DE3842090C2 - DNA mit der genetischen Information von L-alpha-Glycerophosphatoxidase und deren Anwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft nach den Ansprüchen 1 bis 3 eine DNA, welche die genetische Information für L-α-Glycerophosphatoxidase umfaßt, nach den Ansprüchen 4 bis 8 ei­ nen Transformanten, der diese DNA besitzt, nach den Ansprüchen 9 bis 10 ein Polypep­ tid, das erzeugt wird, indem man den Transformanten da­ zu bringt, eine Expression der genetischen Information der DNA durchzuführen, sowie ein Verfahren zur Herstel­ lung der L-α-Glycerophosphatoxidase nach den Ansprüchen 11 bis 14.

L-α-Glycerophosphatoxidase ist ein Enzym, das eine en­ zymatische Reaktion katalysiert, bei der aus L-α-Glyce­ rophosphat und 1 Mol Sauerstoff Dihydroxyacetonphosphat und 1 Mol Wasserstoffperoxid gebildet werden, und zwar gemäß der folgenden Reaktionsformel:

L-α-Glycerophosphat + O₂ → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂.

Da es sich bei L-α-Glycerophosphatoxidase (im folgenden als GPO abgekürzt) um eine Oxidase handelt, deren Sub­ strat L-α-Glycerophosphat ist, kann man, wie aus der obigen Reaktionsformel hervorgeht, sie zur quantitativen Bestimmung von L-α-Glycerophosphat verwenden. Darüber hinaus ermöglicht dieses Enzym, wenn es in Kombination mit anderen Enzymen, wie Lipase, Glycerinkinase oder dergl., oder mit einem ATP-Reagens verwendet wird, ein einfaches und spezifisches Bestimmungsverfahren für die Komponenten, die bei der Reaktion involviert sind, wie Lipaseaktivität, Triglycerid, Glycerin, ATP und dergl. Aus diesen Gründen stellt L-α-Glycerophosphatoxidase ein Hauptenzym für biochemische, quantitative Analyseverfah­ ren dar, welche die herkömmlichen, nicht-spezifischen, chemischen, quantitativen Analyseverfahren zunehmend er­ setzen. Das Enzym ist somit äußerst brauchbar auf den Gebieten der klinischen Diagnose sowie, ganz allgemein, auf dem Gebiet der Forschung.

Man weiß seit langem, daß GPO in der Natur vorkommt. Bei­ spielsweise wurde berichtet, daß das Enzym in Mikroorga­ nismen existiert, welche beispielsweise zu Gattungen, wie Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostock, Pedio­ coccus und Aerococcus, gehören [Archives of Biochemistry and Biophysics, 88, 250 (1960); JP-OS 72 892/1978 und 15 746/1980].

Die Herstellung von GPO durch diese herkömmlichen, be­ kannten, GPO-erzeugenden Mikroorganismen wirft jedoch verschiedene Probleme auf. Genauer gesagt, wird mit al­ len der bekannten GPO-erzeugenden Mikroorganismen ledig­ lich eine niedrige GPO-Produktivität erreicht. GPO-erzeu­ gende Mikroorganismen, die zu dem Stamm Streptococcae und dem Stamm Lactobacillae gehören, erfordern die Zu­ gabe einer Substanz, welche die Produktion von GPO in­ duziert, wie Glycerin, Ascorbinsäure, α-Ketosäure oder dergl. Darüber hinaus ist die Eliminierung anderer En­ zyme und unerwünschter Nebenprodukte, welche gemeinsam mit GPO in dem Produkt dieser Mikroorganismen existieren, äußerst schwierig. Wegen dieser Probleme konnte bisher ein qualitativ hochwertiges GPO lediglich zu äußerst ho­ hen Kosten erzeugt werden, wodurch eine breite Anwendung von GPO als Reagens für Forschungszwecke und für klini­ sche Diagnosen bisher verhindert wurde.

Darüber hinaus gibt es bisher keine Berichte betreffend die detaillierte Primärstruktur des GPO-Gens noch die Primärstruktur der Aminosäuresequenz für das Protein, welches GPO aufbaut.

Von den Erfindern wurden umfangreiche Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die Produktivität von GPO zu stei­ gern und die Menge der anderen co-existierenden Enzyme (verunreinigenden Enzyme), die in dem Produkt enthalten sind, zu reduzieren. Dabei ist es den Erfindern gelun­ gen, das GPO-Gen zu separieren und dessen Primärstruktur aufzuklären. Die Erfinder haben ferner durch die Anwen­ dung von Genetic Engineering-Techniken ein Verfahren ent­ wickelt, das geeignet ist, GPO mit hoher Produktivität zu erzeugen, ohne irgendwelche Zusätze zur Induzierung der GPO-Produktion in dem Produktionsmedium zu verwenden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaf­ fung von DNA mit einer Basensequenz, die für eine Amino­ säuresequenz eines Polypeptids codiert, das L-α-Glycero­ phosphatoxidase (GPO) aufbaut, eines Transformanten, welcher dieser DNA aufweist, eines Polypeptids, das GPO- Aktivität hat und durch Kultivierung des Transformanten erzeugt wird, einer GPO mit überlegenen physiko-chemi­ schen Eigenschaften sowie eines Verfahrens zur Herstel­ lung einer derartigen GPO.

Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung wer­ den aus der folgenden Beschreibung noch deutlicher.

In Fig. 1 ist schematisch der Aufbau von Plasmid pGPOS1 dargestellt.

Die DNA der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise nach der folgenden Verfahrensweise unter Anwendung von Genetic Engineering-Techniken hergestellt werden. Zu­ nächst wird die DNA eines Mikroorganismus, der den GPO- Gendonor darstellt und die Fähigkeit zur GPO-Produktion aufweist, abgetrennt und gereinigt. Diese DNA wird ver­ daut, wobei man Ultraschallwellen oder eine Restrikti­ onsendonuclease verwendet. Diese verdaute DNA und eine Expressionsvektor-DNA, welche linear gemacht wird, wer­ den mit einer DNA-Ligase oder dergl. an den abgestumpf­ ten oder kohäsiven Enden der beiden DNAs unter Bildung eines geschlossenen Kreises verbunden. Der auf diese Weise erhaltene, rekombinante DNA-Vektor wird in einen reproduzierbaren Wirtsmikroorganismus eingeführt. Mikro­ organismen, welche den rekombinanten DNA-Vektor aufwei­ sen, werden mittels Screeningverfahren unter Verwendung des Vektormarkers und der GPO-Aktivität als Indikatoren ausgewählt und kultiviert. Der rekombinante DNA-Vektor wird dann aus den kultivierten Zellen abgetrennt und gereinigt. Die DNA, welche die genetische Information der GPO besitzt und den Gegenstand der vorliegenden Er­ findung darstellt, wird anschließend von dem rekombinan­ ten DNA-Vektor abgetrennt.

Als GPO-Gen-Donatormikroorganismus für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können beliebige Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur GPO-Produktion verwendet werden. Beispiele sind GPO-produzierende Mikroorganismen, die zur Gattung Streptococcus gehören und beispielsweise in den JP-OS 72892/1978, 15746/1980, 165789/1978 und dergl. beschrieben sind, einschließlich die Stämme Streptococcus faecium F-24, Streptococcus faecalis 10C1, Streptococcus faecium ATCC 12755, Streptococcus faecium ATCC 8043, Streptococcus faecalis ATCC 19488, Strepto­ coccus cremoris NRRL 3684 und dergl.; GPO-produzierende Mikroorganismen, die zur Gattung Pediococcus gehören, einschließlich die Stämme Pediococcus cerevisiae ATCC 8042 (Pediococcus acidilactici ATCC 8042), Pediococcus cerevisiae ATCC 8081 (Pediococcus acidilactici ATGC 8081), Pediococcus cerevisiae IFO 12230 (Pediococcus pentosaceus IFO 12230), Pediococcus acidilactici IFO 3885, Pediococcus pentosaceus IFO 12318, Pediococcus parvulus IFO 12235 (Pediococcus parvulus IFO 19371), Pediococcus homari IFO 12217 (Pediococcus sp.IFO 12217), Pediococcus urinae-equi ATCC 29722 (Pediococcus urinae­ equi IFO 12173) und dergl.; GPO-produzierende Mikroorga­ nismen, die zur Gattung Lactobacillus gehören, ein­ schließlich die Stämme Lactobacillus delbruckii NRRL B445 (Lactobacillus casei subsp.rhamnosus ATCC 10863), L.delbruckii NRRL B445, Lactobacillus fermentum NRRL 8338, Lactobacillus leichmannii ATCG 4797 und dergl.; GPO-produzierende Mikroorganismen, die zur Gattung Leuconostoc gehören, einschließlich die Stämme Leuco­ nostoc mesenteroides und dergl.; sowie GPO-produzie­ rende Mikroorganismen, die zur Gattung Aerococcus gehö­ ren, einschließlich die Stämme Aerococcus viridans IFO 12219, Aerococcus viridans IFO 12317 und dergl. Unter diesen sind GPO-produzierende Mikroorganismen, die zur Gattung Streptococcus gehören, besonders bevorzugt.

Von den Erfindern wurden weitere, umfangreiche Forschun­ gen durchgeführt, um eine GPO herzustellen, die keinen Defekt zeigt, wie er bei allen bekannten Enzymen inhärent ist. Im Zuge dieser Forschungen wurden entdeckt, daß ein neuer Stamm GPOS-53, der zur Gatting Streptococcus gehört und der aus dem Boden einer Ranch bei Yamaguchi, Susono City, Shizuoka-Präfektur, Japan, isoliert wurde, eine GPO mit überlegenen physiko-chemischen Eigenschaf­ ten erzeugt. Dieser Stamm GPOS-53 stellt einen besonders bevorzugten Mikroorganismus für die Erzeugung des GPO- Gens dar.

Die taxonomischen Charakteristika dieses neuen Stamms GPOS-53 sind wie folgt:

I. Wachstumsbedingungen in unterschiedlichen Kultur­ medien (Kultivierung bei 28 bis 30°C) (1) Kultivierung auf geneigtem Medium (Nährstoff­ agarmedium + Hefeextrakt 0,2%)

Filiformes Wachstum, jedoch ziemlich schwach, cremi­ ge oder milchigweiße Färbung. Lösliches Pigment wird nicht gebildet.

(2) Kultivierung auf Plattenmedium (Nährstoff­ agarmedium + Hefeextrakt 0,2%)

Kolonien sind kreisförmig, konvex geformt und cremig oder milchigweiß gefärbt. Lösliches Pigment wird nicht gebildet.

(3) Flüssiges Medium (Triptic Soy Broth, hergestellt von Difco Co.)

Gutes Zellwachstum mit trübe werdender Brühe. Die Zel­ len präzipitieren anschließend, und der Überstand wird klar.

(4) BCP-Milch-Kultivierung

Die Kulturbrühe wird sauer.

II. Morphologische Charakteristika

Die Zellen sind sphärisch oder ovoid. Man findet ein­ zelne, nicht-verknüpfte Zellen, zweikettige Zellen und langkettige Zellen. Die Zellen sind nicht bewegungs­ fähig und bilden keine Sporen. Die Größe der Zellen ist 0,8 bis 1,0 µm.

III. Physiologische und biochemische Eigenschaften

In den folgenden Beschreibungen steht "+" für positiv, "-" für negativ und "(+)" für schwach positiv.

Gramanfärbung
+
KOH-Reaktion	-
Säure-Schnellanfärbung	-
Kapselbildung	-
OF-Test (Hugh Leifson)	F
Wachstum unter anaeroben Bedingungen	+
Wachstumstemperatur @	45°C	+
30°C	+
10°C	+
Salzresistenz bei NaCl-Konz. @	0%	+
5,0%	+
6,0%	-
Wachstum bei pH @	9,5	+
8,0	+
4,0	+
Wachstum in einem Methylenblau-Milchmedium	+
Catalasebildung	-
Oxidasebildung	-
Ureasebildung (sowohl für SSR als auch Chris)	-
Gelatine-Zersetzung	-
Casein-Zersetzung	+
Äsculinhydrolyse	+
Hippurat-Zersetzung (API 20 STREP)	+
Cellulose-Zersetzung	-
Arginin-Zersetzung	+
Indol-Bildung	-
Hydrogensulfid-Bildung	-
Acetoin-Bildung (NaCl)	+
MR-Test	+
Nitrat-Reduktion	-
Denitrifikation	-
Nutzungstest @	Citronensäure (sowohl für Simons als auch für Chris)	-
Apfelsäure @	(für Simons)	-
(für Chris)	+
Propionsäure (für Simons)	-
Malonsäure (für Chris)	+
Gasbildung aus Glucose	-
Bildung von Säure aus Kohlenhydrat @	Adonit	-
L(+)-Arabinose	+
Cellobiose	+
Dulcit	-
meso-Erythrit	-
Fructose	+
D-Galactose	+
D-Glucose	+
Glycerin	(+)
Inosit	-
Inulin	-
Lactose	+
Maltose	+
Mannit	+
Mannose	+
Melibiose	+
Melezitose	-
Raffinose	+
L(+)-Rhamnose	-
D-Ribose	+
Salicin	+
L-Sorbose	-
Sorbit	-
Stärke	+
Saccharose	+
Xylose	-
Trehalose	+
Hämolyse (API 20 STREP)	-

Aufgrund der obigen mycologischen Charakteristika kann der neue Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung als grampositiver, sphärischer oder ovoider Mikroorganismus bezeichnet werden, der einzeln, in Paaren oder langket­ tig vorkommt, unfähig zur Bildung von Catalase oder Oxidase ist, Kohlenhydrate fermentativ unter Bildung von Säuren zersetzt, bewegungsunfähig ist, keine Sporen bilden kann und eine Größe von 0,8 bis 1,0 µm besitzt.

Gemäß der Beschreibung in Bergey′s Mannual of Determina­ tive Bacteriology (8. Auflage) wird dieser Mikroorganis­ mus der Gattung Streptococcus zugehörig beurteilt. Mikroorganismen, die zur Gattung Streptococcus gehören (im folgenden auch einfach mit "S." bezeichnet) können in Gruppen eingeteilt werden gemäß ihrer Fähigkeit, bei 10°C und 45°C zu wachsen, in einem 0,1% Methylenblau- Milchmedium zu wachsen, Gelatine zu zersetzen, Salz­ resistenz zu zeigen und dergl. Ein Vergleich der Haupt­ stämme der Gattung Streptococcus und des Mikroorganis­ mus der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf diese Charakteristika ist in der nachfolgenden Tabelle zusam­ mengestellt. Die folgenden Mikroorganismen wurden für den Vergleich verwendet:

Aufgrund des obigen Vergleichs wird der erfindungsge­ mäße Mikroorganismus dahingehend beurteilt, daß es sich um einen Stamm handelt, der ähnlich ist wie S.faecalis, S.faecium und S.lactis. Diese drei Stämme und der erfin­ dungsgemäße Mikroorganismus werden in der nachfolgenden Tabelle noch genauer verglichen.

Gemäß dem obigen Vergleich ist der erfindungsgemäße Mikroorganismus dem S.faecium sehr ähnlich. Er unter­ scheidet sich jedoch von S. faecium hinsichtlich der Hippurat-Zersetzungsfähigkeit und der Salzresistenz (6,5%), Merkmale, die für einen Mikroorganismus indika­ tiv sind, der zur Gattung Streptococcus gehört. Dieser Mikroorganismus wurde daher als zur Gattung Strepto­ coccus gehörender Mikroorganismus identifiziert und als Streptococcus sp.GPOS-53 bezeichnet. Der Mikroorganis­ mus wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt (Hinter­ legungs-Nr. 2120, FERM BP-2120).

Im folgenden wird die Methode erläutert, mit der DNA- induziert durch den Genspender-Mikroorganismus, erhal­ ten wird. Zunächst wird irgendein beliebiges der oben erwähnten Gen-spendenden Mikroorganismen in einem flüs­ sigen Kulturmedium unter Belüftung 1 bis 3 Tage kulti­ viert. Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Anschließend werden die Zellen lysiert, um ein Bakteriolyseprodukt, enthaltend GPO-Gen, zu erzeu­ gen. Für die Bakteriolyse wird eine Behandlung mit einem Zellwand-lysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucana­ se, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Enzymen, wie Protease, oder einem oberflächenaktiven Mittel, wie Natriumlaurylsulfat, verwendet. Zusätzlich kann eine physikalische Verdauung der Zellwände durch Einfrieren- Auftauen oder mittels einer französischen Presse ange­ wendet werden zusammen mit dem Lysat.

Herkömmliche Reinigungsverfahren einschließlich bei­ spielsweise Deproteinisierung durch Phenolextraktion, Proteasebehandlung, Ribonucleasebehandlung, Alkohol- Fällung und Zentrifugieren können angewendet werden, und zwar unabhängig oder in Kombination, um die DNA aus dem Bakteriolyseprodukt abzutrennen und zu reini­ gen.

Die Verdauung der auf diese Weise abgetrennten und ge­ reinigten DNA des Mikroorganismus kann durchgeführt wer­ den mittels einer Behandlung mit Ultraschallwellen oder Restriktionsendonucleasen. Um zu gewährleisten, daß eine leichte Vereinigung der DNA-Fragmente und der Vektor- DNA stattfindet, ist jedoch die Verwendung von Restrik­ tionsendonucleasen bevorzugt, speziell die Verwendung von Typ II Endonucleasen, welche auf eine spezifische Nucleotid-Sequenzwirkt, wie EcoR I, Hind III, BamH I oder BamH II.

Besonders geeignete Vektoren, die für den Einsatz in Frage kommen, sind solche, welche durch künstliche Be­ handlung eines Phagen für die Verwendung als genetische Rekombinanten-DNA rekonstruiert wurden, oder eine Plasmid-DNA, welche in der Lage ist, in einer Wirts- Bakterienzelle autonom zu wachsen.

Bei Verwendung von Escherichia coli als Wirts-Mikroorga­ nismus kann man beispielsweise λgt.λC, λgt.λkB oder dergl. als Phagen-Vektor verwenden.

Als Plasmid kann man pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19 oder dergl. verwenden, falls Escherichia coli als Wirts-Mikroorganismus dient, wäh­ rend pUB110, pC194 oder dergl. in Frage kommt, falls Bacillus subtilis der Wirts-Mikroorganismus ist. Zusätz­ lich kann man Shuttlevektoren einsetzen, welche entwe­ der in grampositiven oder gramnegativen Mikroorganismen- Wirtsbakterienzellen autonom wachsen, z. B. in einem oder in beiden von Escherichia coli und Saccharomyces cerevi­ siae. Diese Vektoren werden vorteilhafterweise unter Verwendung der gleichen Restriktionsendonuclease ver­ daut, wie sie zum Aufbrechen der oben erwähnten GPO- Gen-Spendermikroorganismus-DNA verwendet wurde.

Eine herkömmliche Ligationsmethode unter Verwendung ei­ ner DNA-Ligase kann eingesetzt werden, um die bakteriel­ le DNA und das Vektorfragment zu verbinden. Beispiels­ weise werden das kohäsive Ende der bakteriellen DNA und das des Vektorfragments zunächst getempert und nachfol­ gend kann rekombinante DNA aus der bakteriellen DNA und dem Vektorfragment hergestellt werden unter der Einwir­ kung einer zweckentsprechenden DNA-Ligase. Falls erfor­ derlich, wird das getemperte, bakterielle DNA-Vektor­ fragment in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt, um die rekombinante DNA mit Hilfe einer in vivo-DNA-Ligase zu erzeugen.

