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PATENTANSPRÜCHE
1. Glycerinkinase, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgenden Eigenschaften aufweist: (a) Enzymwirkung: sie katalysiert mindestens die folgende Reaktion:
EMI1.1
(b) Molekulargewicht: 72000+7200; (c) isoelektrischer Punkt: 4,5; (d) Km-Wert: Glycerin 4,8 x 10-5 M
Dihydroxyaceton 6,6 x 10-4 M
D-Glyceraldehyd 3,5 x l0-4M
ATP 2 x10-4M (e) Spezifizitäten für Nukleotide; ATP > CTP > ITP GTP, UTP; (f) optimaler pH-Wert: 9 bis 10; (g) pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10; (h) Einfluss von Metallionen: stimuliert durch Mg+ +; inhibiert durch Ca+ + und Mn+ +; (i) Wärmestabilität: stabil bis zu 45 "C.
2. Verfahren zur Herstellung von Glycerinkinase nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces canus A 2408 in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium kultiviert und die so gebildete Glycerinkinase isoliert.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenstoffquelle Glycerin verwendet.
Die Erfindung betrifft neue Glycerinkinase und ihre Herstellung.
Glycerinkinase ist in der Vergangenheit als Enzym bekannt geworden, das die folgende Reaktion katalysiert.
Reaktion: ATP + Glycerin < ADP + L-a-Glycerophosphat (EC 2.7.1.30 ATP: Glycerinphosphattransferase, Trivialname: Glycerinkinase)
Die bis heute bekannten Glycerinkinasen (im folgenden wird die Glycerinkinase als GK bezeichnet) sind Enzyme aus Candida mycoderma (Biochem. Z., 329, 320 (1957), ibid., 333, 471 [1961]), Enzyme aus Escherichia coli (J. Biol. Chem., 242, 1030 [1967]) und Enzyme aus Taubenleber (Method in Enzymology, Band 5,476 (1962), Biochem. Z., 329, 320 [1957], J.
Biol. Chem. 211, 951 [1954]).
Es wurde gefunden, dass ein Streptomyces-Stamm A 2408, der aus einer Bodenprobe des Sojabohnenfelds in Kakegawa-shi, Shizuoka-ken, Japan, isoliert worden ist, in seinem Mycelium ein Enzym erzeugt, welches die Reaktion mit Glycerin und ATP zur Bildung von ADP und L-o-Glyce- rophosphat katalysiert. Elektrophoretisch wurde ein einziges Enzym in gereinigter Form isoliert. Das Enzym gehört zur GK-Gruppe, seine physikochemischen und biochemischen Eigenschaften sind bis jetzt jedoch noch nicht bekannt und somit ist es ein neues GK.
Die taxonomischen Eigenschaften des Streptomyces Stamms A 2408 sind wie folgt: 1. Morphologische Eigenschaften:
Die Farbe der Lufthyphen, die gereifte Sporen tragen, ist bräunlich-grau bis gräulich-braun. Gelblich-braunes Substratmycelium. Es bildet ein gelblich-braunes lösliches Pigment.
Beobachtungen auf einem anorganischen Stärkeagar bei 30 "C während 10 Tagen sind wie folgt. Man beobachtet die gleichen morphologischen Merkmale wie auf Hafermehlagar und Glycerin/Asparagin-Agar.
Die Lufthyphen besitzen einen Durchmesser von 0,6 bis 0,8 um, sie sind gerade oder wellenförmig, wachsen mit einfacher Verzweigung und bilden viele Sporenketten. Die Sporenketten bilden Spiralen mit losen 3 bis 5 Sporen in Form von Haken, Schlingen oder Schlangen.
Die Form der Sporen ist kugelförmig oder oval, 0,8 bis 1,0 x 1,0 bis 1,5 um, Oberflächen mit Stacheln.
Die Substratmycelien sind verzweigt, sie wachsen wellenförmig oder schlangenförmig, 0,5 bis 0,6 um Durchmesser und üblicherweise kein Aufspalten der Hyphen und Tragen von Sporen.
Keine Bildung von Geiselsporen und Sporenträgern.
II. Zusammensetzung der Diaminopimelinsäure:
L-Diaminopimelinsäure wird nachgewiesen.
III. Eigenschaften auf verschiedenen Medien:
Die Beobachtungen erfolgten auf verschiedenen Medien bei 30 "C während 20 Tagen, wie es in Tabelle I (die Farbangabe beruht auf Color Harmony Manual , 4. Auflage 1958 [Container Corp. of America, USA]) erläutert wird.
IV. Physiologische Eigenschaften:
1. Wachstumstemperatur: 12 bis 45 "C
2. Verflüssigung von Gelatine: positiv
3. Stärkehydrolyse: positiv
4. Magermilch: Peptonisierung positiv, Koagulation negativ
5. Bildung von melaminartigem Pigment: negativ
6. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen: Ausnutzen: L Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, i-Inosit, D-Mannit, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose.
Wie zuvor erläutert, gehört der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismusstamm A 2408 zu Streptomyces wegen seiner Eigenschaften, dass das Luftmycelium ein Sporenkettenwachstum von einem nicht-geteilten wahren Substratmyce lium zeigt, dem Durchmesser des Myceliums und der Sporengrösse und der L-Art der Diaminopimelinsäure. Der Stamm A 2408 besitzt die folgenden Eigenschaften. Die Farbe des Luftmyceliums ist bräunlich-grau bis gräulich-braun. Die Sporenkette ist lose 3 bis 5 aufgespulte Spiralen. Die Oberfläche der Sporen besitzt Dornen. Die Farbe des Substratmyceliums ist gelblich-braun. Bildung von gelblich-braunem löslichen Pigment. Die Ausnutzung von Zucker ist weit. Keine Bildung von melaminartigem Pigment.
