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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Gen für eine thermostabile Diaphorase,
einen rekombinanten Vektor, welcher das Gen aufweist, eine Transformante
mit dem rekombinanten Vektor und ein Verfahren zur Herstellung einer
thermostabilen Diaphorase unter Verwendung der Transformante.
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Diaphorase
[EC.1.6.99.-] ist ein Enzym, das eine wichtige Rolle in den Elektronentransportsystemen in
vivo spielt und auch ein industriell nützliches Enzym in vitro ist.
Das heisst, die Diaphorase ist eine essentielle Komponente für eine klinische
Probe, in der NDA (Nicotinamid-Adenindinukleotid)-Reaktionen eine
Rolle spielen. Diaphorase wird gegenwärtig durch Isolierung und Reinigung
aus Mikroorganismen hergestellt. Beispielsweise sind Mikroorganismen,
die zu Clostridium (Kaplan, N. O., et al., Arch. Biochem. Biophys.,
Bd. 132, S. 91-98, 1969) und Bacillus gehören, als Mikroorganismen mit
dem Vermögen
zur Produktion von Diaphorase bekannt, welche von Sigma, Co., bzw.
Asahi Chemical Industry, Co., im Handel erhältlich sind. Die Ausbeute an
Diaphorase, die von diesen Mikroorganismen erhalten wird, ist jedoch
niedrig und die Diaphorase ist thermisch instabil und somit hat
die Reinigung der Diaphorase extrem aufwendige Arbeiten erforderlich
gemacht.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass der
thermophile Bacillus stearothermophilus endogen eine thermostabile
Diaphorase bildet, und Patente auf das die thermostabile Diaphorase produzierende
Bakterium und ein Verfahren zur Reinigung der Diaphorase erhalten
(japanische Patente Nr. 1715795 und 1973434).
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Gemäß dieser
patentierten Erfindung kann Diaphorase mit ausgezeichneter thermischer
Stabilität
und Lagerstabilität
gewonnen und deren Reinigung erreicht werden. Nachdem jedoch die
thermostabile Diaphorase gemäß der oben
beschriebenen patentierten Erfindung durch Kultivieren der Bakterien
bei gewöhnlich
einer hohen Temperatur von 50 bis 60° C hergestellt wird, war eine
große
Energiemenge erforderlich. Darüber
hinaus ist die Ausbeute an Diaphorase, welche aus den Bakterien
erhalten wird, auf dem gleichen niedrigen Niveau wie bei der herkömmlichen
Diaphorase, das Problem der schwierigen Massenproduktion einer thermostabilen
Diaphorase wurde noch nicht gelöst.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Anmeldung ist die Bereitstellung von Materialien
zur Herstellung einer thermostabilen Diaphorase im großen Maßstab auf
gentechnische Weise und eines Verfahrens zur Herstellung der thermostabilen
Diaphorase unter Verwendung der Materialien.
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Die
Erfindung stellt somit ein von einem thermophilen Bacillus erhaltenes
Gen bereit, das für
eine thermostabile Diaphorase kodiert, welche die Aminosäuresequenz
von SEQ-ID-Nr. 1 oder eine Variante oder ein Fragment davon mit
Diaphorase-Aktivität
umfasst.
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Die
Erfindung stellt auch ein von einem thermophilen Bacillus erhaltenes
Gen bereit, das für
eine thermostabile Diaphorase kodiert, welche aus einer Aminosäuresequenz
besteht, bei der gegenüber
der Aminosäuresequenz
von SEQ-ID-Nr. 1 ein oder mehrere Aminosäurerest(e) deletiert, substituiert
oder hinzugefügt ist/sind.
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Die
Erfindung stellt auch ein Nukleinsäuremolekül bereit, umfassend eine von
einem thermophilen Bacillus erhaltene Sequenz, welche die Nukleotidsequenz
von SEQ-ID-Nr. 2 umfasst und für
eine thermostabile Diaphorase kodiert, oder eine Nukleotidsequenz,
kodierend für
eine Diaphorase, welche im wesentlich homolog zu dieser Sequenz
ist oder damit hybridisiert.
