JP4643999B2 - 組換え微生物 - Google Patents
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Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997
月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したytcG-AFとytcG-A/CmR、及びytcG-B/CmFとytcG-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のytcG遺伝子の上流に隣接する0.5kb断片(A)、及び下流に隣接する0.5kb断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194(J.Bacteriol.,158,543,1984)を鋳型とし、表2に示したytcG-CmFとytcG-CmRのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.9kb断片(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、ytcG-AFとytcG-BRのプライマーを用いてSOE−PCRを行ない、3断片を(A)-(C)-(B)の順になる様に結合させ、1.9kbのDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってytcG遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換され、結果として目的とする遺伝子欠失株となっていることを確認した。
実施例1と同様に、表2に示した各遺伝子-AFと各遺伝子-A/CmR、及び各遺伝子-B/CmFと各遺伝子-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のypuH,yjbI,clpX,ykrB,ywgA,galE,yqfF,yqhT,ylbO,ytqI,yjlC及びyllB各遺伝子の上流に隣接する0.5kb断片(A)、及び下流に隣接する0.5kb断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194(J.Bacteriol.,158,543,1984)を鋳型とし、表2に示した各遺伝子-CmFと各遺伝子-CmRのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.9kb断片(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、各遺伝子-AFと各遺伝子-BRのプライマーを用いてSOE−PCRを行ない、3断片を(A)-(C)-(B)の順になる様に結合させ、1.9kbのDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体のゲノムDNAを調製し、これを鋳型とするPCRによって目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換した遺伝子欠失株であることを確認した。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表3に示した各遺伝子-AFと各遺伝子-A/CmR、及び各遺伝子-B/CmFと各遺伝子-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上の欠失対象とするyqeK,yjbH,ybbR,yrzD,ymcA,ylbG,yhzC,ykzF,ykoA,yebD及びargH遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(A)、及び下流に隣接する1.0kb断片(B)をそれぞれ調製した。次に、プラスミドpC194を鋳型として、表3に示したCmFWとCmRVのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.9kb断片(C)を調製した。さらに、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、各遺伝子-AFと各遺伝子-BRのプライマーセットを用いたSOE−PCRにより、3断片を(A)-(C)-(B)の順になる様に結合させ、2.9kbのDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによって標的とする遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換した遺伝子欠失株であることを確認した。
実施例1〜3にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)をコードするDNA断片(3.1kb)が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で30℃で15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6mLを30mLの2xL−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表4に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株を用いた場合、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
実施例1〜3にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌168株に、配列番号1に示されるアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域とシグナル配列領域の下流に、配列番号5に示されるBacillus属細菌 KSM-K38株(FERM BP-6946)由来のアルカリアミラーゼ遺伝子(特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001)の成熟酵素領域(Asp1-Gln480)をコードするDNA断片(1.5kb)を付加させたDNA断片(2.1kb)を、シャトルベクターpHY300PLKのBglII-XbaI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-K38をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で30℃で15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6mLを30mLの2xL−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で7日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表5に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株を用いた場合、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。
Claims (7)
- 枯草菌遺伝子galE又は当該遺伝子と塩基配列において90%以上の同一性を有し、且つUDP−グルコース−4−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
- 微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項1記載の組換え微生物。
- 異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域を結合した請求項1又は2記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合したものである請求項3記載の組換え微生物。
- 分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項3又は4記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項4記載の組換え微生物。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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