DE3909249A1 - Dna mit genetischer information von glutaminsynthetase und verwendung derselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA mit genetischer Information der Glutaminsynthetase, einen Transformanten, welcher diese DNA trägt, ein Polypeptid, das durch die Expression der genetischen Information der DNA durch diesen Transformanten hergestellt wurde, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Polypeptids.

Glutaminsynthetase wird gemäß der E.C.6.3.1.2.-Nomenklatur als L-Glutamat : Ammoniakligase (ADP-bildend) bezeichnet. Das Enzym katalysiert die folgende Reaktion [Enzyme Handbook, 775 (1982); Asakura Publishing Co.]:

ATP+L-Glutamat+NH₄⁺ ⇄ ADP+ anorganische Phosphorsäure+L-Glutamin.

Die Glutaminsynthase ist bekanntermaßen im Hirn und in der Leber verschiedener Tiere vorhanden sowie in Bohnen. Es ist auch bekannt, daß sie durch Mikroorganismen erzeugt wird, und zwar durch solche der Gattung Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium (JP-OS 33594/ 1982 und 155321/1984), Methanobacterium [Arch. Microbiol., 144 (4), 350-354 (1986)] und Bacillus [J. Biochem. 98 (5), 1211-1219 (1985)].

Es wurde auch bereits über die Klonung von Glutaminsynthetase berichtet, und zwar abgeleitet vom chinesischen Hamster [internationale Publikation WO87/04462; The EMBO Journal, Band 3, Nr. 1, 65-71 (1984)], von Phaseolus vulgaris L. [Journal of Molecular and Applied Genetics, 2, 589-599 (1984)] und von einem photosynthetischen Bakterium Rhodopseudomonas capsulata [Journal of Bacteriology, Band 155, Nr. 1, Juli 1983, 180-185].

Da Glutaminsynthetase bei der Umsetzung, bei der es als Katalysator gemäß der obigen Reaktionsformel wirkt, das NH₄⁺-Ion nutzt, kann es als Reagens zur quantitativen Bestimmung des NH₄⁺-Ions, das in einer Probe vorliegt oder in einer Reaktion freigesetzt wird, verwendet werden oder zum Verbrauch von NH₄⁺-Ionen, die in einer Probe enthalten sind (JP-OS 56095/1986). Beispielsweise wird Glutaminsynthetase als Reagens für die quantitative Bestimmung oder den Verbrauch des NH₄⁺-Ions oder zur quantitativen Bestimmung oder des Verbrauchs von Harnstoff gemäß folgenden Reaktionsgleichungen verwendet:

Diese Reaktionen führen gegebenenfalls zu einer H₂O₂ erzeugenden Reaktion einer NADH₂ verbrauchenden Reaktion und gestatten die rasche quantitative Bestimmung des NH₄⁺-Ions oder Harnstoffs. Bei dem H₂O₂ erzeugenden Reaktionssystems kann H₂O₂ leicht quantitativ bestimmt werden mittels einer H₂O₂-Elektrode oder der H₂O₂-Peroxidase-Colorimetrie. Als Alternative kann das erzeugte H₂O₂ durch die Wirkung von Catalase konsumiert werden. Bei dem NADH₂ verbrauchenden Reaktionssystem kann die quantitative Analyse durchgeführt durch Ermittlung der Absorptionsverminderung bei einer Wellenlänge von 340 bis 360 nm.

Die Produktivität von Glutaminsynthetase mittels bekannter, Glutaminsynthetase erzeugender Mikroorganismen, wie sie bisher beschrieben wurden, ist ziemlich niedrig. Ein weiteres Problem, das bei diesen bekannten, Glutaminsynthetase erzeugenden Mikroorganismen auftritt, besteht in der Schwierigkeit, koexistierende andere Enzyme aus dem Produkt zu eliminieren. Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf nach einem vorteilhafteren Verfahren zur Herstellung von Glutaminsynthetase. Andererseits gibt es bisher keine Literatur mit einer detaillierten Beschreibung der chemischen Struktur von aus Mikroorganismen stammender Glutaminsynthetase oder deren genetischer Charakteristika.

Die Erfinder haben umfangreiche Forschungen mit dem Ziel durchgeführt, die Produktivität von Glutaminsynthetase zu verbessern, Fremdenzyme zu vermindern und die Herstellungskosten zu senken. Dabei gelang den Erfindern die Gen-Klonung der aus Mikroorganismen stammenden Glutaminsynthetase und die Aufklärung ihrer Primärstruktur durch die Anwendung von Genetic Engineer­ ing-Techniken. Zusätzlich haben die Erfinder ein Verfahren zur Herstellung von Glutaminsynthetase durch die Transformation des Gens in andere Mikroorganismen und die Kultivierung derartiger Mikroorganismen entwickelt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung einer DNA, welche eine Basensequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids codiert, welches eine Glutaminsynthetase darstellt, die von einem Mikroorganismus stammt. Aufgabe der Erfindung ist ferner die Bereitstellung eines Transformanten, der diese DNA trägt, eines Polypeptids, das durch die Expression der genetischen Information dieser DNA erzeugt wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Polypeptids.

Andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden anhand der nachstehenden Beschreibung noch deutlicher.

Fig. 1 zeigt einen Endonuclease-Plan für Plasmid pGS2.

Die DNA der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise nach den folgenden Methoden durch die Anwendung von Genetic Engineering-Techniken hergestellt werden. DNA eines Mikroorganismus, bei dem es sich um einen Glut­ aminsynthetase-Gendonor handelt und die Fähigkeit zur Glutaminsynthetase-Erzeugung zeigt, wird zunächst abgetrennt und gereinigt. Diese DNA wird verdaut unter Verwendung von Ultraschallwellen oder Restriktionsendonucleasen. Die verdaute DNA und eine Expressions­ vektor-DNA, welche verdaut und linear gemacht wurde, werden vereinigt mit einer DNA-Ligase oder dergl. an den abgestumpften oder kohäsiven Enden der beiden DNAs unter Bildung eines geschlossenen Kreises. Der so erhaltene, rekombinante DNA-Vektor wird in einen reproduzierbaren Wirts-Mikroorganismus eingeschleust. Mikroorganismen mit diesem rekombinanten DNA-Vektor, der mittels eines Screening-Verfahrens unter Verwendung eines Vektormarkers und der Glutaminsynthetase-Aktivität als Indikatoren ausgewählt wurde, werden kultiviert. Der rekombinante DNA-Vektor wird anschließend von den kultivierten Zellen abgetrennt und gereinigt. Die DNA der vorliegenden Erfindung, welche die genetische Information der Glutaminsynthetase besitzt, wird dann aus dem rekombinanten DNA-Vektor abgetrennt.

Als Glutaminsynthetase-Gendonor können Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Glutaminsynthetase-Erzeugung sowie Glutaminsynthetase erzeugender Gewebe verschiedener Tiere verwendet werden. Diese umfassen Bacillus sp. EH113 (FERM BP-2281), Bacillus cereus [J. Biochem., 98 (5), 1211-1219 (1985)], die zur Gattung Bacillus gehören, Micrococcus glutamicus ATCC 13032, ATCC 13060 und ATCC 13059, die zur Gattung Micrococcus gehören, Brevibacterium flavum ATCC 14607, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 und ATCC 6871 (JP-OSen 33594/ 1982 und 155321/1984), die zur Gattung Brevibacterium gehören, Glutaminsynthetase erzeugende Mikroorganismen, die zur Gattung Methanobacterium gehören. Unter diesen sind als Glutaminsynthetase-Gendonoren bevorzugt Glutaminsynthetase erzeugende Mikroorganismen.

Im folgenden wird das Verfahren erläutert, um durch die genspendenden Mikroorganismen erzeugende DNA zu erhalten. Irgendein beliebiger der oben erwähnten, genspendenden Mikroorganismen wird zunächst in einem flüssigen Kulturmedium unter Belüftung 1 bis 3 Tage kultiviert. Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Anschließend werden die Zellen lysiert unter Erzeugung eines Lysats, das das Glutaminsynthet­ ase-Gen enthält. Behandlung mit einem Zellwand-lysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucanase, wird für die Bakteriolyse angewendet, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Enzymen, wie Protease, oder einem oberflächenaktiven Mittel, wie Natriumlaurylsulfat. Zusätzlich kann beispielsweise die physikalische Verdauung der Zellwände mittels Einfrieren-Auftauen oder mittels der französischen Presse angewandt werden, und zwar zusammen mit dem Lysat.

Herkömmliche Verfahren der Reinigung einschließlich beispielsweise Deproteinisierung durch Phenolextraktion, Proteasebehandlung, Ribonucleasebehandlung, Alkoholfällung und Zentrifugieren können entweder unabhängig oder in Kombination angewandt werden, um die DNA aus dem Lysat abzutrennen und zu reinigen.

Die Verdauung der auf diese Weise abgetrennten und gereinigten Mikroorganismus-DNA kann durchgeführt werden durch Behandlung mit Ultraschallwellen oder mittels Restriktionsendonucleasen. Um zu gewährleisten, daß sich die DNA-Fragmente und die Vektor-DNA problemlos vereinigen, ist jedoch die Verwendung von Restriktionsendonucleasen, speziell die Verwendung von Typ II- Endonucleasen, die auf spezifische Nucleotidsequenzen wirken, wie EccRI, HindIII, BamHI oder dergl., bevor­ zugt.

