CH645668A5 - Verfahren zur herstellung von sarcosinoxidase. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Sarcosinoxidase.

Sarcosinoxidase (EC. 1.5.3.1, Sarcosin: Sauerstoffoxido-reductase (demethylierend)) ist ein bekanntes Enzym, von welchem angenommen wird, dass es auf die folgende Reaktion einwirkt:

Sarcosin + H20 + 02 <=* Glycin + HCHO + H202

Das Enzym wurde bisher aus Leber oder Nieren von Mäusen gewonnen oder aus dem Kulturmedium des Mikroorganismus der Gattung Cornebacterium.

Es wurde nun insbesondere gefunden, dass ein Enzym, welches die oben dargestellte Reaktion katalysiert, durch den Bakterienstamm B-0618 erzeugt wird, welcher zur Gattung Bacillus sp. gehört und aus einer Bodenprobe isoliert wurde, welche in Sasaki, Fukuchiyama, Kyoto, Japan, isoliert wurde. Es gelang ferner, ein gereinigtes Enzym zu isolieren.

Der Stamm B-0618 weist folgende taxonomische Eigenschaften auf:

A) Macroskopische Beobachtung auf verschiedenen Medien, bei 30 °C während 18 bis 24 Stunden gezüchtet.

(1) Schrägbouillon-Agar:

Wachstum: gut, filamentös

Farbe der Kolonie: gräulich-weiss bis schwach braun, praktisch kein diffundierbares Pigment.

(2) Glucose-Bouillon-Schrägagar:

Wachstum: gut, filamentös

Farbe der Kolonie: gräulich-weiss bis schwach braun, wenig diffundierbares Pigment.

(3) Fluisige Bouillon:

Kulturbrühe: trüb mit Sediment, keine Hautbildung.

(4) Lackmus-Milch:

Alkalisierung nach etwa 1 bis 2 Wochen.

(3) Einstich in Bouillon-Gelatine:

Wachstum: Wachstum an der Oberfläche, schwache aber trichterförmige Verflüssigung.

B) Mikroskopische Beobachtungen:

(1) Form und Grösse der Zellen: grosse und gerade Stäbe, 1,0 bis 1,5 x 2,0 bis 5 um, abgerundete Ketten, einzeln oder zu zweit verbunden (double linkage), gelegentlich kurze Ketten.

(2) Polymorphismen: keine.

(3) Motilität: peritrische Bewegung (beobachtet auf einem Bouillon-Schrägagar-Medium bei 26 °C, 18 stündige Kultur).

(4) Sporen: zylindrische oder cosphärische (elliptische) Sporen im Zentrum oder am Ende des Randes der Zelle. Keine Schwellung durch die Sporen. 0,8 bis 1,0 x 1,2 bis 1,6 p.m.

(5) Gram-Färbung: positiv.

(6) Säurefeste Färbung: negativ.

C) Physiologische Eigenschaften:

Nitratreduktion: negativ.

Denitrifizierung: negativ.

s MR-Test: negativ.

VP-Test: negativ.

Indolbildung: negativ.

Schwefel-Wasserstoff-Bildung: positiv.

Stärkehydrolyse: negativ.

io Gelatinehydrolyse: positiv.

Caseinhydrolyse: negativ.

Äsculinhydrolyse: negativ.

Cellulosehydrolyse: negativ.

Citrat-Verwertung, Simons-Medium: negativ. i5 Christensen-Medium: positiv.

Nitrat-Verwertung: positiv.

Ammoniak-Verwertung: negativ.

Bildung von Ammoniak aus Nitrat: positiv.

Wachstums-pH: pH 6,4 bis 9,6.

20 Wachstumstemperatur: 10 bis 42 °C.

Halogenverträglichkeit: NaCl 6,0%.

Verhalten in Sauerstoff: aerob.

O-F-Test (Hugh Leifson-Medium): NT.

O-F-Test*: O (oxidative Zersetzung). 25 * O-F-Testmedium: modifiziertes Medium.

Da keine Säurebildung aus Glucose erfolgt und keine oder nur schwache Säurebildung aus anderen Sacchariden, wurde Glycerin als Zucker verwendet. NH4H2P041,0 g, KCl 0,2 g, MgS04-7H20 0,2 g, Hefeextraktpulver 1,0 g, Agar-Pul-30 ver 3,0 g, Bromthymol-Blau (10%ige wässrige Lösung) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 7,2 bis 7,4.

Säure- und Gasbildung aus Zucker: ** (es wurde keine Gasbildung beobachtet).

35 L-Arabinose: Aerythritol: Glucose:

Lactose: 40 Mannose: Raffinose: L-Sorbose: Saccharose:

Cellobiose:

Fructose: + (Acid)

Glycerin: +

(Acid)

Maltose:

Melezitose:

L-Rhamnose:

Sorbitol:

Trehalose:

Dulcitol:

Galactose:

Inosit:

Mannitol: + (Acid)

Melibiose:

Salicin:

Stärke:

Xylose:

45 ** Grundmedium: NH4H2P041,0 g, KCl 0,2 g,

MgS04-7H20 0,2 g, Hefeextraktpulver 1,0 g, Agar-Pulver 3,0 g, Bromthymol-Blau (10%ige wässerige Lösung) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 7,2 bis 7,4.10 g Zucker wurden zu diesem Medium zugesetzt.

so Unter Zuhilfenahme von Bergey's «Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, ist der Stamm B-0618 mit den oben beschriebenen taxonomischen Eigenschaften, insbesondere grampositiver sporenbildender grosser Bazillus, aerobe Bakterien mit peritrischer Bewegung und Säurebil-55 dung aus Glucose, der Gattung Bacillus der Gruppe der Bakterien zuzurechnen.

Der Vergleich des Stammes B-0618 mit anderen ähnlichen Bakterien, Bacillus badius, Bacillus freudenreichii und Bacillus macroides, wurde wie folgt durchgeführt.

60 Bacillus badius ATCC-14 574 (Typenkultur).

Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (Nichttypenkultur, kein Originalstamm).

Bacillus macroides ATCC-12 905 (Typenkultur).

65

645668

O-F-Test O-F-Test

Catalase Oxidase Urease

Gelatineverflüssigung

Stärkehydrolyse

Äsculinhydrolyse Indolbildung

H2 S-Bildung

Acetonbildung

MR-Test

Stamm B-0618

+

+

+

+

(+) +

Bacillus badus ATCC-14 574

keine Säurebildung

0 0

+ + +

Bacillus-freuden-reichii ATCC-7053

keine Säurebildung keine Säurebildung +

+ (+)

Bacillus macroides ATCC-12 905

+

Bemerkungen

Hugh Leif-son-Medium O-F-Test-Medium

Nitradreduktion

Citratverwertung + + + +

Säurebildung aus Zucker:

Arabinose - - - -

Fructose +

Galactose -

Glucose -

Glycerin + +* - - * spätere

Alkalini-sierung

Lactose - - - -

Maltose - - -

Mannit + - - -

Mannose - - -

Sorbit - - -

Saccharose - - - -

Trehalose - - - -

Xylose - -

Die Charakteristika auf Bouillonmedium sind die folgenden:

Der Stamm B-0618: schwaches Wachstum, wolliges Sediment.

ATCC-14 574: gleichmässig trüb, partielles Sediment.

ATCC-7053: schwaches Wachstum, wolliges Sediment.

ATCC-12 905: schwaches Wachstum, gleichmässig trüb, partielles Sediment.

60

Als Resultat können die taxonomischen Eigenschaften ger Kultur und Ureasebildung (schwache Ähnlichkeit), Äscu-des Stammes B-0618 als in verschiedenen Punkten verschie- lin-Hydrolyse, Säurebildung aus Fructose, Glycerin und den von denjenigen der Vergleichsstämme wie folgt betrachtet Mannose. Der Stamm ATCC-7053 ist weder die Typenkultur werden: noch der ursprüngliche Stamm, doch kann er trotzdem nicht

Bacillus badius ATCC-14 574: Bildung von Urease, Säu- 65 mit dem Stamm B-0618 identifiziert werden. Der Stamm rebildung aus Glycerin (Säurebildung und später Alkanisie- kann somit nicht der neuen Art angehören.

rung) und aus Mannit. Der Stamm B-0618 wird somit als Bacillus sp. eingereiht

Bacillus freudenreichii ATCC-7053: Wachstum aus flüssi- und als Bacillus sp. B-0618 bezeichnet. Dieser Stamm wurde

645 668 4

im Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Vorteil verwendet. Verschiedene anorganische Salze, wie Na-Science and Technology, Ministry of International Trade and triumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumhy-

Industry, 1-3, Higashi 1-eome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, drogenphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat können

Ibaraki-ken 305-Japan, unter der Nummer FERM P-4049 gegebenenfalls verwendet werden. Der Zusatz von Creatin vom 28. April 1977 hinterlegt. Der Stamm wurde ebenfalls im 5 zum Medium, vorzugsweise 0,5 bis 1 % stimuliert die Erzeu-

Agricultural Research Culture Collection, 1815 North Uni- gung von Sarcosinoxidase.

versity Street, Peoria, Illinois 61 604, USA, unter der Die Kulturtemperatur kann innerhalb der für das Wachs-

NRRL-No. B-l 1 380 hinterlegt. tum von mikrobiellen Zellen und die Erzeugung eines En-

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschaf- zyms üblichen Grenzen variieren und beträgt vorzugsweise 26

fung eines Verfahrens zur Herstellung von Sarcosinoxidase, i0 bis 33 °C. Die Kulturdauer kann je nach den Bedingungen ge-

welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Sarcosinoxidase ändert werden, beträgt jedoch üblicherweise 15 bis 25 Stun-

erzeugender Mikroorganismus, welcher zur Gattung Bacillus den. Die Züchtung sollte beendet werden, sobald die Sarco-

sp. gehört, in einem Nährmedium gezüchtet wird und die ge- sinoxidase-Erzeugung praktisch vollendet ist.

bildete Sarcosinoxidase aus der erhaltenen Kulturmasse iso- Sarcosinoxidase befindet sich in den Zellen von Mikroor-

liertwird. ìsganismen.

Als Sarcosinoxidase erzeugenden Mikroorganismen- Die Extraktion der Sarcosinoxidase auf der Kulturmasse

Stamm wird vorzugsweise der oben beschriebene Bacillus sp. kann auf verschiedene Weise wie folgt erfolgen: Die Kultur-

B-0618 FERM-P No. 4049 bezw. NRRL B-l 1 380 ver- masse wird zentrifugiert und die nassen Zellen werden in ei-

wendet. nem Puffer, z.B. Tris-HCl-Puffer suspendiert und durch Be-

Weitere Einzelheiten und Vorteile der vorliegenden Erfin- 20 handlung mit Lysozym, durch Sonication oder einer French-

dung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich, zusam- Presse zerrissen. Die derart erhaltene rohe Sarcosinoxidase men mit den beiliegenden Zeichnungen, in welchen wird nach den für die Isolierung und Reinigung von Prote-

Fig. 1 das optimale pH von Sarcosinoxidase, inen und Enzymen üblichen Methoden gereinigt. So kann

Fig. 2 die optimale Temperatur von Sarcosinoxidase, zum Beispiel, falls erforderlich, nach Entfernung der Nuclein-

Fig. 3 die pH-Stabilität von Sarcosinoxidase, 25 säure durch Zusatz von Protaminsulfat, eine fraktionierte

Fig. 4 die Wärmestabilität von Sarcosinoxidase, Ausfällung mit Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol

Fig. 5 das Resultat der quantitativen Analyse von Sarco- und Aussalzen mit Ammoniumsulfat vorzugsweise durchge-

sin durch Bestimmung von Formaldehyd, und führt werden. Eine weitere Reinigung kann zum Beispiel

Fig. 6 das Resultat der quantitativen Analyse von Sarco- durch Chromatographie erfolgen, bei welcher die rohe Sarcosin durch Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Form von 30 sinoxidase in Tris-HCl-Puffer gelöst und unter Verwendung Kurven oder Diagrammen darstellen. eines Anionenaustauschers, wie Diäthylaminoäthylcellulose

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung oder -Dextrangel und Gelfiltermittel, wie Dextrangel oder wird Bacillus sp. B-0618 FERM-P No. 4049 in einem für An- , Polyacrylamidgel chromatographiert wird. Gereinigte Sarco-

tibiotika- oder Enzymerzeugung üblichen Medium gezüchtet, sinoxidase kann in Form eines lyophilisierten Pulvers gelagert

Die submerse belüftete Kultur wird für die industrielle Erzeu- 35 werden.

gung bevorzugt. Die erfmdungsgemäss hergestellte Sarcosinoxidase weist

Ein übliches Medium für Mikroorganismen kann mit die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf:

Vorteil verwendet werden. Als Stickstoffquellen können assi- 1) Enzymwirkung:

milierbare Stickstoffquellen, wie Maiseinweichflüssigkeit, So- Ein Mol Sarcosin verbraucht ein Mol H20 und ein Mol jabohnenpulver, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Am- 40 Sauerstoff und erzeugt ein Mol Glycin, ein Mol Formaldehyd moniumsulfat, Ammoniumchlorid oder dergleichen verwen- und ein Mol Wasserstoffperoxid. Das Enzym katalysiert die det werden. Assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Oxidase von Sarcosin unter Bildung von Glycin und Form-

Melassen, Stärkehydrolisate oder dergleichen werden mit aldehyd.

CH3NHCH2COOH + 02 + H20-H2NCH2C00H + NCHO + H2O2 Die Enzymuntersuchung wird wie folgt durchgeführt: Die relative Wirksamkeit aus verschiedenen Substraten ist

Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml) bestehend aus 0,2 die folgende:

Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0,0,05 ml), 4-Aminoantipyrin (3

mg/ml, 0,05 ml), 0,2% Phenol (0,05 ml), Peroxidase (0,5 Substrat Relative mg/ml, 0,05 ml), 1 Mol Sarcosin (0,1 ml), und destilliertem 50 Wirksamkeit Wasser (0,2 ml) wird die Enzymlösung ( 10 n I) zugesetzt und während 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Äthanol (2,5 ml) Sarcosin 100,0

wird sodann zugesetzt, um die Reaktion zu unterbrechen. Die Cholin 0

Bildung von Wasserstoffperoxid wird colorimetrisch gemes- Betain 0,03

sen bei einer Absorption bei 480 nm. 55 Dimethylglycin 0,01

Eine Einheit (1 E) an Enzymwirksamkeit wird definiert Glycin 0,06

als diejenige Menge an Enzym, welche 1 p Mol Wasserstoff- Serin 0

peroxid pro Minute erzeugt. Threonin 0

2) Substratspezifität: Alanin 0

Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml) bestehend aus 0,2 60 Valin 0

Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0,0,05 ml), 4-Aminoantipyrin (3 Lysin 0,09

mg/ml, 0,05 ml), 0,2% Phenol (0,05 ml), Peroxidase (0,5 N-Methyläthanolamin 0

mg/ml, 0,05ml) destilliertem Wasser (0,2 ml) und den folgen- N-Dimethyläthanolamin 0 den Substraten (0,5 Mol, 0,20 ml) wird Sarcosinoxidase (0,5

Einheiten) zugesetzt und das Gemisch während 5 Minuten bei 65 3) Optimales pH:

37 °C inkubiert. Anschliessend wird Äthanol (2,5 ml) zuge- Um eine Wirkung der 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxi-

setzt, um die Reaktion zu unterbrechen und das Gemisch co- dase auf chromogen zu verhindern wird die Bildung von Al-lorimetrisch bei 480 nm bestimmt. dehyd nach der Acetylaceton-Methode bestimmt. Das Resul-

tat ist in Fig. 1 dargestellt, in welcher das optische pH 8,0 bis 9,5 beträgt.

Die verwendeten Pufferlösungen sind: pH 4 bis 7: Di-methylglutarat-Puffer, pH 6 bis 8: Phosphat-Puffer, pH 7,5 bis 9: Tris-HCl-Puffer, pH 9 bis 10: Glycin-NaOH-Puffer und pH 10 bis 11: Natriumcarbonat-Borat-Puffer.

4) Optimale Temperatur:

Etwa 50 °C, wie aus Fig. 2 ersichtlich. Substrat: Sarcosin.

5) pH-Stabilität:

Dimethylglutarat-Puffer für pH 5 bis 7, Phosphat-Puffer für pH 6 bis 8, Tris-HCl-Puffer für pH 7,5 bis 9, Glycin-Na-OH-Puffer für pH 9 bis 10 und Natriumcarbonat-Borat-Puf-fer für pH 10 bis 11 werden verwendet. Zu je 0,1 ml von jedem Puffer werden 100 |i 1 Enzymlösung (Protein 100 n g/ml) zugesetzt und das Gemisch während 60 Minuten bei 37 °C stehen gelassen. Anschliessend wurde das pH durch Zusatz von 1,0 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0,0,3 ml) eingestellt und 20 |i 1 jeder Probe entnommen und die Enzymaktivität bestimmt. Sarcosin wurde als Substrat verwendet, und wie aus Fig. 3 ersichtlich liegt das stabile pH bei etwa pH 6,0 bis 10,0.

6) Wärmestabilität:

Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt durch Inkubieren von 10 mMol Tris-HCl-Puffer (0,5 ml, pH 8,0), welche das Enzym (Protein 20 (i g/ml) enthalten, bei verschiedenen Temperaturen während 10 Minuten unter Verwendung von Sarcosin als Substrat. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, ist das Enzym unterhalb etwa 40 °C stabil.

7) Molekulargewicht:

40 000 (gemessen durch Gelfiltration).

8) Isoelektrischer Punkt:

4,7 Elektrophorese unter Verwendung eines Ampholyten vom Trägertypus).

9) Identifizierung und Bestimmung der Reaktionsprodukte:

i) Identifizierung von Glycin:

Reaktionsgemisch:

0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 1,0 ml

1 mMol Sarcosin 1,0 ml

Catalse 200 Einheiten

Sarcosinoxidase 5 Einheiten destilliertes Wasser 8,0 ml

5 645 668

Das Reaktionsgemisch wurde während 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen während 5 Minuten auf 100 °C unterbrochen. Nach dem Abkühlen wurde Acetat-Puffer (pH 5,5,1,5 ml) zugesetzt und ausser-5 dem 20 ml der unten angegebenen Chromogenlösung. Nach 50 Minuten Inkubation bei 27 °C wurde die Lösung colorime-trisch bei 412 nm gemessen. Das Resultat ist in Fig. 5 dargestellt, in welcher die Bildung von Formaldehyd der Konzentration an Sarcosin entspricht.

10

15 g 0,3 ml 0,2 ml

Total

10,0 ml

Das obige Reaktionsgemisch (10 ml) wurde während 60 Minuten bei 37 °C inkubiert, worauf die Reaktion durch Erhitzen auf 100 °C während 5 Minuten unterbrochen wurde. Die gebildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit auf einen Zehntel des Volumens konzentriert und auf ein Filterpapier getupft. Ein Chromato-gramm wurde mit Phenol, das mit Wasser gesättigt war, über Nacht entwickelt und gefärbt durch Erhitzen nach Besprühen mit Ninhydrinlösung. Der Rf-Wert betrug 0,26.

Eine authentische Probe von Sarcosin und Glycin wiesen einen Rf-Wert von 0,66 beziehungsweise 0,26 auf, wodurch ein Fleck mit dem obigen Rf-Wert als Glycin identifiziert wurde.

ii) Bestimmung von Formaldehyd:

Reaktionsgemisch:

0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,05 ml

Sarcosin mit aliquoter Konzentration 0,10 ml

Catalase 200 Einheiten

Sarcosinoxidase 3,0 Einheiten destilliertes Wasser 0,35 ml

Chromogen:

Ammoniumacetat Essigsäure Acetylaceton 15 Wasser auf 100 ml iii) Bestimmung von Wasserstoffperoxid: Wasserstoffperoxid wurde quantitativ bestimmt durch Vereinigung von 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase.

Reaktionsgemisch: 0,2 Mol Tris-HCl-Pufferlösung

(pH 8,0) 0,05 ml

3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,05 ml

25 0,2% Phenol 0,05 ml

0,5 mg /ml Peroxidase 0,05 ml Sarcosin mit aliquoter

Konzentration 0,10 ml

Sarcosinoxidase 3,0 Einheiten

30 destilliertes Wasser 0,2 ml

Total 0,5 ml

Das Reaktionsgemisch wurde während 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach Zusatz von Äthanol (2,5 ml) wurde das Gemisch colorimetrisch bei 480 nm gemessen. Wie aus Fig. 6 ersichtlich entspricht die Bildung von Wasserstoffperoxid der Konzentration an Sarcosin.

Wie oben erwähnt, katalysiert die erfmdungsgemäss hergestellte Sarcosinoxidase die Oxidationsreaktion, bei welcher Sarcosin mit Sauerstoff umgesetzt wird, wobei 1 Mol Wasser pro Mol Sarcosin verbraucht wird, und in welcher Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid gebildet werden. Das Enzym ist daher bestätigt als das Enzym von EC 1.5.3.1 Sarcosin: Sauerstoffoxidoreduktase (demethylierend).

Die Sarcosinoxidase kann als enzymatisches Diagnostiziermittel verwendet werden, z.B. zur Bestimmung von Creatinin im Blut oder Harn zusammen mit Creatinase und Crea-tininase. Ferner kann Sarcosinoxidase zur Bestimmung der Aktivität von Creatininase verwendet werden.

Das folgende Beispiel illustriert eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

35

40

45

50

Total

0,50 ml

Beispiel:

Ein Medium (100 ml), welches Creatin (0,5%), lösliche Fischbestandteile (fish soluble) (0,5%), Hefeextrakt (0,2%), KCl (0,3%), K2HP04 (0,1%) und MgS04-7H20 (0,05%) enthält, wurde in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben während 20 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Bacillus sp. B-0618 6Q FERM-P No. 4049 wurde in diese Lösung eingeimpft und das Gemisch bei 30 °C während einem Tag als Impfkultur gezüchtet, welche in dasselbe sterilisierte Medium (20 Liter) in einem 30 Liter-Fermentiergefäss übertragen und während 20 Stunden bei 30 °C unter Rühren mit 200 Touren pro Minute 65 und einer Belüftung von 20 Litern pro Minute bebrütet wurde. Die Bakterienzellen wurden in einer Zentrifuge gesammelt (12g), mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, in derselben Pufferlösung suspendiert und mit Lyso-

645668

zym versetzt (Endkonzentration 0,2 mg/ml) und während 30 Minuten bei 37 °C gerührt. Die beim Zentrifugieren mit 5000 Touren pro Minute während 15 Minuten erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt (Sarcosinoxidase-Aktivi-tät: 1400 Einheiten). Zu der derart erhaltenen Flüssigkeit wurde 2%ige Protaminsulfatlösung (2,5 ml) zugesetzt und der

Nucleinsäure-Niederschlag abgetrennt.

Zu der verbleibenden Flüssigkeit wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugesetzt und der Niederschlag der Fraktionen von 50% bis 70% Ammoniumsulfat-Konzentration gesammelt. Der Niederschlag wurde in 10 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0,20 ml) gelöst und über eine «Sephadex G-25»-

6

Säule (3,5 x 30 cm) entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde über eine «DEAE»-Cellulosesäule (2,0 x 18 cm, gepuffert mit 10 mMol Tris-HCl-Puffer, pH 7,0) geleitet, um das Enzym zu adsorbieren, die Säule mit derselben Pufferlösung, 5 welche 0,1 Mol KCl enthielt, gewaschen und mit KCl-Lö-sung im Gradienten 0,1 M bis 0,5 M eluiert.

Die aktive Fraktion, welche bei 0,36 M KCl eluiert worden war, wurde gesammelt und während 10 Stunden gegen die Lösung von 10 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert io und anschliessend gefriergetrocknet, um die Sarcosinoxidase in Pulverform zu erhalten.

Totale Aktivität: 540 Einheiten, Protein: 43 mg, spezifische Aktivität: 12,7 E/mg, Ausbeute: 38,6%.

C

2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

645 668 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Sarcosinoxidase, dadurch gekennzeichnet, dass ein Sarcosinoxidase erzeugender Mikroorganismus, welcher zur Gattung Bacillus gehört, in einem Nährmedium gezüchtet wird und die derart erzeugte Sarcosinoxidase aus der erhaltenen Kulturmasse isoliert wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium Creatin enthält.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Bacillus sp. B-0618, FERM-P 4049 verwendet.