"Composition et procédé pour déterminer
le taux de magnésium de liquides".
La présente invention est relative au titrage des taux de magnésium existant dans des liquides aqueux. La présente invention se rapporte plus particulièrement à des procédés de détermi-
<EMI ID=1.1>
oxydase.
La détermination rapide et précise, dans le sérum du sang, des quantités et des taux d'activité de divers minéraux et enzymes constitue un moyen de diagnostic médical important. Le magnésium est le second cation intercellulaire le plus abondant, existant dans le corps humain, et il sert d'activateur pour de nombreuses enzymes importantes. Son importance en physiologie humaine est bien connue. De ce fait, un titrage précis du magnésium du sérum constitue un moyen de diagnostic d'une valeur exceptionnelle.
On a proposé de nombreuses techniques spectrophotométriques pour le titrage du magnésium, en utilisant de la calmagite, du bleu de méthylthymoi, du jaune de titane ou du suflonate de Magon. Ces méthodes sont d'une précision limitée car elles sont basées sur des réactions de chélation et, par conséquent, elles sont sujettes à des degrés variables d'interférences par d'autres cations présents dans l'échantillon. Des analyses d'absorption atomique
et d'activation neutronique ne présentent pas ces erreurs mais elles sont très complexes et sont coûteuses, au point d'être prohibitives, pour la plupart des laboratoires cliniques courants.
On a constaté que le magnésium se combine avec l'adénosine diphosphate (ADP) ou l'adénosine triphosphate (ATP) pour former un complexe moléculaire. Comme signalé dans 31 Clinical Chemistry, pages 703 à 705 (1985), Tabata et col. ont proposé un titrage de magnésium enzymatique utilisant les enzymes hexokinase et glucose-6-phosphate déshydrogénase. Dans leur titrage à réaction arrêtée, la quantité de (NAD(P)H) produite sur une période de 15 minutes est déterminée par arrêt de la réaction d'hexokinase avec du EDTA tétrasodique et en mesurant l'absorbance à 340 nm. Cette absorbance finale dépendant de la vitesse est proportionnelle à la quantité du complexe Mg.ATP présent et, de ce fait, à la concentration de magnésium dans le sérum.
Cette méthode de titrage de magnésium enzymatique exige une incubation préalable de l'échantillon et une période prolongée de réaction, ce qui la rend inappropriée pour une analyse par un appareillage automatisé.
La méthode de Tabata suppose un certain nombre de limitations inhérentes. En premier lieu, elle exige des spectrophotomètres à bande étroite, relativement coûteux, capables de pratiquer des mesures dans la région de l'ultraviolet, pour donner l'absorbance réelle de l'indicateur coenzymatique. En second lieu, ce titrage subit une interférence significative de la part de la lipémie car les effets de diffusion de la lumière de cette substance sont fortement renforcés à des longueurs d'onde inférieures à 400 nm. En troisième lieu, la sensibilité du titrage est limitée du fait de l' absorptivité molaire relativement basse de la substance indicatrice employée. En quatrième lieu, les titrages sont perturbés par des blancs élevés de réactif. En cinquième lieu, la nécessité d'arrêter la réaction réduit fortement la possibilité d'automatiser le processus.
De ce fait, il serait désirable de développer un procédé qui assurerait la détermination rapide et précise des taux de magnésium dans le sérum du sang. Il serait également désirable de prévoir une méthode qui donnerait une détermination colorimétrique d'une sensibilité accrue. Il serait également désirable de prévoir une méthode donnant des résultats décelables à une longueur d'onde supérieure à 340 nm afin de réduire au minimum les effets de dispersion de la lumière dues à la turbidité du sérum et provoqués dans des échantillons lipémiques.
Suivant l'invention, on prévoit une méthode et une composition associée pour la détermination des quantités de magnésium existant . dans un milieu aqueux. Le milieu aqueux peut être une substance quelconque d'origine biologique ou non biologique.
Des exemples de milieux de ce genre sont le sang complet, le plasma, le sérum du sang, des solutions tamponnées, etc.
La présente invention est basée sur la découverte que l'absorbance finale créée à la suite de la réaction basique dans laquelle du glycérol est phosphorylé et mis en réaction en présence
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être amenée à être proportionnelle à la quantité d'un complexe formé entre le ATP et le magnésium.
La méthode de détermination des taux de magnésium dans des échantillons aqueux comprend les phases suivantes :
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de l'échantillon avec une quantité déterminée de : (a) une solution de réactifs, ou (b) des solutions contenant des réactifs et des enzymes, pour déclencher une réaction séquentielle qui finalement formera une espèce décelable, telle qu'un chromogène; et
Il. La mesure de l'espèce décelable ainsi formée.