Ein mit Vorteil eingesetzter Vektor ist ein Phage oder eine Plasmid-DNA mit der Fähigkeit der autonomen Replikation in Wirts-Bakterienzellen und der für die Verwendung als genetischer Rekombinant-Vektor durch künstliche Behandlung rekonstruiert wurde.

Falls man Escherichia coli als Wirts-Mikroorganismus verwendet, kann man beispielsweise λgt.λC, λgt.λB oder dergl. als Phagen verwenden.

Als Plasmid kann man pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19 oder dergl. einsetzen, falls Escherichia coli der Wirts-Mikroorganismus ist, während man pUB110, pC194 oder dergl. verwendet, wenn Bacillus subtilis der Wirts-Mikroorganismus ist. Zusätzlich können Shuttlevektoren eingesetzt werden, die sich in zwei oder mehr Mikroorganismenwirtsbakterienzellen autonom replizieren können, beispielsweise sowohl in Escherichia coli als auch in Saccharomyces cerevisiae. Diese Vektoren werden mit Vorteil verdaut unter Verwendung der gleichen Restriktionsendonucleasen wie die, die zur Verdauung der oben erwähnten Glutaminsynthetase-Gen spendenden Mikroorganismus-DNA eingesetzt wurden.

Ein herkömmliches Ligationsverfahren unter Verwendung einer DNA-Ligase kann angewendet werden, um die bakterielle DNA und das Vektorfragment zu vereinigen. Beispielsweise wird das kohäsive Ende der bakteriellen DNA und das des Vektorfragments zunächst getempert (annealed) und dann kann durch die Wirkung einer geeigneten DNA-Ligase eine rekombinante DNA hergestellt werden, bestehend aus der bakteriellen DNA und dem Vektorfragment. Falls erforderlich, wird das getemperte, bakterielle DNA-Vektorfragment in den Wirts-Mikroorganismus eingeschleust, um die rekombinante DNA mit Hilfe einer in vivo-DNA-Ligase zu erzeugen. Als Wirtsbakterium kann ein beliebiger Mikroorganismus eingesetzt werden, der eine autonome und stabile Replikation der rekombinanten DNA erlaubt und in der Lage ist, den Charakter der Fremd-DNA auszudrücken. Beispiele solcher Mikroorganismen umfassen Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 und dergl., falls der Wirts-Mikroorganismus ein solcher der Species Escherichia coli ist.

Die Einschleusung der rekombinanten DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann beispielsweise in Gegenwart von Calciumionen durchgeführt werden, falls der Mikroorganismus ein Bakterium der Gattung Escherichia ist. Falls ein Bakterium der Gattung als Wirts-Mikroorganismus eingesetzt wird, kann eine Kompetentzellmethode oder eine elektrische Fusionseinschleusung von liposomaler, rekombinanter DNA in Protoplasten-Wirts-Mikroorganismen verwendet werden. Eine Mikroinjektionsmethode kann ebenfalls angewandt werden.

Die Einschleusung der gewünschten DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann ermittelt werden mittels eines Screening-Verfahrens unter Verwendung eines Drogenresistenzmarkers des Vektors und gleichzeitig die Glutaminsynthetase-Aktivität verwendet. Beispielsweise kann man diejenigen Bakterien selektieren, die auf einem selektiven Kulturmedium, basierend auf dem Drogenresistenzmarker, wachsen und Glutaminsynthetase erzeugen.

Rekombinante DNA, welche das Glutaminsynthetase-Gen besitzt und auf diese Weise einmal ausgewählt wurde, kann aus dem Transformanten extrahiert werden für die Einschleusung in ein anderes Wirtsbakterium. Als Alternative kann man eine Glutaminsynthetase-Gen-DNA isolieren unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease oder dergl. aus einer rekombinanten DNA, die ein Glut­ aminsynthetase-Gen besitzt. Durch Vereinigung mit einem linearen Vektorfragment, das auf ähnliche Weise erhalten wurde, kann man eine rekombinante DNA erzeugen, die neue Eigenschaften besitzt. Diese rekombinante DNA kann dann in einen anderen Wirts-Mikroorganismus eingeschleust werden.

