FR2520006A1 - PROCESS FOR THE QUANTITATIVE MEASUREMENT OF UNSATURATED FATTY ACIDS - Google Patents
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Abstract
Description
Procédé de mesure quantitative des acides gras insaturés.Method for the quantitative measurement of unsaturated fatty acids
La présente invention est relative à un procédé nouveau de mesure quantitative des acides gras insaturés et est particulièrement utile pour la détermination de l'acide gras insaturé libéré dans la mesure de l'activité d'une lipase, en utilisant un glycéride d'acide gras insaturé comme substrat. The present invention relates to a novel process for the quantitative measurement of unsaturated fatty acids and is particularly useful for the determination of the unsaturated fatty acid released in the measurement of lipase activity, using a fatty acid glyceride unsaturated as a substrate.
Les lipases sont des enzymes ayant une activité de transformation du glycéride en glycérol et en acides gras, et elles se distinguent des estérases qui agissent sur des glycérides d'acides gras à chaine courte. On trouve ces lipases dans beaucoup de tissus animaux et elles existent en particulier dans le suc pancréatique en une concentration éle uvée. La mesure de l'activité d'une lipase dans du sérum est utilisée, ainsi, pour mettre en évidence des maladies du pancréas, puisque des lipases viennent dans le sang dans le cas de telles maladies. Lipases are enzymes with a glyceride-to-glycerol-fatty acid transformation activity, and are distinguished from esterases that act on short-chain fatty acid glycerides. These lipases are found in many animal tissues and they exist especially in pancreatic juice at an elevated concentration. The measurement of the activity of a lipase in serum is used, thus, to highlight diseases of the pancreas, since lipases come into the blood in the case of such diseases.
Comme procédés de mesure de l'activité d'une lipase dans du sérum, on connait jusqu'ici des procédés tels que décrits dans DeutscheMedizinische
Wochenschrift, 90, 1970 (1965), Analytical Biochemistry, 6, 451 (1963) et Clin. Chem., 21, 1469 à 1473 (1975). En effet, ces procédés ont été pratiqués de manière à permettre à une quantité en excès de triglycéride qui est un substrat des lipases, d'agir par exemple sur du sérum à examiner, et à déterminer ensuite, par une alcalimétrie en utilisant un indicateur tel que la phtaléine du Thymol, etc., ou par une extraction à l'aide de sels de cuivre, la quantité d'acides gras libérés par l'activité d'une lipase.As methods for measuring the activity of a lipase in serum, methods as described in Deutsche Medizinische are known so far.
Wochenschrift, 90, 1970 (1965), Analytical Biochemistry, 6, 451 (1963) and Clin. Chem., 21, 1469-1473 (1975). Indeed, these methods have been practiced so as to allow an excess amount of triglyceride which is a substrate of lipases, to act for example on the serum to be examined, and then to be determined by alkalimetry using an indicator such as Phthalein Thymol, etc., or by extraction with the aid of copper salts, the amount of fatty acids released by the activity of a lipase.
Mais, dans ces procédés, la mesure de l'acide gras par des photomètres s'effectue mal, en raison du trouble de la solution provoqué par les substrats utilisés, et la mesure quantitative de l'acide gras était très difficile parce que la quantité qui en était libérée était aussi petite que par exemple 0,0005 millimole, même après une durée de réaction de 10 minutes en utilisant 1 ml de sérum.On a indiqué récemment un autre procédé de mesure de l'ac- tivité d'une lippe dans du sérum, dans Clinical
Chemistry, 27, 163 à 165 (1931). Suivant ce document, on laisse du sérum agir sur le triglycéride de l'acide linolénique, à titre de substrat pour libérer de l'acide linolénique, l'acide linolénique obtenu étant oxydé par de la lipoxygénase et la quantité d'oxygène consommée dans la réaction d'oxydation étant ensuite déterminée par voie électrochimique, par une électrode à oxygène.Mais ce procédé a les inconvénients d'être beaucoup affecté par la stabilité de détection et par la sensibilité de l'électrode à oxygène elle-même, puisque la mesure quantitative de l'oxygène consommé est effectuée au moyen d'une électrode à oxygène ; en outre, la mesure photométrique ne convient pas non plus, en raison du trouble provoqué par le triglycéride utilisé comme substrat.But in these processes, the measurement of the fatty acid by photometers is poorly performed, because of the disorder of the solution caused by the substrates used, and the quantitative measurement of the fatty acid was very difficult because the amount It was released as small as, say, 0.0005 millimole, even after a reaction time of 10 minutes using 1 ml of serum. Another method of measuring the activity of a lipid was recently reported. in serum, in Clinical
Chemistry, 27, 163-165 (1931). According to this document, serum is allowed to act on the triglyceride of linolenic acid, as a substrate for releasing linolenic acid, the linolenic acid obtained being oxidized by lipoxygenase and the amount of oxygen consumed in the The oxidation reaction is then electrochemically determined by an oxygen electrode. However, this method has the drawbacks of being greatly affected by the detection stability and the sensitivity of the oxygen electrode itself, since Quantitative oxygen consumed is performed by means of an oxygen electrode; furthermore, the photometric measurement is not suitable either, because of the disorder caused by the triglyceride used as a substrate.
