DE69728377T2 - Verbesserte mutanten von (2,5 dkg) reduktase a - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf verbesserte mutierte Formen eines industriell wertvollen Enzyms. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf mutierte Formen von 2,5-Diketo-D-gluconsäure-(2,5-DKG)-Reduktase A, natürlich vorkommende Varianten von 2,5-DKG-Reduktase. Die mutierten Formen zeigen eine verbesserte katalytische Aktivität, um 2,5-DKG stereoselektiv in 2-Keto-L-gluconsäure (2-KLG), einem Vorläufer von Ascorbinsäure (Vitamin C), umzuwandeln. Die mutierten Formen können eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften ausüben: verbesserte Temperaturstabilität, gesteigerte Resistenz gegen Substrathemmung, erhöhte Umsetzung des Substrates durch das Enzym und gesteigerte Affinität für das Substrat.
  • Wegen einem sich erweiternden Gesundheitsbewusstsein von Menschen überall in der Welt bestand ein gesteigerter Bedarf für Vitamin C. Zu dem Bedarf für Ascorbinsäure trägt auch seine weit verbreitete Verwendung als ein Antioxidationsmittel für die Konservierung von Nahrungsmitteln bei. Ein Ansatz zur Befriedigung dieser Nachfrage ist, eine erhöhte Produktion von 2-KLG zu erreichen, einem Zwischenprodukt bei der Herstellung von Ascorbinsäure. Das Zwischenprodukt 2-KLG kann leicht durch eine säure- oder hasenkatalysierte Cyclisierung in Ascorbinsäure umgewandelt werden. Es hat auch eine höhere Stabilität und Lagerstabilität als Ascorbinsäure. Deswegen ist es praktischer, anstatt Ascorbinsäure direkt zu produzieren, 2-KLG für die nachfolgende Umwandlung in Ascorbinsäure zu lagern.
  • Eine Reihe an Arten einer ersten Gruppe an Mikroorganismen, Erwinia, Acetobacter und Gluconobacter, können 2,5-DKG aus D-Glucose erzeugen. Eine zweite Gruppe an Mikroorganismen aus der coryneformen Gruppe an Bakterien (Corynebacterium, Brevibacterium und Arthrobacter), ebenso wie Arten von Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus und Citrobacter, sind in der Lage, 2,5-DKG, erzeugt durch einen Mikroorganismus der ersten Gruppe, zu 2-KLG umzuwandeln. Eine Tandemfermentation oder Cofermentation geeigneter Mikroorganismen, um 2-KLG herzustellen, wurde vereinfacht durch die Kombination der relevanten Eigenschaften von sowohl der Erwinia sp. als auch der von Corynebacterium sp. in einem einzigen Mikroorganismus (Anderson et al., Science, 23: 144–149 (1985)). Dieses wurde bewerkstelligt durch die Identifikation der 2,5-DKG-Reduktase in dem Corynebacterium sp., welches 2,5-DKG in 2-KLG umwandelt. Das Gen für diese Reduktase wurde dann kloniert und in Erwinia herbicola, einem Bakterium der Familie der Enterobacteriaceae, welches D-Glucose in 2,5-DKG in einer einzigen Fermentation umwandelt, exprimiert. Der resultierende rekombinante Bakterienstamm, mit 2,5-DKG-Reduktase als dem zentralen Enzym, war in der Lage, die D-Glucose in 2-KLG in einem Einzelfermentationsvorgang umzuwandeln (Lazarus et al., Fourth ASM Conf. Genet. Molec. Biol. Indust. Microorg., 187–193 (1989)).
  • Die Verbesserung der katalytischen Wirksamkeit der 2,5-DKG-Reduktase in dem Einzelfermentationsvorgang ist ein signifikanter Weg, um die Produktion von 2-KLG zu steigern. Auch könnte eine gereinigte 2,5-DKG-Reduktase A mit erhöhter katalytischer Aktivität in einem in vitro-Vorgang für die Umwandlung von 2,5-DKG zu 2-KLG verwendet werden. Zum Beispiel würde solch ein Vorgang die kontinuierliche Produktion von 2-KLG durch Immobilisierung des gereinigten Enzyms auf einem festen Trägermaterial erlauben.
  • Gemäß dem unten ausgeführten Michaelis-Menten-Schema
    Figure 00020001
    kann die Effizienz einer enzymatischen Reaktion durch zwei kinetische Parameter, kcat und Km, gemessen werden. Die Katalysegeschwindigkeitskonstante, kcat, auch bekannt als die Umsetzungszahl, ist ein Maß für das Zusammenbrechen des Enzymsubstrat-(ES)-Komplexes. Es steht auch für die maximale Anzahl an Substratmolekülen (S), die zum Produkt (P) über einen ES-Komplex pro aktives Zentrum des Enzyms (E) pro Zeiteinheit umgewandelt werden. Vmax ist die Maximalgeschwindigkeit oder -rate der enzymkatalysierten Reaktion, wenn das Enzym mit Substrat gesättigt ist. Deswegen ist Vmax bei gesättigter Substratkonzentration konstant und bleibt mit jedem Anstieg in der Substratkonzentration unverändert. Bei gesättigten Substratkonzentrationen steht kcat in Beziehung mit Vmax und der Gesamtenzymkonzentration, [ET], durch die folgende Gleichung: Vmax = kcat [ET]. Die Michaelis-Konstante, Km, ist die Substratkonzentration, bei der die Geschwindigkeit gleich Vmax/2 ist. Folglich ist Km ein Maß für die Stärke des ES-Komplexes. In einem Vergleich von Km-Werten repräsentiert ein niedrigerer Km einen Komplex mit einer stärkeren, günstigeren Bindung, wohingegen ein höherer Km einen Komplex mit einer schwächeren, weniger günstigen Bindung repräsentiert. Das Verhältnis kcat/Km, als Spezifizitätskonstante bezeichnet, repräsentiert die Spezifizität eines Enzyms für ein Substrat, das heißt die katalytische Effizienz pro Enzymmolekül für ein Substrat. Je größer die Spezifizitätskonstante ist desto bevorzugter ist das Substrat durch das Enzym.
  • Beeindruckende Mengen von 2-KLG wurden mit einer 2,5-DKG-Reduktase aus Corynebacterium (2,5-DKG-Reduktase A, auch bekannt als 2,5-DKG-Reduktase II) erzielt (Anderson et al., Science, 230: 144–149 (1985); Miller et al., J. Biol. Chem., 262: 9016–9020 (1987)), exprimiert in geeigneten Wirtsstämmen (2,5-DKG-Hersteller) wie z. B. Erwinia sp. Diese Ergebnisse wurden trotzdem erreicht, dass von 2,5-DKG-Reduktase A von einer niedrigen Spezifizitätskonstante für 2,5-DKG berichtet wurde.
  • Diese niedrige berichtete Spezifizitätskonstante für 2,5-DKG-Reduktase A steht im Gegensatz Widerspruch zu einer zweiten, homologen Corynebacterium-2,5-DKG-Reduktase (2,5-DKG-Reduktase B, auch bekannt als 2,5-DKG-Reduktase I), von der eine höhere Spezifizitätskonstante für 2,5-DKG berichtet wurde (Sonoyama und Kobayashi, J. Ferment. Technol., 65: 311–317 (1987)). Zusätzlich sind beide 2,5-DKG-Reduktasen homolog zu etlichen bekannten Aldose- und Keto-Reduktasen, die höhere Spezifizitätskonstanten für ihre bekannten Substrate haben. Da Corynebacterium natürlicherweise 2,5-DKG nicht begegnet, ist es nicht überraschend, dass diese Verbindung ein schlechtes Substrat für 2,5-DKG-Reduktase A ist. Solche Erkenntnisse zeigen an, dass das aktive Zentrum der 2,5-DKG-Reduktase A nicht optimal für die katalytische Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG konfiguriert ist. Deswegen scheint es, dass, um die spezifische Aktivität der 2,5-DKG-Reduktase A in dem Einzelfermentationsvorgang zu optimieren, Aminosäuresubstitutionen durch ortsgerichtete Mutagenese an dem aktiven Zentrum des Enzyms getätigt werden müssen.
  • Zusätzlich zur Verbesserung der kinetischen Parameter eines Enzyms kann ortsgerichtete Mutagenese die strukturelle Stabilität durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen erhöhen. Die Folgenden sind Beispiele strukturell stabilisierender Mutationen. Das Einführen neuer Disulfidbindungen, um kovalente Quervernetzungen zwischen unterschiedlichen Teilen eines Proteins zu schaffen, wurde verwendet, um die thermische Stabilität des Lysozyms des Bakteriophagen T4 (Matsumura et al., Nature, 342: 291–293 (1989)), des Bakteriophagen-λ-Repressors (Sauer et al., Biochem., 25: 5992–5998 (1986)), der E. coli-Dihydrofolatreduktase (Villafranca et al., Biochem., 26: 2182–2189 (1987)) und von Subtilisin BPN' (Pantoliano et al., Biochem., 26: 2077–2082 (1987)) zu verbessern. Es gibt ein Computerprogramm (Pabo et al Biochem., 25: 5987–5991 (1986)), das ein wirksames Durchsuchen der kristallographisch bestimmten dreidimensionalen Struktur eines Proteins erlaubt, um jene Stellen vorzuschlagen, wo das Einfügen von zwei Cysteinen zu Disulfidbrücken führen könnte. Solche Bindungen würden die Konformation in großem Maßstab nicht stören, während sie die örtliche Konformation stabilisieren würden.
  • Von den Aminosäuresubstitutionen von Alanin für Glycin in der α-Helix wurde gezeigt, dass sie die thermische Stabilität des Bakteriophagen-λ-Repressors (Hecht et al., Struct. Funct. Genet., 1: 43–46 (1986)) und der neutralen Protease aus Bacillus stearothermophilus (Imanaka et al., Nature, 324: 695-697 (1986)) erhöhen. Eine Erhöhung der Schmelztemperatur, Tm, für das Bakteriophagen-T4-Lysozym wurde durch zwei Aminosäuresubstitutionen von Prolin für Alanin und Alanin für Glycin bewerkstelligt (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6663–6667 (1987)). Von dem Ersetzen von Aminosäuren in dem hydrophoben Kern eines Proteins durch aromatische Reste, wie z. B. Tyrosin, insbesondere in Positionen in der Nähe von bereits bestehenden Clustern aromatischer Nebenketten, wurde gezeigt, dass es die thermische Stabilität in der Kanamycin-Nucleotidyltransferase (Liao et al., Biochem., 83: 576–580 (1986)) und in dem Bakteriophagen-λ-Repressor (Hecht et al., Biochem., 81:5685–5689 (1984)) fördert.
  • Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in Expressionsvektoren sind Schlüsselelemente, benötigt für die Produktion von Proteinen in Bakterien in hohem Maße. Die E. coli Trp-, Bakteriophagen λPL-, E. coli lac UV5- und die Trp-lacUV5-Fusions- (Tac-) Promotoren befinden sich unter den am häufigsten verwendeten prokaryotischen Promotoren (de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25 (1983); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989); Remaut et al., Gene, 15: 81–93 (1981)). Die Translationseffizienz der Botschaft, die mRNA-Stabilität und die intrinsische Proteinstabilität sind Hauptfaktoren der Hochexpression.
  • Ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von synthetischen DNS-Oligonucleotiden mit der gewünschten Sequenz erlaubt die Substitution, Deletion oder Insertion ausgewählter Nucleotide innerhalb einer DNS-Sequenz, die ein Protein von Interesse kodiert. Rekombinante DNS-Verfahren werden verwendet, um die gewünschte Mutation durch Substitution der synthetischen Sequenz für die Zielsequenz einzuführen. Die Entwicklung von Plasmiden, die einen Replikationsstartpunkt enthalten, abgeleitet von einem filamentösen Bakteriophagen (Vieira und Messing, Methods in Enzymology, 153: 3–11 (1987)) erlaubt das Klonieren von Fragmenten in einzelsträngigen Formen von Plasmiden, fähig zu autonomer Replikation. Die Verwendung solcher Plasmide eliminiert das mühsame Geschäft des Subklonierens von DNS-Fragmenten von Plasmiden zu filamentösen Bakteriophagenvektoren. Kits zum Durchführen von ortsgerichteter Mutagenese sind im Handel erhältlich.
  • Mutanten der 2,5-DKG-Reduktase A mit Eigenschaften, die zu denen des nativen Enzyms variieren, wären nützlich. Besonders eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: verbesserte Temperaturstabilität, erhöhte Resistenz gegen die Substratinhibition, erhöhte Umsetzung des Substrates durch das Enzym und gesteigerte Affinität für das Substrat, würden nützlich sein, um die kommerzielle Nützlichkeit des Enzyms auszudehnen.
  • Unglücklicherweise ist es nicht möglich, wenn Proteine nicht Bereiche von wesentlicher Sequenz oder struktureller Homologie teilen, zwischen Proteinen zu verallgemeinern, um, basierend auf einer günstigen Mutation eines Proteins, präzise vorherzusagen, wo die Sequenz, die ein anderes Protein kodiert, verändert werden sollte, um das Erscheinungsbild jenes Proteins zu verbessern. Deshalb ist es notwendig, eine Analyse der präzisen strukturellen und funktionellen Eigenschaften des bestimmten zu ändernden Proteins vorzunehmen. Dies legt nahe, welche Aminosäuren zu ändern sind, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzeugen, wie z. B. eine gesteigerte katalytische Effizienz oder thermische Stabilität.
  • Zunehmend wird die Korrelation zwischen den Strukturen bekannter Proteine und der Sequenz eines Zielproteins unter Verwendung von Computersimulationen (V. F. van Gunsteren, Prot. Engin., 2: 5–13 (1988); M. M. Yang et al. in: Reaction Centers of Photosynthetic Bacteria (Michel-Beyerle, Hrsg.), Springer-Verlag, Deutschland (1990), S. 209–218), Datenbanken (J. Moult et al., Proteins, 1: 146–163 (1987); P. Klein et al., Biopolymers, 25: 1659–1672 (1986); H. Nakashima et al., J. Biochem., 99: 153–162 (1986); G. Deleage et al., Prot. Engin., 1: 289–294 (1987)); neuralen Netzwerken (N. Qian et al., J. Molec. Biol., 202:865–884 (1988); L. H. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 152–156 (1989); H. Bohr et al., FEBS Lett., 241: 223–228 (1988)); oder Expertensystemen (B. Robson et al., J. Molec. Graphics, 5: 8–17 (1987)) gemacht. Siehe allgemein G. R. Fasman, TIBS, 14: 295–299 (1989)).
  • Die Verwendung von Computern oder computergestützten Verfahren bei der Analyse der Struktur von Proteinen wird z. B. in den US-Patenten 4,704,692 (Ladner); 4,760,025 (Estell et al.); 4,853,871 (Pantoliano et al.) und 4,908,773 (Pantoliano et al.) diskutiert.
  • Sequenzvergleiche, durchgeführt unter Verwendung der Sequenz von 2,5-DKG-Reduktase, zeigten, dass es ein Mitglied einer größeren Superfamilie monomerer, NADPH-abhängiger prokaryotischer und eukaryotischer Carbonylreduktasen ist, bekannt als die Aldo-Keto-Reduktasen (Career et al., Exp. Eye Res., 49: 377–388 (1989); Bohren et al., J. Biol. Chem., 264: 9547–9551 (1989)). Mitglieder dieser Enzymfamilie schließen ein: biosynthetische Enzyme wie z. B. Rinderprostaglandin-F-Synthase; entgiftende Enzyme wie z. B. Chlordeconreduktase und Aflatoxin-b1-Reduktase; und Strukturproteine ohne identifizierte enzymatische Aktivität wie z. B. rho-Krystallin aus Froschlinsen.
  • Das menschliche Aldosereduktaseenzym wurde charakterisiert und ausgedehnt untersucht. Aldosereduktase wurde in Zusammenhang gebracht mit diabetischen Komplikationen; von ihr wird angenommen, dass sie die Reduktion von Glucose zu Sorbitol bei diabetischen Patienten verursacht, was in diabetischen Katarakten und der Neuropathologie, die mit Langzeitdiabetes verbunden ist, resultiert. Signifikante Anstrengungen wurden unternommen, um spezifische Aldosereduktaseinhibitoren zu finden, um diabetische Komplikationen bei Menschen zu verhindern (Frank, Opthamology, 98: 586–593 (1991); Zenon et al., Clinical Pharmacy, 9: 446–456 (1990)). Wegen ihrer mögliche Wichtigkeit bei der menschlichen Gesundheit wurde die Kristallstruktur der menschlichen Aldosereduktase durch etliche Gruppen gelöst, entweder als das Holenzym (Wilson et al., Science, 257: 81–84 (1992), im Komplex mit NADPH-Cofaktor oder dem Cofaktor-Analogon ATP-Ribose (Rondeau et al., Nature, 355: 469–472 (1992); Borhani et al., J. Biol. Chem., 267: 24841–24847 (1992) oder im Komplex mit dem Inhibitor Zopolrestat (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 9847–9851 (1993)). Kürzlich wurde die Struktur eines anderen Mitglieds der Aldo-Keto-Reduktase-Familie, alpha HSD, ebenfalls gelöst (Hoog et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 2517–2521 (1994). Diese Strukturen zeigen, dass die Aldo-Keto-Reduktasen achtfache alpha/beta-parallele Tonnen sind, auch bekannt als das "TIM-Tonnen"-Motiv, nach der Triosephosphatisomerase, wo es zuerst beschrieben wurde. Dies ist eine äußerst übliche Proteinfaltung mit ungefähr 17 bekannten Beispielen; ungefähr 10 % aller Enzyme, deren Strukturen bekannt sind, sind "TIM-Tonnen" (Farber und Petsko, TIBS, 1990: 228–235 (1990).
  • Die Struktur der menschlichen Aldosereduktase zeigt eine Anzahl an Merkmalen. Die Aldosereduktase-α/β-Tonne ist zusammengesetzt aus acht Beta-Strängen, die den "Kern" der Tonne bilden, umgeben von acht Alpha-Helices, die durch Schleifen variierender Längen mit den Beta- Strängen verbunden sind. Wie in allen bekannten TIM-Tonnen-Enzymen, umfassen die Schleifen, die an den C-terminalen Enden der Beta-Stränge gefunden werden, das aktive Zentrum des Enzyms, wo Substrat und Cofaktor binden und die Katalyse geschieht. NADPH wird an dem oberen Ende der Tonne in einer ausgedehnten Konformation gebunden, wobei der Nikotinamidring, von dem der Hydridtransfer geschieht, annähernd das exakte Zentrum der Tonne besetzt. Die Orientierung des Cofaktor-Nikotinamidrings ist so, wie sie für eine Klasse-A-Reduktase, bei der der pro-R-Wasserstoff in die Substrat-bindenden Taschen hinein steht, erwartet würde. Es gibt zwei zusätzliche sekundärstrukturelle Merkmale an der Aldosereduktasetonne: zwei zusätzliche Alpha-Helices (bezeichnet als H1 und H2), die auf den Schleifen der Aminosäuren gefunden werden, die den Beta-Strang Sieben und die Alpha-Helix Sieben miteinander verbinden, und am C-terminalen "Schwanz" nach der Alpha-Helix Acht. Die Struktur der Aldosereduktase zeigt, dass dieser C-terminale Schwanz über das obere Ende der Tonne hinaus steht, um Teil des aktiven Zentrums zu bilden.
  • Die WO94/05772 stellt Mutanten bereit, die spezifische Modifikationen der 2,5-DKG-Reduktase A enthalten, welche eine erhöhte Stabilität, Expression und/oder katalytische Aktivität ausüben könnten, und welche verschiedene Km und Vmax haben könnten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt mutierte Formen enzymatisch aktiver prokaryotischer 2,5-DKG-Reduktase A bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Mutanten bereit, die spezifische Modifikationen der 2,5-DKG-Reduktase A enthalten, und Materialien und Methoden, die nützlich sind bei der Herstellung dieser Proteine, ebenso wie modifizierte Mikroorganismen und Zelllinien, die nützlich sind bei ihrer Herstellung. Insbesondere stellt die Erfindung eine mutierte Form der 2,5-DKG-Reduktase A bereit, mit einer verbesserten Fähigkeit, 2,5-DKG in 2-KLG umzuwandeln und mit einer Aminosäuresubstitution in Position 22, definiert wie in SEQ ID NO: 1. Andere Aspekte der Erfindung schließen Expressionskonstrukte und -produkte davon für die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen, ebenso wie Klonierungsvektoren, welche die DNS enthalten, welche die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen kodieren, ein. Insbesondere stellt die Erfindung ein DNS-Konstrukt mit einem Strukturgen bereit, das wenigstens ein mutiertes Codon enthält, wobei dieses Gen eine Mutante der Erfindung kodiert. Ebenfalls wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein DNS-Konstrukt der Erfindung einschließt.
  • Die DNS, die die Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A kodiert, wird modifiziert unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese, wobei eine einzelsträngige Form des Gens verwendet wird, das die Erzeugung einer Änderung an einer ausgewählten Stelle innerhalb des kodierenden Bereichs der 2,5-DKG-Reduktase A ermöglicht. Durch dieses Verfahren wird eine Änderung in isolierte DNS eingeführt, die 2,5-DKG-Reduktase A kodiert, welche nach der Expression der DNS in der Substitution von wenigstens einer Aminosäure an einer vorbestimmten Stelle in der 2,5-DKG-Reduktase A resultiert.
  • Die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen und kodierenden Sequenzen der Erfindung können eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften ausüben: verbesserte Temperaturstabilität, erhöhte Resistenz gegen Substratinhibition, gesteigerte Umsetzung des Substrates durch das Enzym und erhöhte Affinität für das Substrat. Die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen können verschiedene Km- und Vmax-Werte haben.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt einen Expressionsvektor für das 2,5-DKG-Reduktase-A-Gen;
  • 2 zeigt einen Expressionsvektor für die Herstellung mutierter Formen von 2,5-DKG-Reduktase A; und
  • 3 zeigt die Plasmide ptrpl-35.A und prtpl-35.B.
  • 4 zeigt schematisch ein algorithmisches Modell für 2,5-DKG-Reduktase A (SEQ ID NO: 1).
  • 5 zeigt einen Vergleich der vorhergesagten sekundären Elemente in 2,5-DKG-Reduktase A, basierend auf dem Algorithmus- und Homologiemodell.
  • 6 zeigt eine Proteinsequenzanordnung von 2,5-DKG-Reduktase A und B mit menschlicher Aldosereduktase. Die Kästen repräsentieren sekundäre strukturelle Elemente in der Aldosereduktase (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3).
  • 7 zeigt die Substratkinetiken der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y und der 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante Y23F im Vergleich mit den Wildtyp-2,5-DKG-Reduktasen A und B.
  • 8 zeigt die Substratkinetiken der 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante N50A im Vergleich mit den Wildtyp-2,5-DKG-Reduktasen A und B.
  • 9 zeigt die Substratkinetiken der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante A272G im Vergleich mit den Wildyp-2,5-DKG-Reduktasen A und B.
  • 10 zeigt die Substratkinetiken der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y/Q192R, der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y/A272G und der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante Q192R/A272G im Vergleich mit den Wildtyp-2,5-DKG-Reduktasen A und B.
  • 11 zeigt den Cofaktor Km der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten F22Y, Q192R, A272G und F22Y/A272G im Vergleich mit den 2,5-DKG-Reduktasen A und B.
  • 12 zeigt die Analyse der thermischen Denaturierung ausgewählter Mutanten im Vergleich mit den Wildtyp-2,5-DKG-Reduktasen A und B.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Wildtyp"-2,5-DKG-Reduktase A auf ein Protein, das in der Lage ist, stereoselektiv die Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG zu katalysieren. Das Wildtypenzym ist das Enzym, das gewonnen ist aus Corynebacterium sp., erhalten vom ATCC-Stamm Nr. 31090, wie beschrieben im US-Patent Nr. 5,008,193.
  • Der Begriff "Wildtyp"-2,5-DKG-Reduktase B bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, stereoselektiv die Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG zu katalysieren. Das Wildtypenzym ist das Enzym, erhalten von Corynebacterium sp. shs752001, wie beschrieben durch Hardy et al. im US-Patent 4,945,052.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Mutante" im Zusamenhang mit einem Protein, wie z. B. "Wildtyp"-2,5-DKG-Reduktase A oder "Wildtyp"-2,5-DKG-Reduktase B, auf ein Protein mit einer verwandten Aminosäuresequenz. Sie enthält jedoch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäureresten. Diese Reste wurden ausgewählt unter Verwendung gewisser Ansätze. Ein Ansatz enthält die Verwendung sekundärstruktureller Vorhersagen, um 2,5-DKG-Reduktase A einer achtsträngigen α/β-Tonnenstruktur zuzuordnen. Eine Reihe an Modifikationen können unternommen werden, um das Gen zu modifizieren, um Mutanten des Enzyms zu kodieren mit verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu dem Wildtypenzym, und um 2,5-DKG stereoselektiv in 2-KLG umzuwandeln.
  • Es ist im Stand der Technik wohl verstanden, dass viele der Verbindungen, die in der gegenwärtigen Beschreibung diskutiert werden, wie z. B. Proteine und die sauren Derivate von Zuckern, in einer Reihe an Ionisierungszuständen existieren können in Abhängigkeit von ihren umgebenden Medien, falls sie in Lösung sind, oder außerhalb der Lösungen, aus denen sie zubereitet worden sind, falls sie in fester Form vorlagen. Bei der Verwendung eines Begriffes wie beispielsweise Gluconsäure, um solche Moleküle zu bezeichnen, ist beabsichtigt, alle Ionisierungszustände des organischen Moleküls, auf das er sich bezieht, einzuschließen. Folglich beziehen sich z. B. sowohl "D-Gluconsäure" und "D-Gluconat" auf dieselbe organische Einheit und sind nicht darauf gerichtet, besondere Ionisierungszustände zu bestimmen. Es ist wohl bekannt, dass D-Gluconsäure in unionisierter Form existieren kann oder z. B. als das Natrium-, Kalium- oder ein anderes Salz. Die ionisierte oder unionisierte Form, in welcher die Verbindung für die Offenbarung angemessen ist, wird entweder für den Fachmann aus dem Zusammenhang offensichtlich sein oder bedeutungslos. Folglich können das 2,5-DKG-Reduktase-A-Protein selber und seine verschiedenen Mutanten in einer Reihe an Ionisierungszuständen in Abhängigkeit von dem pH-Wert existieren. Alle diese Ionisierungszustände sind umfasst durch die Begriffe "2,5-DKG-Reduktase A" und "mutierte Form der 2,5-DKG-Reduktase A".
  • Der Begriff "Expressionsvektor" schließt Vektoren ein, die in der Lage sind, darin enthaltene DNS-Sequenzen zu exprimieren, wo solche Sequenzen operabel mit anderen Sequenzen gekoppelt sind, die in der Lage sind, ihre Expression zu bewirken. Es ist impliziert, obwohl nicht ausdrücklich festgestellt, dass Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als ein integraler Teil chromosomaler DNS replizierbar sein müssen. Es ist klar, dass ein Fehlen der Replikation sie tatsächlich inoperabel machen würde. Im Ergebnis wird "Expressionsvektor" auch eine funktionelle Definition gegeben. Allgemein werden Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNS-Techniken von Nutzen sind, oftmals in der Form von "Plasmiden" vorliegen. Plasmide beziehen sich entweder auf zirkuläre doppelsträngige DNS-Moleküle oder zirkuläre einzelsträngige DNS-Moleküle, die einen Replikationsstartpunkt enthalten. Diese DNS-Moleküle, in ihrer Vektorform, sind nicht an die Chromosomen gekoppelt. Andere effektive Vektoren, die gewöhnlich verwendet werden, sind Phagen- und azirkuläre DNS. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" oftmals austauschbar verwendet. Die Erfindung ist jedoch beabsichtigt, andere solche Formen von Expressionsvektoren einzuschließen, die äquivalenten Funktionen dienen und welche bekannt sind oder nachfolgend bekannt werden.
  • Von dem Begriff "Konstrukt" wird beabsichtigt, dass er breit Plasmide, Vektoren etc. und Fragmente davon (wie z. B. Kassetten und Gensequenzen) einschließt.
  • "Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszelle", "Zellen", "Zellkulturen" usw. werden austauschbar verwendet, um individuelle Zellen, Zelllinien, Zellkulturen und geerntete Zellen zu bezeichnen, die mit den rekombinanten Vektoren der Erfindung transformiert wurden oder von denen beabsichtigt wird, sie damit zu transformieren. Die Begriffe schließen auch die Vorläufer der Zellen ein, die ursprünglich den Vektor erhielten.
  • "Transformation" bezieht sich auf jeden Vorgang, um den DNS-Gehalt des Wirtes zu ändern.
  • Dies schließt in vitro-Transformationsvorgänge wie z. B. durch Calciumchlorid, Calciumphosphat oder DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Konjugation, Elektroporation, Kerninjektion, Phageninfektion oder solche anderen Mittel ein, um kontrollierte DNS-Aufnahme zu bewirken, wie im Stand der Technik bekannt.
  • Die Begriffe "Aminosäure" und "Aminosäuren" beziehen sich auf sämtliche natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. Von dieser Definition wird gedacht, dass sie nur Leucin, Ornithin und Homocystein einschließt. Die Aminosäuren werden identifiziert durch entweder ihre Einzel-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Bezeichnungen:
  • Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Diese Aminosäuren können gemäß der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen klassifiziert, geladene und ungeladene. Jede dieser Gruppen wird in Untergruppen aufgeteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:
    • I. Geladene Aminosäuren saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin
    • II. Ungeladene Aminosäuren hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin apolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
    Tabelle 1
    Ausgangsrest konservative Substitutionen
    Ala ser
    Arg lys
    Asn gln; his
    Asp glu
    Cys ser, ala
    Gln asn
    Glu asp
    Gly pro
    His asn; gln
    Ile leu; val
    Leu ile; val
    Lys arg gln; glu
    Met leu; ile
    Phe met; leu; tyr
    Ser thr
    Thr ser
    Trp tyr
    Tyr trp; phe
    Val ile; leu
  • Wesentliche Änderungen in der Funktion oder Stabilisierung werden durch das Auswählen von Substitutionen erzeugt, die weniger konservativ sind als jene in Tabelle 1, das heißt durch Auswählen von Resten, die sich signifikanter in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung von (a) der Struktur des Polypeptidgerüstes in dem Bereich der Substitution, wie z. B. als eine Blatt- oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Masse der Seitenkette unterscheiden. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die stärksten Änderungen erzeugen, werden jene sein, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Serin oder Threonin, substituiert wird für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Valin oder Alanin; (b) ein Cystein oder Prolin substituiert wird für (oder durch) irgendeinen anderen Rest; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysin, Arginin oder Histidin, substituiert wird für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure; oder (d) ein Rest mit einer großen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, ersetzt wird für (oder durch) einen, der keine Seitenkette hat, z. B. Glycin.
  • Allgemeine Methoden
  • Die meisten der Techniken, die verwendet werden, um Zellen zu transformieren, Vektoren zu konstruieren, Hybridisierung mit einer Sonde zu bewirken, ortsgerichtete Mutagenese durchzuführen und Ähnliches werden im Stand der Technik weit praktiziert. Die meisten Praktiker sind mit den Standardquellmaterialien, die spezifische Bedingungen und Vorgänge beschreiben, vertraut (siehe z. B.
  • Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)), hierin durch Bezugnahme einbezogen. Für die zusätzliche Führung werden jedoch die folgenden Absätze dargestellt.
  • Expression von 2,5-DKG-Reduktase A
  • Das vollständige funktionelle Gen wird in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert, der einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle enthält, die in der Wirtszelle operabel ist, in welche die kodierende Sequenz transformiert werden wird. Im gegenwärtigen Stand der Technik sind eine Anzahl an Förder-/Kontrollsystemen und geeigneten prokaryotischen Wirten erhältlich, die für die vorliegende Erfindung angemessen sind. Ähnliche Wirte können sowohl verwendet werden für das Klonieren als auch für die Expression, da Prokaryonten im Allgemeinen für das Klonieren von DNS-Sequenzen bevorzugt werden. Das Verfahren der 2-KLG-Produktion ist am üblichsten mit solchen mikrobiellen Systemen verknüpft. Der E. coli-K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) ist besonders als ein Klonierungswirt nützlich. Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden, schließen E. coli-Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537) und E. coli DH-1 (ATCC Nr. 33489) ein. Für die Expression können die zuvor genannten Stämme ebenso wie E. coli W3110 (F-, λ-, prototrophisch ATCC Nr. 27325), Bazillen wie z. B. Bacillus subtilus und andere Enterobacteriaceae wie z. B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans und zahlreiche Pseudomonas-Spezies verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Gruppe an Wirten schließt jene Kulturen ein, die in der Lage sind, Glucose oder andere allgemein erhältliche Metaboliten von 2,5-DKG umzuwandeln. Beispiele solcher Wirte werden im Allgemeinen innerhalb der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acetomonas und Erwinia gefunden. Die Taxonomie und Nomenklatur dieser Gattungen sind dergestalt, dass denselben oder ähnlichen Stämmen manchmal verschiedene Namen gegeben werden. Zum Beispiel wird auf Acetobacter cerinus, in dem Beispiel unten verwendet, auch Bezug genommen als Gluconobacter cerinus. Beispiele bestimmter Wirte schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Erwinia herbicola ATCC Nr. 21998 (auch in Betracht gezogen als Acetomonas albosesamae im US-Patent Nr. 3,998,697); Acetobacter (Gluconobacter) oxydans Unterart melanozenes, IFO 3292, 3293 ATCC Nr. 9937; Acetobacter (Gluconobacter) cerinus IFO 3263 IFO 3266; Gluconobacter rubiginous, IFO 3244; Acetobacter fragum ATCC Nr. 21409; Acetobacter (Acetomonas) suboxydans Unterart industrious ATCC Nr. 23776.
  • Im Allgemeinen werden Plasmidexpressions- oder Klonierungsvektoren oder konjugierende Plasmide, die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, welche abgeleitet werden aus Spezies, die mit der Wirtszelle verträglich sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlicherweise einen Replikationsstartpunkt ebenso wie Markergene, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion transformierter Zellen bereitzustellen. Zum Beispiel wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das abgeleitet ist aus einem E. coli-Stamm (Bolivar et al., Gene, 2: 95–113 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich einfache Mittel bereit für die Identifikation transformierter Zellen. Für die Verwendung bei der Expression muss das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid auch Promotoren enthalten, oder es muss modifiziert werden, um Promotoren zu enthalten, welche durch den mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können. Jene Promotoren, die am gewöhnlichsten bei der rekombinanten DNS-Konstruktion verwendet werden, schließen das β-Lactamase-(Penicillinase)-System und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature, 275: 617–624 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056–1063 (1977); Goeddel et al., Nature, 281: 544–548 (1979)) und ein Tryptophan(trp)-Promotor-System (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057–4074 (1980); EP-Anmeldung Nr. 0 036 776) ein. Während diese die am üblichsten verwendeten sind, wurden auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet. Details betreffend ihre Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, was den Fachmann in die Lage versetzt, jene funktionell in operabler Beziehung zu Genen in Transformationsvektoren zu ligieren (Siebenlist et al., Cell, 20: 269–281 (1980)).
  • Durch geeignetes Spalten und Ligieren können DNS-Sequenzen, die 2,5-DKG-Reduktase A und B kodieren, in den zuvor genannten Vektoren eingeschlossen werden, die, wie oben ausgeführt, zubereitet wurden. Jegliche unnötigen oder hemmenden Sequenzen können zerstört werden und das prokaryotische Enzym kann dann aufgereinigt werden; oder die intakten oder gebrochenen Zellen werden direkt als Katalysatoren verwendet. Alternativ kann der Wirt gewählt werden, so dass er, wenn er einmal transformiert ist, in der Lage ist, die gesamte Umsetzung von Glucose oder einem anderen geeigneten Metaboliten zu dem gewünschten 2-KLG-Produkt zu bewirken.
  • Sowohl die Wildtyp-Plasmid-DNS', die mutierte Plasmid-DNS für 2,5-DKG-Reduktase A als auch die mutierte Plasmid-DNS für 2,5-DKG-Reduktase B werden in einen Wirt für die Enzymexpression transfiziert. Die rekombinanten Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, welche die Enzymexpression begünstigen. Allgemein wird Selektionsdruck bereitgestellt durch die Anwesenheit eines Antibiotikums. Die Resistenz gegen das Antibiotikum wird durch den Vektor kodiert.
  • Vektorkonstruktion für die Mutagenese
  • Anderson et al. beschrieben die Konstruktion des Plasmids ptrpl-35 im US-Patent 5,008,193, hierin eingeschlossen durch Bezugnahme, welches das klonierte 2,5-DKG-Reduktase-A-Gen unter der Kontrolle des E. coli-trp-Promotors enthält (1). Ein Derivat dieses Plasmids wird konstruiert mit einigen geringeren Modifikationen, um die Konstruktion und Charakterisierung mutierter Formen der 2,5-DKG-Reduktase A zu erleichtern. Diese Modifikationen werden unten beschrieben. Das endgültige Plasmidkonstrukt wird pSStac.DKGR.AAA genannt und ist in 2 gezeigt.
    • A) Das Strukturgen für die 2,5-DKG-Reduktase A wird mutiert, um drei neue Restriktionsenzymstellen einzuschließen, um weitere Mutagenesestudien zu erleichtern. Diese drei Stellen sind "stumm", das heißt die Aminosäuresequenz des resultierenden DKGR-A-Proteins bleibt unverändert.
    • B) Der Promotor in pSStac.DKGR.AAA ist der tac-II-Promotor, beschrieben durch de Boer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25 (1983)) anstelle des trp-Prompotors, der in ptrpl-35 gefunden wird. Dies ist eine modifizierte Version des trp-Promotors, der die Bindungsstelle für den lac-Repressor enthält, was die Expression des Gens ermöglicht, das ist in Zellen zu regulieren, die den lac-Repressor exprimieren.
    • C) Das Plasmid wird weiterhin modifiziert, um den Replikationsstartpunkt des einzelsträngigen filamentösen Phagen f1 zu enthalten. Die Verwendung dieser DNS-Sequenz in Plasmiden ist im Stand der Technik wohl bekannt, um eine einzelsträngige Form des Plasmids zu erzeugen, für das Sequenzieren und die Mutagenese.
  • Um 2,5-DKG-Reduktasen und -Mutanten zu erzeugen, wurden zwei zusätzliche Plasmide konstruiert: ptrpl-35.A und ptrpl-35.B (3), welche die Strukturgene für die 2,5-DKG-Reduktase-Varianten A bzw. B hinter dem E. coli-trp-Promotor in einem von pBR322 abgeleiteten Vektor exprimieren. Der Startpunkt für diese Plasmidkonstrukte war ptrpl-35, beschrieben im US-Patent Nr. 5,008,193.
  • Beim Zubereiten der Gene für DKG-Reduktase A und B für die Expression wurden eine Reihe an Modifikationen der Wildtyp kodierenden Sequenzen dieser Gene erzeugt. Das Wildtyp-DKG-Reduktase-A-Gen-Plasmid in ptrpl-35 hat eine EcoRI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des Start-Methionins; eine KpnI-Stelle wurde unmittelbar nach dem Stoppcodon eingeführt, um zu ermöglichen, dass das gesamte Strukturgen in einer EcoRI-KpnI-Verdauung ausgeschnitten wird. Ähnlich wurden EcoRI- und KpnI-Stellen unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts des Wildtyp-DKG-Reduktase-B-Gens eingeführt, um zu ermöglichen, dass das B-Gen in demselben Vektor platziert wird wie das A-Gen.
  • Das Wildtyp-DKG-Reduktase-A-Gen wurde modifiziert, um neue XbaI- und ApaI-Stellen einzuführen, gemeinsam mit flankierenden EcoRI- und KpnI-Stellen, wodurch das Gen in drei Segmente unterteilt wird, jedes ungefähr ein Drittel der Gesamtlänge lang. Die XbaI- und ApaI-Stellen in dem A-Gen sind "stumm", das heißt sie ändern die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins nicht. Dieselben beiden XbaI- und ApaI-Stellen wurden in die analogen Positionen des DKG-Reduktase-B-Gens eingeführt. Die erste der beiden Stellen, XbaI, ist in dem B-Gen stumm und ändert die Aminosäuresequenz des B-Gens nicht. Es war jedoch nicht möglich, die zweite der beiden Stellen (ApaI) in die B-Sequenz eimuführen, ohne die Aminosäuresequenz zu ändern. Eine Sequenzvariation wurde deswegen eingeführt, um die ApaI-Stelle zu begleiten: Serin 189 von DKG-Reduktase B wurde zu Glycin (die Aminosäure, die in der analogen Position des A-Gens gefunden wird) während der Schaffung der ApaI-Stelle mutiert.
  • Das Plasmid ptrpl-35 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, um ein – 1690 by großes Fragment zu erzeugen, das das Strukturgen für DKG-Reduktase A und stromabwärts eine Sequenz enthält, die aufgereinigt wird durch Acrylamidgelelektrophorese und die in EcoRI und HindIII verdaute M13mp19-Vektor-DNS ligiert wird. Ligierungsreaktionen wurden in Zellen von E. coli-Stamm-JM101-Zellen transformiert; und die geeigneten Rekombinanten wurden durch Restriktionskartierung rekombinanter Phagen-RF-Zubereitungen identifiziert. Der rekombinante Phage (M19mp19.EcoR1/HindIII.DKGRA) wurde als eine Matrizenzubereitung (einzelsträngige Form) für Mutagenesereaktionen in großem Maßstab zubereitet.
  • Der Startpunkt für Plasmide, die das Wildtyp-DKGR-B-Gen enthalten, ist das Plasmid pCBR13, wie beschrieben (Grindley et al., Applied and Environmental Microbiology, 54: 1770–1775 (1988)), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Das Plasmid pCBR13 wurde mit EcoR1 und BamH1 verdaut, um ein 2000 by großes Fragment zu erzeugen, das durch Acrylamidgelelektrophorese aufgereinigt wurde und in EcoR1 und BamH1 verdauten M13mp19 ligiert wurde, um den rekombinanten Phagen (M13mp19.R1/BamH1.DKGRB) zu erzeugen. Der rekombinante Phage (M13mp19.R1/BamH1.DKGRB) wurde als eine Matrizenzubereitung (einzelsträngige Form) für Mutagenesereaktionen im großen Maßstab zubereitet.
  • Die Mutagenesereaktionen waren wie folgt. Oligonucleotidprimer wurden gestaltet, um neue Restriktionsstellen in die Wildtyp-DKGR-A- und B-Gene einzufügen: Für DKGR A: XbaI, ApaI und KpnI wurden eingeführt; für DKGR B: EcoRI-, ApaI-, XbaI- und KpnI-Stellen wurden eingeführt. (Die Oligonucleotide, die verwendet wurden, um diese Restriktionsstellen einzuführen, waren die folgenden:
  • Figure 00150001
  • Mutagenesereaktionen geschahen durch das "Zwei-Primer"-Verfahren, wie beschrieben durch Carter, Methods Enzymol., 154: 382 (1987), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Mutagene Oligonucleotide wurden verdünnt auf 10 OD260-Einheiten pro ml. Eine Kinasereaktion wurde wie folgt durchgeführt: 2 μl Primer, 2 μl 10x Kinasepuffer, 1 μl 100 mM DTT, 13,5 μl doppelt destilliertes und entmineralisiertes H2O und 0,5 μl Kinase (4 Einheiten/μl, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) für 30 Minuten bei 37 °C. Die Kinase wurde dann durch Inkubation bei 70 °C für 15 Minuten hitzeinaktiviert und die Reaktion wurde auf 5 μM Primerkonzentration angepasst. Annealing-Reaktionen wurden angesetzt, die 5 μl jedes geeigneten Primers in einer Konzentration von 5 μM, 5 μl ähnlich kinase-verdauten "Stromaufwärts"-Primer (ein sequenzfierendes 18-mer, das komplementär ist, um unmittelbar stromaufwärts der M13-Polylinkerklonierstelle (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG-3' (SEQ ID NO: 11), 3 μg Matrize, 2,5 μl 10x RB-Puffer in einem Endvolumen von 25 μl enthielten und Doppelstränge wurden bei Erhitzen auf 75 °C in einem Heizblock für 3 Minuten gebildet, dann wurde es ermöglicht, auf 25 °C auf der Laborbank abzukühlen. Verlängerungen wurden durchgeführt durch die Zugabe von 2 μl 2,0 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP; plus 1 μl Ligase (6 Weiss-Einheiten/μl, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts), 1 μl Klenow-Fragment von E. coli-DNS-Polymerase (5 Einheiten/μl, großes Fragment von DNS-Polymerase I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts), 5 μl 5x Ligasepuffer, 2 μl 10 mM rATP und H2O auf ein Gesamtvolumen von 50 μl. Die Verlängerung wurde bei 25 °C für 4 Stunden durchgeführt. 5 μl der Verlängerungsreaktion wurden in CaCl2-kompetente MutL-E. coli-Zellen transformiert. Einzelplaques wurden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte angeordnet, wachsen gelassen bei 37 °C, auf einen Rasen von Zellen aus E. coli-Stamm JM101 gestempelt und wiederum bei 37 °C wachsen gelassen. Von jeder Platte wurden mehrfache Nitrozellulosefilterabnahmen gemacht und mit 32P-radiomarkierten mutagenen Oligonucleotiden sondiert. Die Bedingungen waren wie folgt: Hybridisierung für eine Stunde bei 37 °C, Waschen mit 6xSSC bei 37 °C, dann mit TMACI-Waschlösung (3M Tetramethylammoniumchlorid, 50 mM Tris, pH 8,0, 2 mM EDTA und 0,1 % SDS bei 65 und 68 °C). Einzelne mutmaßliche Rekombinanten, die mit allen der geeigneten Olibonucleotide hybridisierten, wurden in einer einzelsträngigen Form zubereitet und sequenziert, um zu bestätigen, dass alle richtigen Stellen vorhanden waren und dass keine Sekundärmutationen eingeführt worden waren. Die demzufolge identifizierten mutierten Phagen wurden genannt:
  • Figure 00160001
  • Die mutierten Gene wurden von dem Phagen zurück in den ptrpl-35-Vektor für die Expression unterkloniert. Die Matrize von M13mp19.R1/HindIII.DKGR.AAA wurde mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNS-Polymerase (5 Einheiten/μl, großes Fragment der DNS-Polymerase I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) unter Verwendung aller vier dNTPs "aufgefüllt", um eine doppelsträngige Form in der folgenden Reaktion zu erzeugen: 25 μl Matrize, 5 μl 10x Nick-DNS-Neusynthese-Puffer, 3 μl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 μl M13-komplementärer "Stromaufwärts"-Primer (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG-3') in einem Gesamtvolumen von 52 μl. Die Reaktionen wurden langsam der Doppelstrangbildung in einem Heizblock wie zuvor unterzogen, gestartet durch die Zugabe von 1 μl E. coli-DNS-Polymerase-Klenow-Fragment (5 Einheiten/μl, großes Fragment von DNS-Polymerase I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) und für 30 Minuten bei 25 °C verlängert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit EcoRI und HindIII verdaut und das resultierende 1690 by lange Fragment wurde aufgereinigt und in ptrpl-35 subkloniert, das mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, um das Plasmid ptrpl-35.DKGR.A zu erzeugen. Für das DKGR B-Konstrukt wurde die Matrize M 13mp 19.EcoRI/BamH1.DKGR.BBB ähnlich aufgefüllt, verdaut mit EcoRI und KpnI und dieses – 843 by große Fragment wurde durch Acrylamidgelelektrophorese aufgereinigt. Dieses Fragment wurde dann in EcoRI/KpnI verdauten ptrpl-35.A kloniert (wodurch das mutierte DKGR A-Gen ersetzt wurde, jedoch die stromabwärts gelegenen DKGR A-Sequenzen von KpnI bis HindIII beibehalten wurden). Dieses Plasmid wird bezeichnet als ptrpl-35.DKGR.B:S189G.
  • Das DKGR B-Expressionskonstrukt ptrpl-35.DKGR.B:S189G wurde als ein Ausgangspunkt verwendet, um ein Plasmid zu konstruieren, das Wildtyp-DKGR B exprimiert, mit dem passenden Codon für Serin an Position 189. Dieses wurde wie folgt durchgeführt: ptrpl-35.B:S189G wurde mit NcoI und XhoI verdaut, um ungefähr die inneren ⁓2/3 (⁓700 bp) der kodierenden Sequenz zu entfernen, wobei diese Region die eingeführten XbaI- und ApaI-Stellen ebenso einschließt wie die Mutation von Serin zu Glycin an der Aminosäure 189. Diese Region wurde ersetzt durch die Wildtyp-Gensequenz von NcoI bis XhoI aus pCBR13. Das Endkonstrukt wird bezeichnet als ptrpl-35.DKGR.B.
  • Um Protein der 2,5-DKG-Reduktase A und B für die Charakterisierung zu erzeugen, wurden die Plasmide ptrpl-35.A und ptrpl-35.B gemeinsam mit pBR322-Kontrollplasmid in den E. coli-Stamm HB101 durch ein CaCl2-Verfahren eingeführt und auf LB-Altarplatten selektiert, die Ampicillin und Tetracyclin enthielten. Man ließ 5 ml Kulturen bis zur Sättigung über Nacht in LB plus Ampicillin plus Tetracyclin bei 37 °C unter Schütteln wachsen. Zellen wurden wieder gewonnen durch Zentrifugation und Aliquoten wurden durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese analysiert. Keine neuen Banden wurden weder in dem Molekulargewichtsbereich von 30.000, der für 2,5-DKG-Reduktase in diesen Zelllysaten erwartet wird, beobachtet, noch in ähnlichen Experimenten mit E. coli-Stamm MM294. Zelllysate wurden auf 2,5-DKG-Reduktase-Aktivität untersucht und keine Aktivität wurde in diesen Lysaten über dem pBR322-Lysathintergrund beobachtet.
  • Wenn diese Plasmide ähnlich in Acetobacter cerinus-Stamm (IFO 3263) eingeführt, bei 28 °C wachsen gelassen und auf Expression durch SDS-PAGE-Elektrophorese kontrolliert wurden, wurden hervortretende neue Banden in dem Bereich von 30.000 Dalton bei den ptrpl-35.A- und ptrpl-35.B-Lysaten beobachtet. Untersuchungen der Acetobacter cerinus-Zelllysate auf die 2,5-DKG reduzierende Aktivität zeigten auch eine gesteigerte Aktivität über dem pBR322-Hintergrund.
  • Ortsgerichtete Mutagenese
  • Die DNS-Sequenz, die 2,5-DKG-Reduktase A oder 2,5-DKG-Reduktase B kodiert, wird ortsgerichteter Mutagenese unterzogen, um Nucleotide zu ersetzen, die ausgewählte Aminosäuren an den vorbestimmten Positionen in der Sequenz kodieren.
  • Das bevorzugte Vorgehen für ortsgerichtete Mutagenese, wo nur ein einzelnes Basenpaar verändert werden muss, wird durchgeführt durch Klonieren der DNS-Sequenz, die das Wildtypenzym enthält, in ein rekombinantes Plasmid, das einen Replikationsstartpunkt enthält, abgeleitet von einem einzelsträngigen Bakteriophagen. Dann wird ein geeigneter Primer verwendet, um ein Nucleotid an einer identifizierten Position umzuwandeln. Ein synthetischer Oligonucleotidprimer, der, mit Ausnahme in den Gebieten von begrenzten fehlenden Übereinstimmungen, komplementär ist zu der gewünschten Sequenz, wird als ein Primer bei der Synthese eines Strangs verwendet, der komplementär ist zu der einzelsträngigen Sequenz der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A oder der 2,5-DKG-Reduktase B in dem Plasmidvektor. Die resultierende doppelsträngige DNS wird in ein Wirtsbakterium transformiert. Konturen der transformierten Bakterien werden auf Agarplatten ausplattiert, wodurch Koloniebildung aus einzelnen Zellen ermöglicht wird, die das Plasmid enthalten. Theoretisch werden 50 % der Kolonien aus Plasmid bestehen, das die mutierte Form enthält; 50 % werden die Ausgangssequenz haben. Die Kolonien werden mit radiomarkiertem synthetischen Primer unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die eine Hybridisierung nur mit dem mutierten Plasmid erlauben, das eine perfekte Übereinstimmung mit der Sonde bilden wird. Hybridisierende Kolonien werden dann gepickt und kultiviert und die mutierte Plasmid-DNS wird wiedergewonnen.
  • Nachfolgende ortsgerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um zusätzliche Nucleotide in irgendeiner Mutante zu ändern. Alternativ können Mutanten mit mehr als einem veränderten Nucleotid konstruiert werden unter Verwendung von Techniken, mit denen Praktiker vertraut sind, wie z. B. der Isolation von Restriktionsfragmenten und dem Ligieren solcher Fragmente in einen Expressionsvektor (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)).
  • Auswahl von Stellen für die Mutagenese von Mutanten für das Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase-A-Gen
  • Entscheidend bei der Auswahl von Mutagenesestellen ist die Vorhersage einer Sekundär- und Tertiärstruktur des Wildtypenzyms. Die Vorhersagen der Sekundärstruktur werden auf einem der folgenden Wege durchgeführt. Zuerst werden die Sequenzen der 2,5-DKG-Reduktasen A und B und die von fünf anderen homologen Enzymen (Prostaglandin-F-Synthase, Rinderlinsen- und Rattenlinsen-Aldosereduktase, menschliche Leberaldehydreduktase und ρ-Kristallin aus Froschaugenlinsen) angeordnet, um eine Anzahl konservierter Reste aufzudecken. Als zweites werden die Sequenzen einer Reihe an Strukturvorhersagealgorithmen unterzogen (Chou und Fasman, Adv. Enzymol., 47: 45–148 (1978); Garnier et al., J. Mol. Biol., 120: 97–120 (1978); Wilmot und Thornton, J. Mol. Biol., 203: 221–232 (1988); Karphus und Schulz, Naturwissenschaften, 72: 212–214 (1985); Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 140–144 (1984); Rose und Roy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4643–4647 (1980)), die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Diese Vorhersagen werden gesammelt und miteinander verglichen, um ein grobes Modell der Sekundärstruktur des Enzyms als eine achtsträngige α/β-Tonne abzuleiten ("algorithmisches Modell"). Diese Sekundärstrukturvorhersage steht in Übereinstimmung mit den kürzlich gelösten Sekundärstrukturen von homologen Enzymen, die die Faltung einer achtsträngigen α/β-Tonne haben (Rondeau et al., Nature, 355: 469–472 81992); Wilson et al., Science, 257: 81–84 (1992)).
  • Die Tonnenstruktur ist aus zwei Bestandteilen zusammengesetzt. Der erste Bestandteil ist ein Kern aus acht verdrehten parallelen Beta-Strängen, die eng aneinander zu einer Tonne angeordnet sind, ähnlich Fassdauben. Diese Tonnenstruktur umgibt ein zweiter Bestandteil von acht Alpha-Helices, die mit den Beta-Strängen durch Schleifen unterschiedlicher Längen verbunden sind. Diese achtsträngige α/β-Tonnenstruktur wird die Triosephosphatisomerase-(TIM)-Tonne genannt nach dem Enzym, für welches diese Struktur zuerst beobachtet wurde. Das Faltmuster der α/β-Tonne wird in 17 Enzymen gefunden, deren Kristallstrukturen bekannt sind. In der Tat sind ungefähr 10 % der bekannten Enzymstrukturen α/β-Tonnen (Faber und Petsko, TIBS, 15: 228–234 81990)). Die 17 bekannten α/β-Tonnenenzyme haben einen gemeinsamen α/β-Tonnenkern; diese Substrat- und Cofaktorspezifität kommt von den variablen Schleifen, die die Beta-Stränge und Alpha-Helices verbindet.
  • Ein vorhergesagtes Sekundärstrukturmodell für die 2,5-DKG-Reduktase A, basierend auf dem algorithmischen Modell (siehe oben), wird schematisch in 4 gezeigt (SEQ ID NO: 1), wo Beta-Stränge durch Pfeile dargestellt werden und die Alpha-Helices als Zylinder gezeigt sind. Bereiche der Polypeptidkette, die die vorhergesagten Elemente der Sekundärstruktur verknüpfen, sind gekennzeichnet als von undefinierter Struktur seiend. Es gibt N- und C-terminale Verlängerungen von 34 bzw. 17 Aminosäuren. Von einigen Untergruppen der acht Schleifen an dem C-Terminus des Beta-Faltblatts (in Richtung der linken Seite von 4), ebenso wie von dem C-terminalen "Schwanz" (Positionen 262 bis 278) wird angenommen, dass sie das aktive Zentrum des Enzyms umfassen, wie in anderen TIM-Tonnenenzymen. Obwohl es nur ein grobes Modell ist, erleichtert diese Struktur stark das rationale Bearbeiten des Enzyms, indem es ermöglicht, den Fokus auf jene Reste zu richten, die in vorhergesagten Schleifen des aktiven Zentrums gefunden werden. Es ist offensichtlich, dass zusätzliche Reste, die sich in der Nähe zu jenen in den vorhergesagten Schleifen und im "Schwanz" befinden, ebenso einen Teil des aktiven Zentrums umfassen können.
  • Die Auswahl von Stellen für Mutagenese wird verstärkt durch eine weitere vergleichende Strukturanalyse. Die Sequenzanalyse der 2,5-DKG-Reduktase offenbart sie als ein Mitglied einer großen Superfamilie monomerer, NADPH-abhängiger prokaryotischer und eukaryotischer Carbonylreduktasen, bekannt als die Aldo-Keto-Reduktasen (Carper et al., Exp. Eye Res., 49: 377–388 (1985); Bohren et al., J. Biol. Chem., 264: 9547–9551 (1989)). Mitglieder dieser Gruppe schließen biosynthetische Enzyme wie z. B. die Rinderprostaglandin-F-Synthase, entgiftende Enzyme wie z. B. Chlordeconreduktase und Aflatoxin-b1-Reduktase, ebenso wie Strukturproteine ohne identifizierte enzymatische Aktivität wie z. B. rho-Kristallin aus Froschlinsen ein.
  • Die Struktur menschlicher Aldosereduktase offenbart eine Anzahl an Schlüsseleigenschaften von Bedeutung bei dem Homologiemodellieren. Die Aldosereduktase-α/β-Tonne ist aus acht Beta-Strängen zusammengesetzt, die den "Kern" der Tonne bilden, umgeben von acht Alpha-Helices, die mit den Beta-Strängen durch Schleifen variierender Längen verbunden sind. Wie in anderen bekannten TIM-Tonnenenzymen umfassen die Schleifen, die an den C-terminalen Enden der Beta-Stränge gefunden werden, das aktive Zentrum des Enzyms, wo Substrat und Cofaktor binden und die Katalyse geschieht. NADPH wird am oberen Ende der Tonne in einer ausgedehnten Konformation gebunden, wobei der Nikotinamidring, von dem aus die Hydridübertragung geschieht, annähernd das genaue Zentrum der Tonne besetzt. Die Orientierung des Cofaktor-Nikotinamidrings ist so, wie sie für eine A-Klasse-Reduktase erwartet würde, wobei der pro-R-Wasserstoff in die Substratbindungstasche vorsteht. Es gibt zwei zusätzliche Sekundärstrukturmerkmale auf der Aldosereduktasetonne: zwei zusätzliche Alpha-Helices (bezeichnet H1 und H2), die auf den Schleifen jener Aminosäuren, die den Beta-Strang Sieben und die Alpha-Helix Sieben miteinander verbinden, und in dem C-terminalen "Schwanz" nach der Alpha-Helix Acht gefunden werden. Die Struktur der Aldosereduktase zeigt von diesem C-terminalen Schwanz, dass er über das obere Ende der Tonne hinaus steht, um einen Teil des aktiven Zentrums zu bilden.
  • Ein Modell der 2,5-DKG-Reduktase Variante A wurde gebildet, basierend auf den Koordinaten des Aldosereduktase:NADPH-Komplexes (Wilson et al., Science, 257: 81–84 (1992)), unter Anwendung von Modellierungsverfahren (Greer, Methods in Enzymology, 202: 239–252 (1991); Bajorath et al., Protein Science, 2: 1798–1810 (1993); beide hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). 5 zeigt die durch dieses Modell vorhergesagten Sekundärelemente.
  • Solche Information, wie welche Aminosäuren das aktive Zentrum eines Enzyms umfassen, kann aus dem Wissen der tatsächlichen dreidimensionalen Form des fraglichen Enzyms gewonnen werden, wie erhalten aus röntgenkristallografischen oder NMR-Untersuchungen. In dem Fall der 2,5-DKG-Reduktase gibt es bis jetzt keine solche äquivalente Information in der veröffentlichten Literatur. Folglich würde eine alternative Strategie in solch einem Fall die Verwendung der Modelle für die 2,5-DKG-Reduktase A sein, wie oben diskutiert, um die möglichen Aminosäureersetzungen oder Kombinationen einzelner Aminosäureersetzungen auf jene Reste zu begrenzen, von denen gefunden wurde, dass sie mit Bereichen des aktiven Zentrums verbunden sind.
  • Mutationen an bestimmten Stellen in einem Protein können zu einer erhöhten Expression jenes Proteins in Bakterien führen. Viele der anderen möglichen Punktmutationen werden in Clustern von ein bis vier eng benachbarten Aminosäuresubstitutionen erzeugt. Von den Mutanten, die stabil gefaltet werden, üben nur jene eine Aktivität aus, die signifikant unterschiedlich sind von dem Wildtypenzym, die in den 21-25-Bereich, den 46-52-Bereich, die 164-170-Schleife, die 188-220-Schleife, die 230-235-Schleife und den C-terminalen "Schwanz" (262–278) fallen. Dies ist eine zusätzliche Bestätigung, dass diese Schleifen- und Schwanzregionen das aktive Zentrum des Enzyms umfassen.
  • Jede Anzahl an hierin vorhergesagten Mutationen kann in einer einzelnen Mutante kombiniert werden. Offensichtlich schließt eine bestimmte Substitution an einer Stelle die Ersetzung mit einer anderen Aminosäure an derselben Örtlichkeit in der bestimmten Mutante aus.
  • Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, um die vorliegende Erfindung zu erläutern und um einen Fachmann dabei zu unterstützen, dieselbe zu machen und zu verwenden. Die Beispiele sind nicht in irgendeiner Weise bedacht, dass sie anderweitig den Schutzumfang der Erfindung begrenzen.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion des Plasmids pSStac.DKGR.AAA für die Mutagenese
  • Eine Aliquote des Plasmids ptrpl-35 wurde mit EcoRI- und HindIII-Restriktionsenzymen verdaut und das resultierende 1.690 Basenpaar-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Dieses Fragment wurde dann in den mit EcoRI und HindIII verdauten Vektor M13 mp19 ligiert. Der resultierende rekombinante Phage (bezeichnet als M13 mp19.DKGRA) wurde verwendet, um eine einzelsträngige Matrizenform des Phagen für die anschließende Mutagenese zu isolieren. An der Matrize wurde eine Mutation mit drei Oligonucleotiden ausgelöst, um drei neue Restriktionsenzymspaltstellen in dem 2,5-DKG-Reduktase-A-Gen einzuführen. Diese Stellen sind in jenem alle "stumm", obwohl sie eine neue Restriktionsspaltstelle in die DNS-Sequenz einführen, wobei die Aminosäuresequenz des Proteins, für das kodiert wird, wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes unverändert bleibt. Die drei mutagenen Oligonucleotide und die eingeführten Änderungen sind wie folgt: 1) das Oligonucleotid XbaA hat die Sequenz 5'CGCGAAGCTGGCTCTAGATCAGGTCGAC 3' (SEQ ID NO: 12) und führt eine XbaI-Stelle an der Aminosäureposition 98 ein; 2) das Oligonucleotid ApaA hat die Sequenz 5' ATCGTGGGGGCCCCTCGGTCAGGGC 3' (SEQ ID NO: 13) und führt eine neue ApaI-Stelle an der Aminosäureposition 188 ein; und 3) das Oligonucleotid KpnA hat die Sequenz 5' GAGGTCGACTGAGGTACCCGAACACCCG 3' (SEQ ID NO: 14) und führt eine KpnI-Stelle unmittelbar folgend auf das Stoppcodon (TGA) nach der letzten Aminosäure ein. Die Mutagenesereaktion und -bedingungen waren im Wesentlichen dieselben wie in Beispiel 2 für die Konstruktion der Mutante Q192R beschrieben. Nach der Mutagenesereaktion wurden positive Plaques durch Hybridisierung an mutagene Oligonucleotide unter stringenten Bedingungen identifiziert und der gesamte kodierende Bereich des 2,5-DKG-Reduktase-A-Fragmentes wurde sequenziert, um die Mutationen zu bestätigen.
  • Das Plasmid pSStac.DKGR.AAA wurde als eine Drei-Wege-Ligation der folgenden Fragmente konstruiert: 1) EcoRI bis HendIII von dem mutagenierten Phagen M13 mp19.DKGRA, wie oben beschrieben, wobei dieses Fragment das kodierende Gen für 2,5-DKG-Reduktase A enthält; 2) das PstI- bis EcoRI-Fragment (850 Basenpaare) von dem Plasmid ptac6 (ptac6 ist äquivalent zu dem Plasmid ptrpl-35, enthält jedoch den tac-Promotor, wie beschrieben in de Boer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25 (1983)), anstelle des trp-Promotors, der in ptrpl-35 gefunden wird, und 3) das 4.000 Basenpaar große Vektorfragment von HindIII bis PstI aus dem Plasmid p690. Das p690-Plasmid ist ein Derivat des Plasmida pBR322 mit dem RsaI/DraI-Restriktionsfragment aus dem Genom des Bakteriophagen f1 (Nucleotide 5489–5946), enthaltend den einzelsträngigen DNS-Replikationsstartpunkt, eingefügt in die PouII-Stelle.
  • Die drei oben beschriebenen Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese isoliert, aufgereinigt und in annähernd äquimolaren Verhältnissen ligiert und verwendet, um kompetente E. coli-Zellen zu transformieren. Die resultierenden Kolonien wurden durch Restriktionskartierung analysiert, um das korrekte Konstrukt zu identifizieren, benannt pSStac.DKGR.AAA (2).
  • BEISPIEL 2
  • Ortsgerichtete Mutagenese des 2,5-DKG-Reduktase-A-Gens
  • A. Zubereitung der Matrizen-DNS für die Mutagenese
  • E. coli-Zellen (Stamm XL1-Blue, Stratagene Corporation), die das Plasmid pSStac.DKGR.AAA tragen, wurden in LB-Medien (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press A.1 (1989)) wachsen gelassen bis zur frühen logarithmischen Phase und mit dem Helferphagen VCS-M13 (Stratagene) infiziert. Die Infektion mit einem Helferphagen stellt die benötigen Faktoren für das Verpacken und die Sekretion der einzelsträngigen Form des Plasmids pSStac.DKGR.AAA bereit. Die infizierten Zellen wurden über Nacht unter Schütteln bei 37 °C wachsen gelassen und am nächsten Tag wurden die Zellen entfernt durch Zentrifugation bei 10.000 rpm für 10 Minuten in einem Sorvall-SM24-Rotor. Der Überstand, der das verpackte Plasmid enthält, wurde aufbewahrt und das Zellpellet verworfen. Das verpackte Plasmid wurde durch die Zugabe von 1/4 Volumen 2,5 M NaCl, 20 % PEG (Polyethylenglykol) gefällt. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei 25 °C für 20 Minuten gelagert und dann wurde das Präzipitat durch Zentrifugation entfernt.
  • Das Präzipitat wurde in 0,4 ml TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA) gelöst und weiter aufgereinigt durch etliche aufeinander folgende Extraktionen mit einem gleichen Volumen an 50:50 Chloroform:Phenol. Nach jeder Extraktion wurde die wässrige (obere) Phase aufbewahrt. Die DNS wurde gefällt mit 2 Volumen an eiskaltem Ethanol. Das Präzipitat wurde wieder gewonnen durch Zentrifugation und gelöst in TE-Puffer. Die Konzentration des Plasmids wurde geschätzt durch Messen der optischen Absorption bei 260 nm unter Verwendung der Umwandlung von 1 OD260 = 40 μg einzelsträngige DNS pro Milliliter. Die Konzentration des Plasmids wurde auf 1 μg pro ml mit TE angeglichen.
  • B. Phosphorylierung des Oligonucleotidprimers
  • Ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz 5' GCCCCTCGGTCGCGGCAAGTACG 3' (SEQ ID NO: 15) wurde synthetisiert und wie folgt phosphoryliert: Das Oligonucleotid wurde auf eine Konzentration von 5,0 OD260-Einheiten pro ml verdünnt. Dann wurden 2,5 Oligonucleotid mit 3 μl 10x Kinasepuffer (1 M Tris, pH 8,0, 100 mM MgCl2, 70 mM Dithiothreitol, 10 mM ATP), 25 μl Wasser und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (4 Einheiten/μl, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) kombiniert. Die Mischung wurde bei 37 °C für 15 Minuten inkubiert, dann wurde das Kinaseenzym durch Erhitzen auf 70 °C für 10 Minuten inaktiviert.
  • C. Mutagenesereaktion
  • 6 μl von mit Kinase behandeltem Primer wurden mit 1 μg Matrizen-DNS und 2,5 μl 10x RB-Puffer (70 mM Tris, pH 7,5, 50 mM Mercaptoethanol, 550 mM NaCl und 1 mM EDTA) in einem Gesamtvolumen von 10,5 μl kombiniert. Der Primer wurde mit der Matrize zum Doppelstrang gebildet durch Erhitzen der Mischung auf 65 °C für 5 Minuten, und dann langsames Abkühlen auf 25 °C über einen Zeitraum von 30 Minuten.
  • Zu der Annealing-Mischung wurden 1,5 μl 10x RB-Puffer, 1 μl 10 mM ATP, 1 μl 10 mM DTT (Dithiothreitol) und 1 μl T4-DNS-Ligase (6 Weiss-Einheiten/μl, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) hinzugefügt. Nach 10 Minuten wurden 1 μl 1 M MgCl2, 1 μl 5 mM dNTPs (eine äquimolare Mischung aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 0,5 μl Klenow (5 Einheiten/μl, großes Fragment der DNS-Polymerase I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) hinzugefügt und die Mischung wurde bei 15 °C über Nacht inkubiert.
  • Am folgenden Tag wurden die gefroren kompetenten E. coli-MutL-Zellen mit einer Aliquote der Reaktionsmischung transformiert und auf Agarplatten ausplattiert, die Antibiotikaselektion enthielten (12,5 μg/ml Tetracyclin, 50 μg/ml Ampicillin). Kolonien, die mutierte Plasmide tragen, wurden anfänglich durch Hybridisierung mit dem mutagenen Ausgangsoligonucleotid unter stringenten Bedingungen identifiziert (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1585–1588 (1988)). Mutierte Plasmide wurden dann in einer einzelsträngigen Form wie in Abschnitt A zubereitet und bestätigt durch direktes DNS-Sequenzieren des Plasmids (United States Biochemical Corporation, Sequenase-Sequenzierkit). Die resultierende mutierte Q192R-2,5-DKG-Reduktase A, wie in Beispiel 5 gezeigt, hatte eine verbesserte katalytische Aktivität im Vergleich zu der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A.
  • BEISPIEL 3
  • Expression der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A in Acetobacter cerinus
  • Plasmid-DNS wurde in Acetobacter cerinus (ATCC Nr. 39140) durch Elektroporation eingeführt, wie beschrieben (Wirth et al., Mol. Gen. Genet., 216(1): 175–177 (1989)) unter Verwendung eines Genepulser-Apparates (Biorad Corporation). Die Zellen wurden wachsen gelassen bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD550 ⁓0,2–0,8) in 100 ml LB-Medium und wieder gewonnen durch Zentrifugation bei 5.000 rpm in einem Sorvall-SS-34-Rotor für 5 Minuten bei 4 °C. Die Zellen wurden in einem halben Volumen eiskaltem Elektroporationspuffer (300 mM Sucrose, 7 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und 1 mM MgCl2) resuspendiert, wiederum pelletiert durch Zentrifugation und anschließend in 1/20 Volumen Elektroporationspuffer resuspendiert und bis zur Verwendung auf Eis gelagert.
  • Plasmid-DNS (0,1 bis 1,0 μg) wurde zu einer 0,4 cm Elektroporationsküvette (Biorad Corporation) hinzugefügt, welche 0,8 ml der zubereiteten Acetobacter-Zellen enthielten. Die Zellen und die DNS wurden in der Küvette vermischt und auf Eis für 10 Minuten vor der Elektroporation gekühlt. Den Zellen und der DNS wurde ein einzelner Puls von 2500 mV unter Verwendung einer 25μF-Kondensatoreinstellung gegeben und sofort auf 3,0 ml mit frischen LB-Medien verdünnt. Den verdünnten Zellen wurde dann ermöglicht, sich unter Schütteln bei 30 °C für 2 Stunden zu erholen. Aliquoten (10–100 μl) der transformierten Zellen wurden auf Selektionsmedien (LB-Altarplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin) ausplattiert und die Platten wurden über Nacht bei 30 °C wachsen gelassen.
  • BEISPIEL 4
  • Aufreinigung der mutierten Q192R- und der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A
  • Einzelkolonien von transformierten Acetobacter cerinus-Zellen wurden in 200 ml 2 X YT-Medien (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)), enthaltend Antibiotika (12,5 μg/ml Tetracyclin und 50 μg/ml Ampicillin) bei 30 °C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation wieder gewonnen (15 Minuten bei 8000 rpm in einem Sorvall-GS3-Rotor) und gefroren gelagert. Die Zellen wurden dann in 1/5 Volumen Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM EDTA, 0,1 % Tween, 2 mg/ml Lysozym) aufgetaut und für 2 Stunden auf Eis lysiert. Die lysierten Zellen wurden wiederum wie zuvor zentrifugiert und der Überstand, der den rohen Zellextrakt enthielt, wurde aufbewahrt.
  • Das 2,5-DKG-Reduktase-A-Protein wurde von dem Rohzellextrakt durch Chromatographie auf DEAE-Zellulose aufgereinigt. DEAE-Zellulose (Whatman DE-52, Marke) wurde mit 25 mM Tris, pH 7,0, voräquilibriert. Ein Gesamtvolumen von 5,0 ml des Gels wurde in eine wegwerfbare Plastik-Chromatographiesäule gegossen, auf welche der Rohzellextrakt aufgetragen wurde. Nachdem der gesamte Extrakt an die Säule gebunden hatte, wurde die Säule mit zwei Säulenvolumen 25 mM Tris, pH 7,0, gewaschen, dann mit einem Volumen 25 mM Tris, pH 7,0, enthaltend 0,3 M NaCl, gewaschen und anschließend wurde das 2,5-DKG-Reduktase-A-Protein mit 25 mM Tris, pH 7,0, enthaltend 0,6 M NaCl, eluiert. Die Zubereitungen wurden auf die Proteinkonzentration durch das Dicinchonsäureverfahren (Methods in Enzymology, 182: 60–62 (1990)) untersucht und auf ihre Reinheit durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft.
  • BEISPIEL 5
  • Kinetische Charakterisierung der Wildtyp- und der mutierten Q192R-2,5-DKG-Reduktase A
  • Die Zubereitungen der Wildtyp- und mutierten Q192R-2,5-DKG-Reduktase-A-Enzyme wurden kinetisch charakterisiert als ihre Fähigkeit, das Substrat 2,5-DKG zu 2-KLG zu reduzieren. Die Untersuchungen wurden in 1 ml Gesamtvolumen aus 50 mM Tris, pH 7,0, enthaltend 0,2 mM NADPH, eine konstante Enzymmenge (15–20 μg) und Substratmengen, die von 2 bis 14 mM variierten, durchgeführt. Die Untersuchungen wurden bei 25 °C durchgeführt und die Rate der Substratreduktion wurde spektrophotometrisch durch Messen des Verlustes an Absorption bei 340 nm Wellenlänge (welche kennzeichnend ist für die Oxidation des Cofaktors NADPH zu NADP+) gemessen.
  • Die Daten wurden gemäß der wohl bekannten Michaelis-Gleichung analysiert, um die kinetischen Parameter Vmax und Km unter Verwendung des Enzfit-Softwarepaketes (Biosoft, Cambridge, UK) auf einem Epson-Tischrechner zu bestimmen. Die Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A hatte eine offensichtliche Vmax für das Substrat 2,5-DKG von 7,8 μM pro Minute pro Milligramm Protein, während die Q192R-Mutante eine offensichtliche Vmax von 14,0 hatte, eine 1,8-fache Steigerung. Der Km oder die Michaelis-Konstante des Wildtypenzyms war anscheinend 28 mM, wohingegen der Km-Wert der Q192R-Mutante anscheinend 21 mM für dieses Substrat war. Dies führte zu einer offensichtlichen Spezifizitätskonstante (kcat/Km) von 140 M–1 s–1 für das Wildtypenzym und einer Spezifizitätskonstante von 335 M–1 s–1 für die Q192R-Mutante, eine 2,4-fache Steigerung.
  • BEISPIEL 6
  • Homologiemodell der 2,5-DKG-Reduktase A
  • Ein Modell der 2,5-DKG-Reduktase Variante A wurde gebildet, basierend auf den Koordinaten des Aldosereduktase:NADPH-Komplexes (Wilson et al., Science, 257: 81–84 (1992)), unter Verwendung von modellierenden Verfahren (Greer, Methods in Enzymology, 202: 239–252 (1991), hierin eingeschlossen durch Bezugnahme; Bajorath et al., Protein Science, 2: 1798–1810 (1993); hierin durch Bezugnahme eingeschlossen), bei welchen "strukturell konservierte Bereiche" (im Allgemeinen Bereiche mit Sekundärstruktureigenschaften wie Alpha-Helix und Beta-Faltblatt oder Bereiche mit ausgedehnter Sequenzidentität) definiert werden und konstant gehalten werden, zu denen später "Schleifen" variabler Aminosäuren hinzugefügt werden. Die Konformation dieser Schleifen wird entweder durch Suche der Konformation mittels die Kristallstrukturdatenbanken modelliert oder durch zufällige Konformationsbildungsalgorithmen.
  • 6 zeigt die Proteinsequenzanordnung der 2,5-DKG-Reduktasen A und B mit menschlicher Aldosereduktase; umrandete Bereiche zeigen Sekundärstruktureigenschaften der Kristallstruktur der Aldosereduktase (Bruce et al., Biochem J., 299: 805–811 (1994)). Bei dieser Modellierung waren die Hauptänderungen: Ersatz der langen Schleife, die den Beta-Strang Vier und die Alpha-Helix Vier bzw. den Beta-Strang Sieben und die Helix H1 verbindet, durch kürzere Schleifen und Modellieren einer neuen Schwanzkonformation, um dem kürzeren Schwanz der 2,5-DKG-Reduktase A Rechnung zu tragen. Die verbleibende Struktur wurde konstant gehalten. Ähnlich ausschauende Strukturen für diese Schleifen wurden aus einer Reihe an Möglichkeiten ausgewählt, erzeugt durch ein zufälliges Konformationserzeugungsprogramm. Das Modell wurde verwendet, um eine Anzahl an Resten im vorhergesagten aktiven Zentrum der 2,5-DKG-Reduktase zum Ziel zu nehmen für die Mutagenese, und wird auch verwendet in den folgenden Abschnitten, um die ungefähren Örtlichkeiten dieser Mutanten in der 2,5-DKG-Reduktase-Tonnenstruktur zu erläutern.
  • BEISPIEL 7
  • Konstruktion der F22Y-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A
  • Das Homologiemodell wurde verwendet, um strukturelle Unterschiede um die Substratsbindungstasche herum zu bestimmen, welche die Basis für Unterschiede in der beobachteten Substratumsetzungsrate der 2,5-DKG-Reduktase A und DKG-Reduktase B sein könnten. Insbesondere wurde das Homologiemodell verwendet, um Aminosäuren zu lokalisieren für eine Ersetzung, verbunden mit der Substratbindungstasche der 2,5-DKG-Reduktase A, die weniger hydrophil war als die Gegen-Aminosäure in der 2,5-DKG-Reduktase B.
  • Die Aminosäure 22 scheint Teil des aktiven Zentrums der Substratspezifitätstasche in sowohl der Aldosereduktasestruktur als auch in dem 2,5-DKG-Reduktase-A-Homologiemodell zu bilden. Ein Phenylalanin wird in dem 2,5-DKG-Reduktase-A-Enzym gefunden, während ein Tyrosin diese Position in der Sequenz der 2,5-DKG-Reduktase B besetzt. Die zusätzliche Hydroxyleinheit von Tyrosin, im Vergleich zu Phenylalanin, könnte dem aktiven Zentrumsbereich des 2,5-DKG-Reduktase-B-Enzyms H-Bindungsfähigkeit verleihen.
  • Die Konstruktion dieser beiden Mutanten, F22Y und Y23F, ist wie folgt: vier Oligonucleotide, zwei für die Mutagenese und zwei für das Sondieren, wurden wie folgt entworfen:
  • Figure 00270001
  • Die Oligonucleotide mit dem Anhang ".m" wurden mit Kinase behandelt und verwendet, um Matrizen für die Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase-A- und -B-Gene mit dem Amersham-Kit zu mutieren (Matrizen sind EcoRI-KpnI-Fragmente der Gene für die DKG-Reduktasen A und B in M13mp19). Die Schritte in den Mutagenesereaktionen, die Isolierung und Charakterisierung der Mutanten waren im Wesentlichen dieselben wie ausgeführt für die Konstruktion der Q192R-Mutante, mit der Ausnahme der Oligonucleotide mit dem Anhang ".p", welche verwendet wurden, um die Mutanten zu isolieren. Die resultierende F22Y-Mutante von 2,5-DKG-Reduktase A hat ein Tyrosin an der Position 22 und die resultierende Y23F-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase B hat ein Phenylalanin an Position 23.
  • BEISPIEL 8
  • Kinetische Charakterisierung der F22Y-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A und der Y23F-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase B
  • Die kinetische Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y und der 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante Y23F wurde im Wesentlichen auf dieselbe Art und Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass, um die kinetischen Parameter für die NADPH-abhängige Reduktion von 2,5-DKG durch die 2,5-DKG-Reduktasen zu bestimmen, eine Reihe an Reaktionen mit konstanten Sättigungskonzentration von NADPH (200 μM) und variierenden Konzentrationen an Substrat von 0 bis 30 mM durchgeführt wurden. Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y zeigt eine signifikant und reproduzierbar erhöhte Aktivität im Vergleich mit der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A (7). Die Aktivität der 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante Y23F ist niedriger als die der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase B (7). Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y könnte auch eine gesteigerte Resistenz gegen die Substratinhibition im Vergleich zu dem Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase-B-Enzym zeigen.
  • BEISPIEL 9
  • Konstruktion der I49N-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A und der N50A-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase B
  • Position 49 wurde für die Mutagenese ausgewählt, basierend auf der Nähe dieser Stelle zu der Substratbindungsstelle in dem Homologiemodell und einem vorhergesagten Hydrophobieunterschied jener Position in den 2,5-DKG-Reduktase-A- und -B-Enzymen: die 2,5-DKG-Reduktase A hat ein Isoleucin an der Position 49, wohingegen die 2,5-DKG-Reduktase B ein Asparagin an der Position 50 hat. Die Position 49 wird auf einer Schleife von Aminosäuren gefunden, die den Beta-Strang 2 und die Alpha-Helix 2 verbindet. Zwei Mutanten wurden konstruiert, um die Wirkung von Seitenkettenmutation an dieser Stelle zu untersuchen: I49N, die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante, und die 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante N50A. Der Bau dieser Mutanten war wie folgt: die Oligonucleotidsequenzen waren wie folgt: A:I49N.m = 5'–C
  • Figure 00290001
  • Die Schritte in dem Mutagenesereaktionen, die Isolierung und Charakterisierung der Mutanten waren im Wesentlichen dieselben, wie erläutert für die Konstruktion der F22Y-Mutante. Die resultierende I49N-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A hat ein Asparagin an der Position 49 und die resultierende N50A-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase B hat ein Alanin an der Position 50.
  • BEISPIEL 10
  • Kinetische Charakterisierung der I49N-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A und der N50A-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase B
  • Die kinetische Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante I49N und der 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante N50A wurde im Wesentlichen auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass um die kinetischen Parameter für die NADPH-abhängige Reduktion von 2,5-DKG durch 2,5-DKG-Reduktasen zu bestimmen, eine Reihe an Reaktionen mit konstanter Sättigungskonzentration von NADPH (200 μM) und variierenden Substratkonzentrationen von 0 bis 30 mM durchgeführt wurden. Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante I49N produzierte keinerlei nachweisbare Spiegel rekombinanten Proteins in der Wirtszelle, möglicherweise wegen struktureller Instabilität. Die 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante N50A exprimierte normal. Kinetische Ergebnisse für die 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante N50A sind in 8 gezeigt. Die 2,5-DKG-Reduktase-B-Mutante N50A übte bis zu Substratkonzentrationen, die höher als 15 mM waren, keine Substrathemmung aus.
  • Die Enzymaktivität der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase B schwächt nach der Zugabe von nur 5 mM 2,5-DKG ab (8).
  • BEISPIEL 11
  • Konstruktion der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten D278A, V277A, E276A, D275A, P274A, H273A, A272G, S271A, V270A, R269A, S267A und D265A der 2,5-DKG-Reduktase A
  • Die Technik des "ala-Scannings" wurde verwendet, um Reste im C-Terminus der 2,5-DKG-Reduktase A zu lokalisieren (Cunningham und Wells, Science, 204: 1081 (1989)), hierin eingeschlossen durch Bezugnahme. Insgesamt wurden 11 ala-Scan-Mutanten konstruiert: D278A, V277A, E276A, D275A, P274A, H273A, S271A, V270A, R269A, S267A und D265A, basierend auf der Vorhersage, dass der durch diese Mutanten abgedeckte Bereich Teil des aktiven Zentrums des Enzyms war. Zusätzlich wurde die folgende Nicht-ala-Scan-Mutante erzeugt: Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante A272G wurde erzeugt durch Ersetzen des Alanins an der Position 272 mit einem Gycin an jener Position. Die 2,5-DKG-Reduktase-Mutanten wurden unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide konstruiert:
  • Figure 00300001
  • Die Schritte in den Mutagenesereaktionen, die Isolierung und Charakterisierung der Mutanten waren im Wesentlichen dieselben, wie für die Konstruktion der Q192R-Mutante ausgeführt.
  • BEISPIEL 12
  • Kinetische Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-Mutanten D278A, V277A, E276A, D275A, P274A, H273A, A272G, S271A, V270A, R269A, S267A und D265A der 2,5-DKG-Reduktase A
  • Eine grobe kinetische Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten D278A, V277A, E276A, D275A, P274A, H273A, A272G, S271A, V270A, R269A, S267A und D265A wurde durchgeführt. Eine dieser Mutanten, A272G, resultierte in einer erhöhten Aktivität. Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante A272G wurde im Wesentlichen auf dieselbe Art und Weise charakterisiert wie in Beispiel 5, mit der Ausnahme, dass, um kinetische Parameter für die NADPH-abhängige Reduktion von 2,5-DKG durch die 2,5-DKG-Reduktasen zu bestimmen, eine Reihe an Reaktionen durchgeführt wurden mit konstanten Sättigungskonzentrationen von NADPH (200 μM) und variierenden Konzentrationen an Substrat von 0 bis 30 mM. Die mutierte 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante A272G zeigte eine signifikante und reproduzierbare Aktivität gegenüber dem Wildtyp-A-Enzym bei sämtlichen Substratkonzentrationen, mit nur geringfügigen Anzeigen an Substrathemmung in dem untersuchten Bereich (siehe 9). Die Mutante übte eine offensichtliche Vmax von 21,44 +/– 4,10 Sek.–1 und einen offensichtlichen Km von 42,61 +/– 12,13 mM aus.
  • BEISPIEL 13
  • Konstruktion der 2,5-DKG-Reduktase-A-Doppelmutanten F22Y/Q192R, Q192R/A272G und F22Y/A272G
  • Drei 2,5-DKG-Reduktase-A-Doppelmutanten wurden konstruiert: F22Y/Q192R, Q192R/A272G und F22Y/A272G. Die Konstrukte waren wie folgt:
  • Für die Q192R/A272G-Doppelmutante wurde das Plasmid ptrpl-35.A:Q192R mit EcoRI und BamHI verdaut, um ein 787 by langes Fragment zu erzeugen, das die Q192R-Mutation enthält. Das Plasmid ptrpl-35.A:A272G wurde mit BamHI und ClaI verdaut, um ein 708 by langes Fragment zu erzeugen, das die A272G-Mutante enthält. Die beiden Mutanten wurden in einer Drei-Wege-Ligation mit dem EcoRI und ClaI verdauten Vektor ptrpl-35.A kombiniert, um die Doppelmutante ptrpl-35.A:Q192R/A272G zu erzeugen. Die Mutanten wurden durch Restriktionsverdauungen verifiziert, um sicherzustellen, dass beide erwarteten Fragmente an Ort und Stelle waren. Die resultierende Q192R/A272G-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A hat ein Arginin an der Position 192 und ein Glycin an der Position 272.
  • Für die 2,5-DKG-Reduktase-Doppelmutante F22Y/A272G wurde ein F22Y enthaltendes Fragment mit 600 Basenpaaren durch EcoRI- und Apal-Verdauung des Plasmids ptrpl-35.A:F22Y zubereitet. Ein Fragment 0300 bp), das die Mutation A272G trägt, wurde durch ApaI- und KpnI-Verdauungen des Plasmids prtpl-35.A:A272G zubereitet. Die Mutante wurde dann in einer Drei-Wege-Ligation mit EcoRI-KpnI-verdautem ptrpl-35.A kombiniert, um das Plasmid ptrpl-35.A:F22Y/A272G zu ergeben. Die resultierende F22Y/A272G-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A hat ein Tyrosin an der Position 22 und ein Glycin an der Position 272.
  • Die mutierte 2,5-DKG-Reduktase A F22Y/Q192R wurde durch eine ähnliche Strategie zubereitet, das Oligonucleotid, welches die Q192R-Mutation regierte, entfernte jedoch die ApaI-Stelle, so dass das Konstrukt durch die XhoI-Stelle des DKG-Reduktase-A-Gens gemacht wurde. Das Plasmid ptrpl-35.A:F22Y wurde mit EcoRI und XhoI verdaut, wodurch ein 435 by langes Fragment erhalten wurde, das die F22Y-Mutation enthält. In einer zweiten Verdauung wurde ptrpl-35.A:Q192R mit XhoI und KpnI verdaut, um ein 400 by langes Fragment zu ergeben, das die Q192R-Mutation enthält. Diese beiden Fragmente wurden in einer Drei-Wege-Ligation mit EcoRI- und KpnI-verdautem ptrpl-35.A kombiniert, um das Plasmid ptrpl-35.A:F22Y/Q192R zu ergeben. Die resultierende F22Y/Q192R-Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A hat ein Tyrosin an der Position 22 und ein Arginin an der Position 192.
  • Alle drei Doppelmutanten wurden durch Restriktionskartierung und direktes Sequenzieren bestätigt, um sicherzustellen, dass die beiden richtigen Mutationen an Ort und Stelle waren.
  • BEISPIEL 14
  • Kinetische Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-A-Doppelmutanten F22Y/Q192R, Q192R/A272G und F22Y/A272G
  • Die kinetische Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-A-Doppelmutanten F22Y/Q192R, Q192R/A272G und F22Y/A272G wurde im Wesentlichen auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass, um die kinetischen Parameter für die NADPH-abhängige Reduktion von 2,5-DKG durch 2,5-DKG-Reduktasen zu bestimmen, eine Reihe an Reaktionen mit konstanter Sättigungskonzentration von NADPH (200 μM) und mit variierenden Substratkonzentrationen von 0 bis 30 mM durchgeführt wurden. Die Substratkinetiken für die Doppelmutanten sind in 10 gezeigt. Doppelmutanten, die Q192R enthalten, führten nicht zu einer erhöhten Aktivität. Die katalytische Aktivität der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y/Q192R ist ähnlich zu jener der beiden Elternmutanten. Die katalytische Aktivität der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante Q192R/A272G ist niedriger als die der Wildtyp-DKG-Reduktase A. Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutante F22Y/A272G-Doppelmutante hat eine deutliche Additivität oder sogar Synergie gegenüber ihren beiden Elternenzymen und übertrifft die Aktivität der DKG-Reduktase B bei Substratkonzentrationen, die höher als 17,5 mM sind. Diese Doppelmutante zeigt auch einen Substratinhibitionseffekt.
  • BEISPIEL 15
  • Cofaktor-Kinetik-Charakterisierung der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten F22Y, Q192R, A272G und F22Y/A272G
  • Die Cofaktor-Affinität der 2,5-DKG-Reduktase A F22Y, Q192R, A272G und F22Y/A272G wurde bestimmt durch Analyse einer Reihe an Reaktionen mit konstanter Substratkonzentration und variierenden Konzentrationen an NADPH. Jede Reaktionsreihe bestand aus 50 mM bis-Tris, pH 6,8, 10 mM 2,5-DKG, von 2,5 bis 200 μM NADPH und Enzym in einem Gesamtvolumen von 1,0 mM. Anfängliche Geschwindigkeitsdaten für die Reaktionen wurden an die Michaelis-Menten-Gleichung durch nicht-lineare Regressionsanalyse angeglichen, wie kürzlich beschrieben, um KM,NADPH zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Abweichungen zu der Michaelis-Konstante für NADPH zwischen den Mutanten sind nicht signifikant; die Werte liegen alle innerhalb von +/– 30 des KM,NADPH des Wildtypenzyms und erstrecken sich zwischen einem hohen Wert von 8,19 μM für die 2,5-DKG-Reduktase A F22Y/A272G und einem niedrigen Wert von 4,92 μM für die 2,5-DKG-Reduktase A A272G.
  • BEISPIEL 16
  • Mutierte thermische Stabilität der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten F22Y, Q192R, A272G und F22Y/A272G
  • Thermische Instabilität kann eine kritische Eigenschaft eines Enzyms sein, das seine Nützlichkeit in einem industriellen Prozess begrenzen kann. Die 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten F22Y, Q192R, A272G und F22Y/A272G mit gesteigerter katalytischer Aktivität wurden der Zirkulardichroismus-Analyse ausgesetzt, um zu bestimmen, welche Auswirkungen die Mutationen haben könnten auf die thermische Stabilität. Proteinproben der 2,5-DKG-Reduktase A und B und der 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten F22Y, Q192R, A272G und F22Y/A272G wurden über Amicon-YM-10-Membranen aufkonzentriert, entsalzt in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, unter Verwendung einer vorgepackten G25-Säule (PD-10 von Pharmacia) und auf eine Endkonzentration von 200 μg/ml für die Zirkulardichroismus-Analyse angeglichen. Proben wurden in einem Aviv Model 60DS Zirkulardichroismus-Spektrophotometer in einer 1,0mm-Küvette gemessen. Die Messungen wurden gegen den Pufferhintergrund korrigiert. Rohe Elliptizitätsdaten (Grad) wurden in molare Elliptizitätswerte (Grad M–1 cm–1) umgewandelt durch die Beziehung: molare Elliptizität = (100)(Elliptizität)/C)(1), wo C die molare Konzentration der Probe und 1 die Weglänge in Zentimetern ist. Die Proteine zeigten Minima bei ⁓220 nm, was kennzeichnend ist für einen Alpha-Helixgehalt. Thermische Denaturierung wurde bestimmt durch Überwachung des Verlusts an Elliptizität bei 220 nm als eine Funktion der Temperatur. Tm-Werte vom Mittelpunkt der thermischen Denaturierungskurven sind in 12 gezeigt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION
    • (i) ANMELDER: POWERS, DAVID B. ANDERSON, STEPHEN
    • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: VERBESSERTE VERFAHREN FÜR DIE HERSTELLUNG VON VITAMIN C
    • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 35
    • (iv) KORRESPONDENZADRESSE: (A) ADRESSAT: HOWREY & SIMON (B) STRASSE: 1299 PENNSYLVANIA AVENUE, N.W. (C) STADT: WASHINGTON (D) STAAT: DC (E) LAND: US (F) PLZ:20004
    • (v) MASCHINENLESBARE FORM (A) DATENTRÄGER: DIKSETTE (B) COMPUTER: IBM-PC kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.25
    • (vi) DATEN DER VORLIEGENDEN PATENTANMELDUNG: (A) ANMELDENUMMER: US 08/585,595 (B) ANMELDETAG: 16. Januar 1996 (C) KLASSIFIKATION:
    • (vii) DATEN DER FRÜHEREN PATENTANMELDUNG: (A) ANMELDENUMMER: US 08/584,019 (B) ANMELDEDATUM: 11. Januar 1996
    • (viii) ANWALT-/VERTRETERINFORMATION: (A) NAME: AUERBACH, JEFFREY L (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32680 (C) REFERENZ-/AKTENNUMMER: 6137-0014 CIP
    • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION: (A) TELEFON: (202) 383-7451 (B) TELEFAX: (202) 383-6610
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 278 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: Protein
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: 2,5-DKG-REDUKTASE A (C) EINZELNES ISOLAT: CORYNEBACTERIUM SP.
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
    Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 277 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: Protein
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: DKGR B (C) STAMM: CORYNEBACTERIUM SP.
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
    Figure 00370002
  • Figure 00380001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 316 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: Protein
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: ALDOSEREDUKTASE (C) STAMM: HOMO SAPIENS
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
    Figure 00380002
  • Figure 00390001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
    Figure 00400001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 25 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
    Figure 00400002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
    Figure 00410001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 24 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
    Figure 00410002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
    Figure 00410003
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
    Figure 00420001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
    Figure 00420002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 18 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
    Figure 00430001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
    Figure 00430002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 25 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
    Figure 00430003
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART-: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
    Figure 00440001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
    Figure 00440002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 29 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
    Figure 00450001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 29 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
    Figure 00450002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
    (B) ART: Nukleinsäure
    (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
    (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) GEGENSINN: NEIN
  • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
    (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
    Figure 00460001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 17 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
    Figure 00460002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
    (B) ART: Nukleinsäure
    (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
    (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) GEGENSINN: NEIN
  • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
    (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
    Figure 00460003
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 17 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
    Figure 00470001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 31 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
    Figure 00470002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 17 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
    Figure 00480001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
    Figure 00480002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
    Figure 00480003
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
    Figure 00490001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
    Figure 00490002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
    Figure 00500001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
    Figure 00500002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22. Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
    Figure 00500003
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
    Figure 00510001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
    Figure 00510002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
    Figure 00520001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
    • (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
    Figure 00530001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
    • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
    • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) GEGENSINN: NEIN
    • (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS: CORYNEBACTERIUM SP
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
    Figure 00530002

Claims (15)

  1. Mutante Form einer 2,5-DKG-Reduktase A (2,5-Diketogluconsäure-Reduktase A) mit verbesserter Fähigkeit, 2,5-DKG zu 2-KLG (2-Keto-L-gluconsäure) zu überführen und mit einer Aminosäuresubstitution in Position 22, wie in SEQ ID Nr. 1 definiert.
  2. Mutante gemäß Anspruch 1 mit einem Tyrosin in Position 22.
  3. Mutante gemäß Anspruch 1 mit einem Serin, Threonin, Histidin, Glutamin, Asparagin oder Tryptophan in dieser Position 22.
  4. Mutante gemäß Anspruch 1 oder 2 mit einer Aminosäuresubstitution in Position 272, wie in SEQ ID Nr. 1 definiert.
  5. Mutante gemäß Anspruch 4 mit einem Glycin in der Position 272.
  6. Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 und 5 mit verminderter Substratinhibition.
  7. Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 4 und 5 mit verbesserter Temperaturstabilität.
  8. Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 und 5 mit erhöhter Wechselzahl des Substrats durch das Enzym oder einer gesteigerten Affinität für das Substrat.
  9. DNS-Konstrukt, umfassend ein Strukturgen, enthaltend mindestens ein mutiertes Codon, wobei das Gen eine Mutante nach einem der vorstehenden Ansprüche kodiert.
  10. Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor, der ein DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 9 enthält.
  11. Wirtszelle gemäß Anspruch 10, bei der es sich um ein Bakterium handelt.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 11, worin das Bakterium aus der Gattung Erwinia, Gluconobacter oder Acetobacter ist.
  13. Wirtszelle nach Anspruch 12, worin das Bakterium Acetobater cerinus (IFO 3263) ist.
  14. Wirtszelle nach Anspruch 10, worin der Expressionsvektor ein Plasmid ist.
  15. Wirtszelle nach Anspruch 10, worin der Expressionsvektor ptrpl-35.A wie in 3 mit den Mutationen F22Y/A272G oder F22Y/Q192R ist.
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