Eine Glutaminsynthetase-Mutein-DNA, welche eine wesentliche Glutaminsynthetase-Aktivität besitzt, ist ein Mutantengen, das durch Genetic Engineering-Techniken aus einem erfindungsgemäßen Glutaminsynthetase-Gen erzeugt wurde. Eine DNA, welche dieses Mutein codiert, kann hergestellt werden mittels verschiedener Genetic Engineering-Techniken, wie der ortsspezifischen Mutage­ nese-Methode (site specific mutagenesis method), der Substitution spezifischer Basen unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids und dgl. Unter den Glutaminsynthetase-Mutein-DNAs, die auf diese Weise hergestellt wurden, werden solche mit besonders ausgezeichneten Eigenschaften schließlich in einen Vektor eingesetzt, um eine rekombinante DNA zu erzeugen. Diese rekombinante DNA wird anschließend in den Wirts-Mikroorganismus eingeschleust, um Glutaminsynthetase-Mutein zu erzeugen.

Die Basensequenz der DNA der vorliegenden Erfindung, hergestellt nach den oben beschriebenen Methoden, kann bestimmt werden mittels der Didesoxy-Methode [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Beispielsweise ist die Basensequenz einer Glutaminsynthetase-Gens in einem Plasmid, hergestellt unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus als Glutaminsynthetase-Gen spendender Mikroorganismus und Escherichia coli als Wirtsbakterium, wie folgt:

In der obigen Basensequenz (II) kann das 5′-Ende, das stromaufwärts des GCA-Kodons liegt, ein beliebiges Kodon aufweisen, solange dasselbe nur für eine Aminosäure codiert. Zusätzlich kann das 5′-Ende ein oder mehrere Kodons aufweisen, die für eine Aminosäure codieren. Ein bevorzugtes Beispiel für die Glieder am 5′- Ende ist ATG, ein Startkodon, oder eine Polydesoxyribonucleinsäure, welche einem Signalpeptid entspricht. Das 3′-Ende, welches stromabwärts von TAT liegt, kann ein Translationsstoppkodon aufweisen oder ein beliebiges Kodon, welches für eine Aminosäure codiert. Zusätzlich kann ein oder mehrere Kodons, die für eine Aminosäure codieren, am 3′-Ende vorliegen, mit der Maßgabe, daß es in diesem Fall wünschenswert ist, daß ein Translationsstoppkodon am 3′-Ende dieser Kodons vorliegt.

Die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch die Expression der DNA der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann aus der Basensequenz der DNA vorausgesagt werden. Die Aminosäuresequenz des Abschnitts, der das N-Ende dieses Polypeptids aufbaut, kann mittels der unten beschriebenen Methode bestimmt werden. Ein Glut­ aminsynthetase-Gen spendender Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Glutaminsynthetase wird zunächst in einem Nährstoffmedium kultiviert, um Glutaminsynthetase in den Zellen zu erzeugen und anzureichern. Die kultivierten Zellen werden aus der Brühe durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Maßnahmen gesammelt. Die gesammelten Zellen werden dann zerstört, und zwar entweder durch mechanische Maßnahmen oder durch enzymatische Maßnahmen unter Verwendung von Lysozym oder dergl. Zu dem Lysat gibt man gegebenenfalls EDTA und/oder ein geeignetes oberflächenaktives Mittel, um Glutaminsynthetase zu solubilisieren und als wäßrige Lösung abzutrennen. Diese wäßrige Lösung von Glutaminsynthetase wird dann eingeengt oder ohne Einengung der Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Gelfiltration, Adsorptionschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie unterworfen, um eine Glutaminsynthetase mit hoher Reinheit zu erhalten. Die Aminosäuresequenz des Abschnitts, der das N-Ende des Glut­ aminsynthetase-Peptids aufbaut, wird bei dieser hochgereinigten Glutaminsynthetase bestimmt unter Verwendung eines Geräts zur Protein-Sequenzbestimmung in flüssiger Phase (Beckman System 890ME, hergestellt von Beckman, Inc.). Auf diese Weise stellt man fest, daß die Aminosäuresequenz bei mindestens diesem Abschnitt identisch ist mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von Glutaminsynthetase, die durch Genetic Engineering-Techniken erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz, die auf diesem Wege aus der Basensequenz (II) ermittelt wurde, entspricht der folgenden Aminosäuresequenz (I):

In der Aminosäuresequenz der Formel (I) kann der Aminosäurerest an der stromaufwärtigen Seite des N-terminalen Ala eine oder mehrere Aminosäuren sein. Als bevorzugte Beispiele für diesen Aminosäurerest seien Met und ein Signalpeptid genannt. Stromab von dem C-terminalen Tyr können ein oder mehrere Aminosäurereste vorliegen.

Der auf diese Weise erhaltene Transformant kann, wenn er in einem Nährstoffmedium kultiviert wird, in stabiler Weise große Mengen des Polypeptids mit Glutamin­ synthetase-Aktivität erzeugen.

