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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Verwendung von
Uridindiphosphat Glukose 4-Epimerase (auch Uridindiphosphat Galaktose-4-Epimerase
genannt), und auf ein Verfahren zur Umwandlung von Uridindiphosphat
N-acetylglukosamin (UDP GlcNAc) in Uridindiphosphat N-acetylgalaktosamin
(UDP GalNAc) durch die Verwendung des oben genannten Enzyms.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
jüngst
erfolgten bemerkenswerten Fortschritte von molekular und von biochemisch
orientierten Untersuchungen haben einige der wichtigen molekularen
Funktionen und Rollen von Zuckern aufgeklärt, so dass es nun möglich ist,
Zuckerketten als Arzneimittel zu entwickeln und funktionelle Materialien
auf der Basis von Zuckerketten (Oligosacchariden) mit physiologischer
Aktivität
zu entwickeln. Trotzdem sind die Oligosaccharide, die zur Zeit als
Reagenzien kommerziell erhältlich
sind, auf ein paar wenige Typen beschränkt und zudem ausgesprochen
kostspielig im Erwerb. Zudem werden solche Oligosaccharide nur auf
dem Niveau von Reagenzien produziert und können daher nicht in größeren Quantitäten erhältlich gemacht
werden.
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Konventionell
sind Oligosaccharide durch das nachstehende Verfahren hergestellt
worden: Extraktion aus natürlich
vorkommenden Substanzen, chemische Synthese, enzymatische Synthese, und
Kombinationen dieser Verfahren, wobei die enzymatische Synthese
für die
Darstellung von Oligosacchariden im großen Maßstab als medizinische oder
funktionelle Materialien als das geeigneteste Verfahren angesehen
worden ist.
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Die
enzymatische Synthese wird deshalb als den anderen Verfahren überlegen
angesehen, weil (1) dieses Verfahren keine komplizierten Schritte
für die
Schützung
und Entschützung
funktioneller Gruppen benötigt,
wie diese in den Verfahren der chemischen Synthese von Nöten sind,
und zudem in der Lage ist, schnell das gewünschte Oligosaccharid zu synthetisieren,
und (2) es mit diesem Verfahren möglich ist, Oligosaccharide
zu synthetisieren, die aufgrund der Substratspezifität des verwendeten
Enzyms eine hohe strukturelle Spezifität aufweisen. Weiterhin haben
jüngste
Entwicklungen in der Biotechnologie wie zum Beispiel die Technologie
der rekombinanten DNA es möglich
gemacht, verschiedene Typen von Enzymen wirtschaftlich in großem Umfang
zu produzieren, was ebenfalls einen Beitrag zur Etablierung der Überlegenheit
der enzymatischen Synthese leistet.
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Für die Synthese
von Oligosacchariden durch enzymatische Synthese sind zwei Verfahren
verfügbar: (1)
die Rückreaktion
der Hydrolase eines Oligosaccharids wird verwendet, und (2) eine
Glykosyltransferase wird verwendet. Das vorstehende Verfahren hat
den Vorteil, dass kostengünstige
Monosaccharide als Substrat eingesetzt werden können, aber da es die Rückreaktion
zur Hydrolyse ausnutzt, ist seine praktische Anwendung sehr schwierig
hinsichtlich der Ausbeute bei der Synthese und hinsichtlich der
Anwendbarkeit auf die Synthese von Oligosacchariden, die sich durch
eine komplizierte Struktur auszeichnen.
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Auf
der anderen Seite wird das zweite Verfahren, welches eine spezifische
Glykosyltransferase verwendet, als dem ersten Verfahren überlegen
angesehen, weil dieses Verfahren auf die Produktion von Oligosacchariden
angewandt werden kann, die sich durch eine komplizierte Struktur
auszeichnen, und weil es hohe Ausbeuten in der Synthese liefert.
Weiterhin trägt
die Darstellung von verschiedenen Glykosyltransferasen in großem Umfang,
die durch die jüngsten
Entwicklungen in der Biotechnologie wie zum Beispiel die Technologie der
rekombinanten DNA möglich
gemacht wurde, dazu bei, die praktische Anwendung des genannten
Verfahrens zu realisieren.
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Dennoch
sind die Zuckernukleotide, die üblicherweise
als Zuckerdonoren verwendet werden, mit Ausnahme einiger weniger
Typen noch immer sehr kostspielig, und tatsächlich nur in kleinen Mengen
auf Reagenz-Niveau verfügbar.
