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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glycerinkinase, bei dem man einen Glycerinkinase produzierenden Mikroorganismus, der zum Genus Streptomyces gehört, in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium kultiviert und die so gebildete Glycerinkinase isoliert.
EMI1.1
EMI1.2
EMI1.3
zeichnet) sind Enzyme aus Candida mycoderma (Biochem. Z., , 320 [1957], ibid., 333,471 [1961]), Enzyme aus Escherichia coli (J. Biol. Chem., 242,1030 [1967]) und Enzyme aus Schweineleber (Method in Enzymology, Band 5,476 [1962], Biochem. Z., 329,320 [1957]. J. Biol. Chem., 211,951 [1954]).
Es wurde gefunden, dass ein Streptomyces-Stamm A 2408, der aus einer Bodenprobe des Sojabohnenfeldes in Kakegawa-shi, Shizuoka-ken, Japan, isoliert worden ist, in seinem Mycel ein Enzym erzeugt, welches die Reaktion mit Glycerin und ATP zur Bildung von ADP und L-a-Glycerophosphat katalysiert. Elektrophoretisch wurde ein einziges Enzym in gereinigter Form isoliert. Das Enzym gehört zur GK-Gruppe, seine physikochemischen und biochemischen Eigenschaften sind bis jetzt jedoch noch nicht bekannt, und somit ist es ein neues GK.
Die taxonomischen Eigenschaften des Streptomyces-Stammes A 2408 sind wie folgt :
I. Morphologische Eigenschaften :
Die Farbe der Lufthyphen, die gereifte Sporen tragen, ist bräunlich-grau bis gräulich- - braun, gelblich-braunes Substratmycelium. Es bildet ein gelblich-braunes lösliches Pigment.
Beobachtungen auf einem anorganischen Stärkeagar bei 30 C während 10 Tagen sind wie folgt : man beobachtet die gleichen morphologischen Merkmale wie auf Hafermehlagar und Glycerin/Asparagin-Agar.
Die Lufthyphen besitzen einen Durchmesser von 0, 6 bis 0, 8 um, sie sind gerade oder wellenförmig, wachsen mit einfacher Verzweigung und bilden viele Sporenketten. Die Sporenketten bilden Spiralen mit losen 3 bis 5 Sporen in Form von Haken, Schlingen oder Schlangen.
Die Form der Sporen ist kugelförmig oder oval, der Durchmesser beträgt 0, 8 bis 1, 0 x 1, 0 bis 1, 5 pm, die Oberflächen sind mit Stacheln versehen.
Die Substratmycelien sind verzweigt, sie wachsen wellenförmig oder schlangenförmig, haben einen Durchmesser von 0, 5 bis 0, 6 pm und zeigen üblicherweise kein Aufspalten der Hyphen und Tragen von Sporen.
Keine Bildung von Geiselsporen und Sporenträgern.
II. Zusammensetzung der Diaminopimersäure :
L-Diaminopimersäure wird nachgewiesen.
III. Eigenschaften auf verschiedenen Medien :
Die Beobachtungen erfolgten auf verschiedenen Medien bei 30 C während 20 Tagen, wie es in Tabelle I (die dann in Klammern stehenden Farbangaben beruhen auf "Color Harmony Manual", 4. Auflage 1958, Container Corporation, America, USA) erläutert wird.
IV. Physiologische Eigenschaften :
1. Wachstumstemperatur : 12 bis 45 C
2. Verflüssigung von Gelatine : positiv
3. Stärkehydrolyse : positiv
4. Magermilch : Peptonisierung positiv, Koagulation negativ
5. Bildung von melaminartigem Pigment : negativ
6. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen :
Ausnutzen : L-Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, i-Inosit, D-Mannit, Raffinose, L-Rham- nose, Saccharose und D-Xylose.
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Wie zuvor erläutert, gehört der erfindungsgemässe Mikroorganismusstamm A 2408 zur Gattung Streptomyces wegen seiner Eigenschaften, dass das Luftmycelium ein Sporenkettenwachstum von einem nichtgeteilten wahren Substratmycelium zeigt, wegen des Durchmessers des Myceliums und der Sporengrösse und der L-Art der Diaminopimelinsäure. Der Stamm A 2408 besitzt die folgenden Eigenschaften. Die Farbe des Luftmyceliums ist bräunlich-grau bis gräulich-braun. Die Sporenkette ist lose und besteht aus 3 bis 5 aufgespulten Spiralen. Die Oberfläche der Sporen besitzt Dornen. Die Farbe des Substratmyceliums ist gelblich-braun ; Bildung von gelblich-braunem löslichen Pigment. Die Ausnutzung von Zucker ist weit. Keine Bildung von melaminartigem Pigment.
Diese Eigenschaften können als Streptomyces canus zugeordnet werden (Heinemann et al.) (Antibiotics and Chemotherapy, 3, 1239 bis 1242 (91953)) in International Streptomyces Projekt (ISP) (Inter.
EMI2.1
und Streptomyces canus ISP 5017 zeigt die Ähnlichkeit der morphologischen, Züchtungs- und physiologischen Eigenschaften.
Der erfindungsgemässe Stamm A 2408 wird somit als Streptomyces canus A 2408 bezeichnet.
Dieser Stamm wurde im Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, als Hinterlegungsstelle unter der FERM-Nr. 4977 hinterlegt.
Es wurde gefunden, dass GK, das durch Streptomyces canus A 2408 gebildet wird, ein neues Enzym ist, das die im folgenden erläuterten physikochemischen und biochemischen Eigenschaften aufweist.
GK kann als Forschungsreagenz oder diagnostisches Reagenz für den Metabolismus von Triglycerid in einem Körperfluid, wie Serum, verwendet werden.
Erfindungsgemäss wird zur Herstellung von Glycerinkinase so verfahren, dass man als Glycerinkinase produzierenden Mikroorganismus Streptomyces canus A 2408 FERM-Nr. 4977 einsetzt, wobei als Kohlenstoffquelle vorzugsweise Glycerin eingesetzt wird.
Tabelle I
EMI2.2
<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Farbe <SEP> des <SEP> Substrat-Luftmycelium <SEP> lösliches
<tb> mycelium <SEP> Pigment
<tb> \
<tb> Saccharose/Nitrat-mässig <SEP> bis <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> : <SEP>
<tb> - <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> hellbraun <SEP> (3 <SEP> ec) <SEP> keines
<tb> schlecht <SEP> bis <SEP> mässig <SEP> :
<tb> Glucose/Asparagin- <SEP> natur <SEP> (3 <SEP> dc) <SEP> bis
<tb> - <SEP> Agar <SEP> mässig <SEP> senfbraun <SEP> (2 <SEP> pi) <SEP> hellbraun <SEP> (3 <SEP> ec) <SEP> keines
<tb> Glycerin/Asparagin-nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl) <SEP> bis <SEP> gut <SEP> :
<SEP> beige <SEP> (3 <SEP> ge) <SEP> bis
<tb> - <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> beige-braun <SEP> (3 <SEP> ig) <SEP> keines
<tb> Stärke/anorgani- <SEP> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> bis <SEP> gut <SEP> : <SEP> beige <SEP> (3 <SEP> ge) <SEP> bis
<tb> sches <SEP> Salz-Agar <SEP> gut <SEP> nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl) <SEP> silbergrau <SEP> (3 <SEP> fe) <SEP> keines
<tb> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> bis <SEP> gut <SEP> : <SEP> beige <SEP> (3 <SEP> ge) <SEP> bis <SEP> keines <SEP> bis <SEP> hellTylosin-Agar <SEP> gut <SEP> nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl) <SEP> beige-braun <SEP> (3 <SEP> ig) <SEP> braun <SEP> (4 <SEP> ng)
<tb> gut <SEP> : <SEP> beige <SEP> (3 <SEP> ge) <SEP> bis
<tb> Hafermehl-Agar <SEP> gut <SEP> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> bis <SEP> beige-braun <SEP> (3 <SEP> ig) <SEP> keines
<tb> Hefeextrakt/Malz- <SEP> gut <SEP> :
<SEP> natur <SEP> (3 <SEP> dc) <SEP> bis
<tb> extrakt-Agar <SEP> gut <SEP> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> silbergrau <SEP> (3 <SEP> fe) <SEP> keines
<tb> Glycerin/Nitrat-gut <SEP> : <SEP> natur <SEP> (3 <SEP> dc) <SEP>
<tb> -Agar <SEP> gut <SEP> nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl) <SEP> bis <SEP> beige <SEP> (3 <SEP> ge) <SEP> nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl)
<tb>
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Tabelle I (Fortsetzung)
EMI3.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Farbe <SEP> des <SEP> Substrat-Luftmycelium <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> mycelium
<tb> gut <SEP> : <SEP> beige <SEP> (3 <SEP> ge)
<tb> Glycerin/Stärke/bis <SEP> verschleiert
<tb> Glutamat-Agar <SEP> gut <SEP> nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl) <SEP> lohfarben <SEP> (2 <SEP> ge) <SEP> nelkenbraun <SEP> (3 <SEP> pl)
<tb> gut <SEP> :
<SEP> natur <SEP> (3 <SEP> dc) <SEP> bis
<tb> Benett-Agar <SEP> gut <SEP> goldbraun <SEP> (3 <SEP> pi) <SEP> silbergrau <SEP> (3 <SEP> fe) <SEP> keines
<tb> Emerson-Agar <SEP> mässig <SEP> senfgold <SEP> (2 <SEP> pe) <SEP> wenig <SEP> : <SEP> weiss <SEP> (a). <SEP> keines <SEP>
<tb> mässig <SEP> bis <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> hellNährager <SEP> wenig <SEP> gelb <SEP> (2 <SEP> ea) <SEP> keines <SEP> keines
<tb>
Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoffquellen, besonders bevorzugt Glycerin, verwendet werden. Andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Melassen, können ebenfalls verwendet werden. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver bzw. Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, trockene Hefe, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt, Fischmehlextrakt und Pepton, verwendet werden.
Gegebenenfalls können Phosphat, Sulfat und anorganische Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan oder Zink verwendet werden.
Die Züchtungstemperatur kann entsprechend den Bedingungen für das Wachstum von Mikroorganismen und die Bildung von GK ausgewählt werden, und sie beträgt bevorzugt 25 bis 30 C.
Die Züchtungszeit hängt von den Bedingungen ab und die Züchtung sollte bei der maximalen Produktion von GK beendet werden. Sie dauert im allgemeinen 1 bis 3 Tage.
Das erfindungsgemässe Enzym kann aus Mycelien isoliert werden. Die Kulturbrühe wird zum Sammeln des gezüchteten Myceliums, das mit Ultraschall beschallt worden ist, zentrifugiert, wobei man eine überstehende Lösung erhält. Die überstehende Lösung wird unter Verwendung von Ammoniumsulfat (das im folgenden als AS bezeichnet wird) oder Natriumsulfat zur Abtrennung der Verunreinigungen ausgesalzt. Nachdem das überstehende Material ausgesalzt wurde, wird es zentrifugiert, wobei man einen GK enthaltenden Niederschlag erhält. Das ausgefällte GK wird weiter durch Entsalzen mit einem Dextran-Gel durch eine Dialysemembran oder ein Hohlfilter gereinigt.
Dann wird eine Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose durchgeführt.
Die so erhaltene GK-Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert.
Die entsalzte Fraktion wird einer Adsorptionschromatographie, wie unter Verwendung einer Calciumphosphatgelsäule, zur Abtrennung der Verunreinigungen unterworfen. Anschliessend wird mit einem Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers eluiert. Die GK enthaltende Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Das Konzentrat wird der Gelchromategraphie unter Verwendung von Dextran-Gel unterworfen. Dann wird die GK-Fraktion lyophilisiert.
Das gemäss dem obigen Reinigungsverfahren erhaltene GK besitzt die folgenden physikochemischen und biochemischen Eigenschaften :
A) Enzymassay :
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<tb>
<tb> 0,2 <SEP> M <SEP> Tris-HCl-Puffer <SEP> (PH <SEP> 9, <SEP> 0) <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> ml
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> Glycerin <SEP> 0,05 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> ATP <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> MgCl2 <SEP> 0,1 <SEP> ml
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
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<tb>
<tb> 0,25% <SEP> Nitrotetrazoliumblau <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 1% <SEP> Rinderserumalbumin <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> NAD <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 0, <SEP> 05% <SEP> Phenazinmethosulfat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> ml
<tb> Glycerophosphatdehydrogenase
<tb> 2 <SEP> mg/ml, <SEP> 65 <SEP> U/mg <SEP> 5 <SEP> pI
<tb>
Das obige Gemisch (1 ml)
wird bei 37 C während 5 min preinkubiert und eine GK-Lösung (50 pl) [verdünnt mit GL-Puffer (10 mM Phosphatpuffer, der 10 mM Glycerin enthält, p, j 7, 5)] wird zugegeben und dann wird bei 37 C während 10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man 0, 1 N HCl zugibt, und dann wird bei 550 nm zur Bestimmung der Absorption (A550 nm) analysiert.
Eine Einheit GK wird so definiert, dass sie 1 Mol Glycero-3-phosphat/min freisetzt.
Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet :
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EMI4.3
x Verdunnungsverhältnis, Enzymwirkung : Sie katalysiert mindestens die folgende Reaktion
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EMI4.5
<tb>
<tb> Molekulargewicht <SEP> : <SEP> 72000 <SEP> 7200
<tb> 72000 <SEP> : <SEP> bestimmt <SEP> durch <SEP> Dextran-Gel
<tb> 65000 <SEP> : <SEP> bestimmt <SEP> durch <SEP> Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid
<tb> Isoelektrischer <SEP> Punkt <SEP> : <SEP> p <SEP> 4, <SEP> 5
<tb> Km-Wert <SEP> : <SEP> Glycerin <SEP> : <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 10-5 <SEP> M <SEP>
<tb> Dihydroxyaceton <SEP> : <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 10-'M
<tb> D-Glyceraldehyd <SEP> : <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10-'M
<tb> ATP <SEP> : <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 10-4 <SEP> M <SEP>
<tb>
Substratspezifizität : 1.
Spezifizität für Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat und D-Glyceraldehyd : Assayverfahren :
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<tb>
<tb> Reaktionsgemisch <SEP> : <SEP>
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> M <SEP> Tris-HCl-Puffer <SEP> (PH <SEP> 9, <SEP> 0) <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> ml
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> Glycerin, <SEP> Dihydroxyacetonphosphat
<tb> oder <SEP> D-Glyceraldehyd <SEP> 0,05 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> ATP <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> MgCl2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 0,3 <SEP> ml
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
0, 95 ml des Reaktionsgemisches werden bei 37 C während 3 min preinkubiert und die Enzymlösung (gelöst in 10 mM Phosphatpuffer, PH 7, 5, 0, 05 ml) wird zugegeben. Dann wird bei 37 C während 10 min inkubiert.
Die Reaktion wird beendet, indem man 3 min kocht. Nach dem Abkühlen auf 37 C wird die Menge an ADP analysiert. ADP wird analysiert, indem man eine ADP-Analyselösung (2, 0 ml) zugibt, die das folgende Gemisch enthält :
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<tb>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> Phosphatpuffer <SEP> (PH <SEP> 7, <SEP> 5) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> M <SEP> Dimethylglutarat-NaOH-Puffer
<tb> (PH <SEP> 7, <SEP> 5) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Peroxydase <SEP> (0, <SEP> 5 <SEP> mg/ml) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 0,2% <SEP> Phenol <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 0,3% <SEP> 4-Aminoantipyrin <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> MnC12 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> Thiaminpyrophosphat <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> ml
<tb> 1 <SEP> mM <SEP> FAD <SEP> 0,01 <SEP> ml
<tb> 10 <SEP> mM <SEP> Phosphoenolpyruvat <SEP> 0,
<SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Pyruvatoxydase <SEP> (100 <SEP> U/ml) <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> ml
<tb> Pyruvatkinase <SEP> (4400 <SEP> U/ml) <SEP> 1 <SEP> pl
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1,26 <SEP> ml
<tb>
Das Reaktionsgemisch wird bei 37 C während 15 min inkubiert. Die gemessene Farbe wird bei 550 nm zur Berechnung der Substratspezifizität gemessen.
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<tb>
<tb>
Substrat <SEP> relative <SEP> Aktivität
<tb> Glycerin <SEP> 100%
<tb> Dihydroxyaceton <SEP> 74%
<tb> D-Glyceraldehyd <SEP> 20%
<tb>
2. Spezifische Aktivität für das Nukleotid :
ATP > CTP > ITP GTP, UTP
Analyseverfahren :
Bei dem obigen Analyseverfahren 1. werden 10 mM ATP durch CTP, ITP, GTP und UTP ersetzt und dann wird das gebildete Glycero-3-phosphat gemessen. Wie im folgenden erläutert, können alle analysierten Nukleotide ein Substrat sein. Es wurde eine besonders hohe Spezifizität für ATP und CTP beobachtet.
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<tb>
<tb>
Substrat <SEP> relative <SEP> Aktivität <SEP> (%)
<tb> ATP <SEP> 100
<tb> CTP <SEP> 92
<tb> ITP <SEP> 47
<tb> GTP <SEP> 19
<tb> UTP <SEP> 18
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
: PHführt.
Einfluss auf Metallionen und p-Chlormercuribenzoat (PCMB) :
EMI6.2
<tb>
<tb> Reagenz <SEP> Konzentration <SEP> relative <SEP> Aktivität <SEP> (%)
<tb> ohne <SEP> Mg <SEP> ++ <SEP> mit <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> Mg <SEP> ++ <SEP>
<tb> keines <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP>
<tb> MgCl2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> mM <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> CaCl2 <SEP> 1,0 <SEP> mM <SEP> 0 <SEP> 54
<tb> MnCl2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> mM <SEP> 6 <SEP> 14
<tb> PCMB <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> x <SEP> 10-'M-13 <SEP>
<tb> PCMB <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10-" <SEP> M-0 <SEP>
<tb>
Das erfindungsgemässe GK wird durch Mg++ aktiviert und durch
Ca ++ und Mn ++ inhibiert. 7, 5 x 10-. M PCMB inhibieren die
Aktivität des erfindungsgemässen GK vollständig.
Wärmestabilität : stabil bis zu 45 C, wie in Fig. 3 dargestellt.
Analyse : 10 mM Phosphatpuffer (PH 7, 6), der 10 mM Glycerin enthält. Inkubation bei 45 bis 75 C jeweils während 10 min.
Wie zuvor erläutert, gehört das erfindungsgemässe Enzym zu einer Enzymklasse, die die Reaktion Glycerin und ATP zu ADP und L-a-Glycerat katalysiert.
Ein Vergleich mit der bekannten Glycerinkinase von Candida mycoderma GK (im folgenden als C. My.-GK bezeichnet), Escherichia coli GK (im folgenden als E. Co-GK bezeichnet) und Schweineherz-GK (im folgenden als Pig.-GK bezeichnet) und der erfindungsgemässen GK ist wie folgt.
Molekulargewicht von E. Co-GK beträgt 300000 und von C. My.-GK 250000 (Tetrameres : Molekulargewicht von 60000), wohingegen das erfindungsgemässe GK ein Monomeres mit einem Molekulargewicht von etwa 70000 ist. Die PH-Stabilität ist PH 6, 5 bis 7 für E. Co-GK, PH 4, 5 bis 5, 5 für
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dungsgemässe GK stark inhibiert.
Ausserdem unterscheiden sich die Substratspezifizitäten voneinander. E. Co.-GK zeigt fast die doppelt starke Aktivität für Dihydroxyacetonphosphat, verglichen mit der von Glycerin, wohingegen das erfindungsgemässe GK eine höhere Spezifizität für Glycerin zeigt als für Dihydroxyacetonphosphat. E. Co-GK wirkt nur für ATP und das erfindungsgemässe GK für ATP und CTP, ebenfalls für ITP, GTP und UTP. Als Folge des Molekulargewichts, der PH-Stabilität, des Erfordernisses von zweiwertigen Metallionen und der Substratspezifizität lässt sich beweisen, dass die erfindungsgemässe Glycerinkinase eine neue GK ist.
Die erfindungsgemässe GK kann für diagnostisches Enzym verwendet werden.
Beispielsweise kann die erfindungsgemässe GK zur Analyse von Triglycerid und Glycerin verwendet werden, indem man mit Triglycerid und Lipoproteinlipase umsetzt, das Reaktionsgemisch mit GK und ATP unter Bildung von Glycero-3-phosphat inkubiert, das weiter mit Glycero-3-phosphatoxydase inkubiert wird, und dann wird der verbrauchte Sauerstoff oder das freigesetzte
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Wasserstoffperoxyd gemessen.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
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20 min lang sterilisiert. Es wird dann mit Streptomyces canus A 2408 FERM-P Nr. 4977 inokuliert. Anschliessend wird bei 26 C während 3 Tagen gezüchtet.
Die Kulturbrühe wird in ein 30-1-Kolben- fermentationsgefäss gegeben, das das gleiche Medium (20 1) enthält, und aerob bei 26 C während 40 h kultiviert (300 Umdr/min, Belüftung 20 l/min). 2 1 Kulturbrühe werden bei 4 C zum Sammeln des Myceliums zentrifugiert (15000 Umdr/min, 10 min). Das Mycelium wird in GL-Puffer (800 ml)
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Material (760 ml) zu erhalten. Nach der Zugabe einer 5%igen Protaminlösung (23, 0 ml) werden die Verunreinigungen durch Zentrifugieren bei 40C um 5000 Umdr/min während 10 min prezitipiert. Gesättigte Ammoniumsulfatlösung (PH 7, 5, 1125 ml) wird zu dem überstehenden Material (750 ml) gegeben und dann wird bei 4 C und 15000 Umdr/min während 10 min zum Sammeln des Prezipitats zentrifugiert.
Gesättigte AS (PH 7, 5, 37, 2 ml) wird zu der Lösung des Prezipitats in 62 ml GL-Puffer zur Ausfällung der Verunreinigungen gegeben. Überstehendes Material (82 ml) wird durch Zentrifugieren bei 40C und 15000 Umdr/min während 10 min erhalten. Dann wird gesättigtes AS (PH 7, 5, 20, 5 ml) zugegeben. Anschliessend wird bei 4 C und 15000 Umdr/min während 10 min zentrifugiert. Man erhält einen Niederschlag.
Der Niederschlag wird in GL-Puffer (11, 0 ml) gelöst und die Lösung wird auf eine Säule von Sephadex G-25 (3 x 30 cm), die mit dem gleichen Puffer gepackt ist, gegeben, dann wird mit dem gleichen Puffer bei 25 C und einer Strömungsrate von 40 ml/h eluiert. Fraktionen, die Absorp- ; tionen bei 280 nm zeigen, werden gesammelt (etwa 21 ml). Diese gibt man auf eine Säule aus DEAE-Cellulose (2, 2 x 17 cm), die mit GL-Puffer gepackt worden ist. Dann wird mit GL-Puffer (80 ml) (Strömungsrate 25 ml/h, 5, 8 ml/Fraktion) gewaschen.
Danach werden die Verunreinigungen mit GL-Puffer, der 0, 1 M KCI enthält (Strömungsrate 25 ml/h, 5, 8 ml/Fraktion) eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 63 bis 79 werden durch lineare Gradientenelution mit GL-Puffer, der 200 ml 0, 1 M KCl enthält, und GL-Puffer, der 200 ml 0, 4 M KCI enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, pro Fraktion 5, 8 ml). Das vereinigte aktive Eluat (98 ml) wird entsalzt und mit einem Membranfilter bei 40C während 4 h konzentriert. Man erhält eine konzentrierte Lösung (10 ml). Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Calciumphosphatgel (2, 0 x 17, 2 cm), die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben.
Dann wird mit GL-Puffer (100 ml) gewaschen und mit einem linearen Gradienten von GL-Puffer 200 ml bis 100 mM Phosphatpuffer, der 200 ml 100 mM Glycerin enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, eine Fraktion 6 ml). Die aktiven Fraktionen 48 bis 58 werden gesammelt und die vereinigte Lösung wird mit einem Membranfilter konzentriert. Man erhält 2 ml Konzentrat. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Dextran-Gel (3 x 60 cm), die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Es wird mit dem gleichen Puffer (Strömugngsrate 25 ml/h, eine Fraktion 6 ml) eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 17 bis 20 werden gesammelt. Sie werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält gereinigte GK (spezifische Aktivität : 57, 6 U/mg, 16, 9 mg-Protein).
4. In den Zeichnungen bedeuten : Fig. 1 die optimale PH-Kurve für das erfindungsgemässe GK,
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für das erfindungsgemässe GK.