Die Kultivierung des Wirts-Mikroorganismus, bei dem es sich um einen Transformanten handelt, wird unter Bedingungen durchgeführt, welche die Nährstoff-physiologischen Eigenschaften des Wirts-Mikroorganismus berücksichtigen. In den meisten Fällen wird eine Flüssigkultivierung angewandt. Für die Herstellung im industriellen Maßstab ist jedoch die Kultivierung unter tiefen, aeroben Rührbedingungen vorteilhafter. Eine große Vielzahl von Nährstoffen, wie sie herkömmlicherweise für bakterielle Kulturen verwendet werden, kann zur Kultivierung des Wirts-Mikroorganismus verwendet werden. Speziell können beliebige, verwertbare Kohlenstoffverbindungen als Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Diese umfassen beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fruktose, Melassen und dergl. Als Stickstoffquellen kann man beliebige, zur Verfügung stehende Stickstoffverbindungen verwenden einschließlich Peptone, Fleichextrakte, Hefeextrakte, Caseinhydrolysate und dergl. Andere Bestandteile einschließlich Salze, wie Phosphate, Carbonate und Sulfate, sowie Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan, Zink und dergl. und bestimmte Typen von Aminosäuren oder Vitaminen können ebenfalls, je nach Zweckmäßigkeit, verwendet werden.

Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich variiert werden, in dem die Bakterien wachsen und Glutaminsynthetase erzeugen können. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 20 bis 42°C für Escherichia coli. Die Kultivierungszeit kann in einem gewissen Ausmaß variiert werden, abhängig von den Kultivierungsbedingungen. Grundsätzlich wird die Kultivierung zu einem Zeitpunkt beendet, wenn die Ausbeute an Glutaminsynthetase ein Maximum erreicht. Bei der gewöhnlichen Praxis sind dafür etwa 12 bis 48 Stunden erforderlich. Es ist möglich, den pH des Kulturmediums in dem Bereich zu ändern, in dem die Bakterien wachsen und Glutaminsynthetase erzeugen können. Der speziell bevorzugte pH-Bereich beträgt etwa 6 bis 8.

Falls Glutaminsynthetase in der Kulturbrühe enthalten ist, kann man die Glutaminsynthetase aus der die Zellen enthaltenden Kulturbrühe abtrennen und isolieren. Im allgemeinen werden jedoch Glutaminsynthetase und die in der Kulturbrühe enthaltenen Zellen voneinander getrennt, z. B. durch Filtration, Zentrifugieren oder dergl., bevor man die Glutaminsynthetase isoliert. Falls Glutaminsynthetase in den Zellen enthalten ist, werden die Zellen zunächst abgetrennt, z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren. Die gesammelten Zellen werden dann zerstört, und zwar entweder mechanisch oder mit enzymatischen Mitteln unter Verwendung von Lysozym oder dergl., und zu den zerstörten Bakterien wird, sofern erforderlich, ein Chelatisierungsmittel, wie EDTA und/oder ein geeignetes Surfaktans, zugesetzt, um Glutaminsynthetase zu solubilisieren und die Sammlung der Glutaminsynthetase als wäßrige Lösung zu ermöglichen.

Die Lösungen mit einem Gehalt der Glutaminsynthetase, die auf diese Weise erhalten wurden, werden dann eingeengt, und zwar durch Eindampfen im Vakuum oder unter Verwendung eines Filters, und einer Aussalzbehandlung mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder dergl. unterworfen oder werden der fraktionierten Fällung unter Verwendung eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder dergl., unterzogen. Das Präzipitat wird in Wasser aufgelöst und die Lösung wird durch eine semipermeable Membran dialysiert, um niedermolekulargewichtige Verunreinigungen zu entfernen. Alternativ kann man das Präzipitat mittels Gelfiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauscherchromatographie oder dergl. raffinieren. Aus der Glutaminsynthetase enthaltenden Lösung, die unter Verwendung dieser verschiedenen Maßnahmen erhalten wurde, wird gereinigte Glutaminsynthetase durch Eindampfen im Vakuum, Gefriertrocknung oder dergl. erzeugt.

Die Aktivität der auf diese Weise hergestellten Glutaminsynthetase wird gemäß der folgenden Methode be­ stimmt.