Betrachtet man zum Beispiel UDP GalNAc, welches einen Donor für N-Acetylgalaktosamin
darstellt, welches wiederum in der Kernregion der Zuckerketten von
O-gebundenen Glykoproteinen oder Sphingoglykolipiden enthalten ist,
so wurde über
ein Verfahren berichtet, nach dem diese Verbindung aus UDP GlcNAc
unter Zuhilfenahme von Uridindiphosphat N-acetylglykosamin 4-Epimerase (UDP GlcNRc 4-Epimerase),
welche aus tierischem Gewebe oder aus Bacillus subtilis gewonnen
wurde, synthetisiert wurde. (Analytical Biochemistry, 127, 171–177 (1982);
J. Biol. Chem., 234 (11), 2801–2805
(1959); JP-A-7-79792).
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Wenngleich
UDP GlcNAc ein Zuckernukleotid darstellt, welches relativ einfach
in großer
Menge herstellbar ist, so existiert UDP GlcNAc 4-Epimerase doch
nur in kleinen Mengen in tierischem Gewebe oder in den Zellen von
Bakterien. Zudem ist kein Bericht bekannt geworden, in dem die Darstellung
dieses Enzyms durch die Technologie der rekombinanten DNA unter
Verwendung eines UDP GlcNAc 4-Epimerase-Gens beschrieben wird. Daher
ist es praktisch schwierig UDP GalNAc unter Verwendung des genannten
Enzyms herzustellen, oder auch das Enzym selbst in großer Menge
herzustellen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Als
ein Resultat aus intensiven Studien zur Eliminierung der oben beschriebenen
Probleme haben die vorliegenden Erfinder gefunden, dass die aus
einem Bacillus subtilis stammende Uridindiphosphat Glukose 4-Epimerase
(UDP Glukose 4-Epimerase) nicht nur Aktivität zur Katalyse der essentiellen
gegenseitigen Umwandlung nach Formel (1) aufweist, sondern ziemlich überraschend
auch Aktivität
zur Katalyse der gegenseitigen Umwandlung nach Formel (2) aufweist.
- (1) UDP Glukose ↔ UDP Galaktose
- (2) UDP GlcNAc ↔ UDP
GalNAc
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UDP
Glukose 4-Epimerase besitzt beides, eine Aktivität zur Katalyse der gegenseitigen
Umwandlungsreaktion in Formel (1) wie auch eine Aktivität zur Katalyse
der gegenseitigen Umwandlungsreaktion in Formel (2). (The Journal
of Biological Chemistry, Vol. 258, No. 17, 10774–10778 (1983); Am. J. Hum.
Genet. 61, 590–598
(1997)).
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Das
Verfahren unter Verwendung des besagten Enzyms ist unpraktikabel
aus den Gründen,
dass zum Beispiel die Herstellung von UDP Glukose 4-Epimerase aus
tierischem Gewebe unzureichend ist, und dass es schwierig ist, dieses
Enzym zu präparieren,
und dass für
die Durchführung
der gegenseitigen Umwandlungsreaktion unter Verwendung des besagten
Enzyms das teuere Nikoti namid-Adenin-Dinukleotid (NAD+)
als Co-enzym eingesetzt werden muss.
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Auf
der anderen Seite ist berichtet worden, dass eine aus Escherichia
coli und aus Hefe gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase keine Aktivität in der
Katalyse der Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNAc besitzt
(J. Biol. Chem., 244, 2132–2136
(1969); Biochemistry, 7, 1645–1654
(1968); The Journal of Biological Chemistry, Vol. 258, No. 17, 10774–10778 (1983);
Am. J. Hum. Genet., 61, 590–598
(1997)), und dass die UDP Glukose 4-Epimerase aus Bacillus subtilis
ein völlig
anderes Enzym ist als UDP GlcNAc 4-Epimerase aus Bacillus subtilis
(J. Biol. Chem., 234 (11), 2801–2805
(1959); Chemistry, Vol. 258, No. 17, 10774–10778 (1983)), weshalb es
ziemlich unerwartet war, zu der Erkenntnis zu gelangen, dass eine
aus Bacillus subtilis gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase Aktivität in der
Katalyse von nicht nur der Umwandlungsreaktion von UDP Glukose in
UDP Galaktose besitzt, sondern auch Aktivität in der Umwandlungsreaktion
von UDP GlcNAc in UDP GalNAc zeigt.
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Unsere
weitere Forschung, die auf den oben genannten Befunden basiert,
hat zur Aufdeckung der Tatsache geführt, dass nicht nur die aus
Bacillus subtilis stammende UDP Glukose 4-Epimerase sondern auch solche aus anderen
Bakterien, die sporenbildende Eigenschaften haben, Aktivität in der
Katalyse der Umwandlungsreaktionen von UDP Glukose in UDP Galaktose
und von UDP GlcNAc in UDP GalNAc besitzen. Die vorliegende Erfindung
wurde auf der Basis dieser neuen Entdeckung erreicht.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch ein Verfahren zur Umwandlung
von UDP GlcNAc in UDP GalNAc unter Verwendung einer Epimerase, wobei
die genannte Epimerase eine UDP Glukose 4- Epimerase darstellt, die aus einem sporenbildenden
Bakterium gewonnen worden ist.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein UDP GalNRc Zufuhrsystem
bestehend aus UDP GlcNAc und einer UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildenden
Bakterium gewonnen worden ist.