Diese Eigenschaften können als Streptomyces canus zugeordnet werden (Heinemann et al.) [Antibiotics and Chemotherapy, 3, 1239 bis 1242 91953]) in International Streptomyces Project (ISP) (Inter. J.
System. Bacteriol., 18 (2), 95 [1968]). Ein Vergleich von Stamm A 2408 und Streptomyces canus ISP 5017 zeigt die Ähnlichkeit der morphologischen, Züchtungs- und physiologischen Eigenschaften.
Tabelle
Medium Wachstum Farbe des Substratmyceliums Luftmycelium lösliches Pigment Saccharose/Nitrat-Agar mässig bis goldbraun (3 pi) mässig bis gut: hellbraun keines gut (3 ec) Glucose/Asparagin-Agar mässig senfbraun (2 pi) schlecht bis mässig: natur keines (3 dc) bis hellbraun (3 ec) Glycerin/Asparagin-Agar gut nelkenbraun (3 pl) bis gut: beige (3 ge) bis keines goldbraun (3 pi) beige-braun (3 ig) Stärke/anorganisches gut goldbraun (3 pi) bis gut: beige (3 ge) bis silbergrau keines Salz-Agar nelkenbraun (3 pl) (3 fe) Tylosin-Agar gut goldbraun (3 pi) bis gut: beige (3 ge) bis keines bis hellbraun nelkenbraun (3 pl) beige-braun (3 ig) (4 ng)
Hafermehl-Agar gut goldbraun (3 pi) gut:
beige (3 ge) bis keines beige-braun (3 ig) Hefeextrakt/Malzextrakt-Agargut goldbraun (3 pi) gut: natur (3 dc) bis silbergrau keines (3 fe) Glycerin/Nitrat-Agar gut nelkenbraun (3 pl) gut: natur (3 dc) bis beige (3 nelkenbraun (3 pl) ge)
Glycerin/Stärke/Glutamat- gut nelkenbraun (3 pl) gut: beige (3 ge) bis nelkenbraun (3 pl)
Agar verschleiert lohfarben (2 ge)
Benett-Agar gut goldbraun (3 pi) gut: natur (3 dc) bis silbergrau keines (3 fe)
Emerson-Agar mässig senfgold (2 pe) wenig: weiss (a) keines
Nähragar mässib bis farblos bis hellgelb (2 ea) keines keines wenig
Der Stamm A 2408 wird somit als Streptomyces canus A 2408 bezeichnet. Dieser Stamm wurde am 8.
Mai 1979 im Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi l-chome Yatabemechi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 - Japan, als Hinterlegungsstelle unter der FERM-Nr. 4977 hinterlegt.
Es wurde gefunden, dass GK, das durch Streptomyces canus A 2408 gebildet wird, ein neues Enzym ist, das die im folgenden erläuterten physiokochemischen und biochemischen Eigenschaften aufweist.
GK kann als Forschungsreagenz oder diagnostisches Reagenz für den Metabolismus von Triglycerid in einem Körperfluid, wie Serum, verwendet werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues GK und ein Verfahren zu seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen.
Das neue GK wird nach dem in Patentanspruch 2 definierten Verfahren hergestellt. Die Züchtung ist normalerweise eine flüssige Züchtung und eine submerse, belüftete Kultur und für die industrielle Produktion geeignet.
Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoffquellen, besonders bevorzugt Glycerin, verwendet werden. Andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Melassen, können ebenfalls verwendet werden. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver bzw. Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, trockene Hefe, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt, Fischmehlextrakt und Pepton, verwendet werden. Gegebenenfalls können Phosphat, Sulfat und anorganische Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan oder Zink verwendet werden.
Die Züchtungstemperatur beträgt bevorzugt 25 bis 30 "C.
Die Züchtungszeit hängt von den Bedingungen ab und die Züchtung sollte bei der maximalen Produktion von GK beendet werden. Sie dauert im allgemeinen 1 bis 3 Tage.
Das erfindungsgemässe Enzym kann aus Mycelien isoliert werden. Die Kulturbrühe wird z.B. zum Sammeln des gezüchteten Myceliums, das mit Ultraschall beschallt worden ist, zentrifugiert, wobei man eine überstehende Lösung erhält.
Die überstehende Lösung wird unter Verwendung von Ammoniumsulfat (das im folgenden als AS bezeichnet wird) oder Natriumsulfat zur Abtrennung der Verunreinigungen ausgesalzt. Nachdem das überstehende Material ausgesalzt wurde, wird es zentrifugiert, wobei man einen GK enthaltenden Niederschlag erhält. Das ausgefällte GK wird weiter durch Entsalzen mit Sephadex G-25 (Warenzeichen, Pharmacia Co.), Biogel P-2 (Warenzeichen, Biorad Corp.) durch eine Dialysemembran oder ein Hohlfilter gereinigt.
Dann wird eine Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose durchführen. Die so erhaltene GK-Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran, wie Amicon XM-50 (Warenzeichen, Amicon Co.) konzentriert. Die entsalzte Fraktion wird einer Adsorptionschromatographie, wie unter Verwendung einer Calciumphosphatgelsäule, zur Abtrennung der Verunreinigungen unterworfen. Anschliessend wird mit einem Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers eluiert. Die GK enthaltende Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran, wie Amicon XM-50, konzentriert. Das Konzentrat wird der Gelchromatographie unter Verwendung von Biogel P-200 (Biorad Co.) oder Sephadex G-150 (Pharmacia Co.) unterworfen. Dann wird die GK-Fraktion lyophilisiert.
Das gemäss dem obigen Reinigungsverfahren erhaltene GK besitzt die folgenden physikochemischen und biochemischen Eigenschaften: (A) Enzymassay: 0,2M-Tris-HC1-Puffer (pH 9,0) 0,4 ml 0,l-M-Glycerin 0,05 ml 10 mM ATP 0,1 ml 10 mM MgCk 0,1 ml 0,25% Nitrotetrazoliumblau 0,1 ml 1% Rinderserumalbumin 0,14 ml 10 mM NAD 0,1 ml 0,05% Phenazinmethosulfat 0,01 ml Glycerophosphatdehydrogenase (Böhringer Co., 2 mg/ml, 65 U/mg) 5 1
Das obige Gemisch (1 ml) wird bei 37 C während 5 min preinkubiert und eine GK-Lösung (50 p1) [verdünnt mit GL Puffer (10 mM Phosphatpuffer, der 10 mM Glycerin enthält, pH 7,5]) wird zugegeben und dann wird bei 37 "C während 10 min inkubiert.
Die Reaktion wird beendet, indem man 0,1 N- HCI zugibt, und dann wird bei 550 nm zur Bestimmung der Absorption (A550 nm) analysiert.
Eine Einheit GK wird so definiert, dass sie 1 Mol Glycero-3-phosphat pro min freisetzt.
Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet: Enzymaktivität (U/ml)= AA x Verdünnungsverhältnis X ·
0,05 (U/ml) = 0,05 x 10 /\A - 2 Verdünnungsverhältnis (B) Physikochemische und biochemische Eigenschaften:
Enzymwirkung: Sie katalysiert mindestens die folgende Reaktion.
C1H2OH CH20P03H
ATP + CHOH ADP + HCOH C'H2OH Cl H2 OH
Molekulargewicht: 720007200 72000: bestimmt durch Sephadex G-100 65000: bestimmt durch SDS-Polyacrylamid
Isoelektrischer Punkt: 4,5
Km-Wert: Glycerin 4,8 x 10-5 M
Dihydroxyaceton 6,6 x 10 - 4M
D-Glyceraldehyd 3,5x 10-4M
ATP 2 x10-4M
Substratspezifizität:
1.
Spezifizität für Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat und D-Glyceraldehyd)
Assayverfahren: Reaktionsgemisch: 0,2M-Tris-HCI-Puffer (pH 9,0) 0,4 ml 0, I M-Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat oder D-Glyceraldehyd 0,05 ml 10 mM ATP 0,1 ml 10 mM MgCI2 0,1 ml destilliertes Wasser 0,3 ml
0,95 ml des Reaktionsgemisches werden bei 37 C während 3 min preinkubiert und die Enzymlösung (gelöst in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,05 ml) wird zugegeben. Dann wird bei 37 C während 10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man 3 min kocht. Nach dem Abkühlen auf 37 C wird die Menge an ADP analysiert.
ADP wird analysiert, indem man eine ADP-Analyselösung (2,0 ml) zugibt, die das folgende Gemisch enthält: 0,lM-Phosphatpuffer (pH 7,5) 0,1 ml 0,2M-Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5) 0,1 ml Peroxidase (0,5 mg/ml) 0,1 ml 0,2% Phenol 0,1 ml 0,3% 4-Aminoantipyrin 0,1 ml 10 mM MnCk 0,05 ml 10 mM Thiaminpyrophosphat 0,03 ml 1 mM FAD 0,01 ml 10 mM Phosphoenolpyruvat 0,1 ml Pyruvatoxidase (100 U/ml; Toyo Jozo Co.) 0,05 ml Pyruvatkinase (4400 Uiml; Sigma Chem. Co.) 1 p1 destilliertes Wasser 1,26 ml
Das Reaktionsgemisch wird bei 37 C während 15 min inkubiert. Die gemessene Farbe wird bei 500 nm zur Berechnung der Substratspezifizität gemessen.
Substrat relative Aktivität Glycerin 100% Dihydroxyaceton 749/0 D-Glyceraldehyd 30%
2. Spezifische Aktivität für das Nukleotid: ATP > CTP > ITP 9 GTP, UTP
Analyseverfahren:
Bei dem obigen Analyseverfahren (1) werden 10 mM ATP durch CTP, ITP, GTP und UTP ersetzt und dann wird das gebildete Glycero-3-phosphat gemessen. Wie im folgenden erläutert, können alle analysierten Nukleotide ein Substrat sein. Es wurde eine besonders hohe Spezifizität für ATP und CTP beobachtet.
Substrat relative Aktivität (%) ATP 100 CTP 92 ITP 47 GTP 19 UTP 18
Optimaler pH: pH 9 bis 10, wie in Fig. 1 dargestellt. [In der Figur 0-0: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6 bis 7,5), - : Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9), t-L: Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), Ä - : Glycin-NaOH-Puffer (pH 9 bis 10,5)].
pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10, wie in Fig. 2 dargestellt.
Dimethylglutaratpuffer (pH 4 bis 7) und Glycin-NaOH Puffer (pH 10 bis 10,5), die je 10 mM Glycerin enthalten, werden verwendet. Die Inkubation wird bei 37 C während 60 min durchgeführt.