(Reaktionsgemisch)
0,2 M Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0)
0,2 (ml)
2 M Natriumglutamat	50 µl
1 M Ammoniumsulfat	50 µl
0,2 M MgCl₂	50 µl
0,2 M ATP	10 µl
0,1 M Phosphoenolpyruvat	10 µl
Pyruvatkinase (500 E/ml)	10 µl
Pyruvatoxidase (500 E/ml)	10 µl
0,1 M Thiaminpyrophosphat	2 µl
0,1 M KH₂PO₄	50 µl
1 mM FAD	10 µl
0,3% 4-Aminoantipyrin	0,1 ml
0,2% Phenol	0,1 ml
Peroxidase (45 E/ml)	0,1 ml
gereinigtes Wasser	0,348 ml

Gib 1,0 ml der Reaktionsmischung mit der obigen Zusammensetzung in ein Reagenzglas und äquilibriere die Temperatur 3 min bei 37°C. Gib 50 µl einer Enzymlösung zu und inkubiere 10 min bei 37°C. Beende die Reaktion durch Zugabe von 2 ml 0,5%igem Natriumdodecylsulfat und bestimme die Absorption der erzeugten roten Farbe bei 550 nm. Die Aktivität der Substanz für die Erzeugung von 1 µm ADP/min wird als 1 Einheit (E) definiert.

In der vorliegenden Beschreibung werden Aminosäuren, Peptide, Nucleinsäuren und Nucleinsäure-verwandte Verbindungen gemäß den üblichen Standards abgekürzt. Einige Beispiele für diese Abkürzungen sind im folgenden angegeben. Alle Bezeichnungen von Aminosäuren bezeichnen die L-Isomeren.

DNA = Desoxyribonucleinsäure
RNA = Ribonucleinsäure
A = Adenin
T = Thymin
G = Guanin
C = Cytosin
Ala = Alanin
Arg = Arginin
Asn = Asparagin
Asp = Aspartat
Cys = Cystein
Gln = Glutamin
Glu = Glutamat
Gly = Glycin
His = Histidin
Ile = Isoleucin
Leu = Leucin
Lys = Lysin
Met = Methionin
Phe = Phenylalanin
Pro = Prolin
Ser = Serin
Thr = Threonin
Trp = Tryptophan
Tyr = Tyrosin
Val = Valin.

Weitere Merkmale der Erfindung werden deutlich anhand der nachfolgenden Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen, welche die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung von chromosomaler DNA

Eine chromosomale DNA wird hergestellt aus dem Stamm Bacillus sp. EH113 (FERM BP-2281) gemäß der folgenden Methode. Der Stamm wird unter Schütteln bei 37°C in 150 ml eines Standard-Bouillonmediums über Nacht kultiviert. Die kultivierte Brühe wird 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen werden in 5 ml einer Lösung suspendiert, enthaltend 10% Saccharose, 50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 50 mM EDTA. Zu der Suspension gibt man 1 ml einer Lysozymlösung (10 mg/ml) und inkubiert das Gemisch 15 min bei 37°C. Anschließend erfolgt die Zugabe von 1 ml 10% SDS (Natriumdodecylsulfat). Zu der auf diese Weise erhaltenen Suspensionen gibt man ein gleiches Volumen einer Lösungsmittelmischung von Chloroform und Phenol (1/1), und das Gemisch wird gerührt und 3 min bei 10 000 U/min zentrifugiert, um die Wasser- und Lösungsmittelschichten zu entfernen. Zu der abgetrennten Wasserschicht gibt man langsam ein 2faches Volumen Ethanol und rührt die Mischung langsam mit einem Glasstab, um zu bewirken, daß sich die DNA um den Stab wickelt. Die so abgetrennte DNA wird in 10 ml einer Lösung aufgelöst, die 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthält (eine solche Lösung wird im folgenden als "TE" bezeichnet). Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen einer Lösungsmittelmischung von Chloroform-Phenol behandelt und erneut zur Abtrennung der Wasserschicht zentrifugiert. Diese Wasserschicht wird ferner mit einem 2fachen Volumen an Ethanol versetzt. Anschließend wird die DNA erneut aus dem Gemisch aus die oben beschriebene Weise abgetrennt. Diese DNA wird dann in 2 ml TE aufgelöst.