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Weiterhin
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung
von UDP GalNAc durch die Einwirkung einer Epimerase auf UDP GlcNAc,
wobei besagte Epimerase eine UDP Glukose 4-Epimerase darstellt,
die aus einem sporenbildenden Bakterium gewonnen worden ist.
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Weiterhin
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Umwandlung
von UDP GlcNAc in UDP GalNAc durch die Verwendung einer Epimerase,
wobei besagte Epimerase eine solche ist, die eine Aminosäuresequenz
aufweist, wie sie durch SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll angezeigt
ist, oder eine Epimerase, die eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID
NO:1 bezeichnet aufweist, und die eine Deletion, Substitution und/oder
Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat und die
gleiche enzymatische Aktivität
aufweist wie die Epimerase, die die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz
besitzt.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein UDP GalNAc Zufuhrsystem
bestehend aus UDP GlcNRc und einer Epimerase, die eine Aminosäuresequenz
aufweist, wie sie durch SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll angezeigt
ist, oder eine Epimerase, die eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID
NO:1 bezeichnet aufweist, und die eine Deletion, Substitution und/oder
Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat und die
glei che enzymatische Aktivität
aufweist wie die Epimerase, die die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz
besitzt.
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Weiterhin
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung
von UDP GalNAc durch die Einwirkung einer Epimerase auf UDP GlcNAc,
wobei besagte Epimerase eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie
durch SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll angezeigt ist, oder eine
Epimerase, die eine Aminosäuresequenz
wie durch SEQ ID NO:1 bezeichnet aufweist, und die eine Deletion,
Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste
erfahren hat und die gleiche enzymatische Aktivität aufweist wie
die Epimerase, die die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz
besitzt.
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Beste Art
zur die Durchführung
der Erfindung
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Die
UDP Glukose 4-Epimerase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, ist nicht Gegenstand zu irgendwelchen Einschränkungen,
solange als sie ein Enzym darstellt, das aus sporenbildenden Bakterien
gewonnen wird und das in der Lage ist, die folgenden gegenseitigen
Umwandlungsreaktionen (1) und (2) zu katalysieren:
- (1) UDP Glukose ↔ UDP
Galaktose
- (2) UDP GlcNAc ↔ UDP
GalNAc
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Eine
solche UDP Glukose 4-Epimerase kann aus sporenbildenden Bakterien
wie jenen, die zum Genus Bacillus gehören, hergestellt werden.
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Typische
Beispiel von Bakterien, die zum Genus Bacillus gehören und
die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind B. subtilis,
B. halodurans, B. megaterium, B. cereus und B. stearothermophilus. Es
ist besonders zu bemerken, dass das UDP Glukose 4-Epimerase-Gen
(galE), das aus B. subtilis gewonnen werden kann, bereits geklont
worden ist, und dass die DNA-Sequenz
dieses Gens berichtet wurde (Gene Bank, Accession Nr. X99339).
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Bevorzugt
wird in der vorliegenden Erfindung eine aus B. subtilis gewonnene
UDP Glukose 4-Epimerase verwendet, die durch die übliche Technologie
der rekombinanten DNA auf der Basis der veröffentlichten DNA-Sequenz des
besagten, geklonten Gens hergestellt wird. Dieses Enzym, wie es
durch die DNA-Sequenz seines geklonten Gens verschlüsselt ist,
besitzt eine Aminosäuresequenz,
die als SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll vermerkt ist. Dieses
Enzym ist nicht das einzige Enzym, das in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden kann; es ist auch möglich ein Enzym zu verwenden,
das eine Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:1 aufweist, die eine Deletion, Substitution und/oder
Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat, und
das gleiche enzymatische Aktivität
aufweist wie das Enzym, das die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz
besitzt.
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Ein
aus B. subtilis gewonnenes UDP Glukose 4-Epimerase-Gen kann zum
Beispiel dadurch erhalten werden, dass auf der Basis der berichteten
DNA-Sequenz eine Sonde hergestellt wird, und dann ein DNA-Fragment
aus der chromosomalen DNA von B. subtilis geklont wird, welches
ein Gen beinhaltet, das UDP Glukose 4-Epimerase kodiert. Der Wirt
für die
Klonierung ist hier nicht spezifiziert, aber es ist zweckmäßig, hierfür aus Gründen der
Vorteile bei der Handhabung und der einfachen Zugänglichkeit
E. coli als Wirt zu verwenden. Ein Gen von einem Enzym, welches
eine Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:1 auf weist, die eine Deletion, Substitution und/oder
Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat, und
das gleiche enzymatische Aktivität
aufweist wie das Enzym, das die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz
besitzt, kann leicht durch ein brauchbares Verfahren wie zum Beispiel
das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese, das Verfahren der
PCR oder das gewöhnliche
Verfahren der Hybridisierung, auf der Basis der Verwendung des Gens
galE erhalten werden.