La composition de la présente invention contient
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kinase, de l'adénosine 5'-triphosphate (ATP), du glycérol et des cosubstrats indicateurs spécifiques. On a constaté qu'une mise en contact d'un échantillon avec les réactifs énumérés et une composition enzymatique déclenche une série ordonnée de réactions qui finalement sont dépendantes de la vitesse d'après la concentration du magnésium présent dans la solution d'échantillon.
La séquence ordonnée de réactions se développe de la façon suivante :
A. Le magnésium présent dans l'échantillon réagit mutuellement avec le ATP venant de la solution de réactifs pour former un complexe de magnésium-ATP (Mg.ATP);
B. le complexe Mg.ATP crée une phosphorylation du glycérol avec catalyse par glycérol kinase pour former du glycérol3-phosphate et un complexe de magnésium-adénosine 5'-diphosphate
(Mg.ADP), le glycérol et la glycérol kinase étant fournis par la composition de la présente invention;
C. le glycérol-3-phosphate ainsi produit réagit avec l'oxygène ambiant pour donner du peroxyde d'hydrogène dans une réaction catalysée par la o(-glycérophosphate oxydase présente dans la composition de la présente invention; et
D. le peroxyde d'hydrogène produit peut être déterminé directement par des techniques traditionnelles ou il réagit encore avec les co-substrats indicateurs dans une réaction catalysée par peroxydase pour former un chromogène décelable à la vue, les co-substrats et la peroxydase présents dans la composition de la présente invention.
Pour mieux comprendre la présente invention, on se référera à la description détaillée suivante et aux exemples présentés.
L'invention est basée sur la découverte que le magnésium présent dans des fluides biologiques a une affinité pour les adénosine polyphosphates et forme un complexe avec ceux-ci. On a également constaté que la vitesse de la séquence de réactions mise en évidence par le Tableau 1 dépend de la complexation du. magnésium avec le ATP, et non pas simplement de la présence du ATP seul. Le complexe de Mg.ATP constitue de ce fait le réactif limitateur dans la formation du glycérol-3-phosphate et dans toutes les réactions ultérieures de la séquence.
La méthode de détermination des taux de magnésium existant dans un échantillon aqueux comprend de ce fait les phases suivantes :
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d'échantillon avec une quantité prédéterminée de : (a) une solution de réactifs, ou (b) des solutions contenant des réactifs et des enzymes, pour déclencher la réaction séquentielle qui forme finalement une espèce décelable, telle qu'un chromogène; et
Il. la mesure de l'espèce décelable ainsi formée.
La séquence ordonnée de réactions se développe de telle sorte que le magnésium présent dans l'échantillon est transformé en complexe avec le ATP. Le complexe de Mg.ATP fournit un groupe phosphate dans la phosphorylation, catalysée par glycérol kinase, du glycérol en glycérol-3-phosphate. Le glycérol-3-phosphate en présence de l'oxygène ambiant et de o(-glycérophosphate oxydase, réagit pour former du peroxyde d'hydrogène qui peut être converti en un chromogène décelable par l'intermédiaire d'une réduction catalysée par peroxydase.
Pour mettre en oeuvre la méthode suivant la présente invention, on prévoit une composition de réactifs, qui contient tous les réactifs et toutes les enzymes, nécessaires pour former un complexe avec le magnésium de l'échantillon en vue d'amorcer
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sition de réactifs peut être une solution en une seule partie ou une solution en plusieurs parties suivant le désir. La composition de réactifs comprend essentiellement :
(a) de la glycérol kinase;
(b) de la Ot-glycérophosphate oxydase;
(c) un composé ayant une activité de peroxydase;
(d) de l'adénosine 5'-triphosphate;
(e) du glycérol;
(f) un co-substrat oxydable par peroxydase;
(g) un agent de combinaison - co-substrat indicateur;
(h) un tampon capable d'entretenir un pH de solution compris
entre environ 6,0 et environ 8,0; et
(i) de l'eau.
Il entre dans le cadre de l'invention d'ajouter individuellement ou suivant une combinaison quelconque, les produits chimiques et les enzymes qui déclencheront la séquence de réactions
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produits chimiques et enzymes peuvent donc être maintenus dans des solutions tamponnées séparées et utilisés suivant les nécessités. Suivant une forme de réalisation, le glycérol et le co-substrat indicateur sont maintenus dans une solution tamponnée, séparément d'une solution tamponnée contenant les constituants restants. Dans cette forme de réalisation, la solution contenant les constituants restants est mélangée avec l'échantillon pour permettre la formation du complexe de Mg.ATP. On laisse réagir les réactifs et l'échantillon <EMI ID=8.1>
pendant une période comprise entre environ 5 secondes et environ
10 minutes. Pour assurer un contact intime, le mélange peut être soumis à agitation. La solution tamponnée de glycérol est ensuite ajoutée au mélange. L'addition du glycérol déclenche la séquence ordonnée de réactions et permet un titrage de la concentration en magnésium de l'échantillon.