Beispiel 2 Konstruktion von Plasmid pGS2 mit einem Glutamin­ synthetase-Gen

(1) 2 µl (etwa 0,5 µg) Bacillus sp. chromosomaler DNA, hergestellt in Beispiel 1, 1 µl einer 10fachen Konzentration von HindIII-Verdauungspuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 70 mM MgCl₂, 0,6 M NaCl und 70 mM Mercaptoethanol], 1 µl HindIII (10 E/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 6 µl Wasser werden vermischt und 1 h bei 37°C zur Verdauung inkubiert. Gesondert werden etwa 0,3 µg pBR322 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) nach der gleichen Methode mit HinIII verdaut. Dazu gibt man 0,6 Einheiten alkalische Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) (im folgenden auch als "BAP" bezeichnet) und inkubiert das Gemisch 1 h bei 65°C. Die beiden verdauten DNA-Lösungen, die auf diese Weise mit HindIII verdaut wurden, werden miteinander vermischt und diese vermischte DNA-Lösung wird mit 0,1 Vol. 3M Natriumacetat versetzt. Nachfolgend wird die Lösung mit einem gleichen Volumen einer Chloroform-Phenol-Lösungsmittelmischung behandelt und zur Abtrennung der Wasserschicht zentrifugiert. Zu der Wasserschicht gibt man eine 2fache Menge Ethanol. Die präzipitierte DNA wird mittels Zentrifugieren gesammelt und im Vakuum getrocknet. Die getrocknete DNA wird in 89 µl Wasser aufgelöst und dazu gibt man 10 µl einer 10fachen Konzentration Ligationspuffer [0,5 M Tris- Chlorwasserstoffsäure (pH 7,6), 0,1 M MgCl₂, 0,1 M Dithiothreit, 10 mM Spermidin, 10 mM ATP] und 1 µl T4 DNA-Ligase (350 E; Takara Shuzo Co., Ltd.) und vermischt das Ganze. Die Mischung wird dann bei 4°C über Nacht stehengelassen. Diese DNA-Lösung wird mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch behandelt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt, im Vakuum getrocknet und in 10 µl TE aufgelöst.

(2) Escherichia coli TH16 [Stock Nr. ME8459, J. Bacteriol., 153, 1247 (1983); zur Verfügung gestellt von National Institute of Genetics] wird in 100 ml BHI-Medium (Hirn-Herz-Infusion; Difco Co.) kultiviert, während der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugieren gesammelt (10 000 U/min, 2 min) und in 40 ml einer eiskalten Lösung mit einem Gehalt an 30 mM Kaliumacetat, 10 mM RbCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM MnCl₂ und 15% Glycerin (pH 5,8 suspendiert. Nachdem man die Suspension 5 min bei 0°C stehengelassen hat, wird sie zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Die Zellen werden in 4 ml einer Lösung suspendiert, enthaltend 10 mM MOPS-Puffer (Dotite Co.), 75 ml CaCl₂, 10 mM RbCl und 15% Glycerin (pH 6,5). Die Suspension wird 15 min bei 0°C stehengelassen, um Kompetentzellen zu erhalten.

(3) Zu 200 µl der Escherichia coli-Zellsuspension gibt man 10 µl der oben unter (1) hergestellten DNA- Lösung. Nach 30minütigem Stehenlassen der Mischung bei 0°C versetzt man sie mit 1 ml BHI-Medium und hält das Gemisch 90 min bei 37°C. Ein Aliquot der Mischung (100 ml) wird auf einer BHI-Agarplatte, enthaltend jeweils 25 µg/ml Ampicillin und Kanamycin, ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert, um Transformanten zu erzeugen. Diese Transformanten werden repliziert auf einer M9-Mediumplatte (Zusammensetzung: 1 g NH₄Cl, 6 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 0,5 g NaCl, 2 ml 1M MgSO₄, 10 ml 20%ige Glucose, 0,1 ml 1M CaCl₂, 1 ml von 1 mg/ml Thiaminchlorid, 15 g Agar und 1 l Wasser) und weiter über Nacht bei 37°C kultiviert. Etwa 2000 Kolonien der auf diese Weise erzeugten Transformanten werden untersucht. Man erhält 3 Stämme, die in dem Thiaminhaltigen M9-Medium wachsen. Einer dieser 3 Stämme wird als Escherichia coli pGS 2 bezeichnet. Aus diesem Stamm wird ein Plasmid hergestellt gemäß der Methode von Maniatis et al. [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)]. Escherichia coli DH1-Kompetentzellen, hergestellt gemäß der vorstehend beschriebenen Methode, werden mit dieser DNA transformiert. Der so erhaltene Transformant wird als Escherichia coli DH1 pGS2 bezeichnet und wurde nach dem Budapester Vertrag bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt; Hinterlegungsnummer 2265, FERM BP-2265. Dieser Stamm wird nach Reinigung in BHI-Medium bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Glutaminsynthetase-Erzeugungsfähigkeit wird bei diesem gereinigten Transformanten bestimmt nach der oben beschriebenen Glutaminsynthetase- Bestimmungsmethode. Dabei stellt man fest, daß der Transformant eine Glutaminsynthetase-Aktivität von etwa 3 E/ml aufweist.

Das diesen Stamm tragende Plasmid wird nach der vorstehend beschriebenen Methode abgetrennt. Das so abgetrennte Plasmid, welches das Glutaminsynthetase-Gen und pBR322-Gen enthält, wird als pGS2 bezeichnet.