Beliebige Mikroorganismen, welche ein autonomes und sta­ bildes Wachstum der rekombinanten DNA erlauben und zur Expression der Beschaffenheit der Fremd-DNA in der Lage sind, können als Wirts-Bakterium verwendet werden. Bei­ spiele derartige Mikroorganismen umfassen Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 und dergl., falls Escheri­ chia coli als Wirts-Bakterium eingesetzt wird.

Die Einführung der rekombinanten DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann durchgeführt werden in Gegenwart von Calciumionen, falls der Wirts-Mikroorganismus ein Bakterium ist, das zur Gattung Escherichia gehört. Falls ein Bakterium als Wirts-Mikroorganismus verwendet wird, das zur Gattung Bacillus gehört, kann man zur Einführung der Ribosom-Rekombinant-DNA in einen Proto­ plast-Wirts-Mikroorganismus eine Kompetent-Zellmethode oder eine elektrische Fusions-Einführungsmethode ver­ wenden. Eine Mikroinjektions-Methode kann ebenfalls angewendet werden.

Die Einführung der gewünschten DNA in den Wirts-Mikro­ organismus kann man mittels Screeningverfahren ermit­ teln, und zwar unter Verwendung eines Drogen-Resistenz­ markers des Vektors und gleichzeitiger Bestimmung der GPO-Aktivität. Auf diese Weise können beispielsweise solche Bakterien ausgewählt werden, welche auf einem se­ lektiven Kulturmedium, basierend auf dem Drogen-Resi­ stenzmarker, wachsen und GPO produzieren.

Rekombinante DNA, welche das GPO-Gen besitzt und auf die beschriebene Weise einmal ausgewählt wurde, kann leicht aus dem Transformanten für die Einführung in ein anderes Wirts-Bakterium extrahiert werden. Alter­ nativ kann man eine GPO-Gen-DNA unter Verwendung einer Restriktions-Endonuclease oder dergl. aus einer rekombi­ nanten DNA, welche ein GPO-Gen besitzt, verdauen und mit einem Ende eines linearisierten Vektors vereinigen, der auf ähnliche Weise erhalten wurde. Auf diese Weise wird ein rekombinantes DNA-Molekül mit neuen Eigen­ schaften erzeugt. Dieses kann anschließend in einen weiteren Wirts-Mikroorganismus eingeführt werden.

DNA, welche für ein GPO-Mutein codiert, welches wesent­ liche GPO-Aktivität besitzt, ist im Sinne der vorlie­ genden Erfindung eine mutierte DNA, welche durch eine Genetic Engineering-Technik aus einem GPO-Gen der vor­ liegenden Erfindung erzeugt wurde. Diese Mutation kann in das Gen eingeführt werden unter Verwendung ver­ schiedener Genetic Engineering-Techniken, einschließlich eine ortsspezifische Mutagenese-Methode und eine Methode zur Substitution eines spezifischen DNA-Fragments des Ziel-Gens mit einem mutierten DNA-Fragment. Unter den auf diese Weise hergestellten Muteinen können solche GPO-Mutein-DNAs, welche speziell gewünschte Eigen­ schaften aufweisen, mit einem Vektor vereinigt werden, um eine rekombinante DNA zu erzeugen, welche an­ schließend in einen Wirts-Mikroorganismus zur Herstel­ lung eines GPO-Muteins eingeführt wird.

Die Basensequenz der DNA der vorliegenden Erfindung, welche nach dem oben beschriebenen Verfahren herge­ stellt wurde, kann durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt werden [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Die Basensequenz ein des GPO-Gens in einem Plas­ mid, das hergestellt wurde unter Verwendung des Stamms Streptococcus sp.GPOS-53, welcher zu einem GPO-Gen- Spender-Mikroorganismus gehört, und Escherichia coli als Wirts-Bakterium, wird durch die folgende Formel (I) darge­ stellt:

wobei X für ein Codon steht, das nicht TAA, TAG oder TGA ist, oder für eine 5′-Endgruppe und Y ein Codon oder eine 3′-Endgruppe bedeutet.

In der obigen Formel (I) kann es sich bei dem durch X ausgedrückten Codon um ein beliebiges Codon handeln, solange dasselbe nur für eine Aminosäure codiert. Zu­ sätzlich kann X an seinem 5′-Ende ein oder mehrere Codons besitzen, die für eine Aminosäure codieren. Be­ vorzugte Beispiele von X sind ATG oder eine Polydesoxy­ ribonucleinsäure, die einem Signal-Peptid entspricht. Das durch Y dargestellte Codon kann ein beliebiges Codon sein, ausgewählt aus Translations-Stoppcodons und Codons, die für eine Aminosäure codieren. Y kann an seinem 3′-Ende ein oder mehrere Codons aufweisen, die für eine Aminosäure codieren, wobei es jedoch in diesem Fall wünschenswert ist, daß ein Translations-Stoppcodon am 3′-Ende dieser Codons vorgesehen ist.

Die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch die Expression der DNA der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann aus der Basensequenz der DNA vorausgesagt werden. Die Aminosäuresequenz des Abschnitts, welcher das N-Ende des Polypeptids darstellt, kann durch die Methode bestimmt werden, die unten erläutert wird. Ein GPO-Spender-Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Bil­ dung von GPO wird zunächst in einem Nährstoffmedium kul­ tiviert, um GPO in den Zellen zu erzeugen und anzurei­ chern. Die kultivierten Zellen werden aus der Brühe durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Maßnah­ men gesammelt. Die gesammelten Zellen werden dann zer­ stört, und zwar entweder auf mechanische Weise oder auf enzymatische Weise unter Verwendung von Lysozym oder dergl. Zu dem Lysat gibt man EDTA und/oder ein geeigne­ tes oberflächenaktives Mittel, falls erforderlich, um GPO zu solubilisieren und als wäßrige Lösung abzutren­ nen. Diese wäßrige Lösung von GPO wird dann konden­ siert oder, ohne daß man sie kondensiert, einer Ammoni­ umsulfat-Fraktionierung, Gelfiltration, Adsorptions­ chromatographie oder Ionenaustauschchromatographie unter­ worfen, um hochreine GPO zu erhalten. Die Aminosäure­ sequenz des Abschnitts, welcher das N-Ende des GPO-Pep­ tids darstellt, wird aus dieser hochreinen GPO unter Verwendung eines Flüssigphasen-Proteinsequenzers (Beck­ man-System 890ME, hergestellt von Beckman, Inc.) be­ stimmt. Auf diese Weise wird festgestellt, daß die Ami­ nosäuresequenz dieses Abschnitts identisch ist mit der Aminosäuresequenz des N-Endes von GPO, die mittels einer Genetic Engineering-Technik erhalten wurde. Die auf die­ sem Wege aus der obigen Basensequenz bestimmte Amino­ säuresequenz wird durch die folgende Formel (II) darge­ stellt:

Dabei steht A für einen Aminosäurerest oder ein Wasser­ stoffatom und B bedeutet einen Aminosäurerest oder eine -OH-Gruppe. In der durch die Formel (II) ausgedrückten Aminosäuresequenz kann es sich bei dem durch A darge­ stellten Aminosäurerest um eine oder um mehrere Amino­ säuren handeln. Bevorzugte Beispiele für A sind ein Wasserstoffatom, ein Met oder ein Signal-Polypeptid. Die durch B dargestellte Gruppe kann entweder ein Säureamid­ sein oder ein oder mehrere Aminosäurereste.

Der auf diese Weise erhaltene Transformant kann, wenn er in einem Nährstoffmedium kultiviert wird, große Mengen GPO in stabiler Weise erzeugen.

Die Kultivierung des Transformanten wird unter den Be­ dingungen durchgeführt, bei denen der Nährstoffbedarf und die physiologischen Eigenschaften des Wirts-Mikro­ organismus in Betracht gezogen werden. In den meisten Fällen wird eine Flüssigkultivierung durchgeführt. Für die Herstellung in industriellem Maßstab ist jedoch eine Kultivierung unter tiefen, aeroben Rührbedingungen vorteilhafter. Eine große Vielfalt von Nährstoffen, wie sie herkömmlicherweise für Bakterienkulturen verwendet werden, kann zur Kultivierung der Wirts-Mikroorganismen eingesetzt werden. Speziell können beliebige, nutzbare Kohlenstoffverbindungen als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Diese umfassen beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melassen und dergl. Als Stickstoffquellen kann man beliebige, zur Verfügung ste­ hende Stickstoffverbindungen einsetzen einschließlich Peptone, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Caseinhydrolysa­ te und dergl. Andere Bestandteile einschließlich Salze, wie Phosphate, Carbonate und Sulfate, sowie Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan, Zink und dergl. sowie bestimmte Typen von Aminosäuren oder Vit­ aminen können verwendet werden, sofern dies zweckmäßig ist. Das Verfahren erfordert nicht den Einsatz von GPO- induzierenden Substanzen, wie Glycerin, Ascorbinsäure, α-Ketosäure und dergl., d. h. Substanzen, die bei dem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von GPO von we­ sentlicher Bedeutung sind.

Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich vari­ iert werden, in dem die Bakterien wachsen und GPO pro­ duzieren. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 20 bis 42°C für Escherichia coli. Die Kultivierungszeit kann in einem gewissen Grad, je nach den Kultivierungsbedingun­ gen, variiert werden. Grundsätzlich wird die Kultivie­ rung zu einem Zeitpunkt beendet, wenn die Ausbeute an GPO das Maximum erreicht. Bei der gewöhnlichen Praxis sind dazu etwa 12 bis 48 Stunden erforderlich. Es ist möglich, den pH des Kulturmediums innerhalb des Berei­ ches zu ändern, in dem die Bakterien wachsen und GPO produzieren können. Der speziell bevorzugte pH-Bereich ist etwa 6 bis 8.

GPO kann für die Verwendung in Form einer Kulturbrühe mit einem Gehalt der Bakterien zur Verfügung gestellt werden. Das in der Kulturbrühe enthaltene GPO wird im allgemeinen jedoch verwendet, nachdem die Zellen durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Maßnahmen abge­ trennt wurden. Falls GPO innerhalb der Zellen enthalten ist, werden die Zellen zunächst mittels Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Die gesammelten Zellen werden anschließend verdaut, und zwar entweder durch mechani­ sche Mittel oder durch enzymatische Mittel unter Verwen­ dung von Lysozym oder dergl. Zu den verdauten Bakterien wird ein Chelatisierungsmittel, wie EDTA und/oder ein ge­ eignetes Surfaktans zugegeben, sofern dies erforderlich ist, um GPO zu solubilisieren und eine Sammlung der GPO als wäßrige Lösung zu ermöglichen.

Die so erhaltenen Lösungen mit einem Gehalt an GPO wer­ den dann durch Eindampfen im Vakuum oder unter Verwen­ dung eines Filters kondensiert und einer Aussalzbehand­ lung mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder dergl. unter­ worfen oder einer fraktionierten Fällung unterzogen unter Verwendung eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder dergl. Das Präzipitat wird in Wasser aufgelöst und die Lösung wird durch eine semi-permeable Membran dialysiert, um niedermolekularge­ wichtige Verunreinigungen zu eliminieren. Als Alterna­ tive kann man das Präzipitat durch Gelfiltration, Chro­ matographie, Ionenaustausch-Chromatographie oder dergl. reinigen und raffinieren. Gereinigte GPO wird aus den GPO enthaltenden Lösungen, die unter Verwendung der obigen verschiedenen Maßnahmen erhalten wurden, durch Vakuumeindampfung, Gefriertrocknung oder dergl. gewonnen.

Die Aktivität der so hergestellten GPO wird gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt:

Reaktionsgemisch:
200 mM PIPES-NaOH-Puffer (pH 6,5)
300 mM L-α-Glycerophosphat
5 E/ml Peroxidase
1,5 mM 4-Aminoantipirin
0,05% Triton X-100
1,0 mM DAOS [3,5-Dimethoxy-N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfo­ propyl)-anilin-natriumsalz].

Gib 1,0 ml der Reaktionsmischung in ein Reagenzglas und stelle die Temperatur auf 37°C ein. Gib 0,02 ml Enzym­ lösung zu und inkubiere 5 min bei 37°C. Beende die Re­ aktion durch Zusatz von 2,0 ml 0,5% SDS und bestimme die Absorption bei 600 nm (As). Wiederhole das Verfah­ ren unter Verwendung von Verdünnungswasser anstelle der Enzymlösung (Ab). Die Aktivität der Substanz zur Erzeu­ gung von 1/µMol Wasserstoffperoxid/min wird als 1 Ein­ heit (E) gemäß der folgenden Gleichung ausgedrückt:

Dabei bedeutet ΔA = As - Ab, 16,6 ist der molekulare Extinktionskoeffizient für den Chinon-Farbstoff (cm²/ µMol) und X bedeutet die Konzentration von GPO in der Enzymlösung (mg/ml).

In der vorliegenden Anmeldung werden Aminosäuren, Pep­ tide, Nucleinsäuren und Nucleinsäure-verwandte Verbin­ dungen nach den herkömmlichen Standards abgekürzt. Ei­ nige Beispiele für die benutzten Abkürzungen sind nach­ stehend aufgeführt. Alle Bezeichnungen der Aminosäuren beziehen sich auf die L-Isomeren.

DNA - Desoxyribonucleinsäure
RNA - Ribonucleinsäure
A - Adenin
T - Thymin
G - Guanin
C - Cytosin
Ala - Alanin
Arg - Arginin
Asn - Asparagin
Asp - Aspartat
Cys - Cystein
Gln - Glutamin
Glu - Glutamat
Gly - Glycin
His - Histidin
Ile - Isoleucin
Leu - Leucin
Lys - Lysin
Met - Methionin
Phe - Phenylalanin
Pro - Prolin
Ser - Serin
Thr - Threonin
Trp - Trpyophan
Typ - Tyrosin
Val - Valin

Im folgenden wird die Erfindung anhand von beispielhaf­ ten Ausführungsformen näher erläutert, ohne daß damit eine Beschränkung der Erfindung beabsichtigt ist.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung von chromosomaler DNA

Eine chromosomale DNA wird hergestellt aus dem Stamm Streptococcus sp. GPOS-53 (FERN BP-2120) unter Anwen­ dung des folgenden Verfahrens. Der Stamm wird unter Schütteln über Nacht bei 37°C in 150 ml Hirn-Herz-Infu­ sionsmedium (hergestellt von Difco Co.; im folgenden als BHI-Medium abgekürzt) kultiviert. Die kultivierte Brühe wird 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen werden in 5 ml einer Lösung sus­ pendiert, enthaltend 10% Saccharose, 50 mM Tris-Chlor­ wasserstoffsäure (pH 8,0) und 50 mM EDTA. Zu der Suspen­ sion gibt man 1 ml Lysozymlösung (10 mg/ml) und inku­ biert das Gemisch 15 min bei 37°C. Dann erfolgt die Zu­ gabe von 1 ml 10% SDS (Natriumdodecylsulfat). Zu der erhaltenen Suspension gibt man ein gleiches Volumen ei­ nes gemischten Lösungsmittels von Chloroform und Phenol (1/1). Das Gemisch wird gerührt und 3 min bei 10 000 U/ min zentrifugiert, um das Wasser und die Lösungsmittel­ schichten zu trennen. Zu der abgetrennten Wasserschicht gibt man langsam ein zweifaches Volumen Ethanol und rührt das Gemisch langsam mit einem Glasstab, um auf die­ se Weise zu bewirken, daß sich die DNA um den Stab wickelt. Die auf diese Weise abgetrennte DNA wird in 10 ml einer Lösung aufgelöst, enthaltend 10 mM Tris-Chlorwas­ serstoffsäure (pH 8,0) und 1 mM EDTA (eine solche Lö­ sung wird im folgenden als TE bezeichnet). Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen des Chloroform-Phenol- Mischlösungsmittels behandelt, und es wird erneut zen­ trifugiert, um die Wasserschicht abzutrennen. Zu die­ ser Lösung wird wiederum ein zweifaches Volumen Etha­ nol zugesetzt, und die DNA wird erneut aus dem Gemisch auf die oben beschriebene Weise abgetrennt. Diese DNA wird dann in 2 ml TE gelöst.

Beispiel 2 Herstellung von pACYC 184-Plasmid-DNA

Escherichia coli pM191, welches pACYC 184 trägt [J. Bacteriol, 134, 1141 (1981); ATCC 37033], wird kulti­ viert durch Schütteln in 1 l BHI-Medium (Difco Co.). So­ bald die Trübung der Brühe einen Wert von OD₆₆₀ = 1,0 erreicht, wird Spectinomycin zugesetzt bis zu einer End­ konzentration von 300 µg/ml. Das Schütteln der Brühe wird mindestens 16 h bei 37°C fortgesetzt. Nach Beendi­ gung der Schüttelkultivierung wird die Brühe 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Plasmid-DNA, die aus den Zellen gesammelt wurde, wird gemäß dem Lysozym-SDS-Verfahren und der Cäsiumchlorid- Äthidiumbromid-Methode [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)] hergestellt.

Beispiel 3 Konstruktion von Plasmid pGPOS1 mit dem L-α-Glycero­ phosphatoxidase-Gen

(1) 2 µl (etwa 0,5 µl Streptococcus sp.chromosomaler DNA, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, 1 µl einer 10fachen Konzentration an M-Puffer [Maniatis et al., Molecular Cloning, 104, Cold Spring Harbor (1982)], 1 µl Hind III (1,0 E/µl; Takara Shuzo Co., Ltd.) und 6 µl Wasser werden vermischt und 1 h bei 37°C inku­ biert, um die Verdauung durchzuführen. Plasmid pACYC 184-DNA (etwa 0,3 µg) wird gesondert verdaut unter Ver­ wendung von Hind III, wobei ein ähnliches Verfahren an­ gewendet wird. Dazu gibt man 0,6 Einheiten alkalische Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.; im folgenden als BAP abgekürzt). Das Gemisch wird 1 h bei 65°C inku­ biert. Die beiden DNA-Lösungen, die auf die beschriebe­ ne Weise mit Hind III verdaut sind, werden zusammenge­ mischt. Zu dieser gemischten DNA-Lösung gibt man 0,1 Volumen 3M Natriumacetat. Anschließend wird die Lösung mit einem gleichen Volumen eines Chloroform- Phenol-Mischlösungsmittels behandelt und zur Abtrennung der Wasserschicht zentrifugiert. Dazu gibt man eine 2fache Menge Ethanol, und die DNA wird mittels Zentri­ fugieren gefällt und im Vakuum getrocknet. Die getrock­ nete DNA wird in 89 µl Wasser gelöst. Dazu gibt man 10 µl einer 10fachen Konzentration Ligationspuffer [0,5 M Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 7,6), 0,1 M MgCl₂, 0,1 M Dithiothreit, 10 mM Spermidin, 10 mM ATP] und 1 µl T4-DNA-Ligase (350 Einheiten; Takara Shuzo Co., Ltd.) und mischt das Ganze. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Diese DNA-Lösung wird mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch behandelt, und die DNA wird mit Ethanol gefällt, im Vakuum getrocknet und in 10 µl TE aufgelöst.

(2) Escherichia coli DH 1 [J.Molecular Biology, 557, (1983); von Genetic Stock Center, Yale University Medical Department] wird in 100 ml BHI-Medium kultiviert, wäh­ rend der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifu­ gieren gesammelt (10 000 U/min, 2 min) und in 40 ml ei­ ner eisgekühlten Lösung suspendiert, die 30 mM Kalium­ acetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM MnCl₂ und 15% Glycerin (pH 5,8) enthält. Die Suspension wird 5 min bei 0°C stehengelassen und die Suspension wird zentri­ fugiert, um den Überstand zu entfernen. Die Zellen wer­ den in 4 ml einer Lösung suspendiert, die 10 mM MOPS- Puffer (Dotite Co.), 75 mM CaCl₂, 10 mM RbCl und 15% Glycerin (pH 6,5) enthält. Die Suspension wird 5 min bei 0°C belassen, um Kompetentzellen zu erhalten.

(3) Zu 200 µl der Zellsuspension gibt man 10 µl der in Stufe (1) hergestellten DNA-Lösung. Nachdem das Gemisch 30 min bei 0°C gestanden hat, gibt man 1 ml BHI- Medium zu und bewahrt das Gemisch 90 min bei 37°C auf. Ein Aliquot der Mischung (0,1 ml) wird auf einer BHI- Agarplatte ausgebreitet, welche 25 µl/ml Chlorampheni­ col enthält. Man kultiviert über Nacht bei 37°C, um Transformanten zu erzeugen. Diese Transformanten werden auf einer GPOS-Mediumplatte repliziert (Zusammensetzung: 5 g Pepton, 2 g Fleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 1 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 0,5 6 MgSO₄, 500 IE Peroxidase, 0,1 g Dianisidin, 15 g Kalium-glycerophosphat, 15 g Agar, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,0) und über Nacht bei 37°C kultiviert.

Etwa 5000 der auf diese Weise hergestellten Transforman­ ten werden untersucht, wobei man 4 Kolonien mit schwarz­ gefärbten (charcoal-colored)-Peripherien ermittelt. Ei­ ner dieser vier Stämme wird als Escherichia coli DHI pGPOS1 bezeichnet (hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; Hinterlegungs-Nr. 9493, FERM-BP-2133). Dieser Stamm wird nach Reinigung in BHI-Nedium über Nacht bei 37°C kultiviert, um dessen GPO-Produktivität gemäß dem oben beschriebenen Meßverfahren zur Bestimmung der GPO-Akti­ vität zu messen. Man findet eine GPO-Aktivität von 0,5 E/ml.

Die in dem Stamm enthaltene Plasmid-DNA wird nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 abgetrennt. Das Plasmid, welches das GPO-Gen enthält und das pACYC 184- Gen, wird als pGPOS1 bezeichnet.

Beispiel 4 Kartierung (Mapping) von pGPOS1 und Bestimmung der Basensequenz des GPO-Gens

pGPOS1-Plasmid DNA wird aus dem Escherichia coli DHI pGPOS1-Stamm auf gleiche Weise hergestellt, wie sie für die Herstellung von pACYC184 angewendet wurde. Ein Schnittplan der so erhaltenen pGPOS1-Plasmid-DNA wird hergestellt unter Verwendung der Endonucleasen BamH I, Bgl II, Cta I, EcoR I, Pst I, Sal I und Xho I (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Ergebnisse sind in Fig. 1 aufgeführt. Die Basensequenz der das GPO-Gen auf­ weisenden DNA wird mittels der Didesoxy-Methode [Science, 214, 1205-1210 (1981)] unter Verwendung eines M13-Phagen bestimmt. Die Basensequenz des GPO-Gens ist derart, daß in der Formel (I) ATG für X und TAA für Y steht. Die aus der Basensequenz bestimmte Aminosäure­ sequenz ist derart, daß in der Formel (II) Met für A und -OH für B steht.

Beispiel 5 Herstellung von L-α-Glycerophosphatoxidase unter Verwendung des Stamms Escherichia coli DHI pGPOS1

Escherichia coli DHI pGPOS1 wird in 20 l BHI-Medium un­ ter Verwendung eines Flaschenfermenters 18 h bei 37°C kultiviert. Die so erzeugten Zellen werden durch Zentri­ fugieren bei 5000 U/min während 10 min gesammelt,mit 2 l physiologischer Salzlösung gewaschen und in 2 l ei­ nes 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert. Zu die­ ser Suspension gibt man Lysozym, EDTA-2Na und Triton X-100 in solchen Mengen zu, daß die jeweiligen Konzen­ trationen in der Mischung 1 mg/ml, 2 mM bzw. 0,1% be­ tragen. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C wird das Gemisch 10 min bei 5000 U/min zentrifugiert, um die überstehende Lösung abzutrennen.

Die überstehende Lösung (1,9 l) wird einer Aussalzbe­ handlung mit Ammoniumsulfat (40-60%) unterworfen. Das Präzipitat wird gesammelt. Dieses Präzipitat wird in 200 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, enthaltend 10 mM FAD), gelöst. Die Lösung wird einer Entsalzungsbehand­ lung über Sephadex G-25 unterzogen. Aktive Fraktionen werden mittels Ionenaustausch-Chromatographie unter Ver­ wendung von DEAE-Sepharose CL-6B gesammelt, entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,395 g L-α-Glycerophos­ phatoxidase in Pulverform (40 E/mg, Ausbeute 27%).

Die physikochemischen Eigenschaften der so erhaltenen L-α-Glycerophosphatoxidase sind wie folgt:

• (a) Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion L-α-Glycerophosphat + O₂ → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂.
• (b) Substratspezifität: zeigt Substratspezifität für L-α-Glycerophosphat.
• (c) Optimaler pH: GOP wird bei jedem der folgen­ den pH-Bereiche umgesetzt: Glycin-Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 2,0-5,0); Essigsäure-Puffer (pH 4,0-6,0); 3,3-Dimethylglutaminsäure-NaOH-Puffer (pH 5,0-7,0); Phosphat-Puffer (pH 6,0-8,0) und Tris-Chlorwasserstoff­ säure-Puffer (pH 7,0-9,0). Man stellt fest, daß der op­ timale pH im Bereich von 5,5 bis 7,5 liegt.
• (d) pH-Stabilität: Die Enzymlösungen (5,0 E/ml) werden hergestellt unter Verwendung von 100 mM Essig­ säure-(pH 4,0-6,0), 100 mM 3,3-Dimethylglutaminsäure- NaOH-(pH 5,0-7,0), 100 mM Phosphat-(pH 6,0-8,0) und 100 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 7,0-9,0), alle bei 100 mM. Jede Lösung wird 5 min bei 50°C inku­ biert, um die Restaktivität des Enzyms zu bestimmen. Man findet, daß das Enzym bei einem pH von 6,0 bis 8,0 stabil ist.
• (e) Km-Wert: 5,5 ± 0,5 mM(für L-α-Glycerophos­ phat).
• (f) Isoelektrischer Punkt: 4,0 ± 0,5 (bestimmt durch eine fokussierende Elektrophorese unter Verwen­ dung eines Ampholin-Trägers).
• (g) Thermische Stabilität: Die unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) hergestellten Enzym­ lösungen (5,0 E/ml) werden 5 min bei verschiedenen Tem­ peraturen inkubiert. Die Restaktivität jeder Lösung wird bestimmt. Man findet, daß das Enzym bis zu 40°C 100% Aktivität zeigt.
• (i) Langzeit-Enzymstabilität: Enzymlösungen (5,0 E/ml) werden unter Verwendung von 0,1 M MES-NaOH- Puffer (pH 6,5) hergestellt und bei 37°C während unter­ schiedlicher Zeitspannen inkubiert. Bei der Messung der Restaktivität stellt man fest, daß das Enzym nach 24 h mindestens 90% Aktivität aufweist. Diese Stabilität in Lösung repräsentiert die Stabilität des Enzyms unter Be­ dingungen, wie sie bei der tatsächlichen klinischen Dia­ gnose auftreten, und zeigt, daß das Enzym äußerst brauchbar ist.

Die Verwendung der DNA und des erfindungsgemäßen Trans­ formanten gewährleistet eine effiziente Produktion von L-α-Glycerophosphatoxidase, ohne daß es erforderlich ist, GPO-induzierende Substanzen, wie Glycerin, Ascor­ binsäure oder dergl., zuzusetzen. Darüber hinaus hat die Erfindung zur Aufklärung der Merkmale des GPO-Gens geführt.

Claims (14)

1. DNA mit einer Basensequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids einer L-α-Glycerophosphatoxidase codiert, wo­ bei das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz aufweist, be­ ginnend mit dem N-Ende: wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoff­ atom steht und B einen Aminosäurerest oder eine -OH- Gruppe bedeutet.

2. DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die L-α-Glycerophosphatoxidase die folgenden physi­ ko-chemischen Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion L-α-Glycerophosphat + O₂ → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂;
• (b) Substratspezifität: zeigt Substratspezifi­ tät für L-α-Glycerophosphat;
• (c) optimaler pH: 5,5 bis 7,5;
• (d) pH-Stabilität: stabil bei pH 6,0 bis 8,0.

3. DNA gemäß Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA, beginnend am 5′-Ende, die folgende Basen­ sequenz aufweist: wobei X für ein Codon steht, das nicht TAA, TAG oder TGA ist, oder für eine 5′-Endgruppe und Y ein Codon oder eine 3′-Endgruppe wiedergibt.

4. Transformant mit einer DNA, welche in bezug auf den Wirts-Mikroorganismus fremd ist und eine Basensequenz gemäß Anspruch 1 umfaßt.

5. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die L-α-Glycerophosphatoxidase die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften aufweist

• (a) Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion L-α-Glycerophosphat + O₂ → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂;
• (b) Substrat-Spezifität: zeigt Substratspezifi­ tät für L-α-Glycerophosphat;
• (c) optimaler pH: 5,5 bis 7,5;
• (d) pH-Stabilität: stabil bei pH 6,0 bis 8,0.

6. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß das Polypeptid, beginnend am N-Ende, die folgende Aminosäuresequenz aufweist: wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoff­ atom steht und B einen Aminosäurerest oder eine -OH- Gruppe bedeutet.

7. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die DNA, beginnend am 5′-Ende, die folgende Basen­ sequenz aufweist: wobei X für ein Codon mit Ausnahme von TAA, TAG oder TGA oder eine 5′-Endgruppe steht und Y ein Codon oder eine 3′-Endgruppe bedeutet.

8. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er zur Gattung Escherichia coli gehört.

9. Polypeptid einer L-α-Glycerophosphatoxidase mit der folgenden Aminosäuresequenz, beginnend am N-Ende: wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoff­ atom steht und B einen Aminosäurerest oder eine -OH- Gruppe wiedergibt.

10. L-α-Glycerophosphatoxidase mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

• (a) Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion L-α-Glycerophosphat + O₂ → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂;
• (b) Substratspezifität: zeigt Substratspezifi­ tät für L-α-Glycerophosphat;
• (c) optimaler pH: 5,5 bis 7,5;
• (d) pH-Stabilität: stabil bei pH 6,0 bis 8,0;
• (e) Km-Wert: 5,5 ± 0,5 mM (für L-α-Glycerophos­ phat);
• (f) isoelektrischer Punkt: pH 4,0 ± 0,5;
• (g) Molekulargewicht: 195 000 ± 10 000 (basie­ rend auf der Gelfiltrationsmethode);
• (h) Wärmestabilität: stabil bei Temperaturen unter 40°C;
• (i) Langzeit-Enzymstabilität: behält eine Rest­ aktivität von 90% oder mehr während 24 Stunden bei, wenn die Substanz in MES-NaOH-Puffer (pH 6,5) bei 37°C belassen wird.

11. Verfahren zur Herstellung von L-α-Glycerophosphat­ oxidase, umfassend
die Kultivierung des Transformanten, wie er in An­ spruch 4 definiert ist, zur Exprimierung der genetischen Information der DNA, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, und
Sammlung des Polypeptids, welches einen Bestandteil der L-α-Glycerophosphatoxidase darstellt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die L-α-Glyceropphosphatoxidase die folgenden physiko- chemischen Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion L-α-Glycerophosphat + O₂ → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂;
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifität für L-α-Glycerophosphat;
• (c) optimaler pH: 5,5 bis 7,5;
• (d) pH-Stabilität: stabil bei pH 6,0 bis 8.0.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet durch die DNA eines L-α-Glycerophosphatoxidase erzeugenden Mikroorga­ nismus, der zur Gattung Streptococcus gehört.

14. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirts-Bakterium ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia coli ist.