On a maintenant trouvé que l'on peut mesurer d'une manière précise et commode la quantité d'acide gras insaturé par un changement spectrophotométrique particulier dûà un donneur d'hydrogène utilisé dans le système réactionnel. En effet, on utilise un monoglycéride, un diglycéride ou un triglycéride d'acide gras insaturé comme substrat, en libérant de l'acide gras insaturé du substrat par l'activité de lipase du liquide à examiner, on transforme l'acide gras insaturé obtenu en son peroxyde par de la lipoxygénase en la présence d'oxygène, et on permet à la peroxydase et à un donneur d'hydrogène d'agir sur ce peroxyde. It has now been found that the amount of unsaturated fatty acid can be measured in a precise and convenient manner by a particular spectrophotometric change due to a hydrogen donor used in the reaction system. In fact, a monoglyceride, a diglyceride or an unsaturated fatty acid triglyceride is used as substrate, by releasing unsaturated fatty acid from the substrate by the lipase activity of the liquid to be examined, the unsaturated fatty acid obtained is converted into peroxidase and a hydrogen donor to act on this peroxide.
L'invention a été effectuée sur la base de ce qui précède. L'invention vise en effet un procédé de mesure quantitative d'acide gras insaturé qui est caractérisé en ce qu'il consiste à permettre à de la lipoxygénase d'agir sur le liquide à examiner contenant l'acide gras insaturé, en la présence d'oxygène, pour former le peroxyde de l'acide gras insaturé, à permettre à de la peroxydase et à un donneur d'hydrogène d'agir sur le mélange, et à mesurer le changement décelable dans le système réactionnel par des moyens spectrophotométriques. The invention has been carried out on the basis of the foregoing. The invention aims in fact at a method of quantitative measurement of unsaturated fatty acid which is characterized in that it consists in allowing lipoxygenase to act on the liquid to be examined containing the unsaturated fatty acid, in the presence of oxygen, to form the peroxide of the unsaturated fatty acid, to allow peroxidase and a hydrogen donor to act on the mixture, and to measure the detectable change in the reaction system by spectrophotometric means.
L'invention est particulièrement utile comme procédé de mesure de l'activité d'une lipase, puisqu'elle ne nécessite pas des processus compliqués comme dans l'art antérieur. En outre, suivant l'invention, le processus de mesure n'est pas rendu inadéquat en raisondu trouble de la solution réactionnelle, et il n'y a pas non plus d'influences dues aux électrodes, la mesure pouvant au contraire être effectuée d'une manière précise et commode en peu de temps, par des moyens spectrophotométriques, en mesurant la faible activité d'une lipase par l'utilisation du glycéride comme substrat. L'invention procure donc un procédé utile de mesure quantitative d'un acide gras insaturé. The invention is particularly useful as a method of measuring the activity of a lipase, since it does not require complicated processes as in the prior art. In addition, according to the invention, the measurement process is not rendered inadequate in the turbidity of the reaction solution, nor are there any influences due to the electrodes, the measurement being able on the contrary to be carried out with a precise and convenient way in a short time, by spectrophotometric means, by measuring the low activity of a lipase by the use of glyceride as a substrate. The invention thus provides a useful method for quantitatively measuring an unsaturated fatty acid.
Suivant l'invention, comme liquides à examiner contenant un acide gras insaturé on peut utiliser tout liquide qui contient un acide gras insaturé, et de préférence un liquidé contenant un acide gras insaturé qui est libéré et qui est formé par 1' ac tivité d'une lipaeà partir du glycéride de l'acide gras insaturé, lequel est un substrat pour la mesure de l'activité d'une lipase.Plus particulièrement, la solution à examiner qui est préférée est préparée habituellement de telle manière qu'une quantité définie d'une solution ayant une activité de lipase, telle qu'une solution de lipase dans du sérum ou une solution d'un réactif de lipase, est mélangée à une quantité définie d'une solution de substrat contenant du glycéride d'un acide gras insaturé, qui est ajustée à une concentration donnée et le mélange est mis à réagir à 370C environ pendant 5 minutes ou davantage, pour libérer de l'acide gras insaturé du substrat en raison de son activité de lipase. According to the invention, as test liquids containing an unsaturated fatty acid, any liquid which contains an unsaturated fatty acid, and preferably a liquid containing an unsaturated fatty acid which is liberated and which is formed by the activity of a lipase from the glyceride of the unsaturated fatty acid, which is a substrate for measuring the activity of a lipase. More particularly, the preferred test solution is usually prepared in such a way that a defined amount of a solution having a lipase activity, such as a lipase solution in serum or a solution of a lipase reagent, is mixed with a defined amount of a substrate solution containing glyceride of an unsaturated fatty acid , which is adjusted to a given concentration and the mixture is reacted at about 370C for 5 minutes or more, to release unsaturated fatty acid from the substrate due to its lipase.
Comme glycéride d'acide gras insaturé qui est utilisé comme substrat dans la mesure de l'activité de lipase, on peut utiliser n'importe quel monoglycéride, diglycéride et triglycéride, et de préférence un monoglycéride ou un diglycéride. As the unsaturated fatty acid glyceride which is used as a substrate in the measurement of lipase activity, any monoglyceride, diglyceride and triglyceride, and preferably a monoglyceride or diglyceride, can be used.
L'acide gras insaturé constituant le glycéride ou le liquide contenant de l'acide gras insaturé à examiner utilisé suivant l'invention est de préférence un acide gras insaturé de type cis ayant deux ou plusieurs doubles liaisons et de 12 à 20 atomes de carbone, tel que l'acide 2,4-dodécadiénoique, l'acide 9, 12-hexadécadiénoîque, l'acide linolique (acide cis-9, cis-12-octadécadiénofque), l'acide linolénique (acide 9, 12, 15-octadécatriénoTque), l'acide 6, 9, 12-octadécatriénoTque, l'acide 11, 14 eicosadiénoique, l'acide 5, 8, 11-eicosatriénolque, l'acide 8, 11, 14-eicosatriénoique, l'acide arachidonique (acide 5, 8, 11, 14-eicosatétraénoSque), etc. The unsaturated fatty acid constituting the glyceride or liquid containing the unsaturated fatty acid to be examined used according to the invention is preferably a cis-type unsaturated fatty acid having two or more double bonds and from 12 to 20 carbon atoms, such as 2,4-dodecadienoic acid, 9,12-hexadecadienoic acid, linolenic acid (cis-9-acid, cis-12-octadecadienoic acid), linolenic acid (9,12,15-octadecatrienoic acid). ), 6,9,12-octadecatrienoic acid, 11,14-eicosadienoic acid, 5,8,11-eicosatrienolac acid, 8,11,14-eicosatrienoic acid, arachidonic acid (acid , 8, 11, 14-eicosatetraenoic), etc.
Comme lipoxygénases, on peut utiliser des enzymes bruts ou purs qui ont une aptitude à catalyser au moins la réaction pour produire 1 mole de peroxyde d'acide linolique à partir d'l mole d'oxygène et d'l mole d'acide linolique comme substrat (Commission des Enzymes 1.13.1.13.Linoleate : oxygène oxydoréductase) et à catalyser la réaction enzymatique suivant l'invention. Les enzymes peuvent être ceux qui sont disponibles dans le commerce ou peuvent être isolés et recueillis à partir d'une plante légumineuse telle que le soja, le pois, etc., l'orge, le blé, etc. (A.L. Tappel, Food Research, 18, 104 (1953), H. Theorell, etal, Acta Chem. Scand., 1, 571 (1947)). On utilise des lipoxygénases à raison, habituellement, de 1000 unités ou davantage et, de préférence, à raison de 10.000 à 50.000 unités environ par test. As lipoxygenases, crude or pure enzymes which have an ability to catalyze at least the reaction can be used to produce 1 mole of linoleic acid peroxide from 1 mole of oxygen and 1 mole of linoleic acid as substrate (Enzyme Commission 1.13.1.13.Linoleate: oxygen oxidoreductase) and to catalyze the enzymatic reaction according to the invention. Enzymes can be those that are commercially available or can be isolated and collected from a leguminous plant such as soybeans, peas, etc., barley, wheat, etc. (A. L. Tappel, Food Research, 18, 104 (1953), H. Theorell et al., Acta Chem Scand., 1, 571 (1947)). Lipoxygenases are usually used at 1000 units or more and preferably at about 10,000 to 50,000 units per test.
Comme peroxydases, on peut utiliser commodément des peroxydases disponibles dans le commerce provenant du raifort. La quantité de peroxydases à utiliser n'est habituellement pas inférieure à 1 unité et, de préférence, est comprise entre 2 unités et 20 unités environ par test. As peroxidases, commercially available peroxidases from horseradish may conveniently be used. The amount of peroxidase to be used is usually not less than 1 unit and preferably is between about 2 units and about 20 units per test.
Comme donneurs d'hydrogène, on peut utiliser des composés oxydables. Ces composés sont un réactif coloré dont la coloration vire dans le domaine visible par oxydation, un réactif fluorescent émettant de la fluorescence et un réactif luxainescent , réactif donnant une coloration lorsqu'il est soumis à un rayonnement ultraviolet, etc. Comme réactif coloré, on peut utiliser souvent une association d'un accepteur d'électron 'et d'un composé phénolique. Des exemples d'accepteur d'électron sont la 4-aminoantipyrine, le 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2, 4-tri- azole, la 3-méthyl-2-benzothiazolinone hydrazone, le 2-amino-benzothiazole, etc.Comme exemples de composés phénoliques, on peut citer le phénol, le p-chlorophénol, le 2,4-dichlorophénol, le 2,4-dibromophénol, le p-hydroxybenzoate de sodium, le 4,6-dichloro-o-crésol, le 3,5-dichloro-2-hydroxybenzènesulfonate de sodium, le 3,5-xylénol, la N,N-diéthyl-mtoluidine, la N, N-diéthanol m-toluidine, la Nethyl-N-sulfo- procylttoiuidine, la N,N-diméthylaniline, la N,N-diéthyl-aniline, la N,N-diméthylm-méthoxyaniline, la 3-acétamino-N ,N-diméthylani- line, la 3-méthyl-N-ethyl-N-(ss-hydroxyéthyl)aniline, la N-éthyl-N- (3-méthyl-phényl) -N'-acétyléthylènediamine, etc. Cor.me substrats fluorescents dans un réactif de fluorescence ou dans un réactif luminescents , on peut mentionner, par exemple, le bis(2,4,6-trichlorophénol)oxalate, la phénylthiohydantolne, l'acide homovanillique, l'acide 4-hydroxyphénylacétique, la vanillylamine, la 3-méthoxytyramine, l'acide phlorétique, l'hordénine, le monoanion de luminol, la lucigénine, la wafine, etc. Les réactifs mentionnés ci-dessus ne sont donnés qu'à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme une liste limitative du donneur d'hydrogène suivant l'invention. On peut déterminer la quantité de ces donneurs d'hydrogène à utiliser en fonction de la quantité d'acide gras insaturé contenue dans le liquide à examiner, ou du peroxyde qui en est obtenu.Bien que la quantité du donneur d'hydrogène ne soit pas habituellement inférieure à 5 moles pour 1 mole d'acide gras insaturé, elle peut varier d'une manière arbitraire suivant la quantité de liquide à examiner, le degré de liaison insaturée et la teneur du liquide à examiner en acide gras insaturé, etc. As hydrogen donors, oxidizable compounds can be used. These compounds are a colored reagent whose color turns into the visible range by oxidation, a fluorescent reagent emitting fluorescence and a reagent luxainescent reagent giving a coloration when subjected to ultraviolet radiation, etc. As the colored reagent, a combination of an electron acceptor and a phenol compound can often be used. Examples of the electron acceptor are 4-aminoantipyrine, 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole, 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone, 2- amino-benzothiazole, etc.As examples of phenolic compounds, mention may be made of phenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, sodium p-hydroxybenzoate, 4,6-dichloro -o-cresol, sodium 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonate, 3,5-xylenol, N, N-diethyl-mtoluidine, N, N-diethanol m-toluidine, Nethyl-N-sulfo propyltinidine, N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, N, N-dimethylmethoxyaniline, 3-acetamino-N, N-dimethylaniline, 3-methyl-N-ethyl- N- (β-hydroxyethyl) aniline, N-ethyl-N- (3-methyl-phenyl) -N'-acetylethylenediamine, etc .; As fluorescent substrates in a fluorescent reagent or in a luminescent reagent, there may be mentioned, for example, bis (2,4,6-trichlorophenol) oxalate, phenylthiohydantolin, homovanillic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, and the like. vanillylamine, 3-methoxytyramine, phloretic acid, hordenine, luminol monoanion, lucigenin, wafine, etc. The reagents mentioned above are for illustrative purposes only and should not be considered as a limiting list of the hydrogen donor according to the invention. The amount of these hydrogen donors to be used may be determined by the amount of unsaturated fatty acid contained in the liquid to be examined, or the peroxide obtained from it.Although the amount of the hydrogen donor is not Usually less than 5 moles per 1 mole of unsaturated fatty acid, it may vary arbitrarily depending on the amount of liquid to be examined, the degree of unsaturated bond and the unsaturated fatty acid content of the test liquid, and so on.
En outre, quand on effectue la réaction, on peut utiliser n'importe quel milieu de réaction convenable, tel que le tampon à l'acide diméthylglutariquehydroxyde de sodium, le tampon à l'acide phosphorique, le tampon à l'acide chlorhydrique tris, le tampon à l'acide borique ou d'autres tampons utilisés en général. On ajuste de préférence le pH de la solution entre 5 et 9. In addition, when carrying out the reaction, any suitable reaction medium, such as sodium dimethylglutaric acid buffer, phosphoric acid buffer, tris hydrochloric acid buffer, can be used. boric acid buffer or other buffers used in general. The pH of the solution is preferably adjusted between 5 and 9.
C'est ainsi, par exemple, qu'on peut préparer d'abord une composition pour la mesure de 1 'aci- de gras insaturé, qui comprend de 0,1 à 0,2 ml d'un accepteur d'électron tel que de la 4-aminoantipyrine à 0,3 %, de 0,1 à 0,2 ml d'un donneur d'hydrogène constitué d'un composé phénolique à 0,2 % tel que le phénol ou le 2,4-dichlorophénol, de 5 à 20 unités de peroxydase, de 10.000 à 30.000 unités de lipoxygénase et de 1 à 2 ml de tampon à l'acide borique 0,1M. Thus, for example, a composition for the measurement of unsaturated fatty acid, which comprises 0.1 to 0.2 ml of an electron acceptor such as 0.3% 4-aminoantipyrine, 0.1 to 0.2 ml of a hydrogen donor consisting of a 0.2% phenolic compound such as phenol or 2,4-dichlorophenol, from 5 to 20 units of peroxidase, from 10,000 to 30,000 units of lipoxygenase and from 1 to 2 ml of 0.1M boric acid buffer.
(pH 9,0) ou de tampon à l'acide chlorhydrique tris 0,2M. Dans la mesure quantitative de l'acide gras insaturé, on chauffe au préalable la composition ainsi préparée pour la mesure, par exemple à 370C, puis on lui ajoute 50 p1 du liquide à examiner contenant l'acide gras insaturé et on laisse le mélange réagir à 370C pendant 10 à 20 minutes. La réaction achevée, on mesure le degré de coloration par des absorbances aux longueurs d'ondes d'absorption spécifiques en utilisant un spectrophotomètre. On calcule ainsi, à partir de son absorbance et on détermine la quantité d'acide gras insaturé dans le liquide à examiner.(pH 9.0) or 0.2M tris hydrochloric acid buffer. In the quantitative measurement of the unsaturated fatty acid, the composition thus prepared for the measurement is heated beforehand, for example to 370 ° C., then 50 μl of the test liquid containing the unsaturated fatty acid is added and the mixture is allowed to react. at 370C for 10 to 20 minutes. When the reaction was complete, the degree of coloration was measured by absorbances at specific absorption wavelengths using a spectrophotometer. This is calculated from its absorbance and the amount of unsaturated fatty acid in the liquid to be examined is determined.
Pour la détermination de l'acide gras insaturé, en vue de la mesure de l'activité d'une lipase, on peut déterminer aussi l'acide gras insaturé libéré en permettant au liquide à examiner ayant une activité de lipase d'agir sur un substrat pour la mesure de l'activité d'une lipase. De préférence, on détermine l'acide gras insaturé en un stade en préparant une composition comprenant la composition de mesure de l'acide gras insaturé et un substrat pour la mesure de l'activité de lipase qui y est ajoutée, et en leur permettant de réagir sur le liquide à examiner pour la mesure de l'activité d'une lipase. Comme .substrats utilisés pour la mesure de l'activité d'une lipase, on peut préparer par exemple une solution éthanolique 0,1M de glycéride.For the determination of the unsaturated fatty acid, for measuring the activity of a lipase, the unsaturated fatty acid released can also be determined by allowing the liquid to be examined having a lipase activity to act on a lipase. substrate for measuring the activity of a lipase. Preferably, the unsaturated fatty acid is determined at one stage by preparing a composition comprising the unsaturated fatty acid measurement composition and a substrate for measuring the lipase activity added thereto, and allowing them to react on the liquid to be examined for measuring the activity of a lipase. As substrates used for the measurement of lipase activity, for example, 0.1M ethanolic solution of glyceride can be prepared.
On utilise de 20 à 50 p1 de cette solution pour 1 à 2 ml de ladite composition pour la mesure de l'acide gras insaturé. Lors de la mesure de l'ac- tivité d'une lipase, on peut ajouter en outre à la composition un agent tensio-actit tel que le désoxycholate de sodium. From 20 to 50 μl of this solution are used for 1 to 2 ml of said composition for the measurement of the unsaturated fatty acid. In measuring the activity of a lipase, a surfactant such as sodium deoxycholate can be added to the composition.
En outre, suivant l'invention, les conditions de réaction telles que le pH, la durée de réaction, la longueur de mesure, etc., peuvent varier suivant les réactifs à utiliser respectivement, et on peut choisir arbitrairement toute condition convenable. In addition, according to the invention, the reaction conditions such as pH, reaction time, measurement length, etc., may vary depending on the reagents to be used respectively, and any suitable condition may be chosen arbitrarily.
Les exemples suivants illustrent l'invention. The following examples illustrate the invention.
EXEMPLE 1
<tb> Tampon <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> borique <SEP> O,1M <SEP> 0,2 <SEP> ml <SEP>
<tb> '(PH <SEP> 9,0)
<tb> 4-aminoantipyrine <SEP> à <SEP> 0,3 <SEP> % <SEP> 0,1 <SEP> ml <SEP>
<tb> Phénol <SEP> à <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP> 0,1 <SEP> ml <SEP>
<tb> Peroxydase <SEP> (50 <SEP> U/ml) <SEP> 0,2 <SEP> ml <SEP>
<tb> Lipoxygénase <SEP> (500.000 <SEP> U/ml) <SEP> 20 <SEP> iii <SEP>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 0,38 <SEP> ml <SEP>
<tb> <SEP> Total <SEP> 1,0 <SEP> ml <SEP>
<tb>
On chauffe au préalable à 370C, 10 ml de la composition de réaction pour la mesure quantitative de l'acide gras insaturé, constitué des constituants mentionnés ci-dessus, et on y ajoute de O à 50 l d'une solution éthanolique d'acide linolique à 1 mM, ou de O à 50 pl d'une solution éthanolique d'acide linolénique à 1 mM, à titre de liquide à examiner. On laisse le mélange réagir à 370C pendant 10 minutes.<tb> Buffer <SEP> to <SEP><SEP> Boric acid <SEP> O, 1M <SEP> 0.2 <SEP> ml <SEP>
<tb>'(PH<SEP> 9.0)
<tb> 4-aminoantipyrine <SEP> to <SEP> 0.3 <SEP>% <SEP> 0.1 <SEP> ml <SEP>
<tb> Phenol <SEP> to <SEP> 0.2 <SEP>% <SEP> 0.1 <SEP> ml <SEP>
<tb> Peroxidase <SEP> (50 <SEP> U / ml) <SEP> 0.2 <SEP> ml <SEP>
<tb> Lipoxygenase <SEP> (500.000 <SEP> U / ml) <SEP> 20 <SEP> iii <SEP>
<tb> Water <SEP> distilled <SEP> 0.38 <SEP> ml <SEP>
<tb><SEP> Total <SEP> 1.0 <SEP> ml <SEP>
<Tb>
The reaction composition for quantitative measurement of the unsaturated fatty acid, consisting of the constituents mentioned above, is preheated to 370 ° C. and 0 to 50 liters of ethanolic acid solution are added thereto. linoleum at 1 mM, or from 0 to 50 μl of an ethanolic solution of linolenic acid at 1 mM, as liquid to be examined. The mixture is allowed to react at 370C for 10 minutes.
Après achèvement de la réaction, on y ajoute 2 ml d'eau distillée et on mesure la couleur de la solution obtenue par l'absorbance à la longueur d'onde de 500 nm -A 500 nm) en utilisant le spectrophotomètre.After completion of the reaction, 2 ml of distilled water is added thereto and the color of the solution obtained is measured by the absorbance at the wavelength of 500 nm -A 500 nm) using the spectrophotometer.
Les résultats sont donnés à la figure 1, dans laquelle les symboles "-" et "o" représentent les résultats dans le cas de l'acide linolique et de l'acide linolénique respectivement. Comme le montre la figure 1, on obtient des résultats de mesure quantitative très satisfaisants. The results are given in Figure 1, in which the symbols "-" and "o" represent the results in the case of linoleic acid and linolenic acid respectively. As shown in FIG. 1, very satisfactory quantitative measurement results are obtained.
EXEMPLE 2
<tb> Tampon <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> chlorhydrique
<tb> tris <SEP> 0,2M <SEP> (pH <SEP> 8,5) <SEP> 0,8 <SEP> ml
<tb> Désoxycholate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> à <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 0,1 <SEP> ml
<tb> Solution <SEP> éthanolique <SEP> O,lM <SEP> de <SEP> 40 <SEP> l
<tb> dilinoléine <SEP>
<tb> Lipoxygénase <SEP> (500.000 <SEP> U/ml) <SEP> 50 <SEP> l <SEP>
<tb> Peroxydase <SEP> (50 <SEP> U/ml) <SEP> 0,2 <SEP> ml <SEP>
<tb> 4-aminoantipyrine <SEP> à <SEP> 0,3 <SEP> % <SEP> 0,2 <SEP> ml
<tb> 2,4-dichlorophénol <SEP> à <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP> 0,2 <SEP> ml <SEP>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 0,41ml <SEP>
<tb> <SEP> Total <SEP> 2,0 <SEP> ml <SEP>
<tb>
On chauffe au préalable à 370C, 2,0 ml de la composition de réaction constituée des constituants mentionnés ci-dessus, et on y ajoute de O à 5 vl d'un réactif de lipase à 0,1 U/ml vendu sur le marché (qui provient de Chromobacterium viscosum fourni par Toyo Jozo Co.). On laisse le mélange réa- gir à 370C pendant 10 minutes. Après achèvement de la réaction, on mesure la coloration de la solution obtenue par l'absorbance à la longueur d'onde de 505 nm (AA 505 nm) en utilisant le spectrophotomètre.<tb> Buffer <SEP> to <SEP> Hydrochloric acid <SEP>
<tb> Tris <SEP> 0.2M <SEP> (pH <SEP> 8.5) <SEP> 0.8 <SEP> ml
<tb> Deoxycholate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> to <SEP> 2 <SEP>% <SEP> 0.1 <SEP> ml
<tb> Ethanolic <SEP> solution <SEP> O, lM <SEP> of <SEP> 40 <SEP> l
<tb> dilinoline <SEP>
<tb> Lipoxygenase <SEP> (500.000 <SEP> U / ml) <SEP> 50 <SEP> l <SEP>
<tb> Peroxidase <SEP> (50 <SEP> U / ml) <SEP> 0.2 <SEP> ml <SEP>
<tb> 4-aminoantipyrine <SEP> to <SEP> 0.3 <SEP>% <SEP> 0.2 <SEP> ml
<tb> 2,4-dichlorophenol <SEP> to <SEP> 0.2 <SEP>% <SEP> 0.2 <SEQ> ml <SEP>
<tb> Water <SEP> distilled <SEP> 0.41ml <SEP>
<tb><SEP> Total <SEP> 2.0 <SEP> ml <SEP>
<Tb>
The reaction composition consisting of the abovementioned constituents is preheated to 370 ° C. and 2.0 ml of a commercially available 0.1 U / ml lipase reagent is added to it. (which comes from Chromobacterium viscosum supplied by Toyo Jozo Co.). The mixture is allowed to react at 370 ° C. for 10 minutes. After completion of the reaction, the staining of the solution obtained by absorbance at the wavelength of 505 nm (AA 505 nm) was measured using the spectrophotometer.
Les résultats obtenus sont donnés à la figu re 2. Comme le montre la figure 2, on obtient des résultats de mesure de l'activité de la lipase qui sont très satisfaisants. The results obtained are given in FIG. 2. As shown in FIG. 2, results of measurement of the activity of the lipase which are very satisfactory are obtained.
EXEMPLE 3
<tb> Tampon <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> chlorhydrique <SEP> 0,8 <SEP> ml
<tb> tris <SEP> 0,2M <SEP> (pH <SEP> 8,0)
<tb> Désoxycholate <SEP> de. <SEP> sodium <SEP> à <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 0,1 <SEP> ml
<tb> Solution <SEP> éthanolique <SEP> O,1M <SEP> de <SEP> 40 <SEP> ul <SEP>
<tb> dilinoléine
<tb> Lipoxygénase <SEP> 500.000 <SEP> U/ml) <SEP> 50 <SEP> ul <SEP>
<tb> Peroxydase <SEP> (50 <SEP> U/ml) <SEP> 0,2 <SEP> ml
<tb> 4-aminoantipyrine <SEP> à <SEP> 0,3 <SEP> % <SEP>
<tb> 2,4-dichlorophénol <SEP> à <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP> 0,2 <SEP> ml
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 0,41ml
<tb> <SEP> Total <SEP> 2,0 <SEP> ml
<tb>
On chauffe au préalable, à 370C, 2,0 ml de la composition de réaction constituée des constituants mentionnés ci-dessus et on y ajoute 50 ul d'une solution diluée de sérum à titre de liquide à examiner. On laisse réagir le mélange à 370C pendant 20 minutes. La réaction achevée, on mesure la coloration de la solution obtenue par l'absorDance à la longueur d'onde de 505 nm t A 505 nm) en utilisant le spectrophotorllètre. Las résultats obtenus sont excellents, comme le montre la figure 3.<tb> Buffer <SEP> to <SEP> acid <SEP> hydrochloric acid <SEP> 0.8 <SEP> ml
<tb> tris <SEP> 0.2M <SEP> (pH <SEP> 8.0)
<tb> Deoxycholate <SEP> of. <SEP> sodium <SEP> to <SEP> 2 <SEP>% <SEP> 0.1 <SEP> ml
<tb> ethanolic solution <SEP><SEP> O, 1M <SEP> of <SEP> 40 <SEP> ul <SEP>
<tb> dilinoline
<tb> Lipoxygenase <SEP> 500,000 <SEP> U / ml) <SEP> 50 <SEP> ul <SEP>
<tb> Peroxidase <SEP> (50 <SEP> U / ml) <SEP> 0.2 <SEP> ml
<tb> 4-aminoantipyrine <SEP> to <SEP> 0.3 <SEP>% <SEP>
<tb> 2,4-dichlorophenol <SEP> to <SEP> 0.2 <SEP>% <SEP> 0.2 <SEP> ml
<tb> Water <SEP> distilled <SEP> 0.41ml
<tb><SEP> Total <SEP> 2.0 <SEP> ml
<Tb>
Beforehand, 2.0 ml of the reaction composition consisting of the abovementioned constituents is heated to 370 ° C. and 50 μl of a dilute solution of serum is added thereto as liquid to be examined. The mixture is allowed to react at 370 ° C. for 20 minutes. Upon completion of the reaction, the color of the solution obtained was measured by absorbance at the wavelength of 505 nm at 505 nm using the spectrophotometer. The results obtained are excellent, as shown in Figure 3.
EXEMPLE 4
On chauffe au préalable, à 370C, 2,0 ml de la composition de réaction constituée des mêmes constituants qu'à l'exemple 3, et on y ajoute 50 pl d'une solution diluée de sérum. On laisse réagir le mélange à 370C. On calcule le changement de coloration de la solution obtenue après une durée de 5 minutes en mesurant les absorbances à la longueur d'onde de 505 nm, 5 minutes et 10 minutes après l'achèvement de la réaction, respectivement, en utilisant le spectrophotomètre.EXAMPLE 4
2.0 ml of the reaction composition consisting of the same constituents as in Example 3 are heated beforehand to 370 ° C., and 50 μl of a dilute solution of serum is added thereto. The mixture is allowed to react at 370 ° C. The change in color of the resulting solution is calculated after a period of 5 minutes by measuring the absorbances at the wavelength of 505 nm, 5 minutes and 10 minutes after completion of the reaction, respectively, using the spectrophotometer.
Les résultats obtenus sont donnés à la figure 4. The results obtained are given in FIG.
EXEMPLE 5
On mesure l'activité de lipase de 39 échantillons en utilisant le même procédé qu'à l'exemple 4, et le procédé connu pour la mesure de l'activité d'une lipase dans du sérum (procédé au sel de cuivre;
Clin. Chem. 21, 1469 à 1473 (1975)). En résultat, on indique à la figure 5 la relation entre le procédé suivant l'invention et le procédé classique, le coefficient de corrélation étant de 0,976 et l'equa- tion de régression étant représentée par : y = 1,28 + 8,6. Il s'avère que la relation obtenue est très satisfaisante. EXAMPLE 5
The lipase activity of 39 samples was measured using the same method as in Example 4, and the known method for measuring the activity of a lipase in serum (copper salt method;
Clin. Chem. 21, 1469 to 1473 (1975)). As a result, the relationship between the method according to the invention and the conventional method is indicated in FIG. 5, the correlation coefficient being 0.976 and the regression equation being represented by: y = 1.28 + 8, 6. It turns out that the relationship obtained is very satisfactory.
Claims (9)
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|---|---|---|---|
| JP839082A JPS58126798A (en) | 1982-01-21 | 1982-01-21 | Novel method for determination of unsaturated fatty acid |
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Cited By (4)
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| NL1007158C2 (en) * | 1997-09-29 | 1999-03-30 | Inst Voor Agrotech Onderzoek | Enzymatic modification. |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DE3301655A1 (en) | 1983-09-08 |
| JPS58126798A (en) | 1983-07-28 |
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