Beispiel 3 Abtrennung von Plasmid pGS2-DNA

Escherichia coli DH1 pGS2 wird unter Schütteln in 1 l BHI-Medium (Difco Co.) kultiviert. Sobald das Wachstum einen Trübungswert von OD₆₆₀=1,0 erreicht hat, wird Chloramphenicol zu der Brühe bis zu einer Endkonzentration von 200 µg/ml zugesetzt. Die Schüttelkultivierung wird mindestens weitere 16 h bei 37°C fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung wird die Brühe mit 3000 U/min während 10 min zentrifugiert, um Bakterienzellen zu sammeln, aus denen die Plasmid-DNA nach der Lysozym-SDS-Methode und der Cäsiumchlorid-Äthidium­ bromid-Methode hergestellt wird [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)].

Beispiel 4 Kartierung von Plasmid pGS2 und Bestimmung der Basensequenz des Glutaminsynthetase-Gens

Ein Schnittplan wird hergestellt unter Verwendung der Endonucleasen EcoRI, XbaI, SphI, Bg1II, NcoI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.) und NdeI (BRL Co.) bei der Plasmid pGS2-DNA, die aus Escherichia coli DH1 pGS2 hergestellt wurde, und zwar auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Die Basensequenz der das Glutaminsynthetase-Gen enthaltenden DNA wird nach der Didesoxy-Methode unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt [Science, 214, 1205 bis 1210 (1981)]. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz des Gens, das die Glutaminsynthetase codiert, sind in den Formeln (II) bzw. (I) dargestellt.

Beispiel 5 Herstellung von Glutaminsynthetase

Der Transformant FERM P-9492 (FERM BP-2265) wird in 20 l BHI-Medium (Difco Co.) 20 h bei 37°C unter Verwendung eines Flaschenfermenters kultiviert. Die kultivierten Zellen werden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 5000 U/min gesammelt. Die Zellen werden mit 2 l physiologischer Salzlösung gewaschen und in 2 l 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Zu der so hergestellten Suspension gibt man 1 mg/ml Lysozym und Triton X-100 mit einer Konzentration von 0,1%. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C wird das Gemisch 10 min bei 5000 U/min zentrifugiert, um den resultierenden Überstand zu sammeln. 1,8 l dieses Überstands werden der Ammoniumsulfat(40-65%)-Fällung unterworfen. Das Präzipitat wird durch 30minütiges Zentrifugieren bei 5000 U/min gesammelt, in 250 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöst, mit Sephadex G-25 entsalzt und dann der DEAE-Sephallose CL-6B-Ionenaustauschchromatographie unterzogen, um die aktive Fraktion zu sammeln. Diese Fraktion wird entsalzt und gefriergetrocknet, wobei man ein pulverförmiges Produkt erhält. Diese Enzymprobe hat eine Glutaminsynthetase-Aktivität von 19,2 E/mg, bestimmt nach der oben beschriebenen Methode zur Bestimmung der Glutaminsynthetase-Aktivität.

Die vorliegende Erfindung gewährleistet eine effiziente Produktion von hochreiner Glutaminsynthetase. Durch die Erfindung wurde ferner der Aufbau von Glutamin­ synthetase-Gen aufgeklärt.

Claims (12)

1. DNA, umfassend eine Basensequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids codiert.

2. DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids durch die folgende Formel (I), beginnend mit den N-Enden, dargestellt wird:

3. DNA gemäß Anspruch 1, umfassend eine Basensequenz, die, beginnend vom 5′-Ende, die folgende Formel (II) aufweist:

4. Transformant, umfassend eine DNA, deren Basensequenz eine Aminosäuresequenz des Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids codiert und die fremd ist bezüglich des Wirts-Mikroorganismus.

5. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids durch die folgende Formel (II), beginnend bei den N-Enden, dargestellt wird:

6. Transformant gemäß Anspruch 4, umfassend eine Basensequenz, die, beginnend vom 5′-Ende, die folgende Formel (II) aufweist:

7. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia ist.

8. Transformant gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Species Escherichia coli ist.

9. Transformant gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus Escherichia coli DH1 pGS2 ist (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; Hinterlegungsnummer 2265, FERM BP-2265).

10. Ein Glutaminsynthetase aufbauendes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die, beginnend von den N-Enden, durch die folgende Formel (I) dargestellt wird:

11. Verfahren zur Herstellung von Glutaminsynthetase, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
Kultivierung eines Transformanten mit einer DNA, die eine Basensequenz umfaßt, welche eine Aminosäuresequenz eines Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids codiert und bezüglich des Wirts-Mikroorganismus fremd ist, um zu bewirken, daß der Transformant die genetische Information der DNA ausdrückt, und Sammlung des Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids aus der Kulturbrühe.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Glutaminsynthetase aufbauenden Polypeptids durch die folgende Formel (I), beginnend bei den N-Enden, dargestellt wird: