DE3931716A1 - Verbesserte rekombinante dna, eine sie enthaltende transformante und ein verfahren zur herstellung von waermestabiler glucosedehydrogenase und ihre verwendung - Google Patents
Verbesserte rekombinante dna, eine sie enthaltende transformante und ein verfahren zur herstellung von waermestabiler glucosedehydrogenase und ihre verwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine verbesserte
rekombinante DNA, die in der Lage ist, in Escherichia
coli repliziert zu werden, in der eine verbesserte DNA,
die durch Substituierung einer an einer spezifischen
Position in einer Aminosäuresequenz der DNA, die für
Glucosedehydrogenase (im folgenden "GDH" bezeichnet)
aus Bacillus megaterium codiert, lokalisierten
Aminosäure mit einer anderen Aminosäure erhalten wird,
in einen Escherichia coli-DNA-Aufnahme-Vektor
integriert wurde. Sie betrifft weiterhin auch eine
diese enthaltende Transformante sowie ein Verfahren
zur Herstellung einer wärmestabilen GDH unter ihrer
Verwendung.
GDH (EC 1.1.1.47) ist ein wichtiges Enzym, das in
Glucosenachweissystemen auf dem Gebiet der klinischen
Tests und Nahrungsmittelindustrie Verwendung findet.
Bisher sind als Mikroorganismen, die in der Lage sind,
GDH zu produzieren, Bakterien der Art Bacillus, wie
Bacillus megaterium und Bacillus cereus (japanische
Patentoffenlegung Nr. Sho 53-1 37 199), bekannt.
Um GDH als glucose-quantifizierendes Enzym zu
verwenden, hat man jedoch nach einer GDH mit besserer
Stabilität gesucht, die mit einem geringeren
Kostenaufwand herstellbar ist.
Vor kurzem wurde im European Journal of Biochemistry,
Band 174, S. 485-490 (1988), ein Verfahren zur
Herstellung von GDH unter Verwendung einer
Transformante offenbart, in der ein GDH-Gen aus
Bacillus megaterium in Escherichia coli integriert
wurde.
Es wird gelehrt, daß das GDH-Gen aus Bacillus
megaterium mehrfach existiert. Die Transformante wurde
erhalten durch ihre Verwendung, um GDH herzustellen,
jedoch ist der hierfür verwendete Vektor für die
Massenproduktion von GDH nicht geeignet, und weiterhin
wurde keinerlei Verbesserung der Stabilisierung von GDH
erreicht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine
wärmestabile GDH bei geringen Kosten in einer großen
Menge durch Kultivierung der die verbesserte
rekombinante DNA, die in Escherichia coli replizierbar
ist und in der eine verbesserte DNA, die durch
Substituierung einer Aminosäure, die an einer
spezifischen Position in der gezeigten
Aminosäuresequenz der DNA, die für GDH aus Bacillus
megaterium codiert, lokalisiert ist, mit einer anderen
Aminosäure erhalten wurde, in einen Escherichia coli-
DNA-Aufnahme-Vektor integriert wurde, enthaltende
Transformanten zur Verfügung zu stellen.
Das erste Ziel, nämlich eine kostengünstigere
Herstellung von GDH zu erreichen, haben die
vorliegenden Erfinder durch eine hohe Produktion von
GDH durch Integrierung eines GDH-Gens aus Bacillus
megaterium in den starken Expressionsvektor PKK 223-3
und Kultivierung dieser Transformante in einer
Nährlösung erreicht.
Danach wurde, als Ergebnis weiterer Untersuchung, eine
Transformante, in der eine verbesserte DNA, die durch
Substituierung eine Aminosäure, die an einer
spezifischen Position in einer Aminosäuresequenz der
DNA, die für GDH aus Bacillus megaterium codiert, mit
einer anderen Aminosäure erhalten wurde, in Escherichia
coli eingebracht wurde, in einer Nährlösung kultiviert.
Als ein Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder
erfolgreich GDH mit einer besseren Wärmestabilität als
die herkömmliche GDH in einer großen Menge in der
Nährlösung hergestellt. Die vorliegende Erfindung wurde
auf diese Weise vollendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine verbesserte,
in Escherichia coli replizierbare rekombinante DNA zur
Verfügung gestellt, in der eine verbesserte DNA, die
durch Substituierung einer Aminosäure, die an einer
spezifischen Position in der folgenden
Aminosäuresequenz der DNA, die für Glucosedehydrogenase
aus Bacillus megaterium codiert, lokalisiert ist, mit
einer anderen Aminosäure erhalten wurde, in einen
Escherichia coli-Aufnahmevektor eingebracht wurde.
(worin A Ser oder Ala ist, X ist Asp oder Glu, Y ist
Ala oder Ser und B ist Leu oder Met).
Fig. 1 zeigt eine Restriktionsendonucleasenkarte des
Plasmids pGDA1;
Fig. 2 zeigt eine DNA-Aminosäuresequenz der GDH aus
Bacillus megaterium IWG3; und
Fig. 3 zeigt eine Restriktionsendonucleasenkarte des
Plasmids pGDA2.
Um eine verbesserte rekombinante DNA der GDH aus
Bacillus megaterium herzustellen, ist es notwendig,
zuerst eine rekombinante DNA, die für die GDH kodiert,
herzustellen.
Als hierfür verwendbare Stämme können alle Stämme
verwendet werden, solange sie zu Bacillus megaterium
gehören, die in der Lage sind, GDH zu produzieren,
jedoch ist es bevorzugt, Bacillus megaterium IAM1030 und
Bacillus megaterium IWG3 aus Erde isoliert zu
verwenden.
Von den obengenannten wurde der aus Erde erhaltene
Stamm Bacillus megaterium IWG3 auf die folgende Weise
identifiziert.
Tests für die bakteriellen Eigenschaften waren
gegründet auf The Genus Bacillus (1973) von Ruth E.
Gordon, und die Klassifizierung wurde in Übereinstimmung
mit Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.
Ausgabe und dem vorgenannten The Genus Bacillus
durchgeführt.
- (1) Bazillen mit einer Zellgröße von 1,1 bis 1,6 µ×3,0
bis 5,0 µ. Das Innere der Zellen war granulär, wenn
die auf einem Glucosenähragar gewachsenen Zellen mit
Fuchsin gefärbt wurden.
(2) Keine Bewegung.
(3) Sporen wurden mit einer Größe von 1,0 bis 1,3 µ×2,0 bis 2,5 µ gebildet und waren eiförmig oder säulenförmig. Sporandia schwellen nicht aus. Die Sporen werden im zentralen Teil oder in dem Teil nahe der Enden gebildet.
(4) Gramfärbung: positiv.
- (1) Reduktion von Nitrat: negativ.
(2) Denitrifikation: negativ.
(3) VP-Test: negativ. Der pH der Nährlösung ist 4,6 bis 5,0 in der Kultur für 7 Tage.
(4) Indolbildung: negativ.
(5) Hydrolyse von Stärke: negativ.
(6) Verwertung von Citrat: positiv.
(7) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: sowohl Ammoniumsalze als auch Nitrate werden verwertet.
(8) Pigmentbildung: ein braunes wasserlösliches Pigment wird in einem Tyrosinmedium gebildet.
(9) Urease: schwach positiv.
(10) Katalase: positiv.
(11) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob.
(12) Bildung von Säure und Gas aus Sacchariden: Säure wird gebildet aus Arabinose, Xylose, Glucose, Fruktose, Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, Mannitol, Inositol, Glycerin und Stärke, jedoch wird Gas nicht gebildet. Weder Säure noch Gas wird aus Mannose und Sorbitol gebildet.
(13) Wachstum in 7% NaCl-Medium: nicht gefunden.
(14) Wachstum bei 45°C: Wachsen.
(15) Wachstum bei 65°C: nicht gefunden.
(16) Wachstum in Sabourauddextrosemedium: Wachsen.
(17) Deaminierung von Phenylalanin: positiv.
(18) Verflüssigung von Gelatine: positiv.
(19) Abbau von Kasein: positiv.
(20) Abbau von Tyrosin: positiv.
(21) York-Reaktion: negativ.
Unter Bezugnahme auf die obigen Eigenschaften findet
man in Übereinstimmung mit der Klassifizierungsmethode
in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8.
Ausgabe), daß der vorliegende Stamm unter dem Genus
Bacillus klassifiziert werden muß, da es ein
gram-positives aerobes Bacillus ist und Sporen bildet.
Die Spezies wurde als Bacillus megaterium wegen der
Eigenschaften, daß i) die nährende Zellgröße 1,0 bis
1,6 µ×3,5 bis 5,0 µ ist und das Innere der Zellen in
dem Glucosenähragar granulär ist, ii) Sporandia nicht
ausschwellen und Sporen in dem zentralen Teil oder in
dem Teil nahe der Enden gebildet werden, iii) Säure aus
Glucose gebildet wird und der VP-Test negativ ist, iv)
kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen gefunden
wird, v) Wachstum in Sabourauddextrosemedium gefunden
wird, vi) Säure von Arabinose, Xylose und Mannitol
gebildet wird und vii) die Yorkreaktion negativ ist,
identifiziert.
Die vorliegenden Erfinder haben den vorliegenden Stamm
als Bacillus megaterium IWG3 bezeichnet.
Bacillus megatorium IWG3 wurde in 2×TY-Nährlösung
inokuliert. Nach Beendigung der Kultur wurden die
Bakterien gesammelt und zerdrückt, gefolgt von einer
zentrifugalen Trennung. Der erhaltene Überstand wurde
entsalzt und dann konzentriert, gefolgt von einer
Gefriertrocknung. Das erhaltene GDH-Rohenzympulver (105 µg)
wurde in 15 ml einer 10% Glycerin enthaltenden
Imidazolpufferlösung (20 mM, pH 6,5) gelöst und an
DEAE-Sephadex A-50 adsorbiert, gefolgt von einer
Elution unter Verwendung eines
Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten (0,1 M-0,5 M),
um die aktiven Fraktionen zu sammeln, die entsalzt
und konzentriert wurden. Danach wurde die molekulare
Fraktionierung mit Hilfe der hochauflösenden
Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von
TSK-Gel DEAE 3 SW als Träger durchgeführt, und
Adsorption und Elution wurden weiterhin durch
hochauflösende Flüssigkeitschromatographie unter
Verwendung von TSK-Gel G3000 SW als Träger
durchgeführt, um eine elektrophoretisch einheitlich
aktive Fraktion zu erhalten (etwa 5 mg als
Proteingewicht).
Die Amino-terminalen Gruppen der Aminosäuresequenz des
gemäß dem obigen Verfahren 1) erhaltenen gereinigten
Enzymproteins wurde unter Verwendung eine
Peptidsequenzierers Gas Phase 470A, hergestellt von ABI
(Applied Baiosystem Inc.), analysiert, auf diese Weise
wurde die Sequenz von 29 Aminosäurenrestgruppen vom
N-terminalen Ende bestimmt. Die so erhaltene
Aminogruppe-terminale Aminosäuresequenz ist unten
gezeigt.
Anmerkung: Der unterstrichene Teil zeigt die Sequenz,
die für die Synthese von Proben verwendet wurde.
Es wurde eine Sequenz auf der einen Seite der
oben gezeigten Aminosäuresequenz ausgewählt, die durch
Unterstreichen gezeigt ist. Unter den möglichen
DNA-Basensequenzen auf Genen, die von diesen
Aminosäuresequenzen ableitbar sind, wurde eine
DNA-Basensequenz ausgewählt unter Berücksichtigung der
Codon-Verwendungsfrequenz von Bacillus subtilis, und
auf diese Weise wurde die Basensequenz der DNA-Probe
mit 38 Nukleotiden, wie unten gezeigt, bestimmt.
Die Synthese der DNA wurde unter Verwendung eines
Synthetisierers, Modell 381A, hergestellt von ABI,
ausgeführt.
Die Gesamt-DNA wurde aus Bacillus megaterium IWG3
extrahiert und gereinigt, in Übereinstimmung mit der
Saito und Miura-Methode (Biochim. Biophys. Acta.,
Bd. 72, 619 [1963]). 240 µg der erhaltenen DNA wurde
genommen und mit jeweils 150 Units der
Restriktionsendonukleasen EcoRI und BglII bei 37°C für
3 Stunden verdaut. Die gesamte Reaktionsmischung wurde
auf einem 1%igen Agarosegel einer Elektrophorese
unterworfen, der Teil der darin enthaltenen DNA mit
einer Größe von 3 bis 4 kb wurde ausgeschnitten und die
DNA-Fragmente aus dem Gel durch Elektroextraktion
eluiert. Im folgenden wurde das Eluat schrittweise
unter Verwendung von äquimolaren Mengen von Phenol und
Phenol-Chlorophorm extrahiert und die DNA durch Zugabe
von Ethanol zu der erhaltenen wäßrigen Phase gefällt,
die danach in 100 µl TE-Pufferlösung gelöst wurde.
Es wurde der Vektor pBR322 verwendet, dabei wurde
lineare Vektor-DNA, die aus einem vollständigen Verdau
von 20 µg pBR322 mit EcoRI-BamHI erhalten und in 200 µl
TE-Pufferlösung gelöst wurde, für die Insertion des
DNA-Fragments verwendet. Die Ligation der im obigen
Schritt 4) erhaltenen DNA-Fragmente mit der linearen
Vektor-DNA wurde durch Mischen der im Schritt 4)
erhaltenen Lösung und der linearen Vektor-DNA-Lösung in
einem 10 : 1-Verhältnis und Reaktion mit T4-DNA-Ligase
bei 14°C über Nacht ausgeführt.
Die in dem obigen Schritt 5) erhaltene rekombinante DNA
wurde in den Wirt Escherichia coli C600 durch
Transformation eingebracht und Kolonien, die auf einem
L-Nähr-Agarmedium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt,
gewachsen waren, wurden gesammelt. Die so erhaltenen
Kolonien wurden als DNA-Bibliothek von Bacillus
megaterium IWG3 bezeichnet.
Die in dem obigen Schritt 3) erhaltenen DNA-Proben
wurden jeweils unter Verwendung von
T4-Polynucleotidkinase und γ-³²-P-ATP markiert, in
Übereinstimmung mit dem Verfahren von Ingria et al.
(Nucleic Acids Research, Bd. 9, 1627-1642 [1982]).
Danach wurden die in dem obigen Schritt 6) erhaltenen
Escherichia coli zu Kolonien auf einem L-Nähr-Agarmedium,
das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, wachsen
gelassen, die dann durch Replikaplattierung auf eine
Amersham Nylonmembran überführt, gefolgt von
Lysozymbakteriolyse, alkalischer DNA-Denaturierung,
Neutralisierung unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure
und danach Hybridisierung mit der obigen Probe. Die
Hybridisierung wurde ausgeführt durch
Vor-Hybridisierung unter Verwendung von 6fach
konzentriertem SSC (0,15 M NaCl, 0,15 M Natriumcitrat,
pH 7,0), einer fünffach konzentrierten Denhardt-Lösung
(0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02%
Rinderserumalbumin), 0,5% SDS, 20 µg/ml
(Endkonzentration) von Rinderthymus-DNA und etwa 5×10⁵ cpm/ml
der markierten DNA-Probe bei 45°C für drei
Stunden, und die Hybridisierung wurde danach bei 45°C
über Nacht durchgeführt. Danach wurde die Nylonmembran
zweimal bei 45°C unter Verwendung von 5fach
konzentriertem SSC, danach zweimal bei 45°C unter
Verwendung von 5fach konzentriertem SSC (enthaltend
0,1% SDS) und zweimal unter Verwendung von 4fach
konzentriertem SSC gewaschen. Danach wurde die
Nylonmembran getrocknet und einer Autoradiographie
unterworfen (Bedingung: -80°C, über Nacht). Als
Ergebnis wurden drei Kolonien gefunden, die ein
positives Hybridisierungssignal lieferten. Es wurde nun
eine Flüssigkultur von den positiven Kolonien
durchgeführt, gefolgt von der Methode nach Birnboim et al.
(Nucleic Acids Research, Bd. 7, 1513-1523 (1979]),
um die Plasmid-DNA zu erhalten. Das erhaltene Plasmid
wurde unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen
EcoRI und SalI geschnitten und einer Agarose-
Gel-Elektrophorese unterworfen, gefolgt von einer
Southern-Hybridisierung (Journal of Molecular Biology,
Bd. 98, 503-517 [1975]) mit der markierten DNA. Als
Ergebnis wurde gefunden, daß die DNA-Probe stark mit
einem etwa 3,6 kb durch den Verdau mit EcoRI und SalI
hergestellten DNA-Fragment hybridisiert. Es zeigte
sich, daß die drei getrennten Stämme das gleiche
Plasmid enthielten, dieses Plasmid wurde mit pGDA1 als
Kandidat für den GDH-Klon bezeichnet.
Die DNA-Basensequenz wurde von dem 930 Basenpaare
langen DNA-Fragment, das von dem Plasmid pGDA1 durch
Verdau mit EcoRI und Sau3AI erhalten wurde, nach der
Methode von Sanger et al. (Proceedings of National
Academy Science, USA, Bd. 74, 5463-5467 [1977])
bestimmt. Als Ergebnis wurde eine Basensequenz, die für
eine Aminosäuresequenz, die vollständig mit der
Aminogruppe-terminalen Aminosäuresequenz der in dem
obigen Schritt 2) erhaltenen GDH übereinstimmt,
gefunden, und es hat sich gezeigt, daß dieses Fragment
ein Teil des GDH-Gens enthält. Bezüglich des Plasmids
pGDA1 wurde die in Fig. 1 gezeigte
Restriktionsendonucleasenkarte, basierend auf den
Ergebnissen des Verdaus mit Restriktionsendonucleasen,
erstellt. Es wurde die DNA-Basensequenz bestimmt, die
in dem Teil in Stromabwärtsrichtung von der schon
bekannten Basensequenz lokalisiert ist, in dem Gene
gelesen werden. Als Ergebnis wurde gefunden, daß eine
Basensequenz, die für ein Protein aus 261 Aminosäuren
codiert, existiert, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Von den
vorgenannten Ergebnissen wurde angenommen, daß das
Strukturgen der GDH vollständig in dem DNA-Fragment aus
Bacillus megaterium IWG3, vorliegend in dem Plasmid
pGDA1, enthalten ist.
Um die klonierten GDH-Gene unter Verwendung von
Escherichia coli zur Expression zu bringen, wurde die
Expression der Gene von dem DNA-Fragment aus
Bacillus megaterium IWG3, vorliegend in dem Plasmid
pGDA1, entsprechend der folgenden Schritte in Angriff
genommen.
Unter Verwendung von EcoRI und PvuII wurden 10 µg des
Plasmids pGDA1 geschnitten und einer 1%igen
Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um ein Fragment
von etwa 1,5 kb zu erhalten. Zu 1 µg des erhaltenen
Fragments wurden dATP, dGTP, dCTP und dTTP, jeweils in
einer Endkonzentration von 1 mM und 4 Units von
DNA-Polymerase Klenow-Fragment zugegeben und die
Reaktion bei 30°C für 20 Minuten in 20 µl einer
Reaktionslösung, umfassend eine 10 mM
Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5),
7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol, durchgeführt. Ein
DNA-Fragment mit stumpfen Enden an jeweils beiden Enden
wurde auf diese Weise gereinigt und zu etwa 0,5 µg
desselben ein PstI-Linker und 10 Units T4 DNA-Ligase
zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei 14°C über
Nacht in 20 µl einer Reaktionslösung, enthaltend eine
66 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5),
5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP. Nach der
Reaktion wurde das DNA-Fragment gereinigt und mit BanII
geschnitten. Danach wurde zu dem erhaltenen Fragment 1 U
Mungbohnenuclease zugegeben, gefolgt von einer
Reaktion bei 30°C für 30 Minuten in 50 µl einer
Reaktionslösung (pH 4,5), enthaltend 40 mM
Natriumacetat, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl₂ und 10%
Glycerin. Als Ergebnis dieses Arbeitsschrittes wurden
die kohäsiven Enden von BanII zu stumpfen Enden
gemacht, und ein EcoRI-Linker wurde weiterhin in der
gleichen, wie oben beschriebenen Art damit verknüpft.
Nach der Reaktion wurde das DNA-Fragment gereinigt und
unter Verwendung von EcoRI und PstI an seinen beiden
Enden geschnitten und als EcoRI-PstI-Fragment
aufgefangen.
Der in dem vorliegenden Beispiel verwendete
Expressionsvektor pKK223-3 ist von Brosius, J., et al.
(Proceedings of National Academy Science, USA, Bd. 81,
6229-6933 [1984]) beschrieben und hat als Promotor
einen Tac-Promotor.
Dieser Expressionsvektor pKK223-3 wurde unter
Verwendung der Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI
geschnitten und danach mit dem erhaltenen
EcoRI-PstI-Fragment gemischt, um die Ligasereaktion
unter Verwendung von T4 DNA-Ligase auszuführen. Mit der
Reaktionsmischung wurde die Transformation von
Escherichia coli JM 105 ausgeführt und Kolonien durch
Wachsen auf einem L-Nähr-Agar-Medium, das Ampicillin
(50 µg/ml) und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) enthielt, selektioniert.
Um die Expression von GDH für die erhaltenen Kolonien
zu bestätigen, wurde eine Kolonieuntersuchung unter
Verwendung eines Farbstoff-Kupplungsverfahrens
durchgeführt. Die Kolonien wurden auf ein
Filterpapier replika-plattiert, und dann wurde eine
Lysozymlösung (eine 50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung
(pH 7,5), 10 mM EDTA, 1 mg/ml Lysozym) zu
den Kolonien auf dem Filterpapier zugegeben. Die
erhaltenen Kolonien wurden bei einer Temperatur von
30°C für 20 Minuten gehalten, gefolgt von der Zugabe
einer 1%igen Tritonlösung, und wurden für 5 Minuten bei
Raumtemperatur stehengelassen. Eine Pufferlösung für
die Wärmebehandlung (eine 50 mM Phosphatpufferlösung
(pH 6,5), 2 M NaCl, 50 mM EDTA) wurde weiterhin
zugegeben, um dann eine Wärmebehandlung bei 60°C für 20
Minuten durchzuführen.
Danach wurde eine Substratlösung (20 mM
Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 8,0), 1 M
NaCl, 100 mM Glucose, 0,5 mM Phenazinethosulfat (PES),
0,5 mM 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2-yl-2,5-
diphenyltetrazolium-bromid (MTT), 50 µM NAD) wurden
zugegeben, und die Mischung wurde bei 37°C für 5 Minuten
im Dunklen stehengelassen. Als Kontrolle wurde eine
Lösung verwendet, die der obigen Substratlösung
entsprach, außer, daß sie keine Glucose enthielt. Die
Reaktion wurde durch Zugabe einer 10%igen
Essigsäurelösung gestoppt. Bei der Kolonienselektion
wurden blau-violett gewordene Kolonien ausgewählt. Als
Ergebnis der Kolonienuntersuchung wurden eine Anzahl
positiver Kolonien erhalten, und die Plasmid-DNA wurde
von einem Stamm unter ihnen extrahiert. Der erhaltene
Extrakt wurde mit pGDA2 bezeichnet, und die erwartete
Struktur (Fig. 3) wurde durch Verdau mit
Restriktionsendonucleasen bestätigt.
Das vorliegende Plasmid wurde in Escherichia coli
JM105 durch Transformation eingebracht, um einen
GDH-Hochexpressionsstamm, Escherichia coli JM105/pGDA2
zu erhalten.
Der vorliegende Stamm wurde im Fermentations-Research
Institut, Agency of Industrial Science and Technology
unter FERM-BP Nr. 2584 hinterlegt.
Unter Verwendung von Bacillus megaterium IAM1030 statt
Bacillus megaterium IWG3 wurden die gleichen
Verfahrensschritte von 1) bis 9) für die Herstellung
der Transformante 1) wiederholt, um die
Hoch-GDH-Expressions-Plasmid-DNA zu extrahieren, die
als pGDA3 bezeichnet wurde. Danach wurde die
Transformation mit dem vorliegenden Plasmid ausgeführt,
um GDH Hochexpressions-Escherichia coli JM 105/pGDA3
zu erhalten.
Die Aminosäuresequenz der aus Bacillus megaterium
IAM1030 erhaltenen GDH ergab im Vergleich zu der in
Fig. 2 gezeigten DNA-Aminosäuresequenz der GDH aus
Bacillus megaterium IGW3 nur eine Aminosäuresequenz,
in der Serin an Position 22 des letzteren N-terminalen
Endes mit Alanin, die Asparaginsäure an Position 43 mit
Glutaminsäure, Alanin an Position 79 mit Serin und
Leucin an Position 95 mit Methionin substituiert war.
Die Aminosäuresequenz der DNA, die für GDH aus
Bacillus megaterium codiert, ist im folgenden
zusammengefaßt:
(worin A Ser oder Ala ist, X ist Asp oder Glu, Y ist
Ala oder Ser und B ist Leu oder Met).
Das obige Plasmid pGDA2 oder pGDA3 wurde unter
Verwendung der Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI
geschnitten, um ein GDH-Genfragment von etwa 0,9 kb zu
erhalten, gefolgt von Klonierung in den M13 Phagen mp18
oder mp19. Von der erhaltenen Rekombinante wurde
Einzelstrang-DNA mit den üblichen Methoden hergestellt.
In 50 µl einer 0,5 M Acetatpufferlösung (pH 4,3) wurden
40 µg der im obigen Schritt erhaltenen einzelsträngigen
DNA gelöst und 50 µl einer 2 M Natriumnitritlösung zu
der erhaltenen Lösung zugegeben und bei 20°C für 1 bis
3 Stunden die Behandlung durchgeführt.
In ähnlicher Weise wurde statt der Natriumnitritlösung
100 µl einer 12 M Ameisensäurelösung zugegeben, um die
Behandlung bei 20°C für 5 bis 20 Minuten durchzuführen.
Weiterhin wurden 100 µl einer 60%igen Hydrazinlösung
zugegeben, um gleichzeitig die Behandlung bei 20°C für
5 bis 20 Minuten durchzuführen. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von 100 µl einer 2,5 M Acetatpufferlösung
(pH 7,0), enthaltend 20 µg tRNA, zu jeder der obigen
Behandlungslösungen gestoppt. Danach wurden 200 µl
destilliertes Wasser zu jeder der Reaktionsmischung
zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 ml eiskaltem
Ethanol zur Fällung der variations-behandelten DNA, die
weiterhin dreimal mit eiskaltem 70%igem wäßrigen
Ethanol gewaschen wurde.
Zu 10 µg der in dem vorhergehenden Schritt erhaltenen
variations-behandelten DNA wurden 10 µl einer zehnfach
konzentrierten, für die reverse Transcriptase
verwendeten Pufferlösung (eine 70 mM
Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5), 70 mM
Magnesiumchlorid, 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM
Dithiothreitol), 2 µl einer Lösung, enthaltend 20 pmol
eines Primers, und 74 µl destilliertes Wasser zugegeben.
Die Mischung wurde bei einer Temperatur von 85°C für 5
Minuten und dann bei einer Temperatur von 40°C für 15
Minuten gehalten, gefolgt von der Zugabe von 13 µl
einer 10 mM dNTP-Lösung und 1 µl (20 u) reverser
Transcriptase, um die Reaktion bei 37°C durchzuführen.
Nach einer Stunde wurde die Reaktionsmischung mit
Phenol extrahiert, danach wurde mit Ethanol gefällt.
Das Präzipitat wurde gelöst und danach unter Verwendung
der Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI verdaut,
gefolgt von Agarosegel- Elektrophorese, und dann wurde
das variierte doppelsträngie DNA-Fragment aus dem Gel
mit üblichen Methoden aufgefangen.
Das im vorhergehenden Schritt erhaltene variierte
doppelsträngige DNA-Fragment wurde in den
Expressionsvektor pKK223 in die mit EcoRI und PstI
geschnittenen Stellen eingebracht, um Escherichia coli
JM103 zu transformieren. Die auf einem
Laborplattenmedium gewachsenen Kolonien wurden auf ihre
enzymatische Aktivität gemäß der Replikaaufdruckmethode
unter Verwendung von Filterpapier untersucht. Das
Filterpapier wurde vorher einer Wärmebehandlung bei
60°C für 20 Minuten ausgesetzt. Für die Klone, die eine
starke Farbbildung auf dem Filterpapier zeigten, wurde
angenommen, daß sie als Ergebnis von Austauschen in den
Genen der GDH mit der Folge der Variation thermisch
stabilisiert waren, und somit wurden die entsprechenden
Stämme ausgewählt.
Danach wurden die durch die obige Methode
selektionierten Stämme jeweils in 5 ml 2×TY-Medium
inokuliert und die Kultur bei 37°C für 18 Stunden
geschüttelt. Nach Sammeln und Waschen der Bakterien
wurde die Bakteriensuspension einer
Ultraschallbehandlung ausgesetzt, gefolgt von einer
zentrifugalen Trennung, um einen Überstand zu erhalten.
Wärmebehandlung dieses Überstandes wurde bei 60°C für
20 Minuten durchgeführt, und die Restaktivität wurde
gemessen, um thermisch stabilisierte variierte
Enzymgene enthaltende Stämme zu selektionieren.
Plasmid-DNA wurde von den Stämmen, die thermisch
stabilisierte variierte Enzymgene enthielten, bereitet,
die Basensequenz der Genfragmente wurde gemäß einer
üblichen Methode zur Klärung von Variationsstellen
bestimmt und diese Änderung auf der Aminosäuresequenz
der Enzymproteine bestätigt.
Im einzelnen wurde eine verbesserte rekombinante DNA,
pGDA2F-18 erhalten, in der die Glutaminsäure an der
Position 96 vom N-terminalen Ende der
Aminosäuresequenz der natürlichen GDH-DNA aus
Bacillus megaterium IWG3 zu Alanin verändert war, in
ähnlicher Weise verbesserte rekombinante DNAs waren
pGDA2H-35, in der Glutaminsäure an Position 96 vom
N-terminalen Ende gegen Glycin ausgetauscht war;
pGDA2F-20, in der Glutaminsäure an der Position 252 vom
N-terminalen Ende gegen Leucin ausgetauscht war;
pGDA2N-71, in der Tyrosin an Position 253 vom
N-terminalen Ende ausgetauscht war gegen Cystein;
pGDA2N-1, in der Glutaminsäure an Position 96 vom
N-terminalen Ende und Valin an Position 183 vom
N-terminalen Ende ausgetauscht waren gegen Lysin bzw.
Isoleucin, pGDA2N-13, in der Glutaminsäure, Valin,
Glutaminsäure und Tyrosin an den Positionen 96, 112,
133 und 217 vom N-terminalen Ende ausgetauscht waren
gegen Lysin, Alanin, Lysin bzw. Histidin; und auch
pGDA2N-28, in der Glutaminsäure, Asparaginsäure, Prolin
und Glutaminsäure an den Positionen 96, 108, 194 und
210 vom N-terminalen Ende ausgetauscht waren gegen
Lysin, Asparagin, Glutamin bzw. Lysin. Danach wurde
jede durch Transformation von Escherichia coli JM103
mit jedem Plasmid erhaltene Transformante bei 37°C für
18 Stunden in einem 2×TY-Nähr-Medium kultiviert.
Nachdem die Bakterien sich angesammelt hatten, wurde
die Bakteriensuspension einer Ultraschallbehandlung
ausgesetzt, gefolgt von der zentrifugalen Trennung. In
den erhaltenen Übertänden wurde nach Behandlung bei
50°C für 20 Minuten und bei 60°C für 20 Minuten die
GDH-Restaktivität gemessen.
Als eine Kontrolle wurde ein Vergleich unter Verwendung
von einem Escherichia coli JM103/pGDA2-Stamm
durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle
1 gezeigt.
Wie aus der Tabelle 1 zu entnehmen ist, wird die
Wärmestabilität der GDH erheblich verbessert, wenn eine
spezifisch gezeigte Aminosäure in der für
GDH-codierenden Aminosäuresequenz, i.e. Glutaminsäure
an Position 96 vom N-terminalen Ende mit irgendeiner von
Alanin, Glycin oder Lysin substituiert ist oder auch,
wenn Glutamin an Position 252 vom N-terminalen Ende
mit Leucin substituiert ist und wenn Tyrosin an der
Position 253 vom N-terminalen Ende durch Cystein
substituiert ist.
Die Verfahrensschritte 1) bis 5) in dem Abschnitt
"Herstellung von verbesserter rekombinanter DNA 1)"
wurden wiederholt mit der Ausnahme, daß statt des
Plasmids pGDA2 das Plasmid pGDA3 verwendet wurde, um
eine verbesserte rekombinante DNA pGDA3F-20 zu
erhalten, in der Glutaminsäure an Position 96 vom
N-terminalen Ende der Aminosequenz der natürlichen DNA
aus Bacillus megaterium IAM1030 gegen Alanin
ausgetauscht ist; pGDA3F-20, in der Glutamin an
Position 252 vom N-terminalen Ende gegen Leucin
ausgetauscht ist und pGDA3N-71 in dem Tyrosin an
Position 253 vom N-terminalen Ende gegen Glycin
ausgetauscht ist.
Danach wurde jede Transformante, die durch
Transformation von Escherichia coli JM103 mit jedem
Plasmid erhalten wurde bei 37°C für 18 Stunden in einem
2×TY-Nähr-Medium kultiviert. Nachdem sich die
Bakterien angesammelt hatten, wurde die
Bakteriensuspension einer Ultraschallbehandlung
ausgesetzt, gefolgt von der zentrifugalen Trennung.
In dem nach Behandlung bei 50°C für 20 Minuten und bei
60°C für 20 Minuten erhaltenen Überstand wurden die
GDH-Restaktivitäten gemessen.
Als eine Kontrolle wurde ein Vergleich unter Verwendung
des Stammes Escherichia coli JM103/pGDA3 durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2
zusammengefaßt:
Transformation nach GCA der Basensequenz GAA
entsprechend der Glutaminsäure an Position 96 vom
N-terminalen Ende der DNA der GDH aus
Bacillus megaterium IWG3.
Bei Verwendung einer gezielten Mutagenesemethode (M.
Soller and M. Smith, Nucleic Acids Research, Bd. 10,
6487 [1982]) wurde die Basensequenz GAA gemäß der
Glutaminsäure an Position 96 vom N-terminalen Ende des
GDH-Gens in GCA (Alanin) konvertiert, um ein variiertes
Gen zu erhalten. Die Wärmestabilität des produzierten
Enzyms wurde auf die gleiche Art wie oben beschrieben
untersucht. Als Ergebnis wurde eine hohe
Wärmestabilität gefunden.
Die Transformante Escherichia coli JM105/pGDA2F-18
wurde in 100 ml 2×TY-Nährlösung, enthaltend 50 µg/ml
Ampicillin, inokuliert und die Kultur bei 37°C für 13
Stunden geschüttelt. Danach wurde IPTG
(Endkonzentration: 0,1 M) zugegeben. Nach zwei Stunden
wurden die Bakterien durch einen Zentrifugationsschritt
gesammelt, mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH
6,5), enthaltend 2 M NaCl, gewaschen und danach in 10 ml
der gleichen Pufferlösung suspendiert. Die erhaltene
Suspension wurde unter Verwendung eines
Ultraschall-Brechers aufgeschlossen, gefolgt von einer
Zentrifugation, um einen Überstand zu erhalten (eine
Enzymlösung). Auf der anderen Seite wurde als Kontrolle
Bacillus megaterium IWG3 in 100 ml 2×TY-Nährlösung
inokuliert und die Kultur bei 37°C für 24 Stunden
geschüttelt. Danach wurden auf die gleiche Art und
Weise wie oben die Bakterien gesammelt, gewaschen und
danach mit Ultraschall aufgebrochen, gefolgt von der
zentrifugalen Abtrennung. Der erhaltene Überstand wurde
als eine Enzymlösung verwendet.
Die enzymatischen Aktivitäten wurden über den Anstieg
der Absorption bei 340 nm bestimmt, wenn die
Enzymlösung zu einer Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung
(pH 8,0), die 0,1 M D-Glucose und 20 mM
NAD enthielt, zugegeben, um die Reaktion bei 30°C in
einer Photometerkammer durchzuführen. Die enzymatische
Aktivität, die in der Lage ist, 1 mM NADH während einer
Reaktionszeit von 1 Minute zu produzieren, wurde als 1
Unit festgesetzt. Die spezifische Aktivität wurde als
Unit pro 1 mg Protein, enthaltend in der Enzymlösung,
angegeben. Als Ergebnis wurde die spezifische Aktivität
für Escherichia coli JM105/pGDA2F-18 von 7,8 µ/mg
gefunden. Auf der anderen Seite wurde die spezifische
Aktivität für Bacillus megaterium IWG von 0,07 µ/mg
gefunden.
Eine Enzymlösung der wärmestabilen GDH aus einem
Escherichia coli JM105/pGDA2F-18-Stamm und als
Kontrolle eine Enzymlösung von GDH aus einem
Bacillus megaterium IWG3-Stamm wurden verglichen, um
ihre jeweiligen Stabilitäten bei 37°C für 6 Monate
zu untersuchen.
Als Ergebnis zeigte die wärmestabile GDH der
Transformanten eine Restaktivität von 90% oder mehr,
während die Kontrolle eine Restaktivität von 80% oder
weniger hatte.
Die Transformante Escherichia coli JM105/pGDA3F-18
wurde in 100 ml 2×TY-Nährlösung, enthaltend 50 µg/ml
Ampicillin, inokuliert und die Kultur bei 37°C für 13
Stunden geschüttelt. Danach wurde IPTG
(Endkonzentration: 0,1 M) zugegeben. Nach 2 Stunden
wurden die Bakterien durch Zentrifugation gesammelt,
mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5),
enthaltend 2 M NaCl, gewaschen und danach in 10 ml der
gleichen Pufferlösung suspendiert. Die erhaltene
Suspension wurde unter Verwendung eines
Ultraschallbrechers aufgeschlossen, gefolgt von einem
Zentrifugationsschritt, um einen Überstand zu erhalten.
Die spezifische Aktivität des obigen Überstandes wurde
entsprechend der spezifischen Aktivitätmeßmethode nach
Beispiel 1 bestimmt und betrug 6,6 µ/mg.
Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, hat die
vorliegende Erfindung es möglich gemacht, eine
wärmestabile GDH bei geringen Kosten und in großer
Menge durch Kultivierung der Transformanten, die jene
verbesserte, in Escherichia coli replizierbare
rekombinante DNA enthalten, in der eine verbesserte
DNA, die durch Substitution einer Aminosäure mit einer
anderen Aminosäure an einer spezifischen gezeigten
Position einer Aminosäuresequenz der DNA, die für GDH
aus Bacillus megaterium codiert, in einen Escherichia
coli-DNA-Aufnahmevektor eingebracht ist, zur Verfügung
zu stellen.
Claims (6)
1. Eine verbesserte, in Escherichia coli replizierbare
DNA, in der eine verbesserte DNA, die durch Substitution
einer Aminossäure an einer spezifischen Position in der
folgenden Aminosäuresequenz der DNA, die für eine aus
Bacillus megaterium stammende Glucosedehydrogenase
codiert, mit einer anderen Aminosäure erhalten wird, in
einen Escherichia coli-Aufnahme-Vektor eingebracht ist,
worin A Ser oder Ala ist, X ist Asp oder Glu, Y ist Ala
oder Ser und B ist Leu oder Met.
2. Eine verbesserte rekombinante DNA nach Anspruch 1,
worin die Aminosäure an einer spezifischen Position
Glutaminsäure in Position 96 vom N-terminalen Ende und
die andere Aminosäur Lysin, Glycin oder Alanin ist.
3. Eine verbesserte rekombinante DNA nach Anspruch 1,
worin die Aminosäure an einer spezifischen Position
Glutaminsäure in Position 252 vom N-terminalen Ende und
die andere Aminosäure Leucin ist.
4. Eine verbesserte rekombinante DNA nach Anspruch 1,
worin die Aminosäure an einer spezifischen Position
Tyrosin an der Position 253 von N-terminalem Ende und
die andere Aminosäure Cystein ist.
5. Escherichia coli, enthaltend eine verbesserte
rekombinante DNA nach Anspruch 2, 3 oder 4.
6. Ein Verfahren zur Herstellung stabiler
Glucosedehydrogenase, umfassend Kultivierung einer
Transformante nach Anspruch 5 in einer Nährlösung,
Produzieren von wärmestabiler Glucosedehydrogenase in
einem kultivierten Produkt, Gewinnen der wärmestabilen
Glucosedehydrogenase aus diesem kultivierten Produkt.
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