während 24 Stunden dialysiert.

Nach der Dialyse wird die Enzymiösung auf eine

Säule mit einem Durchmesser von 3,5 cm gegeben, die mit 500 ml Sephadex G-150 gefüllt ist, der vorher mit

bo dem gleichen ⁿuffer äquilibriert wurde. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Es werden 25 mg eines gereinigten Galactoseoxklasepräparats mit einer spezifischen Aktivität von 13 Einheiten/mg als Pulver erhalten.

Die spezifisch'; Aktivität des gereinigten Enzyms ist um das lOOfache gegenüber dem Zellfiltrat erhöht. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 50%.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird mit Gibberelhi fujikiiroi NRKI. 12 IhM wiederholt. Es wird ein Niihrmcdium vom piI-Wert b.O mil I g Saccharose/dl. I g löslichem Pflan/enprotein/cll -, und 0,001 g ZnCI₂ZcII verwendet. Es werden etwa 20 mti gereinigte Galnctoscoxidusc mit einer spezifischen Aktivität von 10 Einheiten/mg erhallen. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 45°/».

Beispiel 3 '"

Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch wird Gibberella zeae EERM BP-252 verwendet. Es werden etwa 20 mg gereinigte Galaeloseoxidase einer spezifischen Aktivität von 8 Einheiten/mg erhalten. Die Ausbeute, ι; ausgedruckt durch die Aktivität, beträgt 40"/».
Beispiel 4

Beispiel I wird wiederholt, jedoch wird ein Nührmediiiiii vom pH-Wert b.O mit I g Galaclose/dl. I g Heleex.trakt/dlundO.01 g CuSO., · 0 11..O/dl verwendet. Es werden etwa 20 mg gereinigte Galactoseoxida.se mit einer spezifischen Aktivität von 12 Einheilen/mg erhalten. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 50%.

Etwa 2 mg gereinigte Galactoseoxidase einer spezifischen Aktivität von I I Einheiten/mg werden erhalten, wenn das vorstehend beschriebene Verfahren mil einem Niihrmcdiuni vom pi I-Wert b.O mit I g Galactose/dl und I g Hefeeuiakt/dl verwendet wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Galactoseoxida-

se durch Züchten eines Mikroorganismus und Abtrennen des gebildeten Enzyms aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Gibberella fujikuroi NRLL 12 168, Gibberella fujikuroi NRLL 12 169 oder Gibberella zeae FERM BP-252 verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Zinkionen durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Kupferionen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Zinkionen in Form von Zinkchlorid oder Zinksulfat in einer Menge von 0,0001 bis 0,005 Gewichtsprozent pro Volumen zuführt.

5. Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Kupferionen in Form von Kupfersulfat oder Kupfer(ll)-chlorid in einer Menge von 0,001 bis 0.05 Gewichtsprozent pro Volumen zuführt.