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Im
wesentlichen homolog, wie hier verwendet, umfasst Sequenzen mit
einer Sequenzidentität
von etwa 50 % oder mehr, z.B. 60 %, 70 %, 80 % oder 90 % oder mehr,
und auch funktionell äquivalente
Allelvarianten und verwandte Sequenzen, welche durch Substitution,
Addition oder Deletion einzelner oder mehrerer Basen modifiziert
wurden. Funktionell äquivalent
bedeutet Sequenzen, welche für
ein Polypeptid mit Diaphorase-Aktivität kodieren. Ebenfalls eingeschlossen
sind hybridisierende Sequenzen, insbesondere diejenigen, welche
unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren. Stringenzbedingungen
können
gemäß im Stand
der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden, wie z.B. beschrieben
in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor, NY, 1989. Analoga der Sequenz, einschließlich entsprechender
RNA-Sequenzen, sind ebenfalls eingeschlossen.
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Die
Erfindung stellt ferner ein von einem thermophilen Bacillus erhaltenes
Gen bereit, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, bei der gegenüber der
Nukleotidsequenz von SEQ-ID-Nr.
2 ein oder mehrere Nukleotid(e) deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist/sind
und welche für
eine thermostabile Diaphorase kodiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist der thermophile Bacillus Bacillus stearothermophilus.
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Die
Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Vektor bereit, welcher
eine Vektor-DNA ist, die ein DNA-Fragment, umfassend irgendeines
der Gene der Erfindung, aufweist.
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In
dem rekombinanten Vektor ist die Vektor-DNA vorzugsweise ein Expressionsvektor
und zur Vermehrung in einer Wirtszelle, wie z.B. Escherichia coli,
in der Lage. Ein Beispiel eines solchen Plasmids ist pKK233-3.
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Die
Erfindung stellt auch eine Transformante bereit, welche eine Zelle
ist, die mit dem rekombinanten Vektor der Erfindung transformiert
wurde.
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Die
Erfindung stellt auch eine weitere Transformante bereit, welche
Escherichia coli ist, die mit beispielsweise dem von pKK233-3 abgeleiteten
rekombinanten Vektor transformiert wurde.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen
Diaphorase bereit, umfassend das Kultivieren der Transformanten
der Erfindung in einem Kulturmedium und Isolieren der thermostabilen
Diaphorase aus der kultivierten Transformante.
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1 zeigt
schematisch eine Ansicht der Herstellung von pSDE1 als ein Beispiel
des rekombinanten Vektors gemäß der vorliegenden
Erfindung. In der Figur repräsentiert "ER" EcoR; "ET" repräsentiert
EcoT22; "N" repräsentiert
Nael; "S" repräsentiert
Smal; "H" repräsentiert
HindIII; "Terminator" repräsentiert
eine RNA-Polymerase-Eliminierungssequenz; "SD" repräsentiert
eine Ribosomen-Bindungssequenz; und "TAC-Promoter" repräsentiert eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle.
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Die
thermostabile Diaphorase gemäß der vorliegenden
Erfindung ist das Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 1
oder ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, bei der gegenüber der
Aminosäuresequenz
von SEQ-ID-Nr. 1 ein oder mehrere Aminosäurerest(e) deletiert, substituiert
oder hinzugefügt ist/sind.
Demgemäß ist das
Gen der Erfindung ein Gen, welches für die oben genannte Aminosäuresequenz kodiert,
und konkreter das Gen, welches die Nukleotidsequenz von SEQ-ID-Nr.
2 umfasst.
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Ein
solches Gen kann beispielsweise erhalten werden in einem Verfahren
zur partiellen Synthese der Sequenz von SEQ-ID-Nr. 2 und Klonierung
des Zielgens aus einer DNA-Bank unter Verwendung der synthetisierten
DNA als Sonde oder in einem Verfahren zur Amplifizierung des Zielgens
mit einem PCR-Verfahren unter Verwendung der synthetisierten Oligonukleotide,
welche den beiden Enden von SEQ-ID-Nr. 2 entsprechen, als Primer
und der chromosomalen DNA als Matrize.
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Für den thermophilen
Bacillus können
beispielsweise UK-563 (FERM P-7275), ACTT-7953 (FERM P-4775), ACTT-8005
(FERM P-4776), ACTT-10149 (FERM P-4777), NCA-1503 (FERM P-4778),
SP-43 (FERM P-12754) und dgl. verfügbar sein.
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Die
Isolierung des Gens für
die thermostabile Diaphorase aus dem Bacillus, die Herstellungen
eines rekombinanten Vektors, welcher das Gen aufweist, und einer
Transformante mit dem rekombinanten Vektor und die Kultivierung
der Transformante können
durchgeführt
werden, indem beispielsweise die Verfahren kombiniert werden, die
in Molecular Cloning (Sambrook, J., et al., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, 1989) beschrieben sind. Ferner kann die
thermostabile Diaphorase hergestellt werden durch Unterwerfen der
gewonnenen Transformante einer Lyse mit Ultraschallwellen oder Lysozym
vor der Zentrifugation und Passieren des resultierenden Überstands
durch im Handel erhältliche
Ionenaustauschharze oder Affinitätsharze
oder dgl., um die thermostabile Diaphorase abzutrennen.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird nun spezieller und detaillierter in den
folgenden, nicht beschränkenden Beispielen
beschrieben werden.
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Beispiel 1: Identifizierung
eines Gens für
eine thermostabile Diaphorase
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(1) Erstellung einer chromosomalen
DNA-Bank von Bacillus stearothermophilus
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Ein
Gramm der Bakterien von thermophilem Bacillus stearothermophilus
UK-563 (FERM P-7275)
wurde einer Lyse mit Lysozym (hergestellt von Biochemical Industry,
Co.) nach dem bekannten Verfahren (Saito & Miura, Biochim. Biophys., Acta,
Bd. 72, S. 619, 1963) unterworfen, um dann die DNA in einen alkalischen Puffer,
der SDS und Phenol enthält,
zu extrahieren. Ferner wurde die RNA mit RNase abgebaut, um die
chromosomale DNA (1 mg) zu reinigen.
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100 μg der resultierenden
chromosomalen DNA wurden partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 (hergestellt
von Toyobo, Co. Ltd.) verdaut, um ein chromosomales DNA-Fragment
zu erhalten (80 μg).
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Alternativ
wurde 1 μg
Vektor pUC19 (hergestellt von Takara Suzou, Co.) vollständig mit
BamHI (hergestellt von Toyobo, Co. Ltd.) verdaut und dann mit einer
alkalischen Phosphatase behandelt, die von einem Bakterium erhalten
wurde (hergestellt von Takara Suzou, Co. Ltd.), um ein Vektor-DNA-Fragment
zu erhalten (0,8 μg).
Durch Verwendung einer von T4-Ligase
abgeleiteten DNA-Ligase (hergestellt von Takara Suzou, Co. Ltd.)
wurde das resultierende chromosomale DNA-Fragment (0,28 μg) mit dem
Vektor-DNA-Fragment (0,1 μg) 30
Minuten lang bei 16° C
ligiert, wodurch eine rekombinante DNA erhalten wurde. Die resultierende
rekombinante DNA wurde mit 200 μg
kompetenter Zellen von Escherichia coli JM109 (hergestellt von Toyobo,
Co. Ltd.) gemischt und die resultierende Mischung wurde 1 h lang
bei 0° C
gelagert, gefolgt von einem Erwärmen
bei 42° C
für 120
Sekunden, wodurch die Transformation bewirkt wurde.
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Die
resultierende Transformante wurde in 1 ml L-Medium überimpft,
für eine
Kultivierung bei 37° C
für 1 h,
und mit der resultierenden Kulturbouillon wurde ein Agarplattenmedium
mit Ampicillin überschichtet,
um einen ampicillin-resistenten Bakterienstamm zu erzeugen. Der
Bakterienstamm wurde in einem L-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin kultiviert,
für eine Übernachtkultur,
und nach dem Ernten der Bakterien wurde mit dem Alkali-SDS-Verfahren
ein Plasmid präpariert,
welches als eine chromosomale DNA-Bank von Bacillus stearothermophilus
definiert war.
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(2) Isolierung des Gens
für die
thermostabile Diaphorase
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Endonuklease
und Exonuklease III (hergestellt von GIBCO BRL, Co.) wurden nacheinander
mit der chromosomalen Bacillus stearothermophilus-DNA-Bank umgesetzt
und eine einzelsträngige
DNA-Bank wurde hergestellt. Biotinylierte Diaphorase-Sonden (Di-IF
und Di-IR) und Magnetperlen mit darauf immobilisiertem Streptavidin
wurden mit der einzelsträngigen
DNA-Bank gemischt und unter Ausnutzung der starken spezifischen
Bindung zwischen Biotin und Streptavidin wurde ein einzelsträngiger Klon,
der mit den Sonden hybridisierte, mit Hilfe eines Magneten gescreent.
Mittels Verwendung von Di-IF und Di-IR als Primer wurde der gescreente
einzelsträngige
Klon in ein doppelsträngiges
Plasmid überführt, welches
dann in 200 μg
von kompetenten Escherichia coli JM109-Zellen (hergestellt von Toyobo,
Co., Ltd.) gemischt und dann 1 h lang bei 0° C gelagert wurde, gefolgt von
Erwärmen
bei 42° C
für 120
Sekunden, wodurch die Transformation bewirkt wurde. Mit der resultierenden Transformante
wurde 1 ml L-Medium angeimpft, für
eine Kultivierung bei 37° C
für 1 h, und
mit der resultierenden Kulturbouillon wurde ein Agarplattenmedium,
enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin, überschichtet,
um 10 Kolonien von ampicillin-resistenten Bakterienstämmen zu
erhalten.
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Zum
Screenen eines Bakterienstammes, welcher das Gen für eine thermostabile
Diaphorase trägt, aus
den Kolonien wurde eine Kolonie-PCR unter Verwendung von Di-IF und
Di-IR als Primer und DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (hergestellt
von Toyobo, Co. Ltd.) nach dem bekannten Verfahren (Simpson et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 151, S. 487, 1988) durchgeführt und
es wurde angezeigt, dass vier Bakterienstämme das Diaphorase-Gen enthielten.
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(3) Bestimmung der Nukleotidsequenz
des Gens für
die thermostabile Diaphorase
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Ein
Stamm wurde aus den vier Transformantenstämmen ausgewählt und dann in ein L-Medium (100 ml),
enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin, überimpft.
Nach Kultivierung des Stammes bei 37° C wurde nach dem Alkali-SDS-Verfahren
das Plasmid präpariert,
welches als Plasmid pSD1 definiert wurde. Nach Denaturierung von
pSD1 (10 μg)
mit Alkali wurde eine Kettenabbruchsreaktion unter Verwendung eines
universellen M13-Primers und eines reversen M13-Primers nach dem
bekannten Verfahren (Sanger, Nicklen & Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci.,
Bd. 74, S. 5463, 1977) durchgeführt.
Für die
Reaktion wurde der Auto Read Sequence Kit (hergestellt von Pharmacia,
Co.) verwendet. Das Reaktionsprodukt wurde unter Verwendung des
ALF-DNA-Sequenators (hergestellt von Pharmacia, Co.) analysiert,
um die Nukleotidsequenz von 633 Basenpaaren zu bestimmen, wie in
SEQ-ID-Nr. 2 gezeigt.
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Beispiel 2: Herstellung
eines rekombinanten Vektors und transformierter Escherichia coli
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Das
Plasmid pSD1 wurde an der Stelle von EcoT221 (Produkt von Toyobo,
Co. Ltd.) gespalten, welche sich am ersten Nukleotid stromaufwärts des
Diaphorase-Gens befindet, um das Plasmid in der linearen Form herzustellen,
welche dann mit T4-Phagen-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara
Suzou, Co. Ltd.) glattendig gemacht und weiter mit HindIII (Produkt
von Toyobo Co. Ltd.) gespalten wurde. Individuelle Fragmente des gespaltenen
linearen Plasmids wurden einer Agarosegelelektrophorese unterworfen,
um ein DNA-Fragment zu
erhalten, welches das Diaphorase-Gen umfasste. Alternativ wurde
pKK223-3 (hergestellt von Pharmacia, Co.) an der Stelle von Smal
(Produkt von Toyobo, Co. Ltd.), welche sich am 12. Nukleotid stromabwärts der SD-Sequenz
befindet, und an der Mehrfachklonierungsstelle mit HindIII (Produkt
von Toyobo, Co. Ltd.) gespalten.
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Mit
Hilfe von DNA-Ligase aus dem T4-Phagen (Produkt von Takara Suzou,
Co. Ltd.) wurden das DNA-Fragment (0,1 μg), welches das Diaphorase-Gen
umfasste, und das Vektor-DNA-Fragment
(0,1 μg)
30 Minuten lang bei 16° C
zusammenligiert, um einen rekombinanten Plasmidvektor pSDE1 zu erhalten,
welcher das Gen der thermostabilen Diaphorase aufwies. 1 zeigt
schematisch die Herstellungsverfahren des rekombinanten Vektors
pSDE1.
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Dann
wurde pSDE1 mit 200 μg
kompetenter JM109-Zellen (200 μg,
hergestellt von Toyobo, Co. Ltd.) gemischt und dann 1 h lang bei
0° C aufbewahrt,
gefolgt von Erwärmen
bei 42° C
für 120
Sekunden, um die Zellen mit dem pSDE1 zu transformieren. Die resultierende
Transformante wurde in ein L-Medium (1 ml) zur Kultivierung bei
37° C für 1 h überimpft
und mit der resultierenden Kulturbouillon wurde ein Agarplattenmedium, enthaltend
50 μg/ml
Ampicillin, überschichtet,
um eine Kolonie von 100 Bakterien eines transformierten Escherichia
coli, enthaltend das Gen für
die thermostabile Diaphorase, zu erzeugen. Eines der Bakterien wurde
als Escherichia coli JM109/pSDE1 am 21. März 1997 beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology, the Agency of Industrial Science
and Technology, MITI (Hinterlegungsnummer FERM BP-6325) hinterlegt.
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Beispiel 3: Herstellung
von thermostabiler Diaphorase durch Escherichia coli
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Das
transformierte Escherichia coli JM109/pSDEI, hergestellt in Beispiel
3, wurde in ein L-Medium (300
ml) mit 50 μg/ml
Ampicillin für
eine Übernachtvorkultur
bei 37° C überimpft.
Die Vorkulturbouillon wurde in ein L-Medium (30 Liter), enthaltend
50 μg/ml
Ampicillin, für
die Kultivierung bei 37° C
für 10
h überimpft,
gefolgt von Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-thiogalactopyranosid zur weiteren
Kultivierung für
weitere 15 h. Dann wurden die Bakterien geerntet. Die resultierenden
Bakterien wurden in 25 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, (1000 ml) für eine Ultraschallbehandlung
suspendiert. Die aufgebrochenen Bakterien wurden verworfen und die
thermostabile Diaphorase wurde aus dem resultierenden Überstand
durch Ionenaustauschchromatographie mittels DEAE-Sepharose und Affinitätschromatographie
mittels Blue-Sepharose gereinigt. Thermostabile Diaphorase wurde
in einer Ausbeute von 180.000 Einheiten gewonnen, welches das 10fache
der Ausbeute an Diaphorase ist, welche durch Kultivierung von 30
l Bacillus stearothermophilus UK-563 (FERM P-7275) gewonnen wird.
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Die
Eigenschaften der gewonnenen Diaphorase wurden untersucht. Die restliche
Aktivität
der Diaphorase nach einer Behandlung bei 50° C für 1 h betrug 100 %, der optimale
pH-Wert war pH 8,0 und Km für
NADH betrug 0,5 mM. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde be stätigt, dass
die mit der vorliegenden Erfindung erhaltene thermostabile Diaphorase
dieselben Eigenschaften hatte wie diejenigen der Diaphorase, welche
aus Bacillus stearothermophilus UK-563 (FERM P-7275) erhalten wurde.
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Die
Aktivität
von Diaphorase wurde wie folgt nachgewiesen und die Aktivität wird wie
hier im folgenden beschrieben ausgedrückt. Konkreter wurde die Aktivität nachgewiesen
durch Mischen einer Enzymlösung
mit 1,0 ml einer Lösung,
die 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, 1 mM reduziertes Nicotinamid-Adenindinukleotid (NADN)
und 0,06 mM 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCIP) enthält, und
Bestimmen der Anfangsgeschwindigkeit der Extinktionsänderung
bei 600 nm bei 30° C.
Eine Einheit der Enzymaktivität
ist diejenige Menge des Enzyms, welche für die Reduktion von 1 μmol DCIP
unter den vorgenannten Bedingungen für eine Minute erforderlich
ist.
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Wie
detailliert beschrieben, kann die thermostabile Diaphorase in großem Maßstab auf
einfache Weise mit niedrigen Kosten hergestellt werden.
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