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Dès que tous les composants ont été mélangés avec l'échantillon, l'absorbance du mélange résultant est surveillée pendant un intervalle de temps allant jusqu'à environ 5 à environ
15 minutes à une longueur d'onde spécifiée, comprise entre environ
450 et environ 650 nm, de préférence à 510 nm, suivant les cosubstrats indicateurs utilisés. Un témoin de réactifs contenant une quantité mesurée d'eau peut également être préparé pour déterminer l'absorbance de base de l'eau employée dans la préparation des solutions de réactifs. Le changement dans l'absorbance au cours
<EMI ID=11.1>
de l'échantillon.
La composition de la présente invention contient du ATP en une concentration comprise entre environ 0,05 et environ 2,0 mmoles par litre. Le ATP dans cette gamme de concentrations formera un complexe avec le magnésium présent dans un échantillon de fluide biologique pour assurer une détermination efficace du taux de magnésium dans l'échantillon, allant jusqu'à environ 2,5 mmoles de magnésium par litre. Des concentrations de magnésium supérieures à 2,5 mmoles/litre peuvent être déterminées par une dilution mesurée de l'échantillon avec des solutions salines normales traditionnelles, sans magnésium, et un nouveau titrage. Du ATP est disponible sur le marché auprès de la société Sigma Chamical Corp., St. Louis, MO.
Dès que le complexe de Mg.ATP s'est formé dans la solution aqueuse, un contact avec du glycérol en présence de glycérol kinase assurera la phosphorylation du glycérol pour former du glycérol-3-phosphate et du Mg.ADP. Dans la méthode et la composition suivant la présente invention, on utilise du glycérol en une concentration comprise entre environ 0,05 et environ 20 mmoles par litre, avec une préférence pour des concentrations comprises entre environ 0,2 et environ 7 mmoles par litre. Le glycérol peut être obtenu sur le marché. auprès de la société Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
D'une manière ,générale, on peut employer de la glycérol kinase provenant de n'importe quelle source, dans la mise
<EMI ID=12.1> de la glycérol kinase dérivant de Streptomyces canus (E.C. 2.7.1.30). On peut obtenir cette glycérol kinase de la société Finnsugar Bio-
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on utilise avec succès de la glycérol kinase en des quantités d'environ
10 U à environ 150 U par litre de tampon.
Le glycérol-3-phosphate produit de la réaction catalysée par enzyme du Mg.ATP avec du glycérol réagit en présence
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acétone et du peroxyde d'hydrogène.
La o(-gtycérophosphate oxydase utilisée peut dériver de toute une série d'espèces microbiennes pouvant provenir de toute une variété de sources. Les propriétés de cette enzyme dérivant de certaines sources sont plus avantageuses que les propriétés d'enzymes provenant d'autres sources, dans le cas de la méthode de la présente invention. On préfère l'enzyme obtenue de Aerococcus viridans car elle montre une plus grande activité sur une plus large
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phosphate oxydase obtenue de cette source peut être utilisée avec succès dans la présente invention en des quantités allant d'environ 2,0 kU à environ 18,0 kU par litre. Pour la facilité de la manipulation, la (X-gtycérophosphate oxydase peut être présente dans la solution initiale contenant le ATP.
Pour quantifier les produits formés par la séquence de réactions, déclenchée au départ par la créatine kinase, le peroxyde d'hydrogène produit est mesuré directement ou peut être encore mis en réaction pour former un chromogène décelable dans une réaction catalysée par une peroxydase ou une substance ayant une activité de peroxydase.
Les peroxydases sont des protéines conjuguées contenant de la porphyrine de fer. On peut utiliser avec succès dans le cadre de la présente invention, les peroxydases que l'on trouve dans le raifort, les pommes de terre, la sève de figuier, le navet, le lait, les globules blancs du sang et les micro-organismes. Certaines peroxydases synthétiques, telles que décrites par Theorell et Machly dans Acta Chem. Scand., Vol. 4, pages 422-434 (1950), sont également satisfaisantes. Sont moins satisfaisantes des substances telles que :
hémine, méthémoglobine, oxyhémoglobine, hémoglobine, hémochromogène, hématine alcaline, dérivés d'hémine, et certains autres composés qui montrent une activité de peroxydase ou semblable à celle de la peroxydase, c'est-à-dire la capacité de catalyser l'oxydation d'une autre substance grâce au peroxyde d'hydrogène et d'autres peroxydes.
D'autres substances qui ne sont pas des enzymes mais qui présentent une activité de peroxydase et que l'on peut employer dans la présente invention sont : sulfosuccinate de fer, tannate de fer, ferrocyanure ferreux, sels chromiques (tels que le sulfate chromique de potassium), en absorption dans un gel de silice, etc. Ces substances ne sont pas aussi satisfaisantes que la peroxydase en soi mais sont également intéressantes.