Einfluss von Metallionen und p-Chlormercuribenzoat (PCMB) Reagenz Konzentration relative Aktivität (%) ohne Mg+ + mit 1 mM
Mg++ keines - 5 100 MgCk 1,0 mM 100 100 CaCl 1,0 mM 0 54 MnClr 1,0 mM 6 14 PCMB 5,0 x 106 - 13 PCMB 7,5x 106 M - 0
Das erfindungsgemässe GK wird durch Mg+ + aktiviert und durch Ca++ und Mn+ + inhibiert. 7,5:: 10-6 M PCMB inhibieren die Aktivität des erfindungsgemässen GK vollständig.
Wärmestabilität: stabil bis zu 45 C, wie in Fig. 3 dargestellt.
Analyse: 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,8), der 10 mM Glycerin enthält. Inkubation bei 45 bis 75 C jeweils während 10 min.
Wie zuvor erläutert, gehört das erfindungsgemässe Enzym zu einer Enzymklasse, die die Reaktion Glycerin und ATP zu ADP und L-u-Glycerat katalysiert.
Ein Vergleich mit der bekannten Glycerinkinase von Candida mycoderma GK (im folgenden als C.My.-GK bezeichnet), Escherichia coli GK (im folgenden als E.Co-GK bezeichnet) und Taubenherz-GK (im folgenden als Pig.-GK bezeichnet) und der erfindungsgemässen GK ist wie folgt.
Molekulargewicht von E.Co-GK beträgt 300 000 und von C.My.-GK 250 000 (Tetrameres: Molekulargewicht von 60 000), wohingegen das erfindungsgemässe GK ein Monomer mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 ist. Die pH-Stabilität ist pH 6,5 bis 7 für E.Co-GK, pH 4,5 bis 5,5 für Pig.-GK und pH 6,7 für C.My-GK, hingegen pH 5,5 bis 10 für das erfindungsgemässe GK. Da Reaktionen, die ATP erfordern, zweiwertige Metallionen benötigen, erfordert das obige GK ebenfalls Mg+ +. Jedoch kann Mn+ + für E.Co-GK und Pig.-GK ersetzt werden, wohingegen Mn+ + das erfindungsgemässe GK stark inhibiert.
Ausserdem unterscheiden sich die Substratspezifizitäten voneinander. E.Co.-GK zeigt fast die doppelt starke Aktivität für Dihydroxyacetonphosphat, verglichen mit der von Glycerin, wohingegen das erfindungsgemässe GK eine höhere Spezifizität für Glycerin zeigt als für Dihydroxyacetonphosphat.
E.Co-GK wirkt nur für ATP und das erfindungsgemässe GK für ATP und CTP, ebenfalls für ITP, GTP und UTP. Als Folge des Molekulargewichts, der pH-Stabilität, des Erfordernisses von zweiwertigen Metallionen und der Substratspezifizität lässt sich beweisen, dass die erfindungsgemäse Glycerinkinase eine neue GK ist.
Die erfindungsgemässe GK kann zu diagnostischen Zwekken Enzym verwendet werden.
Beispielsweise kann die erfindungsgemässe GK zur Analyse von Triglycerid und Glycerin verwendet werden, indem man mit Triglycerid und Lipoproteinlipase umsetzt, das Reaktionsgemisch mit GK und ATP unter Bildung von Glycero-3-phosphat inkubiert, das weiter mit Glycero3-phosphatoxidase inkubiert wird, und dann wird der verbrauchte Sauerstoff oder das freigesetzte Wasserstoffperoxid gemessen.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel
100 ml eines Mediums (pH 7,0), das 1,0% Pepton, 1,5% Glycerin, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4 und 0,20% KCI enthält, wird in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei 120 C 20 min lang sterilisiert. Es wird dann mit Streptomyces canus A 2408 FERM-P Nr. 4977 inokuliert. Anschliessend wird bei 26 "C während 3 Tagen gezüchtet. Die Kulturbrühe wird in ein 30-1-Kolbenfermentationsgefäss gegeben, das das gleiche Medium (20 1) enthält, und aerob bei 26 "C während 40 h kultiviert (300 U/m, Belüftung 20 1/min). 2 1 Kulturbrühe werden bei 4 "C zum Sammeln des Myceliums zentrifugiert (15 000 U/m, 10 min).
Das Mycelium wird in GL-Puffer (800 ml) suspendiert und bei 0 "C während 5 min durch eine Ultraschallvorrichtung (Kubota Insonator 200M, Warenzeichen) beschallt.
Die Lösung wird bei 4 "C während 10 min bei 15 000
U/m zentrifugiert, um überstehendes Material (760 ml) zu erhalten. Nach der Zugabe einer 5%gen Protaminlösung (23,0 ml) werden die Verunreinigungen durch Zentrifugieren bei 4 "C und 5000 U/m während 10 min prezitipiert. Gesät tigte Ammoniumsulfatlösung (pH 7,5, 1125 ml) wird zu dem überstehenden Material (750 ml) gegeben und dann wird bei
4 "C und 15 000 U/m während 10 min zum Sammeln des Pre zipitats zentrifugiert. Gesättigte AS (pH 7,5, 37,2 ml) wird zu der Lösung des Prezipitats in 62 ml GL-Puffer zur Ausfällung der Verunreinigungen gegeben. Überstehendes Material (82 ml) wird durch Zentrifugieren bei 4 "C und 15 000 U/m während 10 min erhalten.
Dann wird gesättigte AS (pH 7,5,
20,5 ml) zugegeben. Anschliessend wird bei 4 "C und 15 000
U/m während 10 min zentrifugiert. Man erhält einen Nieder schlag.
Der Niederschlag wird in GL-Puffer (11,0 ml) gelöst und die Lösung wird auf eine Säule von Sephadex G-25 (3 x 30 cm), die mit dem gleichen Puffer gepackt ist, gegeben, dann wird mit dem gleichen Puffer bei 25 "C und einer Strö mungsrate von 40 ml/h eluiert. Fraktionen, die Absorptionen bei 280 nm zeigen, werden gesammelt (etwa 21 ml). Diese gibt man auf eine Säule aus DEAE-Cellulose (2,2 x 17 cm), die mit
GL-Puffer gepackt worden ist. Dann wird mit GL-Puffer i (80 ml) (Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) gewaschen.
Danach werden die Verunreinigungen mit GL-Puffer, der 0,1 M-KCI enthält, (Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 63 bis 79 werden durch lineare Gradientenelution mit GL-Puffer, der 200 ml 0,1 M- KCI enthält, und GL-Puffer, der 200 ml 0,4M-KCI enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, pro Fraktion 5,8 ml). Das ver einigte aktive Eluat (98 ml) wird entsalzt und mit Amicon
XM-50 bei 4 "C während 4 h konzentriert. Man erhält eine konzentrierte Lösung (10 ml). Das Konzentrat wird auf eine 5 Säule aus Calciumphosphatgel (2,0 x 17,2 cm), die mit GL
Puffer gepackt ist, gegeben.
Dann wird mit GL-Puffer (100 ml) gewaschen und mit einem linearen Gradienten von
GL-Puffer 200 ml bis 100 mM Phosphatpuffer, der 200 ml
100 mM Glycerin enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, ,eine Fraktion 6 ml). Die aktiven Fraktionen 48 bis 58 werden gesammelt und die vereinigte Lösung wird mit Amicon
XM-50 konzentriert. Man erhält 2 ml Konzentrat. Das Kon zentrat wird auf eine Säule aus Biogel P-200 (3 x 60 cm), die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Es wird mit dem gleichen 5 Puffer (Strömungsrate 25 ml/h, eine Fraktion 6 ml) eluiert.
Die aktiven Fraktionen Nr. 17 bis 20 werden gesammelt. Sie werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält gereinigte GK (spezifische Aktivität: 57,6 U/mg, 16,9 mg-Protein).
4. Erläuterung der Zeichnungen:
Fig. 1: optimale pH-Kurve für das erfindungsgemässe VGK.
Fig. 2: pH-Stabilitätskurve für das erfindungsgemässe 5 GK.
Fig. 3: Wärmestabilitätskurve für das erfindungsgemässe
GK.
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS
1. glycerol kinase, characterized in that it has the following properties: (a) enzyme action: it catalyzes at least the following reaction:
EMI1.1
(b) molecular weight: 72000 + 7200; (c) isoelectric point: 4.5; (d) Km value: glycerin 4.8 x 10-5 M
Dihydroxyacetone 6.6 x 10-4 M
D-glyceraldehyde 3.5 x 10-4M
ATP 2 x10-4M (e) specificities for nucleotides; ATP> CTP> ITP GTP, UTP; (f) optimal pH: 9 to 10; (g) pH stability: pH 5.5 to 10; (h) Influence of metal ions: stimulated by Mg ++; inhibited by Ca ++ and Mn ++; (i) Thermal stability: stable up to 45 "C.
2. Process for the preparation of glycerol kinase according to claim 1, characterized in that one cultivates Streptomyces canus A 2408 in a nutrient medium containing carbon and nitrogen sources and inorganic salts and the glycerol kinase thus formed is isolated.
3. The method according to claim 2, characterized in that glycerol is used as the carbon source.
The invention relates to new glycerol kinase and its production.
Glycerol kinase has been known in the past as an enzyme that catalyzes the following reaction.
Reaction: ATP + glycerin <ADP + L-a-glycerophosphate (EC 2.7.1.30 ATP: glycerol phosphate transferase, common name: glycerol kinase)
The glycerol kinases known to date (hereinafter the glycerol kinase is referred to as GK) are enzymes from Candida mycoderma (Biochem. Z., 329, 320 (1957), ibid., 333, 471 [1961]), enzymes from Escherichia coli (J Biol. Chem., 242, 1030 [1967]) and enzymes from pigeon liver (Method in Enzymology, volume 5.476 (1962), Biochem. Z., 329, 320 [1957], J.
Biol. Chem. 211, 951 [1954]).
A Streptomyces strain A 2408, isolated from a soil sample from the soybean field in Kakegawa-shi, Shizuoka-ken, Japan, was found to produce an enzyme in its mycelium that would react with glycerin and ATP to form Catalyzed ADP and Lo-Glycerophosphate. A single enzyme in purified form was isolated electrophoretically. The enzyme belongs to the GK group, but its physicochemical and biochemical properties are not yet known, making it a new GK.
The taxonomic properties of Streptomyces strain A 2408 are as follows: 1. Morphological properties:
The color of the aerial hyphae that have matured spores is brownish-gray to grayish-brown. Yellowish-brown substrate mycelium. It forms a yellowish-brown soluble pigment.
Observations on an inorganic starch agar at 30 ° C. for 10 days are as follows. The same morphological characteristics are observed as on oatmeal agar and glycerin / asparagine agar.
The aerial hyphae have a diameter of 0.6 to 0.8 µm, they are straight or wavy, grow with simple branching and form many spore chains. The spore chains form spirals with loose 3 to 5 spores in the form of hooks, loops or snakes.
The shape of the spores is spherical or oval, 0.8 to 1.0 x 1.0 to 1.5 µm, surfaces with spikes.
The substrate mycelia are branched, they grow wavy or serpentine, 0.5 to 0.6 µm in diameter and usually no splitting of the hyphae and carrying spores.
No formation of hostage spores and spore carriers.
II. Composition of diaminopimelic acid:
L-diaminopimelic acid is detected.
III. Properties on different media:
The observations were made on various media at 30 "C for 20 days, as explained in Table I (the color is based on Color Harmony Manual, 4th edition 1958 [Container Corp. of America, USA]).
IV. Physiological properties:
1. Growth temperature: 12 to 45 "C
2. Liquefaction of gelatin: positive
3. Starch hydrolysis: positive
4. Skim milk: peptonization positive, coagulation negative
5. Formation of melamine-like pigment: negative
6. Utilization of carbon sources: Exploit: L arabinose, D-fructose, D-glucose, i-inositol, D-mannitol, raffinose, L-rhamnose, sucrose and D-xylose.
As previously explained, the microorganism strain A 2408 used according to the invention belongs to Streptomyces because of its properties that the aerial mycelium shows a spore chain growth from an undivided true substrate mycelium, the diameter of the mycelium and the spore size and the L-type of the diaminopimelic acid. The A 2408 strain has the following characteristics. The color of the aerial mycelium is brownish-gray to greyish-brown. The spore chain is loosely 3 to 5 wound spirals. The surface of the spores has thorns. The color of the substrate mycelium is yellowish brown. Formation of yellowish-brown soluble pigment. Sugar is widely used. No formation of melamine-like pigment.
These properties can be assigned as Streptomyces canus (Heinemann et al. [Antibiotics and Chemotherapy, 3, 1239 to 1242 91953]) in the International Streptomyces Project (ISP) (Inter. J.
System. Bacteriol., 18 (2), 95 [1968]). A comparison of strain A 2408 and Streptomyces canus ISP 5017 shows the similarity of the morphological, breeding and physiological properties.
table
Medium growth Color of substrate mycelium Air mycelium soluble pigment Sucrose / nitrate agar moderate to golden brown (3 pi) moderate to good: light brown none good (3 ec) Glucose / asparagine agar moderate mustard brown (2 pi) poor to moderate: natural none (3rd dc) to light brown (3 ec) glycerin / asparagine agar good clove brown (3 pl) to good: beige (3 ge) to none golden brown (3 pi) beige-brown (3 ig) starch / inorganic good golden brown (3 pi) to good: beige (3 ge) to silver gray no salt agar clove brown (3 pl) (3 fe) tylosin agar good golden brown (3 pi) to good: beige (3 ge) to none to light brown clove brown (3 pl) beige -brown (3 ig) (4 ng)
Oatmeal agar good golden brown (3 pi) good:
beige (3 ge) to none beige-brown (3 ig) yeast extract / malt extract agar good golden brown (3 pi) good: natural (3 dc) to silver gray none (3 fe) glycerin / nitrate agar good clove brown (3 pl) good : natural (3 dc) to beige (3 carnation brown (3 pl) ge)
Glycerin / starch / glutamate- good clove brown (3 pl) good: beige (3 ge) to clove brown (3 pl)
Agar veiled tan (2 ge)
Benett agar good golden brown (3 pi) good: natural (3 dc) to silver gray none (3 fe)
Emerson agar moderately mustard gold (2 pe) little: white (a) none
Nutrient agar moderate to colorless to light yellow (2 ea) none none none
The strain A 2408 is thus referred to as Streptomyces canus A 2408. This strain was
May 1979 at the Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi l-chome Yatabemechi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 - Japan, as a depository under the FERM- No. 4977 deposited.
GK, which is formed by Streptomyces canus A 2408, has been found to be a new enzyme which has the physiocochemical and biochemical properties explained below.
GK can be used as a research or diagnostic reagent for the metabolism of triglyceride in a body fluid such as serum.
The object of the present invention is therefore to provide a new GK and a method for its production.
The new GK is manufactured according to the method defined in claim 2. The breeding is usually a liquid cultivation and a submerged, aerated culture and is suitable for industrial production.
Assimilable carbon sources, particularly preferably glycerol, can be used as carbon sources. Other carbon sources such as glucose, sucrose, lactose, starch, molasses can also be used. Assimilable nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean powder or soybean meal, cottonseed meal, dry yeast, casein hydrolyzate, yeast extract, fish meal extract and peptone can be used as nitrogen sources. Optionally, phosphate, sulfate and inorganic salts of magnesium, calcium, potassium, iron, manganese or zinc can be used.
The cultivation temperature is preferably 25 to 30 "C.
The breeding time depends on the conditions and the breeding should be stopped at the maximum production of GK. It generally lasts for 1 to 3 days.
The enzyme according to the invention can be isolated from mycelia. The culture broth is e.g. centrifuged to collect the cultured mycelium sonicated to obtain a supernatant solution.
The supernatant solution is salted out using ammonium sulfate (hereinafter referred to as AS) or sodium sulfate to separate the impurities. After the supernatant has been salted out, it is centrifuged to obtain a precipitate containing GK. The precipitated GK is further purified by desalting with Sephadex G-25 (trademark, Pharmacia Co.), Biogel P-2 (trademark, Biorad Corp.) through a dialysis membrane or a hollow filter.
Then ion exchange chromatography will be performed using DEAE cellulose. The GK fraction thus obtained is desalted and concentrated through an ultrafiltration membrane such as Amicon XM-50 (trademark, Amicon Co.). The desalted fraction is subjected to adsorption chromatography, such as using a calcium phosphate gel column, to separate the impurities. The mixture is then eluted with a gradient using a phosphate buffer. The fraction containing GK is desalted and concentrated through an ultrafiltration membrane such as Amicon XM-50. The concentrate is subjected to gel chromatography using Biogel P-200 (Biorad Co.) or Sephadex G-150 (Pharmacia Co.). Then the GK fraction is lyophilized.
The GK obtained according to the above purification process has the following physicochemical and biochemical properties: (A) Enzyme assay: 0.2M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 0.4 ml 0.1M glycerol 0.05 ml 10 mM ATP 0.1 ml 10 mM MgCk 0.1 ml 0.25% nitrotetrazolium blue 0.1 ml 1% bovine serum albumin 0.14 ml 10 mM NAD 0.1 ml 0.05% phenazine methosulfate 0.01 ml glycerophosphate dehydrogenase (Böhringer Co., 2 mg / ml, 65 U / mg) 5 1
The above mixture (1 ml) is preincubated at 37 C for 5 min and a GK solution (50 p1) [diluted with GL buffer (10 mM phosphate buffer containing 10 mM glycerol, pH 7.5]) is added and then is incubated at 37 "C for 10 min.
The reaction is stopped by adding 0.1N-HCl and then analyzed at 550 nm to determine the absorption (A550 nm).
One unit of GK is defined to release 1 mole of glycero-3-phosphate per minute.
Enzyme activity is calculated by the following equation: Enzyme activity (U / ml) = AA x dilution ratio X
0.05 (U / ml) = 0.05 x 10 / \ A - 2 dilution ratio (B) Physicochemical and biochemical properties:
Enzyme action: It catalyzes at least the following reaction.
C1H2OH CH20P03H
ATP + CHOH ADP + HCOH C'H2OH Cl H2 OH
Molecular weight: 720007200 72000: determined by Sephadex G-100 65000: determined by SDS-polyacrylamide
Isoelectric point: 4.5
Km value: glycerin 4.8 x 10-5 M.
Dihydroxyacetone 6.6 x 10-4M
D-glyceraldehyde 3.5x 10-4M
ATP 2 x10-4M
Substrate specificity:
1.
Specificity for glycerin, dihydroxyacetone phosphate and D-glyceraldehyde)
Assay procedure: Reaction mixture: 0.2M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 0.4 ml 0, 1 M-glycerol, dihydroxyacetone phosphate or D-glyceraldehyde 0.05 ml 10 mM ATP 0.1 ml 10 mM MgCl 2 0 , 1 ml distilled water 0.3 ml
0.95 ml of the reaction mixture are preincubated at 37 C for 3 min and the enzyme solution (dissolved in 10 mM phosphate buffer, pH 7.5, 0.05 ml) is added. Then incubate at 37 C for 10 min. The reaction is stopped by boiling for 3 minutes. After cooling to 37 C, the amount of ADP is analyzed.
ADP is analyzed by adding an ADP analysis solution (2.0 ml) containing the following mixture: 0.1M phosphate buffer (pH 7.5) 0.1 ml 0.2M dimethylglutarate NaOH buffer (pH 7.5) 0.1 ml peroxidase (0.5 mg / ml) 0.1 ml 0.2% phenol 0.1 ml 0.3% 4-aminoantipyrine 0.1 ml 10 mM MnCk 0.05 ml 10 mM Thiamine pyrophosphate 0.03 ml 1 mM FAD 0.01 ml 10 mM phosphoenol pyruvate 0.1 ml pyruvate oxidase (100 U / ml; Toyo Jozo Co.) 0.05 ml pyruvate kinase (4400 Uiml; Sigma Chem. Co.) 1 p1 distilled water 1.26 ml
The reaction mixture is incubated at 37 C for 15 min. The measured color is measured at 500 nm to calculate the substrate specificity.
Substrate relative activity glycerol 100% dihydroxyacetone 749/0 D-glyceraldehyde 30%
2. Specific activity for the nucleotide: ATP> CTP> ITP 9 GTP, UTP
Analysis method:
In the above analysis method (1), 10 mM ATP is replaced by CTP, ITP, GTP and UTP and then the glycero-3-phosphate formed is measured. As explained below, all of the nucleotides analyzed can be a substrate. A particularly high specificity for ATP and CTP was observed.
Substrate relative activity (%) ATP 100 CTP 92 ITP 47 GTP 19 UTP 18
Optimal pH: pH 9 to 10, as shown in Fig. 1. [In the figure 0-0: dimethylglutarate-NaOH buffer (pH 6 to 7.5), -: Tris-HCl buffer (pH 7 to 9), tL: phosphate buffer (pH 6 to 8), Ä -: glycine -NaOH buffer (pH 9 to 10.5)].
pH stability: pH 5.5 to 10 as shown in Fig. 2.
Dimethylglutarate buffers (pH 4 to 7) and glycine-NaOH buffers (pH 10 to 10.5), each containing 10 mM glycerol, are used. Incubation is carried out at 37 C for 60 min.
Influence of metal ions and p-chloro mercuribenzoate (PCMB) reagent concentration relative activity (%) without Mg + + with 1 mM
Mg ++ none - 5 100 MgCk 1.0 mM 100 100 CaCl 1.0 mM 0 54 MnClr 1.0 mM 6 14 PCMB 5.0 x 106 - 13 PCMB 7.5 x 106 M - 0
The GK according to the invention is activated by Mg ++ and inhibited by Ca ++ and Mn ++. 7.5 :: 10-6 M PCMB completely inhibit the activity of the GK according to the invention.
Heat stability: stable up to 45 C, as shown in Fig. 3.
Analysis: 10 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 10 mM glycerin. Incubation at 45 to 75 C for 10 min each.
As explained above, the enzyme according to the invention belongs to an enzyme class which catalyzes the reaction glycerol and ATP to ADP and L-u-glycerate.
A comparison with the known glycerol kinase from Candida mycoderma GK (hereinafter referred to as C.My.-GK), Escherichia coli GK (hereinafter referred to as E.Co-GK) and Taubenherz-GK (hereinafter referred to as Pig.-GK ) and the GK according to the invention is as follows.
Molecular weight of E. Co-GK is 300,000 and of C.My.-GK is 250,000 (tetrameres: molecular weight of 60,000), whereas the GK according to the invention is a monomer with a molecular weight of about 70,000. The pH stability is pH 6.5 to 7 for E. Co-GK, pH 4.5 to 5.5 for Pig.-GK and pH 6.7 for C.My-GK, however pH 5.5 to 10 for the GK according to the invention. Since reactions that require ATP require divalent metal ions, the above GK also requires Mg ++. However, Mn + + can be replaced for E.Co-GK and Pig.-GK, whereas Mn + + strongly inhibits the GK according to the invention.
In addition, the substrate specificities differ from each other. E.Co.-GK shows almost twice the activity for dihydroxyacetone phosphate compared to that of glycerin, whereas the GK according to the invention shows a higher specificity for glycerin than for dihydroxyacetone phosphate.
E. Co-GK only works for ATP and the GK according to the invention for ATP and CTP, also for ITP, GTP and UTP. As a result of the molecular weight, the pH stability, the requirement of divalent metal ions and the substrate specificity, it can be demonstrated that the glycerol kinase according to the invention is a new GK.
The GK according to the invention can be used for diagnostic purposes.
For example, the GK of the present invention can be used to analyze triglyceride and glycerin by reacting with triglyceride and lipoprotein lipase, incubating the reaction mixture with GK and ATP to form glycero-3-phosphate, which is further incubated with glycero3-phosphate oxidase, and then the oxygen consumed or the hydrogen peroxide released is measured.
The following example illustrates the invention.
example
100 ml of a medium (pH 7.0) containing 1.0% peptone, 1.5% glycerol, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4 and 0.20% KCI is placed in a 500 ml Erlenmeyer flasks and sterilized at 120 C for 20 min. It is then inoculated with Streptomyces canus A 2408 FERM-P No. 4977. Subsequently, cultivation is carried out at 26 ° C. for 3 days. The culture broth is placed in a 30-1 flask fermentation vessel which contains the same medium (20 l) and cultivated aerobically at 26 ° C. for 40 h (300 rpm, aeration 20 rpm). 2 1 culture broth are centrifuged at 4 "C to collect the mycelium (15,000 U / m, 10 min).
The mycelium is suspended in GL buffer (800 ml) and sonicated at 0 ° C. for 5 minutes by an ultrasound device (Kubota Insonator 200M, trademark).
The solution is at 4 "C for 10 min at 15,000
RPM centrifuged to obtain supernatant (760 ml). After adding a 5% protamine solution (23.0 ml), the impurities are precipitated by centrifugation at 4 ° C. and 5000 rpm for 10 min. Saturated ammonium sulfate solution (pH 7.5, 1125 ml) becomes the supernatant (750 ml) and then at
Centrifuged at 4 "C and 15,000 U / m for 10 min to collect the precipitate. Saturated AS (pH 7.5, 37.2 ml) is added to the solution of the precipitate in 62 ml GL buffer to precipitate the impurities. Supernatant (82 ml) is obtained by centrifugation at 4 "C and 15,000 U / m for 10 minutes.
Then saturated AS (pH 7.5,
20.5 ml) added. Then at 4 "C and 15 000
U / m centrifuged for 10 min. You get a knockdown.
The precipitate is dissolved in GL buffer (11.0 ml) and the solution is applied to a column of Sephadex G-25 (3 x 30 cm) packed with the same buffer, then added with the same buffer 25 "C and a flow rate of 40 ml / h eluted. Fractions showing absorptions at 280 nm are collected (about 21 ml). These are placed on a column of DEAE cellulose (2.2 x 17 cm), with
GL buffer has been packed. Then it is washed with GL buffer i (80 ml) (flow rate 25 ml / h, 5.8 ml / fraction).
The contaminants are then eluted with GL buffer containing 0.1 M-KCI (flow rate 25 ml / h, 5.8 ml / fraction). The active fractions No. 63 to 79 are eluted by linear gradient elution with GL buffer containing 200 ml 0.1 M-KCI and GL buffer containing 200 ml 0.4M-KCI (flow rate 25 ml / h , 5.8 ml per fraction). The united active eluate (98 ml) is desalted and with Amicon
XM-50 concentrated at 4 "C for 4 h. A concentrated solution (10 ml) is obtained. The concentrate is placed on a 5 column of calcium phosphate gel (2.0 x 17.2 cm), which is filled with GL
Buffer packed is given.
Then it is washed with GL buffer (100 ml) and with a linear gradient of
GL buffer 200 ml to 100 mM phosphate buffer, the 200 ml
Contains 100 mM glycerol, eluted (flow rate 25 ml / h, a fraction 6 ml). The active fractions 48 to 58 are collected and the combined solution is washed with Amicon
XM-50 concentrated. 2 ml of concentrate are obtained. The concentrate is placed on a column of Biogel P-200 (3 x 60 cm) packed with GL buffer. It is eluted with the same 5 buffer (flow rate 25 ml / h, a fraction 6 ml).
The active fractions No. 17 to 20 are collected. They are combined and lyophilized. Purified GK is obtained (specific activity: 57.6 U / mg, 16.9 mg protein).
4. Explanation of the drawings:
1: optimal pH curve for the VGK according to the invention.
2: pH stability curve for the 5 GK according to the invention.
Fig. 3: Thermal stability curve for the inventive
GK.