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Um
ein System für
die Hochexpression des geklonten Gens zu etablieren wird die DNA-Sequenz
des DNA-Fragments, welches durch die Anwendung des Verfahrens nach
Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499, (1983)), des Verfahrens
der Dideoxy-Kettentermination
(Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)) oder nach einem anderen
Verfahren, das geeignet ist, die kodierende Region des besagten
Gens zu spezifizieren, und ein Signal zur Expressionskontrolle (initiierende
Signale der Transkription und der Translation) oberhalb der besagten
Region eingebaut, um das besagte Gen in die Lage zu versetzen, in
den mikrobiellen Zellen, die zum Mikroorganismus des Wirts gehören, die
Expression durchzuführen,
wodurch ein rekombinanter Expressionsvektor eingerichtet wird.
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Als
das Signal für
die Expressionskontrolle zur Produktion von UDP Glukose 4-Epimerase
in E. coli in großer
Menge werden vorzugsweise leistungsstarke Initiationssignale der
Transkription und der Translation verwendet, die nach Intention
kontrolliert werden können
und in der Lage sind, die Ausbeute bei der Produktion von UDP Glukose
4-Epimerase drastisch zu steigern. Ein solches leistungsstarkes
Initiationssignal der Transkription liegt zum Beispiel im lac Promoter,
im trp Promoter, im tac Promoter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 21 (1983);
Gene, 20, 231 (1982)) und im trc Promoter vor (J. Biol. Chem., 260,
3539 (1985)).
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Als
Vektor können
verschieden Arten von Plasmidvektoren, Phagenvektoren u.s.w. verwendet
werden, wobei bevorzugt ein Plasmidvektor benutzt wird, der eine
hohe Kopienzahl in der bakteriellen Zelle hat, der in den Zellen
von E. coli kopiert werden kann, und der einen passenden Marker
für Arzneimittelresistenz sowie
eine spezifische Spaltungsstelle für ein Restriktionsenzym aufweist.
Typische Beispiele solcher Plasmidvektoren sind pBR322 (Gene, 2,
95 (1975)), pUC18 und pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)).
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E.
coli wird durch die Verwendung des zuvor präparierten rekombinanten Vektors
transformiert. Mit E. coli als Wirtszelle kann die K12 Zelllinie,
die C600 Zelllinie, die JM105 Zelllinie oder die JM109 Zelllinie,
die für Experimente
mit rekombinanter DNA herangezogen wird (Gene, 33, 103–119 (1985)),
verwendet werden.
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Viele
Verfahren für
die Transformation von E. coli sind bislang beschrieben worden,
wie zum Beispiel ein Verfahren, in dem das Plasmid nach Behandlung
mit Calciumchlorid bei einer tiefen Temperatur in die bakteriellen
Zellen eingeführt
worden ist (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
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Der
so erhaltene Transformant wird in einem Medium kultiviert, in dem
dieser Mikroorganismus wachsen kann, und wird solange kultiviert,
bis sich durch die Induktion der Expression der entsprechenden Gene große Mengen
von UDP Glukose 4-Epimerase in den bakteriellen Zellen angehäuft haben.
Die Kultivierung des Transformanten kann nach einem konventionellen
Verfahren unter Verwendung eines Mediums, das Nährstoffe enthält, die
für das
Wachstum des besagten Mikroorganismus notwendig sind wie zum Beispiel
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann
die Kultivierung bei 20 bis 50 °C
für etwa 10
bis 50 Stunden und wenn notwendig unter Belüftung und mit Rühren durchgeführt werden,
wobei ein Medium verwendet wird, das üblicherweise für die Kultivierung
von E. coli eingesetzt wird, wie zum Beispiel das Bouillon Medium,
das LB Medium (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 1 % übliches
Salz), oder das 2 × YT Medium
(1,6 % Trypton, 1 % Hefeextrakt und 0,5 % übliches Salz). Sofern das Plasmid
als Vektor eingesetzt wird, wird eine passende Menge eines relevanten
Antibiotikums (Ampicillin, Kanamycin, usw., abhängig vom Arzneimittelresistenzmarker
des Plasmids) zu der Kultur zugesetzt, um ein Dropout des Plasmids
während
der Kultivierung zu verhindern.
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Sofern
die Expression des UDP Glukose 4-Epimerase-Gens induziert werden
muss kann die Expression durch herkömmliche Verfahren induziert
werden, die konventionell für
den Promoter, der als Signal für
die Expressionskontrolle verwendet wird, sind. Zum Beispiel kann
im mittleren Stadium Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
(IPTG) als ein die Expression induzierendes Reagenz dem Medium in
einer passenden Menge zugesetzt werden, wenn lac Promoter, tac Promoter
und Ähnliches
verwendet worden sind. Wenn der verwendete Promoter eine konstitutionelle
Aktivität
zur Transkription aufweist, wird der Zusatz eines solchen Reagenz nicht
notwendig sein.
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Das
aus den sporenbildenden Bakterien mit Ausnahme von Bacillus subtilis
gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase Gen kann durch die Darstellung
eines Primers mit Referenz zu der DNA-Sequenz des besagten, aus
B. subtilis gewonnenen UDP Glukose 4-Epimerase Gens galE, suchen nach einem
DNA-Fragment mit hoher Homologie mit galE in der chromosomalen DNA
des sporenbilden den Bakteriums mit Ausnahme von B. subtilis, wobei
der synthetisierte Primer als Sonde eingesetzt wird, und Klonierung
dieses DNA-Fragments erhalten werden. Im Falle von B. Halodurans,
welches ebenfalls ein Bakterium darstellt, das zum Genus Bacillus gehört, ist
die gesamte Sequenz des Genoms bereits aufgeklärt worden (Extremophiles, 3(1),
21–28
(1999)), so dass die Klonierung hiervon mit Bezug auf die besagte
und andere Informationen relativ einfach durchgeführt werden
kann. Es ist möglich,
für die
Darstellung von UDP Glukose 4-Epimerase,
die aus einem sporenbildenden Bakterium mit Ausnahme von B. subtilis
durch die Anwendung der Technologie der rekombinanten DNA unter
Verwendung eines geklonten DNA-Fragments
gewonnen wird, der gleichen Prozedur zu folgen, wie sie für die Präparation
des oben beschriebenen und aus B. subtilis gewonnenen UDP Glukose
4-Epimerase Gens galE verwendet wird.
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Alternativ
kann eine UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildenden
Bakterium mit Ausnahme von B. subtilis gewonnen wird, durch die
Kultivierung des Bakteriums auf dem üblichen Wege und Reinigung
der Kulturen dargestellt werden. Im Besonderen wird das Bakterium
in einem SCD, einem Standard Agar oder in einem Nährstoff
Agar Medium kultiviert. Die Kultivierung kann mittels eines konventionellen
Verfahrens der Flüssigkultivierung
bei einer Temperatur, die für
das Wachstum des zu kultivierenden Bakteriums geeignet ist, wie
zum Beispiel 25 bis 65 °C
und, wenn notwendig, unter Belüftung
und mit Rühren
durchgeführt werden.
Aus den so erhaltenen Kulturen werden die bakteriellen Zellen durch
geeignete Verfahren wie zum Beispiel Membranfiltration oder Zentrifugieren
gewonnen, und die gesammelten bakteriellen Zellen werden durch Behandlung
mit Ultraschall oder anderen geeigneten Verfahren zer stört und danach
einer oder einer Kombination von verschiedenen Behandlungen unterzogen,
wie zum Beispiel Behandlung mit Hitze, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat,
Dialyse, Verfahren der Chromatographie (Ionenaustausch, Gelfiltration
usw.), um die gewünschte
UDP Glukose 4-Epimerase zu erhalten. Der Nachweis und die Bestätigung der
Präsenz von
UDP Glukose 4-Epimerase
kann bei den Schritten der Reinigung zum Beispiel durch das Verfahren
der Messung der Aktivität
der UDP Glukose 4-Epimerase durchgeführt werden, welches in den
Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist.
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Hinsichtlich
der Art der Verwendung der so erhaltenen UDP Glukose 4-Epimerase
in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es für den Fall
der UDP Glukose 4-Epimerase, die durch die Technologie der rekombinanten
DNA erhalten wurde, möglich,
den besagten Transformanten direkt im Verfahren einzusetzen, oder
aber der Transformant kann in der Form eines behandelten Produkts
des Transformanten eingesetzt werden, oder in Form eines Enzyms,
welches durch Reinigung des behandelten Produkts erhalten wird.
Im Fall der UDP Glukose 4-Epimerase,
die nach dem konventionellen Verfahren der Reinigung und ohne Nutzung
der Technologie der rekombinanten DNA dargestellt wurde, kann diese
in der vorliegenden Form eingesetzt werden.
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Im
Falle der Verwendung eines Transformanten als UDP Glukose 4-Epimerase
ist es möglich,
zum Beispiel die mikrobiellen Zellen, die aus den Kulturen des Transformanten
durch Verfahren der fest/flüssig
Separation wie zum Beispiel Zentrifugieren oder Membranfiltration
gewonnen wurden, zu verwenden. Beispiele von behandelten Zellprodukten
des Transformanten beinhalten zerstörte Zellprodukte ebenso wie
modifizierte Produkte der Zellwand oder der zellulären Plasmamembranen,
die von den besagten gewonnenen mikrobiellen Zellen durch gewöhnliche
Behandlung wie zum Beispiel mechanische Zerstörung (zerstört durch Waring blender, French
press, Homogenisator, Mörser
usw.), Einfrieren und Wiederauftauen, Autolyse, Trocknung (Lyophilisierung,
Lufttrocknung usw.), enzymatische Behandlung (Behandlung mit Lysozym
usw.), Behandlung mit Ultraschall und chemische Behandlungen (Behandlungen
mit Säure,
einer Base usw.) erhalten wurden. Unter den Enzymen, die durch die
Reinigung der besagten behandelten Produkte erhalten werden, befinden sich
rohe oder gereinigte Enzyme, die aus den besagten Produkten der
behandelten mikrobiellen Zellen erhalten werden können, indem
die Fraktionen, die die gewünschte
enzymatische Aktivität
aufweisen, einer gewöhnlichen
Reinigungsbehandlung für
Enzyme unterworfen werden (Aussalzen, isoelektrische Fällung, Fällung durch
Zugabe von organischen Solventien, Dialyse, Chromatographie usw.).
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Die
Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNRc unter Verwendung
einer solchen UDP Glukose 4-Epimerase, oder die Epimerisierung von
UDP GlcNAc in UDP GalNAc kann zum Beispiel unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt
werden.
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Das
UDP GlcNAc, das für
diese Reaktion eingesetzt wird, ist bereits kommerziell erhältlich,
und das kommerzielle Produkt kann in der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden. Die Konzentration des UDP GlcNAc kann richtig
eingestellt werden, zum Beispiel im Bereich von 1 bis 5 000 mM,
vorzugsweise 10 bis 1 000 mM. Die Konzentration der UDP Glukose
4-Epimerase, die zu der Reaktionslösung zugesetzt wird, kann ebenfalls
richtig eingestellt werden, zum Beispiel im Bereich von 0,001 bis
100 Einheiten/ml.
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Die
obige Reaktion kann in einem passenden Puffer wie zum Beispiel Tris – Chlorwasserstoffsäure oder
Kaliumphosphat (pH 7–9,
bevorzugt 7,5–8,5)
bei 60 °C
oder darunter, bevorzugt 15 bis 50 °C, über einen Zeitraum von etwa
1 bis 50 Stunden durchgeführt
werden, falls notwendig mit Rühren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird Magnesium nach Wunsch zu der obigen Reaktionslösung gegeben.
Als Magnesium können
Magnesiumsalze anorganischer Säuren
wie zum Beispiel Magnesiumsulfat, Magnesiumnitrat und Magnesiumchlorid
und Magnesiumsalze organischer Säuren
wie zum Beispiel Magnesiumcitrat verwendet werden. Die Konzentration
an Magnesium kann richtig eingestellt werden im Bereich von 5 bis
50 mM.
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In
dem Fall, in dem das produzierte UDP GalNAc aus der Mischung mit
UDP GlcNAc isoliert werden muss, können die gewöhnlich verwendeten
Verfahren zur Reinigung von Zuckernukleotiden (zum Beispiel verschiedene
chromatographische Techniken wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie,
Adsorptionschromatographie, Affinitätschromatographie und Gelfiltration,
Verfahren, die die Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen ausnutzen wie
zum Beispiel Gegenstromverteilung und Gegenstromextraktion, Verfahren,
die die Unterschiede in der Löslichkeit
ausnutzen wie zum Beispiel Auf konzentrieren, Kühlen und die Zugabe von organischen
Solventien, und Aussalzen) unabhängig
voneinander oder in einer passenden Kombination verwendet werden.
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Das
UDP GalNAc Zufuhrsystem besteht in der vorliegenden Erfindung aus
UDP GlcNAc und UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildendem
Bakterium gewonnen wurde. Dieses Zufuhrsystem kann, wenn es zum
Beispiel an eine Glykosyltransferase (GalNAc Transferase) allein
oder an eine Kombination von letzterer mit einem UDP GlcNAc Regenerationssystem
gekoppelt ist, zur Darstellung von Oligosacchariden verwendet werden,
die N-Acetylgalaktosamin
enthalten (JP-A-7-79792).
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird in genaueren Einzelheiten mit Verweis
auf ein Beispiel erklärt,
aber soll offensichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung nicht
auf dieses Beispiel beschränkt
ist. In dem Beispiel, das im folgenden beschrieben ist, wurde die
Bestimmung von UDP GalNAc in der Reaktionslösung durchgeführt mittels
HPLC, wobei ODS-AQ312 Säulen
von YMC Corp. für
die Trennung und eine 1 mM Tetrabutuylammonium- und eine 50 mM Magnesiumacetat
Lösung
als Eluens verwendet wurden. Die Herstellung von DNA, die Spaltung
durch ein Restriktionsenzym, die DNA Ligation durch die T4DNA Ligase
und die Transformation von E. coli wurden alle entsprechend zu den
Verfahren durchgeführt,
wie sie in Sambrook et al; Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
(1989) beschrieben sind. Die Restriktionsenzyme AmpliTaqDNA Polymerase
und T4DNA Ligase wurden von Takara Co., Ltd. erhalten.
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Beispiel 1
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(1) Klonen des UDP Glukose
4-Epimerase Gens
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Chromosomale
DNA von B. subtilis 168M (ATCC 27370) wurde durch das Saito-Miura
Verfahren (Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) hergestellt.
Das B. subtilis UDP Glukose 4-Epimerase (galE) Gen wurde durch PCR
vervielfältigt,
wobei diese DNA maßvoll
vervielfältigt
wird und die folgenden zwei Arten von Primer DNA (SEQ ID NO: 2 und
3 in dem Sequenzprotokoll) verwendet wurden.
Primer (A): 5'-GATCTAGAAACCTCTATCGAATTGCTGG-3'
Primer (B):
5'-AACTGCAGGCCTCCATTCTTATTCCGCACT-3'
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Die
Amplifizierung des galE Gens durch PCR wurde durchgeführt, indem
25 mal die Schritte der thermischen Denaturierung (94 °C, 1 min),
des Temperns (57 °C,
15 min) und der Polymerisation der Reaktionslösung [bestehend in 100 ⎕1
davon aus 50 mM Kaliumchlorid, 10 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure (pH
8,3), 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0.001 % Gelatine, 0,2 mM dNTP, 0.1 μg temperierte
DNA, Primer DNAs (A) und (B) (jeweils 0,2 μM) und 2,5 Einheiten von AmpliTag
DNA-Polymerase] (72 °C,
3 min) unter Verwendung des DNA Thermal Cycler von Perkin-Elmer
Cetus Instrument Co., Ltd. wiederholt wurden.
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Nach
der Gen Amplifizierung wurde die Reaktionslösung mit einer aus Phenol/Chloroform
(1:1) gemischten Lösung
behandelt und zu der wasserlöslichen
Fraktion wurde Ethanol in einer Menge dazu gegeben, die doppelt
so groß ist,
um damit DNA auszufällen.
Die ausgefallene und wiedergewonnene DNA wurde durch Agarose Gel
Elektrophorese entsprechend den Verfahren in der Literatur (molecular
Cloning, wie oben erwähnt)
getrennt, um die DNA Fragmente von 1,2 kb zu reinigen. Diese DNA
wurde durch die Restriktionsenzyme YbaI und PstI gespalten und dann
mit dem Plasmid pTrc99A (erhalten von Pharmacia Biotech) unter Verwendung
von T4DNA Ligase abgebunden, die das Plasmid abgebunden hat mit
diesen Restriktionsenzymen YbaI und PstI. E. coli JM109 Ketten (erhalten
von Takara Co. Ltd.) wurden unter Verwendung der Ligations-Reaktionslösung transformiert
und das Plasmid pTrc-galE-1 wurde aus der erhaltenen Ampicillin
resistenten Transformierung isoliert. Dieses Plas mid pTrc-galE-1
ist ein Produkt, das erhalten wurde durch Insertion in pTrc99A bei
den XbaI PstI Spaltungsstellen unterhalb von dem trc Promoter, einem
XbaI PstI DNA Fragment, das den Promoter und das strukturelle Gen
von B. subtilis galE Gen enthält.
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(2) Herstellung von UDP
Glukose 4-Epimerase
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Mit
E. coli JM109 Ketten, die das Plasmid pTrc-galE-1 beherbergen, wurde
ein 500 ml von 2 × YT
Medium beimpft, das 100 μg/ml
von Ampicillin enthält,
und diese wurde einer schüttelnden
Kultur bei 37 °C
ausgesetzt. Wenn die bakterielle Zellenkultur 4 × 108 Zellen/ml
erreichte, wurde IPTG zu der Kulturlösung zugegeben, so dass es
eine endgültige
Konzentration von 1 mM haben würde,
und die schüttelnde
Kultur wurde für 5
weitere Stunden bei 37 °C
gehalten. Nach der Kultivierung wurden die bakteriellen Zellen durch
Zentrifugieren (9 000 × g,
10 Min) gesammelt und in 50 ml von einer gepufferten Lösung (20
mM Tris – Chlorwasserstoffsäure (pH
8,0) und 2 mM EDTA) suspendiert. Die bakteriellen Zellen wurden
durch Ultraschall zerstört
und weiter zentrifugiert (20 000 × g, 10 Min), um den zellulären Rest
zu entfernen.
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Die
so erhaltene überstehende
Fraktion wurde für
die Enzymherstellung bereit gestellt und die UDP Glukose 4-Epimerase
Aktivität
und die UDP GlcNAc 4-Epimerase Aktivität wurden in diesem Enzym Präparat bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammen mit den Ergebnissen des
Kontrollbakteriums (E. coli MJM109 Ketten, die pTrc99A beherbergen)
zu sehen. Die Einheit der Epimerase Aktivität in der vorliegenden Erfindung
wurde wie folgt berechnet.
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i) Bestimmung von UDP
Glukose 4-Epimerase Aktivität
und Verfahren der Bestimmung der Einheit der Aktivität
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Das
Enzym Präparat
wurde zu einem 50 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure Puffer
(pH 8,0), der 2,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM UDP Glukose enthält, gegeben
und auf 37 °C
erwärmt,
um die Reaktion durchzuführen,
gefolgt von einem 5-minütigem
Kochen, um das Enzym zu inaktivieren. Die UDP Galaktose in der Reaktionslösung wurde
durch HPLC bestimmt. Die Aktivität,
die 1 μmol
von UDP Galaktose bei 37 °C
in einer Minute bildet, wird als eine Einheit definiert.
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ii) Bestimmung von UDP
GlcNAc 4Epimerase Aktivität
und Verfahren der Bestimmung der Einheit der Aktivität
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Das
Enzym Präparat
wurde zu einem 50 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure Puffer
(pH 8,0), der 2,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM UDP GlcNAc enthält, gegeben
und auf 37 °C
erwärmt,
um die Reaktion durchzuführen,
gefolgt von einem 5-minütigem
Kochen, um das Enzym zu inaktivieren. Die UDP GalNAc in der Reaktionslösung wurde
durch HPLC bestimmt. Die Aktivität,
die 1 μmol
von UDP GalNAc bei 37 °C
in einer Minute bildet, wird als eine Einheit definiert.
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(3) Darstellung von partiell
gereinigtem UDP Glukose 4-Epimerase
Produkt
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Zu
dem Enzympräparat,
die nach (2) oben erhalten wurde, wurde Ammoniumsulfat in einer
solchen Menge gegeben, dass eine 40 %ige Sättigung erreicht wurde, und
die Mischung wurde über
Nacht bei 4 °C gerührt und
dann zentrifugiert (20 000 × g,
10 Min), um den Niederschlag zu entfernen. Ammoniumsulfat wurde wieder
zu der überstehenden
Fraktion gegeben, um eine 80 %ige Sättigung zu erreichen, und die
Mischung wurde über
Nacht bei 4 °C
gerührt
und dann zentrifugiert (20 000 × g,
10 Min). Die ausgefallene Fraktion wurde in 5 ml eines 20 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure-Puffers
(pH 8,0) gelöst
und zweimal in 1 Liter der genannten Pufferlösung dialysiert. Die so erhaltene
Probe wurde als die Enzymlösung
verwendet und in der Synthesereaktion eingesetzt, die unten unter
(4) beschrieben ist. Die Aktivität
der UDP GlcNAc 4-Epimerase in dieser Enzymlösung betrug 4,38 Einheiten/mg
Protein.
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(4) Darstellung von UDP
GalNAc
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0,212
Einheiten der nach (3) oben erhaltenen Enzymlösung wurden zu 500 μl eines 100
mM Tris – Chlorwasserstoffsäure-Puffers (pH 8,0)
gegeben, der 180 mM UDP GlcNAc und 10 mM Magnesiumchlorid enthält, und
bei 37 °C
für 21
Stunden reagieren gelassen. Die HPLC-Analyse der Reaktionslösung zeigte
die Bildung von 50,38 mM UDP GalNAc an.
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Aus
Gründen
wie der unzureichenden Produktion des Enzyms im tierischen Gewebe
und in den bakteriellen Zellen war jede der bislang berichteten
Verfahren für
die Darstellung von UDP GalNAc mittels UDP GlcNAc 4-Epimerase weit
von jeglichem praktischen Wert.
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Die
vorliegenden Erfinder fanden heraus, dass eine aus sporenbildenden
Bakterien gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase nicht nur in der Lage
ist, eine Reaktion der Umwandlung von UDP Glukose in UDP Galaktose
zu induzieren, sondern auch eine Aktivität für die Katalyse der Umwandlungsreaktion
von UDP GlcNAc in UDP GalNAc aufweist. Diese Offenbarung hat es
zum ersten Mal möglich
gemacht, die Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNRc für praktische
Anwendungen zu verwenden.
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