Dans la méthode suivant la présente invention, on préfère la peroxydase provenant de raifort (E.C. 1.11.1.7) que l'on peut obtenir de la société Finnsugar Biochemicals. Dans la méthode suivant la présente invention, on peut employer des quantités d'enzyme peroxydase comprises entre environ 0,5 kU et 20 kU par litre.
Lorsque le peroxyde d'hydrogène produit est immédiatement réduit en présence d'une peroxydase, il est amené à réagir avec un substrat ou co-substrat oxydable par peroxydase et un cosubstrat-agent de combinaison pour donner un chromogène décelable. La peroxydase et le co-substrat oxydable par peroxydase sont de préférence présents dans la solution tamponnée de ATP. Le cosubstrat-agent de combinaison peut être présent dans la solution contenant le glycérol pour réduire au minimum une auto-combinaison ou une auto-oxydation non spécifiques durant le stockage.
Les co-substrats oxydables par peroxydase, que l'on peut employer avec succès, sont généralement ceux qui réagissent pour former un chromogène décelable. Le co-substrat oxydable par peroxydase est capable de subir une condensation oxydante avec des agents de combinaison, tels que ceux qui contiennent des groupes phénoliques. Des exemples de ces composés oxydables sont le benzidène et ses homologues, les p-phénylènediamines, les p-aminophénols, le 4-amino-antipyrène, la 3-méthyl-2-benzothazolinone hydrazone, etc., ainsi que leurs mélanges.
Le co-substrat-agent de combinaison est choisi dans le groupe comprenant l'ammoniac ou les sels alcalins de 2hydroxy-3,5-dichlorobenzènesulfonate (HDCBS), ou d'autres amines et alcools aromatiques, et leurs mélanges. Le co-substrat-agent de combinaison est de préférence du HDCBS présent en une concentration comprise entre environ 0,1 mmole et, environ 5,0 mmoles par litre.
Le chromogène qui résulte de la combinaison du HDCBS et de la 4-aminoantipyrine est une molécule stable, de couleur rouge, ayant une absorbance comprise entre environ 450 et 525 nm, avec un maximum à 510 nm. On a constaté que l'absorptivité molaire du chromogène résultant est de quatre fois celle des indicateurs traditionnels. L'utilisation de la longueur d'onde plus importante apporte l'avantage supplémentaire de réduire au minimum les effets de dispersion de la lumière, créés par la turbidité dans des échantillons lipémiques.
La séquence de réactions se développe de façon. optimale à un pH compris entre environ 5,5 et environ 9,2. On peut donc employer des agents tampons dans la composition de la présente invention, pour maintenir le pH dans cet intervalle désiré, de préférence entre environ 6,5 et environ 7,2.
L'agent tampon employé doit être un agent qui ne perturbera pas la séquence de réactions du Tableau I. Des tampons appropriés sont : acide N,N-bis-(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique (BES); acide 3-(N-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonique
(MOPSO); acide 3-N-morpholinopropanesulfonique (MOPS); acide N-(2-acétamido)-2-aminoéthanesulfonique (ACES), pipérazine-N,N-
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méthylamino]propane(bis-tris-propane), tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane/acide chlorhydrique (Tris/HCI), imidazole/acide chlorhydrique, phosphate alcalin, imidazole/acide chlorhydrique ou leurs mélanges. On emploie de préférence du tris/HCl en une concentration propre à donner entre environ 0,01 et 1,0 mole par litre dans la composition de la présente invention.
Pour iliustrer et expliquer encore la présente invention, on présente les Exemples suivants. Ces exemples sont destinés à des besoins d'illustration seulement et ne constituent donc nullement une limitation quelconque du cadre de la présente invention.
EXEMPLE 1
Détermination de la concentration de magnésium
On a préparé une série de solutions de travail contenant du magnésium, présentant des concentrations de 0,5, de 1,0, de 1,5 et de 2,0 mmoles/1, par une dilution appropriée d'une solution mère de 10 mmoles/i d'acétate de magnésium.
Pour obtenir un graphique de la concentration
<EMI ID=17.1>
chaque solution de travail a été analysée suivant la méthode ci-après.
Une portion de 0,9 ml du réactif de Mg.ATP, tel que défini dans le Tableau IIA, a été introduite dans un tube d'essai de 12 x 75 mm et incubée dans un bain-marie à 37[deg.]C pendant 2
<EMI ID=18.1>
introduite dans le tube et on a procédé au mélange par tourbillonnement. Une portion de 0,1 mi de la solution de glycérol, présentée
<EMI ID=19.1>
on a procédé au mélange par tourbillonnement. Le contenu a ensuite été transféré dans une cuvette et le changement d'absorbance à
510 nm a été mesuré pendant 1 à 10 minutes, par rapport à un témoin
<EMI ID=20.1>
sur un spectrophotomètre Gilford, modèle 300-N.
Les solutions restantes et les échantillons ont été également testés et le changement d'absorbance au cours du temps est illustré par le graphique présenté par la Figure I. Une analyse de régression linéaire de la courbe standard typique de la <EMI ID=21.1> de Mg ++ , a donné l'équation :
<EMI ID=22.1>
EXEMPLE Il
On a récolté des échantillons de sérum et on les a préparés pour analyse dans les 24 heures de la récolte. Les sérums ont été séparés des caillots dans les 10 minutes de la centrifugation pour empêcher une fausse élévation de la teneur du sérum en magnésium, en provenance d'érythrocytes séquestrés. On a rejeté les échantillons de sérum visiblement hémolysés.
Chaque échantillon a été testé suivant le procédé défini dans l'Exemple 1. Le changement d'absorbance au cours du temps a été calculé pour chaque échantillon à partir de la portion linéaire de la courbe. On a constaté qu'après une phase de retard de 2 à 3 minutes, les vitesses de réaction étaient linéaires pendant au moins 10 minutes. Le titrage lui-même était linéaire jusqu'à une concentration en magnésium d'au moins 2,0 mmoles/l. Les concentrations de magnésium supérieures à cette dernière peuvent être diluées avec une solution saline normale sans magnésium, et être retitrées de façon satisfaisante.
<EMI ID=23.1>
<EMI ID=24.1>
EXEMPLE III
On a analysé des échantillons de sérum de cent patients à la fois par la méthode suivant l'invention et par la méthode au bleu de méthylthymol telle qu'appliquée au produit ACA de Dupont et à une méthode manuelle au sulfonate de Magon, voir Baginaki et col., Magnésium in Biological Fluids, Selected Methods of Clinical Chemistry, Vol. 19 (1982) pages 277-281 et Baginski et col., Microdetermination of Magnésium in Biological Fluids, 27 Microchem (1982) pages 141-150.
Les résultats obtenus sur les échantillons ont été comparés. On a atteint une excellente corrélation des résultats avec les deux méthodes, et ce comme illustré par la Figure II. Les résultats appropriés de régression linéaire sont :
<EMI ID=25.1>
(y) proposé = 1,007(Magon) - 0,03(mmole/1),(r=0,952)
REVENDICATIONS
1. Composition pour déterminer le taux de magnésium dans un fluide aqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement :
de la glycérol kinase;
<EMI ID=26.1>
une substance ayant une activité du type peroxydase;
de l'adénosine 5'-triphosphate;
du glycérol;
un co-substrat oxydable par peroxydase;
un agent de combinaison-co-substrat indicateur;
un tampon capable de maintenir un pH de solution compris entre environ 5,5 et environ 9,2; et
de l'eau.
"Composition and method for determining
the magnesium level of liquids ".
The present invention relates to the titration of magnesium levels existing in aqueous liquids. The present invention relates more particularly to methods for determining
<EMI ID = 1.1>
oxidase.
The rapid and precise determination, in blood serum, of the quantities and activity rates of various minerals and enzymes constitutes an important means of medical diagnosis. Magnesium is the second most abundant intercellular cation in the human body, and it serves as an activator for many important enzymes. Its importance in human physiology is well known. Therefore, a precise titration of the magnesium of the serum constitutes a means of diagnosis of an exceptional value.
Numerous spectrophotometric techniques have been proposed for the titration of magnesium, using calmagite, methylthymoi blue, titanium yellow or Magon suflonate. These methods are of limited accuracy because they are based on chelation reactions and, therefore, are subject to varying degrees of interference by other cations present in the sample. Atomic absorption analyzes
and neutron activation do not have these errors, but they are very complex and costly, to the point of being prohibitive, for most common clinical laboratories.
Magnesium has been found to combine with adenosine diphosphate (ADP) or adenosine triphosphate (ATP) to form a molecular complex. As reported in 31 Clinical Chemistry, pages 703-705 (1985), Tabata et al. proposed an enzymatic magnesium titration using the enzymes hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. In their stop reaction titration, the amount of (NAD (P) H) produced over a period of 15 minutes is determined by stopping the reaction of hexokinase with tetrasodium EDTA and measuring the absorbance at 340 nm. This final speed-dependent absorbance is proportional to the amount of the Mg.ATP complex present and, therefore, to the concentration of magnesium in the serum.
This method of titration of enzymatic magnesium requires a prior incubation of the sample and an extended reaction period, which makes it unsuitable for analysis by automated equipment.
The Tabata method involves a number of inherent limitations. First, it requires relatively expensive narrow band spectrophotometers capable of performing measurements in the ultraviolet region to give the actual absorbance of the coenzymatic indicator. Secondly, this titration undergoes significant interference from the lipemia because the light scattering effects of this substance are strongly reinforced at wavelengths less than 400 nm. Third, the sensitivity of the titration is limited due to the relatively low molar absorptivity of the indicator substance used. Fourth, the titrations are disturbed by high reagent blanks. Fifth, the need to stop the reaction greatly reduces the possibility of automating the process.
Therefore, it would be desirable to develop a method which would ensure the rapid and precise determination of magnesium levels in blood serum. It would also be desirable to provide a method which would give a colorimetric determination of increased sensitivity. It would also be desirable to provide a method giving detectable results at a wavelength greater than 340 nm in order to minimize the effects of light scattering due to the turbidity of the serum and caused in lipemic samples.
According to the invention, a method and an associated composition are provided for determining the quantities of magnesium existing. in an aqueous medium. The aqueous medium can be any substance of biological or non-biological origin.
Examples of such media are whole blood, plasma, blood serum, buffered solutions, etc.
The present invention is based on the discovery that the final absorbance created as a result of the basic reaction in which glycerol is phosphorylated and reacted in the presence
<EMI ID = 2.1>
be made to be proportional to the amount of a complex formed between ATP and magnesium.
The method for determining magnesium levels in aqueous samples includes the following steps:
<EMI ID = 3.1>
sample with a specified amount of: (a) a solution of reagents, or (b) solutions containing reagents and enzymes, to initiate a sequential reaction which will ultimately form a detectable species, such as a chromogen; and
He. The measurement of the detectable species thus formed.
The composition of the present invention contains
<EMI ID = 4.1>
kinase, adenosine 5'-triphosphate (ATP), glycerol and specific indicator cosubstrates. It has been found that contacting a sample with the listed reagents and an enzyme composition triggers an ordered series of reactions which ultimately are rate dependent on the concentration of magnesium present in the sample solution.
The ordered sequence of reactions develops as follows:
A. The magnesium present in the sample reacts mutually with the ATP coming from the reagent solution to form a magnesium-ATP complex (Mg.ATP);
B. the Mg.ATP complex creates glycerol phosphorylation with catalysis by glycerol kinase to form glycerol3-phosphate and a magnesium-adenosine 5'-diphosphate complex
(Mg.ADP), the glycerol and the glycerol kinase being provided by the composition of the present invention;
C. the glycerol-3-phosphate thus produced reacts with ambient oxygen to give hydrogen peroxide in a reaction catalyzed by the o (-glycerophosphate oxidase present in the composition of the present invention; and
D. the hydrogen peroxide produced can be directly determined by traditional techniques or it still reacts with the indicator co-substrates in a reaction catalyzed by peroxidase to form a visible chromogen, the co-substrates and peroxidase present in the composition of the present invention.
To better understand the present invention, reference will be made to the following detailed description and to the examples presented.
The invention is based on the discovery that magnesium present in biological fluids has an affinity for adenosine polyphosphates and forms a complex therewith. It has also been observed that the speed of the reaction sequence highlighted in Table 1 depends on the complexation of the. magnesium with ATP, not just the presence of ATP alone. The Mg.ATP complex therefore constitutes the limiting reagent in the formation of glycerol-3-phosphate and in all the subsequent reactions of the sequence.
The method for determining the magnesium levels existing in an aqueous sample therefore comprises the following phases:
<EMI ID = 5.1>
sample with a predetermined amount of: (a) a reagent solution, or (b) solutions containing reagents and enzymes, to initiate the sequential reaction which ultimately forms a detectable species, such as a chromogen; and
He. the measurement of the detectable species thus formed.
The orderly sequence of reactions expands so that the magnesium present in the sample is transformed into a complex with ATP. The Mg.ATP complex provides a phosphate group in the glycerol kinase-catalyzed phosphorylation of glycerol to glycerol-3-phosphate. Glycerol-3-phosphate in the presence of ambient oxygen and o (-glycerophosphate oxidase) reacts to form hydrogen peroxide which can be converted to a detectable chromogen via a reduction catalyzed by peroxidase.
To implement the method according to the present invention, there is provided a reagent composition, which contains all the reagents and all the enzymes necessary to form a complex with the magnesium of the sample in order to initiate
<EMI ID = 6.1>
The reagents can be a single part solution or a multi part solution depending on the desire. The composition of reagents essentially comprises:
(a) glycerol kinase;
(b) Ot-glycerophosphate oxidase;
(c) a compound having peroxidase activity;
(d) adenosine 5'-triphosphate;
(e) glycerol;
(f) a co-substrate oxidizable by peroxidase;
(g) a combination agent - indicator co-substrate;
(h) a buffer capable of maintaining a pH of solution included
between about 6.0 and about 8.0; and
(i) water.
It is within the scope of the invention to add, individually or in any combination, the chemicals and enzymes which will trigger the sequence of reactions
<EMI ID = 7.1>
chemicals and enzymes can therefore be kept in separate buffered solutions and used as needed. According to one embodiment, the glycerol and the indicator co-substrate are maintained in a buffered solution, separately from a buffered solution containing the remaining constituents. In this embodiment, the solution containing the remaining constituents is mixed with the sample to allow the formation of the Mg.ATP complex. The reactants and the sample are allowed to react <EMI ID = 8.1>
for a period of between about 5 seconds and about
10 minutes. To ensure intimate contact, the mixture can be stirred. The glycerol buffered solution is then added to the mixture. The addition of glycerol triggers the ordered sequence of reactions and allows titration of the magnesium concentration of the sample.
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
As soon as all of the components have been mixed with the sample, the absorbance of the resulting mixture is monitored for a time interval of up to about 5 to about
15 minutes at a specified wavelength, between approximately
450 and around 650 nm, preferably 510 nm, depending on the indicator cosubstrates used. A reagent control containing a measured amount of water can also be prepared to determine the basic absorbance of the water used in the preparation of the reagent solutions. The change in absorbance during
<EMI ID = 11.1>
of the sample.
The composition of the present invention contains ATP in a concentration of between about 0.05 and about 2.0 mmol per liter. ATP in this range of concentrations will form a complex with the magnesium present in a sample of biological fluid to ensure effective determination of the level of magnesium in the sample, ranging up to about 2.5 mmol of magnesium per liter. Magnesium concentrations greater than 2.5 mmol / liter can be determined by a measured dilution of the sample with traditional normal saline solutions, without magnesium, and a new titration. ATP is available commercially from Sigma Chamical Corp., St. Louis, MO.
As soon as the Mg.ATP complex is formed in the aqueous solution, contact with glycerol in the presence of glycerol kinase will ensure the phosphorylation of glycerol to form glycerol-3-phosphate and Mg.ADP. In the method and composition according to the present invention, glycerol is used in a concentration of between approximately 0.05 and approximately 20 mmol per liter, with a preference for concentrations of between approximately 0.2 and approximately 7 mmol per liter. Glycerol can be obtained on the market. from Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
Generally speaking, glycerol kinase can be used from any source, in the implementation
<EMI ID = 12.1> of glycerol kinase derived from Streptomyces canus (E.C. 2.7.1.30). This glycerol kinase can be obtained from the company Finnsugar Bio-
<EMI ID = 13.1>
glycerol kinase is successfully used in amounts of approximately
10 U to approximately 150 U per liter of buffer.
Glycerol-3-phosphate produced by the enzyme catalyzed reaction of Mg.ATP with glycerol reacts in the presence
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acetone and hydrogen peroxide.
The o (-gtycerophosphate oxidase used can be derived from a whole series of microbial species which can come from a variety of sources. The properties of this enzyme deriving from certain sources are more advantageous than the properties of enzymes from other sources, in the case of the method of the present invention, the enzyme obtained from Aerococcus viridans is preferred because it shows greater activity over a wider
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phosphate oxidase obtained from this source can be successfully used in the present invention in amounts ranging from about 2.0 kU to about 18.0 kU per liter. For ease of handling, (X-gtycerophosphate oxidase may be present in the initial solution containing ATP.
To quantify the products formed by the reaction sequence, initially triggered by creatine kinase, the hydrogen peroxide produced is measured directly or can be further reacted to form a detectable chromogen in a reaction catalyzed by a peroxidase or a substance. having peroxidase activity.
Peroxidases are conjugated proteins containing iron porphyrin. Peroxidases found in horseradish, potatoes, fig sap, turnip, milk, white blood cells and microorganisms can be used successfully in the context of the present invention. . Certain synthetic peroxidases, as described by Theorell and Machly in Acta Chem. Scand., Vol. 4, pages 422-434 (1950), are also satisfactory. Substances such as:
hemin, methemoglobin, oxyhemoglobin, hemoglobin, hemochromogen, alkaline haematin, hemin derivatives, and certain other compounds which show peroxidase activity or similar to that of peroxidase, i.e. the ability to catalyze oxidation of another substance through hydrogen peroxide and other peroxides.
Other substances which are not enzymes but which exhibit peroxidase activity and which can be used in the present invention are: iron sulfosuccinate, iron tannate, ferrous ferrocyanide, chromic salts (such as chromic sulfate potassium), in absorption in silica gel, etc. These substances are not as satisfactory as peroxidase per se but are also of interest.
In the method according to the present invention, the peroxidase from horseradish (E.C. 1.11.1.7) which is obtainable from the company Finnsugar Biochemicals is preferred. In the method according to the present invention, amounts of peroxidase enzyme can be used between about 0.5 kU and 20 kU per liter.
When the hydrogen peroxide produced is immediately reduced in the presence of a peroxidase, it is reacted with a substrate or co-substrate oxidizable by peroxidase and a cosubstrate-combining agent to give a detectable chromogen. The peroxidase and the peroxidase oxidizable co-substrate are preferably present in the buffered ATP solution. The combining cosubstrate may be present in the glycerol-containing solution to minimize non-specific auto-combination or auto-oxidation during storage.
Peroxidase oxidizable co-substrates, which can be used successfully, are generally those which react to form a detectable chromogen. The co-substrate oxidizable by peroxidase is capable of undergoing oxidative condensation with combining agents, such as those which contain phenolic groups. Examples of these oxidizable compounds are benzidene and its counterparts, p-phenylenediamines, p-aminophenols, 4-amino-antipyrene, 3-methyl-2-benzothazolinone hydrazone, etc., as well as their mixtures.
The co-substrate-combining agent is chosen from the group comprising ammonia or the alkaline salts of 2hydroxy-3,5-dichlorobenzenesulfonate (HDCBS), or other aromatic amines and alcohols, and their mixtures. The co-substrate-combining agent is preferably HDCBS present in a concentration of between approximately 0.1 mmol and, approximately 5.0 mmol per liter.
The chromogen which results from the combination of HDCBS and 4-aminoantipyrine is a stable molecule, red in color, having an absorbance of between approximately 450 and 525 nm, with a maximum at 510 nm. It has been found that the molar absorbency of the resulting chromogen is four times that of traditional indicators. The use of the longer wavelength provides the additional benefit of minimizing the scattering effects of light created by turbidity in lipemic samples.
The reaction sequence expands so. optimal at a pH between about 5.5 and about 9.2. Buffering agents can therefore be used in the composition of the present invention to maintain the pH within this desired range, preferably between about 6.5 and about 7.2.
The buffering agent used should be one that will not disrupt the reaction sequence in Table I. Suitable buffers are: N, N-bis- (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES); 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid
(MOPSO); 3-N-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS); N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), piperazine-N, N-
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methylamino] propane (bis-tris-propane), tris- (hydroxymethyl) -aminomethane / hydrochloric acid (Tris / HCI), imidazole / hydrochloric acid, alkaline phosphate, imidazole / hydrochloric acid or their mixtures. Preferably tris / HCl is used in a concentration which will give between about 0.01 and 1.0 mole per liter in the composition of the present invention.
To illustrate and further explain the present invention, the following Examples are presented. These examples are intended for illustration purposes only and therefore do not in any way constitute any limitation of the scope of the present invention.
EXAMPLE 1
Determination of magnesium concentration
A series of working solutions containing magnesium, having concentrations of 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 mmol / l, were prepared by an appropriate dilution of a stock solution of 10 mmol / l of magnesium acetate.
To get a graph of the concentration
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each working solution was analyzed according to the method below.
A 0.9 ml portion of the Mg.ATP reagent, as defined in Table IIA, was introduced into a 12 x 75 mm test tube and incubated in a water bath at 37 [deg.] C for 2
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introduced into the tube and mixing was carried out by swirling. A 0.1 mi portion of the glycerol solution, presented
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mixing was carried out by swirling. The contents were then transferred to a cuvette and the change in absorbance to
510 nm was measured for 1 to 10 minutes, compared to a control
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on a Gilford spectrophotometer, model 300-N.
The remaining solutions and samples were also tested and the change in absorbance over time is illustrated by the graph shown in Figure I. A linear regression analysis of the standard curve typical of the <EMI ID = 21.1> of Mg ++, gave the equation:
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EXAMPLE II
Serum samples were collected and prepared for analysis within 24 hours of harvest. The sera were separated from the clots within 10 minutes of centrifugation to prevent a false rise in the magnesium content of the serum from sequestered erythrocytes. Visibly hemolyzed serum samples were rejected.
Each sample was tested according to the method defined in Example 1. The change in absorbance over time was calculated for each sample from the linear portion of the curve. It has been found that after a delay phase of 2 to 3 minutes, the reaction rates were linear for at least 10 minutes. The titration itself was linear up to a magnesium concentration of at least 2.0 mmol / l. Concentrations of magnesium higher than the latter can be diluted with normal saline without magnesium, and be renamed satisfactorily.
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EXAMPLE III
Serum samples from 100 patients were analyzed both by the method according to the invention and by the methylthymol blue method as applied to the ACA product from Dupont and to a manual method with Magon sulfonate, see Baginaki and col., Magnesium in Biological Fluids, Selected Methods of Clinical Chemistry, Vol. 19 (1982) pages 277-281 and Baginski et al., Microdetermination of Magnesium in Biological Fluids, 27 Microchem (1982) pages 141-150.
The results obtained on the samples were compared. An excellent correlation of the results was achieved with the two methods, as illustrated in Figure II. Appropriate linear regression results are:
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(y) proposed = 1.007 (Magon) - 0.03 (mmole / 1), (r = 0.952)
CLAIMS
1. Composition for determining the level of magnesium in an aqueous fluid, characterized in that it essentially comprises:
glycerol kinase;
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a substance having a peroxidase activity;
adenosine 5'-triphosphate;
glycerol;
a co-substrate oxidizable by peroxidase;
an indicator combination-co-substrate agent;
a buffer capable of maintaining a solution pH of between about 5.5 and about 9.2; and
some water.